Here, we present protocols to rapidly screen and characterize enzymes for antimicrobial activity. The microslide diffusion assay and the dye-release assay utilize target bacterial substrates for qualitative and quantitative enzymatic activity evaluation.
Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods to screen for target enzymes prior to investing greater research effort and resources. The goal of this protocol is to demonstrate two complementary assays for conducting these initial evaluations. The microslide diffusion assay provides an initial or simple detection screen to enable the qualitative and rapid assessment of proteolytic activity against an array of both viable and heat-killed bacterial target substrates. As a counterpart, the increased sensitivity and reproducibility of the dye-release assay provides a quantitative platform for evaluating and comparing environmental influences affecting the hydrolytic activity of protein antimicrobials. The ability to label specific heat-killed cell culture substrates with Remazol brilliant blue R dye expands this capability to tailor the dye-release assay to characterize enzymatic activity of interest.
Antimicrobial agents play an essential role in targeting a wide range of microorganisms such as viruses, fungi, and bacteria. The antimicrobial activities produced by various bacteria range in target specificity from broad-spectrum to species-specific, including clinically relevant bacterial pathogens 1. In nature, protein antimicrobial compounds like bacteriocins and lysins represent a microbial arsenal of tools for self-defense, replication, and nutrient acquisition 2,3. Serving as mediators of population dynamics within microbial communities, protein antimicrobials provide a competitive advantage to the producing organism over nonproducing, sensitive species 4. As recombinant enzymes and probiotics, these proteins also have an economic and societal importance as the need for new sources of pathogen control increases with each new expansion of antimicrobial resistance within the bacterial population 5.
The first evaluations of newly discovered protein antimicrobials include determining the basic physical characteristics that are inherent to the enzyme. Methods for rapid screening of potential antimicrobials allow selection of candidates with hydrolytic activities against the desired target substrates. The microslide diffusion assay and the quantitative dye-release assay allow for the use of a variety of substrates in the detection of enzymatic hydrolysis. For protein antimicrobial enzymes with activity against the bacterial cell wall, the versatility of these assays allow rapid and effective, qualitative and quantitative screening against viable bacterial cells (microslide assay only), heat-killed whole bacterial cell substrates, or purified peptidoglycan from the target bacterium. These assays have utility in antimicrobial enzyme discovery for use in fields such as alternative therapeutics, food supplements, and inhibitors of biofilm production.
The microslide diffusion assay and the dye-release assay are demonstrated methods for detection and characterization of novel protein antimicrobials. The microslide diffusion assay provides a relative (qualitative) estimate of antimicrobial activity and allows for minimal inference of enzyme concentration and activity. Using this method, activity is readily visualized as the development of a zone of lysis with the absence of activity resulting in a lack of zone formation. The rate of zone development and the zone diameter are indicative of the amount and purity of the enzyme present in the sample; however, this rate and the quality of the substrate clearing within the zone can also be affected by the presence of contaminants, the completeness of the hydrolysis reaction, and the type of substrate. Interfering contaminants can affect the rate of enzyme diffusion from the well, while incomplete hydrolysis or variation of the substrate type can result in a turbid zone of lysis 6.
The dye-release assay quantitatively assesses the amount of covalently-linked Remazol brilliant blue R dye products released into the reaction supernatant from the enzymatically hydrolyzed substrate. The method has only slight variability associated with a difference in substrate, thus allowing greater sensitivity for detection of hydrolysis as compared to the microslide diffusion assay. These properties allow the method to have utility in the characterization of biochemical properties of the enzyme and in the standardization of the assay for comparison between different antimicrobial enzymes.
In this protocol, we provide methods to perform the basic microslide diffusion assay and dye-release assay, while demonstrating the scale of detection limits and variability for each. The assays are used to perform basic evaluations of an unknown protein antimicrobial purified from the culture supernatant of an uncharacterized soil bacterial isolate. Observed activities against bacterial cell substrates within the assays allow comparison of reaction activities between a previously uncharacterized protein antimicrobial and α-chymotrypsin, a control proteolytic enzymes. These protocols provide a foundation for the application of the two techniques that can be expanded and modified to accommodate varied applications.
Den microslide diffusjon analysen og dye-release assay gi fordeler for å påvise og karakterisere tidligere uidentifiserte protein antimikrobielle midler. Disse raske og følsomme metoder tillate high-throughput screening av organisme kilde biblioteker for identifisering av enzymer av interesse før du investerer større forskningsressurser. Som høy profil målenzymer er identifisert, kan varianter av påvisningsanalysen benyttes til å raskt detektere enzymet eller for å bestemme biokjemiske egenskaper ved enzymet. For eksempel under en flertrinns proteinrensing ordningen, microslide diffusjon analysen raskt kan påvise Fraksjonene inneholdende enzymet av interesse. I tillegg kan reaksjonen optima for enzymet bestemmes ved å endre reaksjonsbuffere og inkubasjonstemperaturer i fargebad-frigjøringsanalyse.
