Here, we present protocols to rapidly screen and characterize enzymes for antimicrobial activity. The microslide diffusion assay and the dye-release assay utilize target bacterial substrates for qualitative and quantitative enzymatic activity evaluation.
Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods to screen for target enzymes prior to investing greater research effort and resources. The goal of this protocol is to demonstrate two complementary assays for conducting these initial evaluations. The microslide diffusion assay provides an initial or simple detection screen to enable the qualitative and rapid assessment of proteolytic activity against an array of both viable and heat-killed bacterial target substrates. As a counterpart, the increased sensitivity and reproducibility of the dye-release assay provides a quantitative platform for evaluating and comparing environmental influences affecting the hydrolytic activity of protein antimicrobials. The ability to label specific heat-killed cell culture substrates with Remazol brilliant blue R dye expands this capability to tailor the dye-release assay to characterize enzymatic activity of interest.
Antimicrobial agents play an essential role in targeting a wide range of microorganisms such as viruses, fungi, and bacteria. The antimicrobial activities produced by various bacteria range in target specificity from broad-spectrum to species-specific, including clinically relevant bacterial pathogens 1. In nature, protein antimicrobial compounds like bacteriocins and lysins represent a microbial arsenal of tools for self-defense, replication, and nutrient acquisition 2,3. Serving as mediators of population dynamics within microbial communities, protein antimicrobials provide a competitive advantage to the producing organism over nonproducing, sensitive species 4. As recombinant enzymes and probiotics, these proteins also have an economic and societal importance as the need for new sources of pathogen control increases with each new expansion of antimicrobial resistance within the bacterial population 5.
The first evaluations of newly discovered protein antimicrobials include determining the basic physical characteristics that are inherent to the enzyme. Methods for rapid screening of potential antimicrobials allow selection of candidates with hydrolytic activities against the desired target substrates. The microslide diffusion assay and the quantitative dye-release assay allow for the use of a variety of substrates in the detection of enzymatic hydrolysis. For protein antimicrobial enzymes with activity against the bacterial cell wall, the versatility of these assays allow rapid and effective, qualitative and quantitative screening against viable bacterial cells (microslide assay only), heat-killed whole bacterial cell substrates, or purified peptidoglycan from the target bacterium. These assays have utility in antimicrobial enzyme discovery for use in fields such as alternative therapeutics, food supplements, and inhibitors of biofilm production.
The microslide diffusion assay and the dye-release assay are demonstrated methods for detection and characterization of novel protein antimicrobials. The microslide diffusion assay provides a relative (qualitative) estimate of antimicrobial activity and allows for minimal inference of enzyme concentration and activity. Using this method, activity is readily visualized as the development of a zone of lysis with the absence of activity resulting in a lack of zone formation. The rate of zone development and the zone diameter are indicative of the amount and purity of the enzyme present in the sample; however, this rate and the quality of the substrate clearing within the zone can also be affected by the presence of contaminants, the completeness of the hydrolysis reaction, and the type of substrate. Interfering contaminants can affect the rate of enzyme diffusion from the well, while incomplete hydrolysis or variation of the substrate type can result in a turbid zone of lysis 6.
The dye-release assay quantitatively assesses the amount of covalently-linked Remazol brilliant blue R dye products released into the reaction supernatant from the enzymatically hydrolyzed substrate. The method has only slight variability associated with a difference in substrate, thus allowing greater sensitivity for detection of hydrolysis as compared to the microslide diffusion assay. These properties allow the method to have utility in the characterization of biochemical properties of the enzyme and in the standardization of the assay for comparison between different antimicrobial enzymes.
In this protocol, we provide methods to perform the basic microslide diffusion assay and dye-release assay, while demonstrating the scale of detection limits and variability for each. The assays are used to perform basic evaluations of an unknown protein antimicrobial purified from the culture supernatant of an uncharacterized soil bacterial isolate. Observed activities against bacterial cell substrates within the assays allow comparison of reaction activities between a previously uncharacterized protein antimicrobial and α-chymotrypsin, a control proteolytic enzymes. These protocols provide a foundation for the application of the two techniques that can be expanded and modified to accommodate varied applications.
Le test de diffusion de microplaque et le test de colorant à libération offrent des avantages pour la détection et la caractérisation des antimicrobiens de protéines non identifiés auparavant. Ces méthodes rapides et sensibles permettent le criblage à haut débit de banques de source organisme pour l'identification des enzymes d'intérêt avant d'investir des ressources plus importantes de recherche. En tant que haut niveau des enzymes cibles sont identifiées, les variations des dosages de détection peuvent être utilisés pour détecter rapidement l'enzyme ou de déterminer les caractéristiques biochimiques de l'enzyme. Par exemple, au cours d'un procédé de purification de la protéine en plusieurs étapes, le dosage de la diffusion de la microplaque peut détecter rapidement les fractions contenant l'enzyme d'intérêt. En outre, les optima de réaction pour l'enzyme peut être déterminée en modifiant les tampons de réaction et les températures d'incubation dans le dosage de colorant à libération prolongée.
