Here, we present protocols to rapidly screen and characterize enzymes for antimicrobial activity. The microslide diffusion assay and the dye-release assay utilize target bacterial substrates for qualitative and quantitative enzymatic activity evaluation.
Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods to screen for target enzymes prior to investing greater research effort and resources. The goal of this protocol is to demonstrate two complementary assays for conducting these initial evaluations. The microslide diffusion assay provides an initial or simple detection screen to enable the qualitative and rapid assessment of proteolytic activity against an array of both viable and heat-killed bacterial target substrates. As a counterpart, the increased sensitivity and reproducibility of the dye-release assay provides a quantitative platform for evaluating and comparing environmental influences affecting the hydrolytic activity of protein antimicrobials. The ability to label specific heat-killed cell culture substrates with Remazol brilliant blue R dye expands this capability to tailor the dye-release assay to characterize enzymatic activity of interest.
Antimicrobial agents play an essential role in targeting a wide range of microorganisms such as viruses, fungi, and bacteria. The antimicrobial activities produced by various bacteria range in target specificity from broad-spectrum to species-specific, including clinically relevant bacterial pathogens 1. In nature, protein antimicrobial compounds like bacteriocins and lysins represent a microbial arsenal of tools for self-defense, replication, and nutrient acquisition 2,3. Serving as mediators of population dynamics within microbial communities, protein antimicrobials provide a competitive advantage to the producing organism over nonproducing, sensitive species 4. As recombinant enzymes and probiotics, these proteins also have an economic and societal importance as the need for new sources of pathogen control increases with each new expansion of antimicrobial resistance within the bacterial population 5.
The first evaluations of newly discovered protein antimicrobials include determining the basic physical characteristics that are inherent to the enzyme. Methods for rapid screening of potential antimicrobials allow selection of candidates with hydrolytic activities against the desired target substrates. The microslide diffusion assay and the quantitative dye-release assay allow for the use of a variety of substrates in the detection of enzymatic hydrolysis. For protein antimicrobial enzymes with activity against the bacterial cell wall, the versatility of these assays allow rapid and effective, qualitative and quantitative screening against viable bacterial cells (microslide assay only), heat-killed whole bacterial cell substrates, or purified peptidoglycan from the target bacterium. These assays have utility in antimicrobial enzyme discovery for use in fields such as alternative therapeutics, food supplements, and inhibitors of biofilm production.
The microslide diffusion assay and the dye-release assay are demonstrated methods for detection and characterization of novel protein antimicrobials. The microslide diffusion assay provides a relative (qualitative) estimate of antimicrobial activity and allows for minimal inference of enzyme concentration and activity. Using this method, activity is readily visualized as the development of a zone of lysis with the absence of activity resulting in a lack of zone formation. The rate of zone development and the zone diameter are indicative of the amount and purity of the enzyme present in the sample; however, this rate and the quality of the substrate clearing within the zone can also be affected by the presence of contaminants, the completeness of the hydrolysis reaction, and the type of substrate. Interfering contaminants can affect the rate of enzyme diffusion from the well, while incomplete hydrolysis or variation of the substrate type can result in a turbid zone of lysis 6.
The dye-release assay quantitatively assesses the amount of covalently-linked Remazol brilliant blue R dye products released into the reaction supernatant from the enzymatically hydrolyzed substrate. The method has only slight variability associated with a difference in substrate, thus allowing greater sensitivity for detection of hydrolysis as compared to the microslide diffusion assay. These properties allow the method to have utility in the characterization of biochemical properties of the enzyme and in the standardization of the assay for comparison between different antimicrobial enzymes.
In this protocol, we provide methods to perform the basic microslide diffusion assay and dye-release assay, while demonstrating the scale of detection limits and variability for each. The assays are used to perform basic evaluations of an unknown protein antimicrobial purified from the culture supernatant of an uncharacterized soil bacterial isolate. Observed activities against bacterial cell substrates within the assays allow comparison of reaction activities between a previously uncharacterized protein antimicrobial and α-chymotrypsin, a control proteolytic enzymes. These protocols provide a foundation for the application of the two techniques that can be expanded and modified to accommodate varied applications.
Den Micro diffusion analysen och färgfrisättningsanalysen ger fördelar för att detektera och karakterisera tidigare oidentifierade proteinantimikrobiella medel. Dessa snabba och känsliga metoder medger high-throughput screening av organismer källbibliotek för identifiering av enzymer av intresse innan investera större forskningsresurser. Som hög profil målenzym har identifierats, kan variationer av detektionsanalyser användas för att snabbt detektera enzymet eller för att bestämma biokemiska egenskaper hos enzymet. Till exempel, under en flerstegsproteinreningsschema, den mikros diffusionsanalys kan snabbt detektera fraktioner innehållande enzymet av intresse. Dessutom kan reaktions optima för enzymet bestämmas genom att förändra reaktionsbuffertar och inkubationstemperaturer i färgämnet-frisättningsanalys.
