Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Kvalitative og kvantitative analyser for påvisning og karakterisering av Protein antimicrobials

doi: 10.3791/53819 Published: April 10, 2016

Protocol

1. Utarbeidelse av Bakteriell og peptidoglykan Underlag

Merk: Hele cellebakterie substrater og rensede peptidoglykaner brukes som enzymsubstrater, både i microslide diffusjon analysen og fargestoffet-frigjøringsanalyse. Disse underlag krever forberedelse før gjennomføringen av enzymreaksjoner. Den følgende protokollen beskriver deres fremstilling.

  1. Hele Bakteriell Cell Substrat
    1. Fremstille bakteriecelle substrat ved å inokulere 500 ml næringsbuljong med en 2 ml over natten kultur av Bacillus subtilis 168 (American Type Culture Collection, ATCC 23857). Inkuber ved 30 ° C med risting (125 rpm) helt til kulturen når en eksponensiell vekstfase, definert som en rask vekstfase resulterer i dobling av bakteriekultur. For dyrking av Salmonella enterica subsp. Ente (ATCC 10708) ved hjelp av næringsbuljong som et vekstmedium ved 37 ° C med risting (125 rpm). Varme drepe hver kultur ved autoklavering i 10 minutter ved 121 ° C under 3 atm trykk.
    2. Høste varme-drepte bakterie substrat ved sentrifugering i 20 minutter ved 5000 x g. Vask pelleten med tre ganger Type 1 vann og re-suspendere i en minimal mengde vann. I denne studien, suspendere underlag i 1200 mL.
    3. Alikvoter 300 ul av den bakterielle celle substratene til 1,5 ml mikrofugerør og oppbevar ved 20 ° C.
  2. Renset peptidoglykan Substrat
    1. Rens peptidoglykan fra målet underlaget bakterien 7-10 eller kjøpe fra en leverandør (se Materialer og utstyr tabell). Rens rå peptidoglykan preparater fra tilbehørscellevegg polymerer.

2. Kvalitativ Microslide Diffusion analysen [Endret fra Lachica, et al. 11]

Merk: microslide diffusjon analysen eren kvalitativ metode for påvisning av nærvær av antimikrobielle enzym i en prøve. Som enzym diffunderer gjennom en agarose-matriks inneholdende substrat, en sone av rengjøring utvikles som enzymet hydrolyserer substratet. Følgende protokoll beskriver fremstillingen og ytelsen til microslide diffusjon assay for kvalitativ påvisning av nærvær av protein antimikrobielle midler.

  1. Bestemme konsentrasjonen av det antimikrobielle enzymet som skal evalueres ved hjelp av en Bicinchoninic Acid (BCA) Protein Assay Kit ifølge produsentens protokoll.
  2. Utnytte fosfat-bufret saltvann (PBS) som et enzym buffer; imidlertid empirisk å bestemme den passende buffer for den gitte enzymet.
  3. Utføre en seriell fortynning av den antimikrobielle enzymet ved hjelp av fosfat-bufret saltvann (PBS) som en reaksjonsbuffer. Den seriefortynning ble anvendt i disse analysene microslide diffusjon produsert endelige assay protein masser av 0 pg, 10 pg, 100 pg, 1 ng, 10 ng, 100 ng, 1 ug, og ett0 mikrogram per reaksjon volum.
  4. Tilsett protein massene til individuelle mikrofugerør og justere protein volumer til 20 ul hjelp PBS i forberedelse for tillegg til microslide reaksjonsbrønnene.
  5. Foreta en 0,5% agarose-oppløsning ved å oppløse 0,25 g agarose i 50 ml PBS. Oppvarm løsningen til å koke inntil agarose er fullstendig oppløst. Bestemme vann tapt under smelteprosessen av vekt og legger tilbake til oppløsningen.
  6. Tilsett 50 ul 10% natriumazid i vann til agarose oppløsningen og regulere temperaturen av oppløsningen til 50 ° C i et vannbad. Den natriumazid ble tilsatt for å hemme forurensende bakterievekst under inkubasjon av microslide diffusjon analysen. Hvis levedyktige celler blir anvendt som substrat, utelate natriumazid fra agarosen oppløsningen.
  7. Tine den varme-drepte bakterie substrat på is.
  8. Re-suspendere den bakterielle substratet i 12 ml agarose oppløsningen til omtrent sams turbiditeten av en 2,0 mcfArland ekvivalens standard (se Materialer tabell). Sammenligne turbidities av løsningene ved å visualisere en sort linje på en hvit bakgrunn gjennom oppløsningene, og legger bakteriell substrat til agarose inntil den omtrentlige turbiditet er oppnådd.
  9. Umiddelbart pipettér 3 ml av agarose-substrat-løsning til hver microslide (25 x 75 x 1 mm 3).
  10. Etter lysbilder stivne, punch tre brønner i agarose-substrat lag av hver microslide bruker en kork borer (4,8 mm diameter). Tilsett 20 ul av hver justerte protein seriefortynning til de respektive brønner.
  11. Bruke PBS (20 pl) eller bovint serumalbumin (5 ug i 20 ul PBS) i en negativ kontrollbrønn. Bruke kjente bacteriolytic enzymer som er egnet for substratet, som for eksempel lysozym, som en positiv kontroll.
  12. Inkuber objektglasset i et fuktighetskammer ved 37 ° C, eller den optimale aktiviteten temperatur av enzymet. Lengden av inkubasjon avhenger av konsentrasjonen ogspesifikk aktivitet av den antimikrobielle enzymet. En typisk reaksjonstid er over natten (ca. 16 timer).
  13. Etter inkubasjon observere lysbildene henhold indirekte lys og ta bilder av den tredje analysen bruker et digitalt speilreflekskamera med en 60 mm linse på en brennvidde på ca 30 cm.
    Merk: Enzymatisk aktivitet av proteinet antimikrobielle for det gitte substrat er korrelert med utviklingen av en klar sone av hydrolyse, som danner seg rundt brønnen som enzymet diffunderer inn i agarosen.
  14. For å kvalifisere enzymatisk aktivitet, observere størrelsen på sonene som danner rundt hver brønn. Høy enzymatisk aktivitet kvalitativt angår en større sone, mens lav enzymatisk aktivitet kvalitativt angår en mindre sone.