La plage de masse enzyme nécessaire pour la détection dans le test de diffusion de la microplaque est une fonction de l'enzyme tystics. les limites de détection du dosage nécessitent généralement l'utilisation de quantités plus élevées d'enzyme que le dosage de colorant à libération prolongée. Dans cette étude, la comparaison des limites de détection de l'essai de diffusion de la microplaque (figure 1) pour le dosage de colorant libération (figure 4) a démontré que le dosage de la diffusion de la microplaque est une technique moins sensible que le dosage de colorant à libération prolongée . Lorsque la concentration d'enzyme est pas une préoccupation, le dosage de microplaque permet le dépistage rapide initial des bibliothèques pour la production d'antimicrobiens de protéines contre les substrats cibles avec de faibles exigences de main-d'œuvre et d'équipement. Bien que nécessitant plus d'efforts et de l'équipement, le dosage de colorant à libération est plus sensible et reproductible, ce qui donne des résultats quantitatifs qui permettent la comparaison entre les dosages colorant libération des mêmes ou différentes enzymes pour un substrat donné. Les deux méthodes peuvent être facilement réalisées dans la plupart des laboratoires de microbiologie sans avoir besoin d'instruments hautement spécialisés. Dans le reprédes dosages tifs, l'enzyme de contrôle, α-chymotrypsine, a été détecté à des quantités aussi faibles que 100 ng (figure 5) en utilisant le dosage de colorant libération, tandis que la quantité minimale détectée dans l'essai de diffusion de la microplaque était de 1 ug (données non présentées).
Fournir une utilité comme un test de détection qualitative pour les enzymes antimicrobiennes, un certain nombre de variantes du test de diffusion ont été rapportés 11,13. En examinant ces tests, le test de diffusion de microplaque a été développé pour sa sensibilité relativement élevée comme un écran initial et pour sa facilité de réaction observance. Modification du travail de Lachica et al. , 11 dans lequel les superpositions d'agarose ont été utilisés pour détecter la production de nucléases par des souches de Staphylococcus aureus, l'essai de diffusion de la microplaque fonctionne de façon similaire à la méthode d'immunodiffusion radiale 14 que la protéine se diffuse à partir du puits dans la agarose contenant le substrat. Le immunodiffu radialProcédé sion arrête l'expansion de la zone d'immunoprécipitation lorsque le système atteint un équilibre de formation d'un complexe entre l'antigène et l'anticorps diffusant au sein de l'agarose. En revanche, le substrat de l'essai de diffusion de la microplaque est d'abord digéré par la protéine antimicrobienne de diffusion dans une zone d'expansion continue de la lyse entourant le puits. Le diamètre croissant de la zone continue jusqu'à ce que l'enzyme perd son activité ou le substrat est épuisé. Le taux de la production de la zone de lyse est accélérait comme la pureté et donc l'activité spécifique de l'enzyme ou de la concentration de l'enzyme ajoutée aux puits augmente.
Permettant d' évaluer quantitativement l'activité enzymatique des antibiotiques contre des protéines tuées par la chaleur B. subtilis, le dosage de colorant à libération a été choisi. essais colorimétriques utilisant Remazol bleu brillant R colorant (RBB) marqué à des substrats permettent d'évaluer polyvalent et sensible de la protéine activi antimicrobienty. L'hydrolyse enzymatique des résultats de substrat RBB marqués dans la libération des produits bleus solubles qui peut être facilement mesurée par un spectrophotomètre à 595 nm. Plusieurs variantes du RBB colorant test de libération, mis au point pour caractériser d'autres enzymes antimicrobiennes de protéines, montrent la souplesse de ce dosage pour une application avec d'autres substrats. Par exemple, pour déterminer les effets de la lysostaphine activité bactériolytique, Zhou et al., A rapporté un essai de colorant à libération en utilisant des cellules de staphylocoques RBB-teints et staphylococcique peptidoglycane comme substrats 12. Dans une modification de l'application de ce RBB colorant test de libération, le substrat de Micrococcus luteus RBB marqué a été proposé pour être utilisé comme un moyen rapide et sensible pour diagnostiquer et dépister les maladies telles que l' infection bactérienne et la présence d'un carcinome malin, qui peut être corrélée au taux d'expression de lysozyme humain dans le sérum sanguin 15. En outre, des substrats de cellules bactériennes RBB marquées ont unLSO été utilisé dans un procédé de zymogramme pour la détection de lysozyme 16.