Utvalget av enzymet masse som kreves for deteksjon i microslide diffusjon analysen er en funksjon av enzym karakteristiske gjestgpinner. Deteksjons begrensninger av analysen krever generelt anvendelse av høyere mengder av enzymet enn fargestoffet-frigjøringsanalyse. I denne studien ble sammenlignet med påvisningsgrensene for den microslide diffusjon analysen (figur 1) til den fargestoff-frigjøringsanalyse (figur 4) viste at microslide diffusjon analysen er en mindre følsom teknikk enn den fargestoff-frigjøringsanalyse. Når enzymkonsentrasjon er ikke et problem, tillater microslide analysen for hurtig innledende screening av bibliotekene for produksjon av protein antimikrobielle midler mot mål-substrater med lave arbeids og utstyrsbehov. Selv om det krever mer arbeid og utstyr, er det fargestoff-release-analysen mer følsom og reproduserbar og man oppnådde kvantitative resultater som tillater sammenligning av fargestoff-frigjøringsanalyser av de samme eller forskjellige enzymer for et gitt substrat. De to metodene er lett utføres i de fleste mikrobiologiske laboratorier uten behov for høyt spesialisert instrumentering. I representative analyser, kontroll enzymet, α-chymotrypsin, ble påvist ved mengder så lave som 100 ng (figur 5) ved hjelp av farvestoff-frigjøringsanalyse, mens den minimale mengden påvist i microslide diffusjonen analysen var 1 ug (data ikke vist).
Gir verktøyet som en kvalitativ påvisning analysen for antimikrobielle enzymer, har en rekke varianter av diffusjon analysen er rapportert 11,13. I går gjennom disse analysene ble microslide diffusjon analyse utviklet for sin relativt høy følsomhet som en innledende skjerm og for enkelt reaksjon ritualer. Modifisert fra arbeidet til al. Lachica et 11, hvori agarose-overleggene ble anvendt for å detektere produksjon av nukleaser av stammer av Staphylococcus aureus, driver microslide diffusjon analyse på samme måte som den radielle immunodiffusjon metode 14 som proteinet diffunderer fra brønnen inn i det agarose inneholdende substratet. Radial immunodiffusion fremgangsmåte stopper utvidelse av sonen av immunoutfelling når systemet har nådd en kompleks-dannelse likevekt mellom det diffuserende antigen og antistoff i agarose. I motsetning til dette er substratet av den microslide diffusjon analysen innledningsvis spaltet av det diffuserende protein antimikrobielle i en stadig voksende sone av lysering som omgir brønnen. Den økende diameter av sonen fortsetter til enzymet taper aktivitet eller substratet er oppbrukt. Hastigheten for fremstilling av sonen av lysis blir vakt som renhet, og således den spesifikke aktiviteten av enzymet eller konsentrasjonen av enzymet tilsatt til brønnen øker.
For kvantitativt å vurdere den enzymatiske aktiviteten til protein antimikrobielle midler mot varme-drepte B. subtilis, fargestoff-frigjøringsanalyse ble valgt. Kolorimetriske analyser ved hjelp Remazol strålende blå R fargestoff (RBB) -merket underlag tillate allsidig og følsom evaluering av protein antimikrobielle aktivitety. Enzymatisk hydrolyse av RBB-merkede substrat resulterer i utslipp av oppløselige blå produkter som lett kan måles med et spektrofotometer ved 595 nm. Flere variasjoner av RBB fargestoff-release-analysen, som er utviklet for å karakterisere andre protein antimikrobielle enzymer, viser fleksibiliteten av denne analysen for anvendelse med andre substrater. For eksempel, for å bestemme virkningen av lysostafin bakteriolytiske aktivitet, Zhou et al., Rapporterte et farvestoff-frigjøringsanalyse ved hjelp av RBB-farget stafylokokk-celler og stafylokokk-peptidoglykan som substrater 12. I en modifikasjon av anvendelsen av denne RBB fargestoff-frigivelse analysen ble RBB-merket Micrococcus luteus substrat foreslått for anvendelse som en hurtig og følsomme metoder for å diagnostisere og skjerm for sykdommer som bakteriell infeksjon, og nærværet av en ondartet karsinom, som kan være korrelert til humane lysozym ekspresjonsnivåer i blodserum 15. I tillegg RBB-merkede bakterielle celle substrater ha enLSO vært brukt i en zymogram fremgangsmåte for påvisning av lysozym 16.