3. Underlag Merking - Remazol Brilliant Blue R Dye merking [Endret fra Zhou 12]

Merk: I dye-release assay, er underlaget kovalent Linked å Remazol strålende blå R fargestoff. Følgende protokoll beskriver fremstilling av farget enzymsubstrater.

  1. Lage en 250 mM natriumhydroksid (NaOH) oppløsning ved oppløsning av 1 g NaOH i 99 ml av type I vann som skal brukes til å lage en 200 mM Remazol Brilliant Blue R fargestoff (RBB) løsning.
  2. Lage en 200 mM RBB oppløsning ved å oppløse 1,25 g RBB i 98,75 ml ± 1 ml av en frisk 250 mM NaOH-oppløsning (trinn 3.1).
  3. Re-suspen varme-drepte bakterieceller i en konsentrasjon på 0,5 g våtvekt i 30 ml RBB oppløsning. For renset peptidoglykan, re-suspendere peptidoglykan i en konsentrasjon på 0,3 g våtvekt i 30 ml RBB oppløsning.
  4. Inkuber reaksjonsblandingen i en Erlenmeyer-kolbe på en roterende plattform i 6 timer ved 37 ° C med forsiktig blanding.
  5. Overfør reaksjonsblandingen til en 4 ° C inkubator og inkuberes i ytterligere 12 timer med forsiktig omrøring.
  6. Etter inkubasjon høste farget substrat ved sentrifugering ved 3000 xgi 30 minutter. Dekanter fargestoff løsning fra substratet pellet.
  7. Fjerne ikke-kovalent bundet løselige fargestoff fra substratene ved vasking av fargestoffmerkede celler eller peptidoglykan gjentatte ganger (ca. 3-5 vaskinger) med type I vann etterfulgt av sentrifugering. Med hver vann tillegg re-suspendere pellet grundig.
    Merk: Når ubundet, løselig fargestoff er ikke lenger synlig i vannet vask etter sentrifugering. Substratet bør gis en ytterligere vask. Legg merke til at substratet vil forbli blått, mens supernatanten av den siste vaskingen vil være klart.
  8. Oppbevar farget substrater suspendert i en minimal mengde av vann ved -20 ° C for senere bruk.

4. Kvantitativ Dye-release-analyse

Merk: I løpet av fargestoff-frigjøringsanalyse, hydrolyse av RBB-farget substrat i den enzymatiske reaksjonen frigjør farget produkt i reaksjons supernatanten. Kolorimetrisk måling av mengden av fargestoff frigitt indikerer amount av enzymatisk aktivitet til stede i prøven for et gitt enzym. Den kvantitative metoden tillater sammenligning av forskjellige enzymer på tvers av substrater og gir mulighet for variasjon av miljøforhold som påvirker den enzymatiske reaksjon (for eksempel temperatur, saltholdighet, og pH). Følgende protokoll beskriver fremstillingen og ytelsen av fargestoffet-release assay for kvantitativt å detektere den enzymatiske aktiviteten til protein antimikrobielle midler.