Intervallet av enzym massa som krävs för detektering i mikros diffusionsanalys är en funktion av enzymkänneSTICS. Detekterings begränsningar av analysen kräver i allmänhet användning av högre mängder enzym än dye-frisättningsanalys. I denna studie, jämförelse av gränserna för mikros diffusion analysen (Figur 1) till färgfrisättningsanalys (Figur 4) detektions illustrerade att mikros diffusion analysen är mindre känslig teknik än dye-frisättningsanalys. När enzymkoncentrationen är inte ett problem, medger mikros analys för snabb initial screening av bibliotek för framställning av proteinantimikrobiella medel mot mål substrat med låga krav arbetskraft och utrustning. Även kräver mer ansträngning och utrustning, är färgfrisättningsanalysen mer känslig och reproducerbar, vilket ger kvantitativa resultat som tillåter jämförelse mellan färgfrisättningsanalyser av samma eller olika enzymer för ett givet substrat. De två metoderna är lätt utföras i de flesta mikrobiologiska laboratorier utan behov av högt specialiserad instrumentering. I representiva analyser, kontrollenzym, α-chymotrypsin, detekterades vid mängder som är så låga som 100 ng (Figur 5) med användning av det färgämnesfrisättningsanalys, under det att minimal mängd detekteras i mikros diffusion analysen var 1 pg (data ej visade).
Tillhandahålla verktyg som en kvalitativ analys av antimikrobiella enzymer upptäckt, har ett antal varianter av diffusion analysen rapporterats 11,13. Vid granskningen dessa analyser, var mikros diffusion analys utvecklad för sin relativt hög känslighet som en inledande undersökning och för dess enkla reaktions efterlevnad. Modifierad från arbetet av al. Lachica et 11, i vilken agaros överlägg användes för att detektera produktionen av nukleaser av stammar av Staphylococcus aureus, driver mikros diffusionsanalys på liknande sätt som den radiella immundiffusion metoden 14 som proteinet diffunderar från brunnen in i agaros innehållande substratet. Den radiella immunodiffusionen metod stoppar expansionen av det fria immunoprecipitation när systemet når en komplexbildning jämvikt mellan det diffunderande antigen och antikropp inom agarosen. I motsats, är substratet av mikros diffusionsanalys initialt ned av diffunderande proteinantimikrobiella i en ständigt expanderande zon av lys omgivande brunnen. Den ökande diameter zonen fortsätter tills enzymet förlorar aktivitet eller underlaget är uttömd. Hastigheten för produktion av den zon av lys levande som renheten, och därmed den specifika aktiviteten, hos enzymet eller koncentrationen av enzymet till brunnen ökar.
För att kvantitativt utvärdera den enzymatiska aktiviteten av proteinantimikrobiella medel mot värme-dödade B. subtilis, var färgämnet-frisättningsanalys valt. Kolorimetriska analyser som använder Remazol brilliant blue R färgämne (RBB) -märkta substrat tillåter mångsidiga och känslig utvärdering av protein antimikrobiell activity. Enzymatisk hydrolys av RBB-märkt substrat resulterar i frisättning av lösliga blå produkter som enkelt kan mätas genom en spektrofotometer vid 595 nm. Flera varianter av RBB färgfrisättningsanalys, har utvecklats för att karakterisera andra proteinantimikrobiella enzymer, visar flexibiliteten i denna analys för tillämpning med andra substrat. Till exempel i att bedöma effekterna av lysostafin bakteriolytiskt aktivitet, Zhou et al., Rapporterade en färgfrisättningsanalys med användning av RBB-färgade stafylokocker celler och stafylokocker peptidoglykan som substrat 12. I en modifiering av tillämpningen av denna RBB färgämne-frisättningsanalys, var RBB-märkt Micrococcus luteus substrat föreslagits för användning som ett snabbt och känsligt medel för att diagnostisera och skärm för sjukdomar såsom bakteriell infektion och närvaron av ett malignt karcinom, vilket kan korreleras till humana lysozym-expressionsnivåer i blodserum 15. Dessutom, RBB-märkta bakteriecellsubstrat har enLSO använts i ett zymogram metod för detektion av lysozym 16.