Vi viser den senkede deteksjonsgrensen, bekvemmelighet og reproduserbarhet av fargestoffet-release-analysen, noe som muliggjør hurtig screening av bibliotek for enzymproduksjonen. Modifikasjoner av analysen gir mulighet for nedstrøms kvantitative biokjemiske karakterisering analyser, herunder virkningen av temperatur, pH, salinitet og i tillegg til effekten av andre proteolytiske enzymer på aktiviteten av antimikrobielle proteiner 6. I tillegg kan den kvantitative farvestoff-frigivelse assay brukes til å sammenligne aktivitetene til flere enzymer for et gitt substrat. RBB fargestoff-frigjøringsanalyse har rapportert verktøy for enzymer med aktivitet mot polysakkarider i tillegg til karakterisering og påvisning av protein antimikrobielle midler. Pettersson og Eriksson rapporterte en analyse for å detektere endoglycanase aktivitet ved anvendelse av amorfe, RBB-farget polysakkarid kuler av cellulose, xylan, mannan, og chiti 17. I en utvidelse av disse resultater, ble en følsom fremgangsmåte for påvisning av kitinase-enzymer som produseres av Bacillus thuringiensis Bt-107 utviklet ved bruk av kolloidalt kitin som er merket med RBB 18. Fra disse og andre studier, har kommersielt tilgjengelige kilder til RBB-farget underlag dukket opp for bruk i påvisning av glycolytic aktivitet, inkludert de mot keratin, amylopektin, amylose, glykogen, Laminarin, d-xylan, Azo-bygg glukan, og stivelse.
I denne studien viser vi nytten av fargestoff-frigjøringsanalyse i en mikroplateformat, å redusere volumet av RBB-merket substrat og enzym som er nødvendig for å produsere den kolorimetriske resultat. Som illustrert i Figur 4 og Figur 5, gir mikro fargestoff-release-analysen en lavere påvisningsgrense enn den microslide diffusjon assay for enzymatisk aktivitet detektering. Med hensyn til rask bruk, bevaring av arbeidskraft, og enkel tolkning, microslide diffusjon analysen gir verktøyet i innledende high-throughput skjermer for tilstedeværelse av antimikrobiell aktivitet, så vel som indikasjon på antimikrobiologisk protein til stede i nedstrøms protein isolerings- og rensetrinn. Kombinasjonen av disse to analyser utfyller hverandre i den innledende screening og endelig karakterisering av nye antimikrobielle midler protein
The authors have nothing to disclose.
This work was funded by The MITRE Corporation through the MITRE Innovation Program (Project 25MSR621-CA). The authors would like to thank Mark Maybury, Ph.D., Richard Games, Ph.D., James Patton, Ellen Mac Garrigle, Ph.D., Carl Picconatto, Ph.D., and Caroline Gary for their support and review of this work.
48-well flat-bottom microplate with low evaporation lid | Becton Dickinson | 3078 | |
96-well flat-bottom microplate (Costar 3595) | Corning, Inc. | 3595 | |
agarose | Fisher Scientific | BP162-100 | |
α-chymotrypsin | MP Biomedicals | 215227205 | |
Bacillus subtilis 168 | American Type Culture Collection | 23857 | |
C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | ||
cork borer | Humboldt | H-9661 | |
lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876-1G | |
McFarland equivalence standard (2.0) | Fisher Scientific | R20412 | |
microslides | Fisher Scientific | 22-38-103 | |
nutrient broth | Fisher Scientific | S25959B | |
peptidoglycan of Bacillus subtilis 168 | Sigma-Aldrich | 69554-10MG-F | |
phosphate-buffered saline (1×) | Teknova | P0200 | |
Pierce BCA Protein Assay Kit | Life Technologies | 23227 | |
Synergy HT microplate spectrophotometer | BioTek Instruments, Inc. | ||
Remazol brilliant blue R dye (RBB) | Sigma-Aldrich | R8001 | |
Salmonella enterica subsp. enterica | American Type Culture Collection | 10708 | |
sodium azide | Fisher Scientific | S227-100 | |
sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | S318-500 | |
Titer Tops pre-cut adhesive polyethylene film | Diversified Biotechnology | T-TOPS-50 | |
UltraPure distilled water | Invitrogen | 10977-015 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Solution | |||
agarose solution 50 ml PBS 0.25 g agarose |
Add 10% sodium azide to the molten PBS/agarose solution | ||
nutrient broth medium 4 g nutrient broth 500 ml Type I water |
|||
250mM sodium hydroxide (NaOH) solution 1 g NaOH 99 ml Type I water |
|||
200mM Remazol brilliant blue R dye (RBB) 1.25 g RBB 98.75 ml 250 mM NaOH solution |