  1. Forberedelse til Dye-release-analyse
    1. Tillat den frosne fargede substratet for å vende tilbake til romtemperatur og vaskes to ganger med analysebuffer (PBS), som er empirisk bestemt for en gitt enzym.
    2. Beregn volum av substrat suspensjon som er nødvendig ved å multiplisere den 200 pl reaksjonsvolum ved antall fargestoff frigivelse analyser som skal utføres.
    3. Forberede substratet suspensjonen ved tilsetning av farget substrat til volumet av analysebufferen, bestemt i 4.1.2, inntil en optisk tetthet (OD) på 2,0 er oppnådd ved 595 nm ved hjelp av et spektrofotometer. For å holde seg innenfor de funksjonelle begrensningene av spektrofotometeret, måle 2,0 OD 595 som 1,0 for en 1: 1 fortynning av den konsentrerte oppløsning. Bruk analysebuffer som en blank.
      Merk: Underlaget turbiditet for reaksjonen kan heves utover 2.0 for å matche aktivitetsnivået av høyeffektive enzymer.
    4. Suspendere proteinet antimikrobielle som skal evalueres i analysebuffer til en estimert konsentrasjon på 1 mg / ml.
    5. Ved hjelp av mikro analyse av en BCA Protein Assay Kit ifølge produsentens protokoll, bestemme den virkelige konsentrasjonen av proteinprøven som skal bli analysert. Juster konsentrasjonen av massesuspensjonen til 1 mg / ml ved bruk av analysebuffer.
  2. Bruke Dye-release-analyse for å finne den optimale Inkuberingsbetingelsene for et protein antimikrobiell
    1. Fortynn aksjen protein antimikrobielle suspensjon til 100 ng / mL. Denne konsentrasjonen gir afginalen reaksjonsmassen på 1 ug protein per volum (10 ul) tilsettes til analysereaksjon.
    2. Bestem varmeområdet skal vurderes for bacteriolytic protein. Den termiske varierer i disse analysene tatt med 5 ° C, 15 ° C, 25 ° C, 35 ° C, 45 ° C, 55 ° C, og 65 ° C.
    3. Utføre reaksjonen assays i 0,5 ml mikrofugerør. For hver termisk tilstand, tilsett 10 mL av aksje protein til 200 ul forberedt underlaget suspensjon.
    4. Inkuber i en termosykler i 8 timer under omrøring ved inversjon gang i timen.
    5. Etter inkubering, arrestere reaksjonene ved tilsetning av 25 ul av etanol.
    6. Fjerne ufordøyd, uoppløselig substrat ved sentrifugering ved 3000 x g i 2 min, og overfør 150 pl av reaksjons supernatanten til hver reaksjonsblanding til en 96-brønns flatbunnet mikroplate, tar seg ikke å forstyrre pelleten av ufordøyd substrat.
    7. Måle enzymatisk aktivitet i proteinet AntimicrobIal for det gitte substrat ved å bestemme mengden av løselige RBB fargestoff dissosiert fra substratet etter enzymatisk hydrolyse. For å kvantifisere den enzymatiske aktiviteten, måle absorbansen av supernatanten ved 595 nm ved anvendelse av en mikroplate-spektrofotometer. Økt absorbans av den løselige fargestoff frigjøres i supernatanten fra den merkede substratet er en kvantitativ måling av enzymatisk aktivitet.
      Merk: Endringen i absorbans er representert ved aktivitetsenheter (AU), hvor AU 1 resulterer i en 0,01 økning i den optiske tetthet av fargestoff-release reaksjon supernatanten ved 595 nm. En tom reaksjon, inkubert med alle reaksjonskomponentene bortsett fra enzymet, blir brukt til å trekke ethvert fargestoff som frigjør fra RBB-merkede substrat på grunn av inkubering. Den optimale enzymatiske temperatur gir toppmålingen aktivitet enhet.
    8. Gjenta trinn 4.2.1 via 4.2.7 ved hjelp av ulike ruge buffere, for å bestemme de optimale bufferbetingelsene for den antimikrobielle enzymet. i these analyser, bruke PBS.
  3. Bruke Dye-release analyse for å bestemme Minimal Active Konsentrasjon på Optimal Inkubasjon Temperatur for et protein antimikrobiell
    1. Utfør en seriell fortynning av bestanden antimikrobielle protein suspensjonen med analysebuffer. Den fortynningsserie rekkevidde avhenger av aktiviteten av den antimikrobielle enzymet. Den seriefortynning ble anvendt i disse analysene produsert endelige assay proteinmengder 0 pg, 10 pg, 100 pg, 1 ng, 10 ng, 100 ng, 1 ug og 10 ug.
    2. Utfør hver reaksjon analyse i en 48-brønns flatbunnet mikro. For hver analyse tilstand, tilsett 10 ul av de respektive proteinsuspensjonen til 200 ul skapt substrat suspensjon. Juster enhver variasjon i volumet av proteinoppløsning tilsatt til reaksjonsblandingen til 10 pl ved bruk av reaksjonsbuffer.
    3. Tett mikroplate med platen tettende film for å unngå volumvariasjon på grunn av fordampning. Inkuber i en shaker inkubator ved den bestemte optimal icubation temperatur for gitt protein antimikrobielle for 16 timer med risting.
    4. Etter inkubering stanse reaksjonen ved å tilsette 25 ul av etanol til hver brønn og fjerne ufordøyd substrat ved sentrifugering ved 3000 x g i 2 min.
    5. Overfør 150 ul av reaksjons supernatanten til hver reaksjonsblanding til en 96-brønns flatbunnet mikroplate, tar seg ikke å forstyrre pelleten av ufordøyd substratet.
    6. For å kvantifisere den enzymatiske aktiviteten, måle absorbansen av supernatanten ved 595 nm ved anvendelse av en mikroplate-spektrofotometer. En tom reaksjon, inkubert med alle reaksjonskomponentene bortsett fra enzymet, blir brukt til å trekke ethvert fargestoff som frigjør fra RBB-merkede substrat på grunn av inkubering. Økt absorbans av den løselige fargestoff frigjøres i supernatanten fra den merkede substratet gir et kvantitativt mål for enzymatisk aktivitet.
      Merk: Endring i absorbans er representert med aktivitet enheter (AU), der 1 AU resultater ien 0,01 økning i den optiske tetthet av fargestoff-release reaksjon supernatanten ved 595 nm.