Vi visar den sänkta detektionsgränsen, bekvämlighet och reproducerbarhet av färgämnet-frisättningsanalys, vilket möjliggör snabba biblioteksscreening för enzymproduktion. Ändringar av analysen möjliggör nedströms kvantitativa biokemiska karakterisering analyser, inklusive effekter av temperatur, pH och salthalt samt effekterna av andra proteolytiska enzymer på aktiviteten av antimikrobiella proteiner 6. Dessutom kan den kvantitativa analysen färg frisättning användas för att jämföra verksamheten i flera enzymer för ett givet substrat. RBB färgfrisättningsanalys har rapporterat användbarhet för enzymer med aktivitet mot polysackarider förutom karakterisering och detektion av proteinantimikrobiella medel. Pettersson och Eriksson rapporterade en analys för att detektera endoglykanas aktivitet med användning av amorfa, RBB-färgade polysackarid pärlor av cellulosa, xylan, mannan och chiti 17. I en utvidgning av dessa fynd var en känslig metod för detektion av kitinas enzymer som produceras av Bacillus thuringiensis Bt-107 utvecklas med hjälp av kolloidalt kitin märkt med RBB 18. Från dessa och andra studier, har kommersiellt tillgängliga källor av RBB-färgade substrat framkommit för användning vid detektion av glykolytiska aktivitet, inklusive de mot keratin, amylopektin, amylos, glykogen, laminarin, d-xylan, Azo-korn glukan, och stärkelse.
I denna studie visar vi nyttan av färgämnet-frisättningsanalys i en mikroplattformat, att minska volymen av RBB-märkt substrat och enzym som erfordras för att producera den kolorimetriska resultatet. Såsom illustreras i figur 4 och figur 5, ger mikroplattan dye-frisättningsanalys en lägre detekteringsgräns än den mikros diffusionsanalys för enzymatisk aktivitet detektering. När det gäller snabb användning, bevarande av arbetskraft, och enkel tolkning, microslide diffusion analys ger nytta i första hög genomströmning skärmar för närvaron av antimikrobiella aktiviteten liksom indikation på antimikrobiellt protein närvaro i nedströms protein isolerings- och reningssteg. Kombinationen av dessa två analyser kompletterar varandra i den inledande granskningen och slutliga karakterisering av nya proteinantimikrobiella
The authors have nothing to disclose.
This work was funded by The MITRE Corporation through the MITRE Innovation Program (Project 25MSR621-CA). The authors would like to thank Mark Maybury, Ph.D., Richard Games, Ph.D., James Patton, Ellen Mac Garrigle, Ph.D., Carl Picconatto, Ph.D., and Caroline Gary for their support and review of this work.
48-well flat-bottom microplate with low evaporation lid | Becton Dickinson | 3078 | |
96-well flat-bottom microplate (Costar 3595) | Corning, Inc. | 3595 | |
agarose | Fisher Scientific | BP162-100 | |
α-chymotrypsin | MP Biomedicals | 215227205 | |
Bacillus subtilis 168 | American Type Culture Collection | 23857 | |
C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | ||
cork borer | Humboldt | H-9661 | |
lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876-1G | |
McFarland equivalence standard (2.0) | Fisher Scientific | R20412 | |
microslides | Fisher Scientific | 22-38-103 | |
nutrient broth | Fisher Scientific | S25959B | |
peptidoglycan of Bacillus subtilis 168 | Sigma-Aldrich | 69554-10MG-F | |
phosphate-buffered saline (1×) | Teknova | P0200 | |
Pierce BCA Protein Assay Kit | Life Technologies | 23227 | |
Synergy HT microplate spectrophotometer | BioTek Instruments, Inc. | ||
Remazol brilliant blue R dye (RBB) | Sigma-Aldrich | R8001 | |
Salmonella enterica subsp. enterica | American Type Culture Collection | 10708 | |
sodium azide | Fisher Scientific | S227-100 | |
sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | S318-500 | |
Titer Tops pre-cut adhesive polyethylene film | Diversified Biotechnology | T-TOPS-50 | |
UltraPure distilled water | Invitrogen | 10977-015 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Solution | |||
agarose solution 50 ml PBS 0.25 g agarose |
Add 10% sodium azide to the molten PBS/agarose solution | ||
nutrient broth medium 4 g nutrient broth 500 ml Type I water |
|||
250mM sodium hydroxide (NaOH) solution 1 g NaOH 99 ml Type I water |
|||
200mM Remazol brilliant blue R dye (RBB) 1.25 g RBB 98.75 ml 250 mM NaOH solution |