Nous démontrons la limite de détection abaissée, la commodité et la reproductibilité du dosage à libération de colorant, ce qui permet le criblage de banques rapide pour la production d'enzymes. Les modifications du dosage permettent des dosages quantitatifs en aval de la caractérisation biochimique, y compris les effets de la température, le pH et la salinité, ainsi que les effets d'autres enzymes protéolytiques sur l'activité des protéines antimicrobiennes 6. En outre, le dosage quantitatif de colorant libération peut être utilisé pour comparer les activités des multiples enzymes pour un substrat donné. RBB colorant essai de libération a rapporté l'utilité pour des enzymes ayant une activité contre les polysaccharides, en plus de la caractérisation et la détection des protéines agents antimicrobiens. Pettersson et Eriksson ont rapporté un dosage pour détecter une activité endoglycanase utilisant amorphe, les perles de polysaccharide RBB-teintes de la cellulose, le xylane, le mannane, et chiten 17. Dans une expansion de ces résultats, une méthode sensible pour la détection des enzymes chitinase produites par Bacillus thuringiensis Bt-107 a été développé en utilisant la chitine colloïdale marquée avec RBB 18. A partir de ces études et d'autres sources de substrats RBB-teintes disponibles dans le commerce ont émergé pour une utilisation dans la détection de l'activité glycolytique, y compris ceux contre la kératine, l'amylopectine, l'amylose, le glycogène, la laminarine, d-xylane, glucane Azo-orge, et de l'amidon.
Dans cette étude, on démontre l'utilité du dosage de libération de colorant dans un format de microplaque, ce qui réduit le volume du substrat RBB marqué et l'enzyme nécessaire pour produire le résultat colorimétrique. Comme cela est illustré sur la figure 4 et la figure 5, la microplaque de colorant essai de libération fournit une limite inférieure de détection de l'essai de diffusion de la microplaque pour la détection d' une activité enzymatique. En ce qui concerne une utilisation rapide, la conservation de la main-d'œuvre, et la facilité d'interprétation, le microessai de diffusion roslide présente une utilité dans des criblages à haut débit initial pour détecter la présence de l'activité antimicrobienne, ainsi que l'indication de la présence de la protéine antimicrobienne dans l'isolement des protéines et des étapes de purification en aval. La combinaison de ces deux essais se complètent mutuellement dans le criblage et la caractérisation initiale ultime de nouveaux agents antimicrobiens protéiques
The authors have nothing to disclose.
This work was funded by The MITRE Corporation through the MITRE Innovation Program (Project 25MSR621-CA). The authors would like to thank Mark Maybury, Ph.D., Richard Games, Ph.D., James Patton, Ellen Mac Garrigle, Ph.D., Carl Picconatto, Ph.D., and Caroline Gary for their support and review of this work.
48-well flat-bottom microplate with low evaporation lid | Becton Dickinson | 3078 | |
96-well flat-bottom microplate (Costar 3595) | Corning, Inc. | 3595 | |
agarose | Fisher Scientific | BP162-100 | |
α-chymotrypsin | MP Biomedicals | 215227205 | |
Bacillus subtilis 168 | American Type Culture Collection | 23857 | |
C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | ||
cork borer | Humboldt | H-9661 | |
lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876-1G | |
McFarland equivalence standard (2.0) | Fisher Scientific | R20412 | |
microslides | Fisher Scientific | 22-38-103 | |
nutrient broth | Fisher Scientific | S25959B | |
peptidoglycan of Bacillus subtilis 168 | Sigma-Aldrich | 69554-10MG-F | |
phosphate-buffered saline (1×) | Teknova | P0200 | |
Pierce BCA Protein Assay Kit | Life Technologies | 23227 | |
Synergy HT microplate spectrophotometer | BioTek Instruments, Inc. | ||
Remazol brilliant blue R dye (RBB) | Sigma-Aldrich | R8001 | |
Salmonella enterica subsp. enterica | American Type Culture Collection | 10708 | |
sodium azide | Fisher Scientific | S227-100 | |
sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | S318-500 | |
Titer Tops pre-cut adhesive polyethylene film | Diversified Biotechnology | T-TOPS-50 | |
UltraPure distilled water | Invitrogen | 10977-015 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Solution | |||
agarose solution 50 ml PBS 0.25 g agarose |
Add 10% sodium azide to the molten PBS/agarose solution | ||
nutrient broth medium 4 g nutrient broth 500 ml Type I water |
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250mM sodium hydroxide (NaOH) solution 1 g NaOH 99 ml Type I water |
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200mM Remazol brilliant blue R dye (RBB) 1.25 g RBB 98.75 ml 250 mM NaOH solution |