Representative Results

Den microslide diffusjon analysen og den kvantitative dye-release assay er effektive metoder for screening og måling innledende undersøkelser av nye protein antimikrobielle midler. Hver analyse har fordeler og begrensninger; imidlertid, når utført i sammenheng, de tillater rask innledende screening og grunnleggende karakterisering av en antimikrobiell.

Den microslide diffusjon analysen gjør det mulig effektivt for hurtig screening av mikrobielle biblioteker, produsere protein antimikrobielle midler. Når enzymkonsentrasjonsnivåer er av interesse, kan sensitiviteten til deteksjon begrensninger begrenser analysen, noe som krever en større mengde enzym som skal tilsettes til reaksjons vel enn den fargestoff-frigjøringsanalyse. Som illustrert i figur 1, de kvalitative egenskapene til analysen tillater observatøren å sammenligne relative mengder enzym som er tilstede i hver brønn.

figur 1A (25 mikrogram enzym), viser den fremre kant av sonen grumset eller ufullstendig lysering av substratet, mens den sone som ligger nærmest brønn viser en mer komplett substrat lyse. Dette fenomen, et produkt av den synkende konsentrasjon av det diffuserende enzym ved forkanten, vanskeliggjør nøyaktig måling av sonen diameter. Etter hvert som brønner B (15 pg), C (10 ug), D (5 ug), E (1,0 ug), og F (0,1 ug) er observert i figur 1, diameteren av sonen av fullstendig lysering forsvinner til utryddelse korrelere til den reduserte mengden av enzym. For betingelse F (0,1 ug), er den enzymkonsentrasjon innenfor agarosen under grensen som vil tillate det diffuserende enzym for å bli visualisert som den beveger seg gjennom agarose, hydrolysering av substratet. Den microslide diffusjon analysen ble også kjøres ved hjelp rensede Bacillus subtilis peptidoglycan som substrat (figur 2). Mens sonen er mindre definert enn de som ble observert med hele celler av Salmonella enterica grunn av motvilje av peptidoglycan å suspendere jevnt i agarose, er hydrolysen av peptidoglycan ved den ukjente antimikrobielle enzymet tydelig.

Fargestoffet-release-analysen er en mer følsom og allsidig assay enn microslide diffusjon assay, slik at en nedre deteksjonsgrense og variasjon av miljøfaktorer som påvirker enzymreaksjonen. I de representative analyser, ble temperaturen variert for å bestemme den optimale temperatur for det antimikrobielle enzym, bestemt til å være 35 ° C i PBS (figur 3). Denne optimale sees tydelig i reaksjons supernatantene som økte mengder av blå farge (figur 3B), så vel som representert i aktivitetsenheter avledet fra absorbansmålinger ved 595 nm (figur 3A). DeAllsidigheten av fargestoff-release-analysen tillater forskeren til å variere ikke bare temperaturen, men også i reaksjonsbufferen og bufferkomponenter for raskt å bestemme optimale inkuberingsbetingelser for et gitt enzym.

Aktivitetsnivået for den ukjente antimikrobiell enzym (figur 4) og den α-chymotrypsin kontroll enzym (figur 5) ble målt ved det bestemmes optimale inkubasjonstemperatur på 35 ° C i PBS mot RBB-merket Bacillus subtilis varme-drepte substrat. Sammenligning av resultater fra Figur 4 og Figur 5 viser at den antimikrobielle ukjente enzym har nesten dobbelt så stor affinitet for B. subtilis underlaget. I tillegg gjorde den α-chymotrypsin kontrollen ikke helt fordøye den varme drept B. subtilis substrat inne i brønnen (data ikke vist). Aktiviteten av α-chymotrypsin kontroll begynner til platenau rundt 0,3 mikrogram sammenlignet med fortsatt økning i aktivitetsenheter på tvers av alle enzym beløp for det ukjente antimikrobielle enzym (Figur 4 og Figur 5). Dette kan tyde på at den ukjente enzym har en større vedvarende aktivitet, eller at det er et større antall spaltningssetene er tilgjengelig for enzymet i B. subtilis underlaget.

Figur 1
Fig. 1: enzymaktiviteten mot Salmonella enterica Whole Cell Substrat Den microslide diffusjons-analysen ble anvendt for å kvalitativt å evaluere aktiviteten til et ukjent protein antimikrobiell mot varme-drepte Salmonella enterica subsp ente (ATCC 10708).. Protein masser av den ukjente antimikrobielle suspenderes i fosfat-bufret saltvann (PBS) som ble tilsatt til de respektive brønnerlysbildene inkluderte 25 ug (vel A), 15 ug (vel B), 10 pg (brønn C), 5 ug (vel D), 1 mikrogram (vel E), og 0,1 ug (vel F). PBS alene ble brukt for de negative kontroller av analysene. Soner av lysis ble fotografert etter en 6 timers inkubasjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Fig. 2: enzymaktiviteten mot Bacillus subtilis peptidoglykan Cell Wall Den microslide diffusjons-analysen ble anvendt for å kvalitativt å evaluere aktiviteten til et ukjent protein antimikrobiell mot peptidoglykan av Bacillus subtilis 168. Suspendert i 20 pl PBS, 10 ug av det ukjente antimikrobielle ble tilsatt til godt A i microslides. PBS alene ble anvendt som en negativkontroll for analysen (vel B). Sonen av lyse ble fotografert etter en 6-timers inkubasjon ved 37 ° C. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Fig. 3: Optimal reaksjonstemperatur for et protein antimikrobiell Allsidigheten av fargestoff-release assay tillater variasjon av fysikalske og kjemiske parametre, så som inkubasjonstemperaturer og buffere, for å bestemme deres innflytelse på aktiviteten av enzymet av interesse 6. Som vist i denne figuren, ble aktiviteten av det ukjente protein antimikrobiell (1 pg) evaluert i PBS mot RBB-merkede varme-drepte Bacillus subtilis under en rekke rugetemperaturer. Vist som aktivitetsenheter (AU) i (A), absorbansen RBB-bound produktene slippes ut i supernatanten etter hydrolyse ble målt ved 595 nm ved anvendelse av en mikroplate-spektrofotometer. Ved hver temperatur tilstand, ble reaksjoner uten enzym tilsatt som brukes til å trekke virkningene av eventuelle utgitt fargestoff som et resultat av inkubering ved forskjellige temperaturer. Reaksjons Supernatantene tilsvarer hver inkubasjon temperatur ble fotografert før absorbans måling (B). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Fig. 4: Aktivitet området for en Protein Antimikrobiell Aktivitetsområdet for den ukjente protein antimikrobielle ble målt som aktivitetsenheter etter over natten inkubering for 0, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 og 1000 ng , målt ved BCA protein assay (A). For disse reaksjonene, RBB-merket B. subtilis substrat nivå ble øket for å gi en optisk tetthet på 5,0 ved 595 nm for å sikre at reaksjonen med den største mengden av enzym (1,000 ng) ikke helt hydrolyserer alle tilgjengelige substrat i reaksjons inkubasjonsperioden. Kontrollreaksjoner uten enzym tilsatt ble anvendt for å subtrahere virkningene av eventuelle utgitt fargestoff forårsaket av inkubasjon alene. Reaksjons Supernatantene tilsvarer hvert enzym beløpet ble fotografert før absorbansmålinger (B). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5
Fig. 5: Aktivitetsområde for α-Chymotrypsin Aktiviteten området for α-chymotrypsin ble målt som Activity enheter etter over natten inkubering for 0, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 og 1000 ng enzym (A). For disse reaksjonene, RBB-merket B. subtilis substrat nivå ble øket for å gi en optisk tetthet på 5,0 ved 595 nm for å sikre at reaksjonen med den største mengden av enzym (1,000 ng) ikke helt hydrolyserer alle tilgjengelige substrat i reaksjons inkubasjonsperioden. Kontrollreaksjoner uten enzym tilsatt ble anvendt for å subtrahere virkningene av eventuelle utgitt fargestoff forårsaket av inkubasjon alene. Reaksjons Supernatantene tilsvarer hvert enzym beløpet ble fotografert før absorbansmålinger (B). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Den microslide diffusjon analysen og dye-release assay gi fordeler for å påvise og karakterisere tidligere uidentifiserte protein antimikrobielle midler. Disse raske og følsomme metoder tillate high-throughput screening av organisme kilde biblioteker for identifisering av enzymer av interesse før du investerer større forskningsressurser. Som høy profil målenzymer er identifisert, kan varianter av påvisningsanalysen benyttes til å raskt detektere enzymet eller for å bestemme biokjemiske egenskaper ved enzymet. For eksempel under en flertrinns proteinrensing ordningen, microslide diffusjon analysen raskt kan påvise Fraksjonene inneholdende enzymet av interesse. I tillegg kan reaksjonen optima for enzymet bestemmes ved å endre reaksjonsbuffere og inkubasjonstemperaturer i fargebad-frigjøringsanalyse.

Utvalget av enzymet masse som kreves for deteksjon i microslide diffusjon analysen er en funksjon av enzym karakteristiske gjestgpinner. Deteksjons begrensninger av analysen krever generelt anvendelse av høyere mengder av enzymet enn fargestoffet-frigjøringsanalyse. I denne studien ble sammenlignet med påvisningsgrensene for den microslide diffusjon analysen (figur 1) til den fargestoff-frigjøringsanalyse (figur 4) viste at microslide diffusjon analysen er en mindre følsom teknikk enn den fargestoff-frigjøringsanalyse. Når enzymkonsentrasjon er ikke et problem, tillater microslide analysen for hurtig innledende screening av bibliotekene for produksjon av protein antimikrobielle midler mot mål-substrater med lave arbeids og utstyrsbehov. Selv om det krever mer arbeid og utstyr, er det fargestoff-release-analysen mer følsom og reproduserbar og man oppnådde kvantitative resultater som tillater sammenligning av fargestoff-frigjøringsanalyser av de samme eller forskjellige enzymer for et gitt substrat. De to metodene er lett utføres i de fleste mikrobiologiske laboratorier uten behov for høyt spesialisert instrumentering. I representative analyser, kontroll enzymet, α-chymotrypsin, ble påvist ved mengder så lave som 100 ng (figur 5) ved hjelp av farvestoff-frigjøringsanalyse, mens den minimale mengden påvist i microslide diffusjonen analysen var 1 ug (data ikke vist).

Gir verktøyet som en kvalitativ påvisning analysen for antimikrobielle enzymer, har en rekke varianter av diffusjon analysen er rapportert 11,13. I går gjennom disse analysene ble microslide diffusjon analyse utviklet for sin relativt høy følsomhet som en innledende skjerm og for enkelt reaksjon ritualer. Modifisert fra arbeidet til al. Lachica et 11, hvori agarose-overleggene ble anvendt for å detektere produksjon av nukleaser av stammer av Staphylococcus aureus, driver microslide diffusjon analyse på samme måte som den radielle immunodiffusjon metode 14 som proteinet diffunderer fra brønnen inn i det agarose inneholdende substratet. Radial immunodiffusion fremgangsmåte stopper utvidelse av sonen av immunoutfelling når systemet har nådd en kompleks-dannelse likevekt mellom det diffuserende antigen og antistoff i agarose. I motsetning til dette er substratet av den microslide diffusjon analysen innledningsvis spaltet av det diffuserende protein antimikrobielle i en stadig voksende sone av lysering som omgir brønnen. Den økende diameter av sonen fortsetter til enzymet taper aktivitet eller substratet er oppbrukt. Hastigheten for fremstilling av sonen av lysis blir vakt som renhet, og således den spesifikke aktiviteten av enzymet eller konsentrasjonen av enzymet tilsatt til brønnen øker.

For kvantitativt å vurdere den enzymatiske aktiviteten til protein antimikrobielle midler mot varme-drepte B. subtilis, fargestoff-frigjøringsanalyse ble valgt. Kolorimetriske analyser ved hjelp Remazol strålende blå R fargestoff (RBB) -merket underlag tillate allsidig og følsom evaluering av protein antimikrobielle aktivitety. Enzymatisk hydrolyse av RBB-merkede substrat resulterer i utslipp av oppløselige blå produkter som lett kan måles med et spektrofotometer ved 595 nm. Flere variasjoner av RBB fargestoff-release-analysen, som er utviklet for å karakterisere andre protein antimikrobielle enzymer, viser fleksibiliteten av denne analysen for anvendelse med andre substrater. For eksempel, for å bestemme virkningen av lysostafin bakteriolytiske aktivitet, Zhou et al., Rapporterte et farvestoff-frigjøringsanalyse ved hjelp av RBB-farget stafylokokk-celler og stafylokokk-peptidoglykan som substrater 12. I en modifikasjon av anvendelsen av denne RBB fargestoff-frigivelse analysen ble RBB-merket Micrococcus luteus substrat foreslått for anvendelse som en hurtig og følsomme metoder for å diagnostisere og skjerm for sykdommer som bakteriell infeksjon, og nærværet av en ondartet karsinom, som kan være korrelert til humane lysozym ekspresjonsnivåer i blodserum 15. I tillegg RBB-merkede bakterielle celle substrater ha enLSO vært brukt i en zymogram fremgangsmåte for påvisning av lysozym 16.

Vi viser den senkede deteksjonsgrensen, bekvemmelighet og reproduserbarhet av fargestoffet-release-analysen, noe som muliggjør hurtig screening av bibliotek for enzymproduksjonen. Modifikasjoner av analysen gir mulighet for nedstrøms kvantitative biokjemiske karakterisering analyser, herunder virkningen av temperatur, pH, salinitet og i tillegg til effekten av andre proteolytiske enzymer på aktiviteten av antimikrobielle proteiner 6. I tillegg kan den kvantitative farvestoff-frigivelse assay brukes til å sammenligne aktivitetene til flere enzymer for et gitt substrat. RBB fargestoff-frigjøringsanalyse har rapportert verktøy for enzymer med aktivitet mot polysakkarider i tillegg til karakterisering og påvisning av protein antimikrobielle midler. Pettersson og Eriksson rapporterte en analyse for å detektere endoglycanase aktivitet ved anvendelse av amorfe, RBB-farget polysakkarid kuler av cellulose, xylan, mannan, og chiti 17. I en utvidelse av disse resultater, ble en følsom fremgangsmåte for påvisning av kitinase-enzymer som produseres av Bacillus thuringiensis Bt-107 utviklet ved bruk av kolloidalt kitin som er merket med RBB 18. Fra disse og andre studier, har kommersielt tilgjengelige kilder til RBB-farget underlag dukket opp for bruk i påvisning av glycolytic aktivitet, inkludert de mot keratin, amylopektin, amylose, glykogen, Laminarin, d-xylan, Azo-bygg glukan, og stivelse.

I denne studien viser vi nytten av fargestoff-frigjøringsanalyse i en mikroplateformat, å redusere volumet av RBB-merket substrat og enzym som er nødvendig for å produsere den kolorimetriske resultat. Som illustrert i Figur 4 og Figur 5, gir mikro fargestoff-release-analysen en lavere påvisningsgrense enn den microslide diffusjon assay for enzymatisk aktivitet detektering. Med hensyn til rask bruk, bevaring av arbeidskraft, og enkel tolkning, microslide diffusjon analysen gir verktøyet i innledende high-throughput skjermer for tilstedeværelse av antimikrobiell aktivitet, så vel som indikasjon på antimikrobiologisk protein til stede i nedstrøms protein isolerings- og rensetrinn. Kombinasjonen av disse to analyser utfyller hverandre i den innledende screening og endelig karakterisering av nye antimikrobielle midler protein

Disclosures

Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser. Mitre Corporation er en ikke-for-profit selskap som driver flere statlig finansiert forskning og utvikling (FFRDCs).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
48-well flat-bottom microplate with low evaporation lid Becton Dickinson 3078
96-well flat-bottom microplate (Costar 3595) Corning, Inc. 3595
agarose Fisher Scientific BP162-100
α-chymotrypsin MP Biomedicals 215227205
Bacillus subtilis 168 American Type Culture Collection 23857
C1000 Touch Thermal Cycler Bio-Rad
cork borer Humboldt H-9661
lysozyme Sigma-Aldrich L6876-1G
McFarland equivalence standard (2.0) Fisher Scientific R20412
microslides Fisher Scientific 22-38-103
nutrient broth Fisher Scientific S25959B
peptidoglycan of Bacillus subtilis 168 Sigma-Aldrich 69554-10MG-F
phosphate-buffered saline (1x) Teknova P0200
Pierce BCA Protein Assay Kit Life Technologies 23227
Synergy HT microplate spectrophotometer BioTek Instruments, Inc.
Remazol brilliant blue R dye (RBB) Sigma-Aldrich R8001
Salmonella enterica subsp. enterica American Type Culture Collection 10708
sodium azide Fisher Scientific S227-100
sodium hydroxide (NaOH) Fisher Scientific S318-500
Titer Tops pre-cut adhesive polyethylene film Diversified Biotechnology T-TOPS-50
UltraPure distilled water Invitrogen 10977-015
Name Company Catalog Number Comments
Solution
agarose solution
50 ml PBS
0.25 g agarose
Add 10% sodium azide to the molten PBS/agarose solution
nutrient broth medium
4 g nutrient broth
500 ml Type I water
250 mM sodium hydroxide (NaOH) solution
1 g NaOH
99 ml Type I water
200 mM Remazol brilliant blue R dye (RBB)
1.25 g RBB
98.75 ml 250 mM NaOH solution

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Anand, T. P., et al. Antimicrobial activity of marine bacteria associated with sponges from the waters off the coast of South East India. Microbiol Res. 161, 252-262 (2006).
  2. Tagg, J. R., Dajani, A. S., Wannamaker, L. W. Bacteriocins of gram-positive bacteria. Bacteriol Rev. 40, 722-756 (1976).
  3. Hibbing, M. E., Fuqua, C., Parsek, M. R., Peterson, S. B. Bacterial competition: surviving and thriving in the microbial jungle. Nat Rev Microbiol. 8, 15-25 (2010).
  4. Riley, M. A., Gordon, D. M. The ecological role of bacteriocins in bacterial competition. Trends Microbiol. 7, 129-133 (1999).
  5. Tenover, F. C. Mechanisms of antimicrobial resistance in bacteria. Am J Med. 119, S3-S10 (2006).
  6. Farris, M. H., Steinberg, A. D. Mitrecin A, an endolysin-like bacteriolytic enzyme from a newly isolated soil streptomycete. Lett Appl Microbiol. 58, 493-502 (2014).
  7. Dehart, H. P., Heath, H. E., Heath, L. S., Leblanc, P. A., Sloan, G. L. The Lysostaphin Endopeptidase Resistance Gene (epr) Specifies Modification of Peptidoglycan Cross Bridges in Staphylococcus simulans and Staphylococcus aureus. Appl Environ Microbiol. 61, 2811 (1995).
  8. Srivastava, K. K., Siddique, I. H. Quantitative chemical composition of peptidoglycan of Listeria monocytogenes. Infect Immun. 7, 700-703 (1973).
  9. Heilmann, H. D. On the peptidoglycan of the cell walls of Pseudomonas aeruginosa. Eur J Biochem. 31, 456-463 (1972).
  10. Schumann, P. Taxonomy of Prokaryotes. Rainey, F., Oren, A. 38, Academic Press. (2011).
  11. Lachica, R. V., Genigeorgis, C., Hoeprich, P. D. Metachromatic agar-diffusion methods for detecting staphylococcal nuclease activity. Appl Microbiol. 21, 585-587 (1971).
  12. Zhou, R., Chen, S., Recsei, P. A dye release assay for determination of lysostaphin activity. Anal Biochem. 171, 141-144 (1988).
  13. Osserman, E. F., Lawlor, D. P. Serum and urinary lysozyme (muramidase) in monocytic and monomyelocytic leukemia. J Exp Med. 124, 921-952 (1966).
  14. Mancini, G., Carbonara, A. O., Heremans, J. F. Immunochemical quantitation of antigens by single radial immunodiffusion. Immunochemistry. 2, 235-254 (1965).
  15. Ito, Y., Yamada, H., Imoto, T. Colorimetric assay for lysozyme using Micrococcus luteus labeled with a blue dye, Remazol brilliant blue R, as a substrate. Chem Pharm Bull. (Tokyo). 40, 1523-1526 (1992).
  16. Hardt, M., Guo, Y., Henderson, G., Laine, R. A. Zymogram with Remazol brilliant blue-labeled Micrococcus lysodeikticus cells for the detection of lysozymes: example of a new lysozyme activity in Formosan termite defense secretions. Anal Biochem. 312, 73-76 (2003).
  17. Pettersson, B., Eriksson, K. E. A standardized spectrophotometric assay of endoglycanase activities using dyed, amorphous polysaccharides. Anal Biochem. 285, 220-224 (2000).
  18. Gomez Ramirez, M., Rojas Avelizapa, L. I., Rojas Avelizapa, N. G., Cruz Camarillo, R. Colloidal chitin stained with Remazol Brilliant Blue R, a useful substrate to select chitinolytic microorganisms and to evaluate chitinases. J Microbiol Methods. 56, 213-219 (2004).
Kvalitative og kvantitative analyser for påvisning og karakterisering av Protein antimicrobials
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Farris, M. H., Ford, K. A., Doyle, R. C. Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials. J. Vis. Exp. (110), e53819, doi:10.3791/53819 (2016).More

Farris, M. H., Ford, K. A., Doyle, R. C. Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials. J. Vis. Exp. (110), e53819, doi:10.3791/53819 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter