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Immunology and Infection

जांच के लिए गुणात्मक और मात्रात्मक assays और प्रोटीन antimicrobials की विशेषता

doi: 10.3791/53819 Published: April 10, 2016

Protocol

1. बैक्टीरियल और पेप्टीडॉग्लीकैन Substrates की तैयारी

नोट: पूरे सेल बैक्टीरियल substrates और शुद्ध peptidoglycans दोनों microslide प्रसार परख और डाई रिलीज परख में एंजाइम substrates के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैं। इन substrates तैयारी एंजाइम प्रतिक्रियाओं का आयोजन करने से पहले की आवश्यकता होती है। निम्नलिखित प्रोटोकॉल उनकी तैयारी का वर्णन है।

  1. पूरे बैक्टीरियल सेल सब्सट्रेट
    1. बेसिलस subtilis 168 की एक 2 मिलीलीटर रातोंरात संस्कृति के साथ पोषक तत्व शोरबा के 500 मिलीलीटर inoculating द्वारा बैक्टीरिया कोशिका सब्सट्रेट उत्पादन (अमेरिकी प्रकार संस्कृति संग्रह; ATCC 23857)। मिलाते (125 आरपीएम) जब तक संस्कृति के विकास की एक घातीय चरण, जीवाणु संस्कृति के दोहरीकरण में जिसके परिणामस्वरूप एक तेजी से विकास के चरण के रूप में परिभाषित तक पहुँच के साथ 30 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। साल्मोनेला enterica subsp की खेती के लिए। Enterica (ATCC 10708), मिलाते (125 आरपीएम) के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर एक मध्यम विकास के रूप में पोषक तत्व शोरबा का उपयोग करें। दबाव के 3 एटीएम के तहत 121 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए autoclaving द्वारा प्रत्येक संस्कृति हीट-मारने के लिए।
    2. पर 5000 x जी 20 मिनट के लिए centrifugation द्वारा गर्मी की मौत हो बैक्टीरियल सब्सट्रेट हार्वेस्ट। टाइप 1 पानी के साथ गोली धो तीन बार और पानी की एक न्यूनतम राशि में फिर से निलंबित। इस अध्ययन में 1,200 μl में substrates निलंबित।
    3. अशेष 20 डिग्री सेल्सियस पर 1.5 मिलीलीटर microfuge ट्यूब और स्टोर करने के लिए बैक्टीरिया कोशिका substrates के 300 μl।
  2. शुद्ध पेप्टीडॉग्लीकैन सब्सट्रेट
    1. लक्ष्य सब्सट्रेट जीवाणु 7-10 से पेप्टीडॉग्लीकैन शुद्ध या एक विक्रेता से प्राप्त (सामग्री और उपकरण तालिका देखें)। गौण कोशिका दीवार पॉलिमर से कच्चे पेप्टीडॉग्लीकैन तैयारियों शुद्ध।

2. गुणात्मक Microslide प्रसार परख [Lachica से संशोधित, एट अल। 11]

नोट: microslide प्रसार परख हैएक नमूने में रोगाणुरोधी एंजाइम की उपस्थिति का पता लगाने के लिए एक गुणात्मक विधि। एंजाइम एक agarose मैट्रिक्स युक्त सब्सट्रेट के माध्यम से diffuses के रूप में, समाशोधन के एक क्षेत्र के रूप में एंजाइम सब्सट्रेट hydrolyzes विकसित करता है। निम्नलिखित प्रोटोकॉल गुणात्मक प्रोटीन antimicrobials की उपस्थिति का पता लगाने के लिए तैयार करने और microslide प्रसार परख के प्रदर्शन का वर्णन है।

  1. रोगाणुरोधी एंजाइम की एकाग्रता निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार एक Bicinchoninic एसिड (बीसीए) प्रोटीन परख किट का उपयोग कर मूल्यांकन किया जाना निर्धारित करते हैं।
  2. एक एंजाइम का उपयोग बफर के रूप में फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस); हालांकि, अनुभव से दी एंजाइम के लिए बफर उचित निर्धारण करते हैं।
  3. रोगाणुरोधी एंजाइम एक प्रतिक्रिया बफर के रूप में फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) का उपयोग करने का एक धारावाहिक कमजोर पड़ने प्रदर्शन करना। सीरियल इन microslide प्रसार assays में इस्तेमाल कमजोर पड़ने अंतिम 0 पीजी, 10 स्नातकोत्तर, 100 पीजी, 1 एनजी, 10 एनजी, 100 एनजी, 1 ग्राम, और 1 की परख प्रोटीन जनता का उत्पादनप्रतिक्रिया मात्रा प्रति 0 माइक्रोग्राम।
  4. अलग-अलग microfuge ट्यूबों में प्रोटीन जनता बांटना और इसके लिए तैयार करने में पीबीएस का उपयोग प्रतिक्रिया कुओं microslide को μl 20 के लिए प्रोटीन की मात्रा समायोजित करें।
  5. पीबीएस के 50 मिलीलीटर में agarose की 0.25 ग्राम भंग करके एक 0.5% agarose समाधान करें। एक फोड़ा करने के लिए समाधान हीट जब तक agarose पूरी तरह भंग है। वजन से पानी पिघलने की प्रक्रिया के दौरान खो निर्धारण करते हैं और समाधान के लिए वापस जोड़ने।
  6. agarose समाधान करने के लिए पानी में 10% सोडियम azide के 50 μl जोड़ें और एक पानी के स्नान में 50 डिग्री सेल्सियस के समाधान के तापमान को समायोजित। सोडियम azide microslide प्रसार परख के ऊष्मायन के दौरान बैक्टीरिया विकास को बाधित करने के लिए दूषित जोड़ा जाता है। व्यवहार्य कोशिकाओं सब्सट्रेट के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैं, तो agarose समाधान से सोडियम azide न आना।
  7. बर्फ पर गर्मी की मौत हो बैक्टीरियल सब्सट्रेट गला लें।
  8. पुनः निलंबित लगभग करने के लिए agarose समाधान के 12 मिलीलीटर में बैक्टीरियल सब्सट्रेट एक 2.0 एमसीएफ का मैलापन से मेलArland मानक तुल्यता (देखें सामग्री तालिका)। समाधान के माध्यम से एक सफेद पृष्ठभूमि पर एक काले रंग की लाइन visualizing, agarose करने के लिए जीवाणु सब्सट्रेट जोड़ने जब तक अनुमानित मैलापन हासिल की है के द्वारा समाधान के turbidities की तुलना करें।
  9. इसके तत्काल बाद प्रत्येक microslide (25 x 75 x 1 मिमी 3) को agarose-सब्सट्रेट समाधान के 3 मिलीलीटर pipet।
  10. स्लाइड जमना के बाद, एक काग बोरर (4.8 मिमी व्यास) का उपयोग कर प्रत्येक microslide की agarose सब्सट्रेट परत में तीन कुओं पंच। उनके संबंधित कुओं के लिए प्रत्येक समायोजित प्रोटीन धारावाहिक कमजोर पड़ने के 20 μl जोड़ें।
  11. अच्छी तरह से एक नकारात्मक नियंत्रण में पीबीएस (20 μl) या गोजातीय सीरम albumin (20 μl पीबीएस में 5 माइक्रोग्राम) का प्रयोग करें। ऐसे लाइसोजाइम के रूप में सब्सट्रेट के लिए उचित नाम से जाना जाता bacteriolytic एंजाइमों, का उपयोग करें, एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में।
  12. 37 डिग्री सेल्सियस पर एक आर्द्रता चैम्बर में स्लाइड या एंजाइम का इष्टतम गतिविधि तापमान सेते हैं। ऊष्मायन की लंबाई एकाग्रता पर निर्भर करता है औररोगाणुरोधी एंजाइम की विशिष्ट गतिविधि। एक ठेठ प्रतिक्रिया समय रातोंरात (लगभग 16 घंटा) है।
  13. ऊष्मायन के बाद, लगभग 30 सेमी की एक फोकल दूरी पर एक 60 मिमी लेंस के साथ एक डिजिटल एकल लेंस पलटा कैमरा का उपयोग कर के विकास परख के अप्रत्यक्ष प्रकाश और छवियों पर कब्जा के तहत स्लाइड निरीक्षण करते हैं।
    नोट: दी सब्सट्रेट के लिए प्रोटीन रोगाणुरोधी के enzymatic गतिविधि हाइड्रोलिसिस का एक स्पष्ट क्षेत्र है, जो अच्छी तरह से आसपास रूपों के रूप में एंजाइम agarose में diffuses के विकास के साथ जोड़ा जाता है।
  14. enzymatic गतिविधि अर्हता प्राप्त करने के लिए, क्षेत्रों है कि अच्छी तरह से प्रत्येक के आसपास फार्म के आकार का पालन। उच्च enzymatic गतिविधि गुणात्मक, एक बड़ा क्षेत्र से संबंधित है, जबकि कम enzymatic गतिविधि गुणात्मक एक छोटे क्षेत्र से संबंधित है।

3. सब्सट्रेट लेबल - Remazol खूब ब्लू आर डाई लेबलिंग [झोउ 12 से संशोधित]

नोट: डाई रिलीज परख में, सब्सट्रेट covalently Linke हैडी खूब ब्लू आर डाई Remazol करने के लिए। निम्नलिखित प्रोटोकॉल रंगे एंजाइम substrates की तैयारी का वर्णन है।

  1. प्रकार मैं पानी की 99 मिलीलीटर में 1 ग्राम NaOH भंग द्वारा एक 250 मिमी सोडियम हाइड्रोक्साइड (NaOH) समाधान करें एक 200 मिमी Remazol खूब ब्लू आर डाई (RBB) समाधान बनाने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा।
  2. 98.75 मिलीलीटर ± 1 एक ताजा 250 मिमी NaOH समाधान (3.1 कदम) के मिलीलीटर में 1.25 जी RBB भंग द्वारा एक 200 मिमी RBB समाधान करें।
  3. RBB समाधान के 30 मिलीलीटर में 0.5 ग्राम गीला वजन की एकाग्रता में गर्मी की मौत हो बैक्टीरियल कोशिकाओं फिर से निलंबित। शुद्ध पेप्टीडॉग्लीकैन के लिए, RBB समाधान के 30 मिलीलीटर में 0.3 ग्राम गीला वजन की एकाग्रता में पेप्टीडॉग्लीकैन फिर से निलंबित।
  4. एक घूर्णन सौम्य मिश्रण के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 6 घंटे के लिए मंच पर एक Erlenmeyer फ्लास्क में प्रतिक्रिया मिश्रण सेते हैं।
  5. एक 4 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर प्रतिक्रिया मिश्रण स्थानांतरण, और सौम्य मिश्रण के साथ एक अतिरिक्त 12 घंटे के लिए सेते हैं।
  6. ऊष्मायन के बाद, 3000 XG पर centrifugation द्वारा रंगे सब्सट्रेट फसल30 मिनट के लिए। सब्सट्रेट गोली से डाई समाधान छानना।
  7. centrifugation द्वारा पीछा प्रकार मैं पानी के साथ (लगभग 3-5 washes) बार-बार डाई-लेबल की कोशिकाओं या पेप्टीडॉग्लीकैन धोने से substrates से गैर covalently जुड़े घुलनशील डाई निकालें। प्रत्येक पानी अलावा के साथ, अच्छी तरह से गोली फिर से निलंबित।
    नोट: जब अनबाउंड, घुलनशील डाई नहीं रह centrifugation के बाद पानी से धो में दिख रहा है। सब्सट्रेट एक अतिरिक्त धोने दी जानी चाहिए। ध्यान दें कि सब्सट्रेट, नीला रहेगा, जबकि पिछले धोने की सतह पर तैरनेवाला स्पष्ट हो जाएगा।
  8. स्टोर बाद में उपयोग के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर पानी की एक न्यूनतम राशि में निलंबित कर दिया रंगे substrates।

4. मात्रात्मक डाई-रिलीज परख

नोट: डाई रिहाई परख के दौरान, प्रतिक्रिया सतह पर तैरनेवाला में रंगे उत्पाद enzymatic प्रतिक्रिया विज्ञप्ति में RBB रंगे सब्सट्रेट की hydrolysis। डाई की राशि जारी की Colorimetric माप एमो इंगित करता हैenzymatic गतिविधि एक दिया एंजाइम के लिए नमूना के भीतर मौजूद का UNT। मात्रात्मक विधि substrates भर में विभिन्न एंजाइमों की तुलना की अनुमति देता है और पर्यावरण की स्थिति enzymatic प्रतिक्रिया (जैसे, तापमान, लवणता, और पीएच) को प्रभावित की भिन्नता के लिए अनुमति देता है। निम्नलिखित प्रोटोकॉल मात्रात्मक प्रोटीन antimicrobials के enzymatic गतिविधि का पता लगाने के लिए तैयार करने और डाई-परख रिहाई के प्रदर्शन का वर्णन है।

  1. डाई-रिलीज परख के लिए तैयारी
    1. जमे हुए रंगे सब्सट्रेट कमरे के तापमान पर लौटने और परख बफर (पीबीएस) है, जो अनुभव से दी एंजाइम के लिए चुना गया है के साथ दो बार धोने के लिए अनुमति दें।
    2. सब्सट्रेट निलंबन की मात्रा कि डाई-रिहाई assays की संख्या से 200 μl प्रतिक्रिया मात्रा गुणा प्रदर्शन किया जा रहा द्वारा की जरूरत है की गणना।
    3. (परख बफर की मात्रा, 4.1.2 में निर्धारित करने के लिए रंगे सब्सट्रेट जोड़कर सब्सट्रेट निलंबन तैयार एक ऑप्टिकल घनत्व तक2.0 ओवर ड्राफ्ट) 595 एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग एनएम पर हासिल की है। केंद्रित समाधान के 1 घोला: स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के कार्यात्मक सीमाओं के भीतर रहने के लिए, एक 1 के लिए 2.0 ओवर ड्राफ्ट 1.0 के रूप में 595 के उपाय। एक खाली के रूप में परख बफर का प्रयोग करें।
      नोट: प्रतिक्रिया के लिए सब्सट्रेट मैलापन अत्यधिक कुशल एंजाइमों की गतिविधि के स्तर के मैच के लिए 2.0 से परे उठाया जा सकता है।
    4. निलंबित प्रोटीन रोगाणुरोधी 1 मिलीग्राम / एमएल के एक अनुमान के अनुसार एकाग्रता में परख बफर में मूल्यांकन किया जाना है।
    5. एक बीसीए प्रोटीन परख निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार किट के microplate परख का उपयोग करना, निर्धारित प्रोटीन नमूना की वास्तविक एकाग्रता यत्न किया जाएगा। मिलीलीटर परख बफर का उपयोग / 1 मिलीग्राम शेयर निलंबन की एकाग्रता को समायोजित करें।
  2. एक प्रोटीन रोगाणुरोधी के लिए इष्टतम ऊष्मायन शर्तों का निर्धारण करने के लिए डाई-रिहाई परख का उपयोग
    1. 100 एनजी / μl को शेयर प्रोटीन रोगाणुरोधी निलंबन पतला। यह एकाग्रता वायुसेना देता हैमात्रा (10 μl) प्रति प्रोटीन का 1 माइक्रोग्राम की inal प्रतिक्रिया बड़े पैमाने पर परख प्रतिक्रिया के लिए कहा।
    2. थर्मल सीमा निर्धारित bacteriolytic प्रोटीन के लिए मूल्यांकन किया जाना है। इन assays में थर्मल रेंज 5 डिग्री सेल्सियस, 15 डिग्री सेल्सियस, 25 डिग्री सेल्सियस, 35 डिग्री सेल्सियस, 45 डिग्री सेल्सियस, 55 डिग्री सेल्सियस, और 65 डिग्री सेल्सियस शामिल थे।
    3. 0.5 मिलीलीटर microfuge ट्यूबों में प्रतिक्रिया assays के प्रदर्शन। प्रत्येक थर्मल हालत के लिए, तैयार सब्सट्रेट निलंबन के 200 μl को शेयर प्रोटीन के 10 μl जोड़ें।
    4. प्रति घंटे एक बार उलटा द्वारा मिश्रण के साथ 8 घंटे के लिए एक थर्मल cycler में सेते हैं।
    5. ऊष्मायन के बाद, इथेनॉल के 25 μl जोड़कर प्रतिक्रियाओं गिरफ्तारी।
    6. 2 मिनट के लिए 3,000 XG पर centrifugation द्वारा पचाया, अघुलनशील सब्सट्रेट निकालें, और एक 96 अच्छी तरह से फ्लैट नीचे microplate करने के लिए प्रत्येक प्रतिक्रिया मिश्रण के लिए प्रतिक्रिया सतह पर तैरनेवाला के 150 μl हस्तांतरण, देखभाल करने के पचाया नहीं सब्सट्रेट की गोली बाधित करने के लिए नहीं।
    7. प्रोटीन antimicrob के enzymatic गतिविधि को मापनेघुलनशील RBB डाई की राशि का निर्धारण द्वारा दिए गए सब्सट्रेट के लिए ial enzymatic हाइड्रोलिसिस के बाद सब्सट्रेट से अलग हो गई। enzymatic गतिविधि यों, एक microplate स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग 595 एनएम पर तैरनेवाला की absorbance के उपाय। लेबल सब्सट्रेट से सतह पर तैरनेवाला में जारी घुलनशील डाई की वृद्धि हुई absorbance enzymatic गतिविधि का एक मात्रात्मक माप है।
      नोट: absorbance में परिवर्तन गतिविधि इकाइयों (एयू), का प्रतिनिधित्व करती है, जहां 595 एनएम पर डाई रिहाई प्रतिक्रिया सतह पर तैरनेवाला के ऑप्टिकल घनत्व में वृद्धि 0.01 में 1 ए.यू. का परिणाम है। एक खाली प्रतिक्रिया, एंजाइम को छोड़कर सभी घटकों के साथ प्रतिक्रिया incubated, किसी भी डाई कि RBB लेबल सब्सट्रेट से ऊष्मायन के कारण रिलीज घटाना करने के लिए इस्तेमाल किया जाता है। इष्टतम एंजाइमी तापमान शिखर गतिविधि इकाई माप प्रदान करता है।
    8. दोहराएँ 4.2.1 4.2.7 के माध्यम से विभिन्न ऊष्मायन buffers का उपयोग, रोगाणुरोधी एंजाइम के लिए इष्टतम बफर की स्थिति निर्धारित करने के लिए कदम। टी मेंhese assays, पीबीएस का उपयोग करें।
  3. डाई-रिलीज परख का प्रयोग एक प्रोटीन रोगाणुरोधी के लिए इष्टतम ऊष्मायन तापमान पर कम से कम सक्रिय एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए
    1. परख बफर का उपयोग शेयर रोगाणुरोधी प्रोटीन निलंबन के एक धारावाहिक कमजोर पड़ने प्रदर्शन करना। कमजोर पड़ने श्रृंखला रेंज रोगाणुरोधी एंजाइम की गतिविधि के साथ अलग अलग होंगे। सीरियल इन assays में इस्तेमाल कमजोर पड़ने अंतिम 0 पीजी, 10 स्नातकोत्तर, 100 पीजी, 1 एनजी, 10 एनजी, 100 एनजी, 1 ग्राम, और 10 माइक्रोग्राम की परख प्रोटीन की मात्रा का उत्पादन किया।
    2. एक 48 अच्छी तरह से फ्लैट नीचे microplate में प्रत्येक प्रतिक्रिया परख प्रदर्शन। प्रत्येक परख हालत के लिए, तैयार सब्सट्रेट निलंबन के 200 μl करने के लिए संबंधित प्रोटीन निलंबन के 10 μl जोड़ें। प्रोटीन समाधान प्रतिक्रिया बफर का उपयोग कर 10 μl करने के लिए प्रतिक्रिया करने के लिए जोड़ा की मात्रा में किसी भी बदलाव को समायोजित करें।
    3. प्लेट सील फिल्म के साथ microplate सील मात्रा वाष्पीकरण के कारण परिवर्तन से बचने के लिए। में निर्धारित इष्टतम पर एक प्रकार के बरतन इनक्यूबेटर में सेतेदिए गए प्रोटीन झटकों के साथ 16 घंटे के लिए रोगाणुरोधी के लिए cubation तापमान।
    4. ऊष्मायन के बाद, अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए इथेनॉल के 25 μl जोड़कर प्रतिक्रिया की गिरफ्तारी और 2 मिनट के लिए 3,000 XG पर centrifugation द्वारा पचाया नहीं सब्सट्रेट हटा दें।
    5. एक 96 अच्छी तरह से फ्लैट नीचे microplate करने के लिए प्रत्येक प्रतिक्रिया मिश्रण के लिए प्रतिक्रिया सतह पर तैरनेवाला के 150 μl स्थानांतरण, देखभाल करने के पचाया नहीं सब्सट्रेट की गोली बाधित करने के लिए नहीं।
    6. enzymatic गतिविधि यों, एक microplate स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग 595 एनएम पर तैरनेवाला की absorbance के उपाय। एक खाली प्रतिक्रिया, एंजाइम को छोड़कर सभी घटकों के साथ प्रतिक्रिया incubated, किसी भी डाई कि RBB लेबल सब्सट्रेट से ऊष्मायन के कारण रिलीज घटाना करने के लिए इस्तेमाल किया जाता है। लेबल सब्सट्रेट से सतह पर तैरनेवाला में जारी घुलनशील डाई की वृद्धि हुई absorbance enzymatic गतिविधि को एक मात्रात्मक उपाय प्रदान करता है।
      नोट: absorbance में परिवर्तन गतिविधि इकाइयों (एयू), में जहां 1 ए.यू. परिणामों का प्रतिनिधित्व करती है595 एनएम पर डाई रिहाई प्रतिक्रिया सतह पर तैरनेवाला के ऑप्टिकल घनत्व में 0.01 वृद्धि हुई है।

Representative Results

microslide प्रसार परख और मात्रात्मक डाई रिलीज परख स्क्रीनिंग और नए प्रोटीन antimicrobials की प्रारंभिक जांच को मापने के लिए प्रभावी तरीके हैं। प्रत्येक परख फायदे और सीमाएं हैं; हालांकि, जब संयोजन के रूप में प्रदर्शन किया, वे तेजी से प्रारंभिक जांच और एक रोगाणुरोधी के बुनियादी लक्षण वर्णन अनुमति देते हैं।

microslide प्रसार परख कुशलता प्रोटीन antimicrobials उत्पादन, माइक्रोबियल पुस्तकालयों की तेजी से जांच के लिए अनुमति देता है। एंजाइम एकाग्रता का स्तर चिंता का विषय हैं, पता लगाने की कमी की संवेदनशीलता को परख सीमित कर सकता है, प्रतिक्रिया अच्छी तरह से डाई रिहाई परख करने के लिए जोड़ा जा करने के एंजाइम की एक बड़ी राशि की जरूरत पड़ेगी। जैसा कि चित्र 1 में सचित्र, परख के गुणात्मक गुण पर्यवेक्षक प्रत्येक कुएं के भीतर मौजूद रिश्तेदार एंजाइम मात्रा की तुलना करने की अनुमति देते हैं।

में, चित्रा 1 ए में सचित्र में (25 एंजाइम की माइक्रोग्राम), क्षेत्र के अग्रणी धार सब्सट्रेट के पंकिल या अधूरा सेल को प्रदर्शित करता है, जबकि अच्छी तरह से करने के लिए करीब जोन एक और पूरी सब्सट्रेट सेल प्रदर्शित करता है। यह घटना, अग्रणी धार पर diffusing एंजाइम की ह्रासमान एकाग्रता का एक उत्पाद है, क्षेत्र के व्यास का सही माप पेचीदा हो। के रूप में कुओं बी (15 माइक्रोग्राम), सी (10 माइक्रोग्राम), डी (5 माइक्रोग्राम), ई (1.0 माइक्रोग्राम), और एफ (0.1 माइक्रोग्राम) चित्रा 1 में मनाया जाता है, पूरा सेल के क्षेत्र के व्यास विलुप्त होने के लिए dissipates एंजाइम की कम राशि के लिए correlating। हालत एफ (0.1 माइक्रोग्राम) के लिए, agarose भीतर एंजाइम एकाग्रता सीमा के रूप में यह agarose के माध्यम से चलता है, सब्सट्रेट hydrolyzing diffusing एंजाइम कल्पना की जा करने की अनुमति देगा के नीचे है। Microslide प्रसार परख भी शुद्ध बेसिलस subtilis pepti का उपयोग कर चला गया थासब्सट्रेट के रूप में doglycan (चित्रा 2)। जबकि क्षेत्र पेप्टीडॉग्लीकैन की अनिच्छा के समान रूप से agarose में निलंबित करने के कारण पूरे सेल साल्मोनेला enterica साथ मनाया उन लोगों की तुलना में कम परिभाषित किया गया है, अज्ञात रोगाणुरोधी एंजाइम द्वारा पेप्टीडॉग्लीकैन की hydrolysis स्पष्ट है।

डाई रिलीज परख microslide प्रसार परख की तुलना में अधिक संवेदनशील और बहुमुखी परख, एक कम सीमा का पता लगाने और एंजाइम की प्रतिक्रिया को प्रभावित करने पर्यावरणीय कारकों की भिन्नता की अनुमति है। प्रतिनिधि assays में तापमान रोगाणुरोधी एंजाइम के लिए अधिकतम तापमान निर्धारित करने के लिए अलग-अलग किया गया था, 35 डिग्री सेल्सियस पीबीएस में (चित्रा 3) होने के लिए निर्धारित। इस इष्टतम नीले रंग (चित्रा 3 बी) के रूप में अच्छी तरह से 595 एनएम (चित्रा 3 ए) पर absorbance माप से ली गई गतिविधि इकाइयों में प्रतिनिधित्व के रूप में की मात्रा में वृद्धि के रूप में प्रतिक्रिया supernatants में स्पष्ट रूप से देखा जाता है।डाई रिलीज परख की चंचलता शोधकर्ता न केवल तापमान लेकिन यह भी प्रतिक्रिया बफर और बफर घटक तेजी से एक दिया एंजाइम के लिए इष्टतम ऊष्मायन शर्तों का निर्धारण करने के लिए भिन्न करने की अनुमति देता है।

अज्ञात रोगाणुरोधी एंजाइम (चित्रा 4) और α-काइमोट्रिप्सिन नियंत्रण एंजाइम (चित्रा 5) की गतिविधि के स्तर से निर्धारित इष्टतम ऊष्मायन 35 डिग्री सेल्सियस के पीबीएस में RBB लेबल बेसिलस subtilis गर्मी की मौत हो सब्सट्रेट के खिलाफ तापमान पर मापा गया। चित्रा 4 और 5 चित्रा से परिणामों की तुलना इंगित करता अज्ञात रोगाणुरोधी एंजाइम लगभग दो बार बी के लिए समानता है कि subtilis सब्सट्रेट। इसके अलावा, α-काइमोट्रिप्सिन नियंत्रण पूरी तरह से गर्मी की मौत हो बी पचा नहीं किया अच्छी तरह से भीतर subtilis सब्सट्रेट (डेटा) नहीं दिखाया। α-काइमोट्रिप्सिन नियंत्रण की गतिविधि थाली करने के लिए शुरू होता हैAu के आसपास 0.3 माइक्रोग्राम प्रति के रूप में निरंतर अज्ञात रोगाणुरोधी एंजाइम (चित्रा 4 और चित्रा 5) के लिए सभी एंजाइम मात्रा में गतिविधि इकाइयों में वृद्धि की तुलना में। यह संकेत हो सकता है कि अज्ञात एंजाइम एक बड़ा निरंतर गतिविधि है या बी भीतर एंजाइम के लिए उपलब्ध दरार साइटों की एक बड़ी संख्या देखते हैं कि subtilis सब्सट्रेट।

आकृति 1
चित्रा 1:। साल्मोनेला enterica पूरे सेल सब्सट्रेट के खिलाफ एंजाइम गतिविधि microslide प्रसार परख (ATCC 10708) गुणात्मक गर्मी की मौत हो साल्मोनेला enterica subsp के खिलाफ एक अज्ञात प्रोटीन रोगाणुरोधी की गतिविधियों का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था enterica।। अज्ञात रोगाणुरोधी फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) में निलंबित कर दिया है कि संबंधित कुओं लिए जोड़ा गया था के प्रोटीन जनतास्लाइड्स शामिल 25 माइक्रोग्राम (अच्छी तरह से ए), 15 माइक्रोग्राम (अच्छी तरह से बी), 10 माइक्रोग्राम (अच्छी तरह से सी), 5 माइक्रोग्राम (अच्छी तरह से डी), 1 ग्राम (अच्छी तरह से ई), और 0.1 माइक्रोग्राम (अच्छी तरह से एफ)। पीबीएस अकेले assays के नकारात्मक नियंत्रण के लिए इस्तेमाल किया गया था। सेल के क्षेत्र में एक 6 घंटा ऊष्मायन के बाद imaged थे। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2:। एंजाइम गतिविधि बेसिलस subtilis के खिलाफ पेप्टीडॉग्लीकैन कोशिका दीवार microslide प्रसार परख गुणात्मक बेसिलस subtilis 168 के पेप्टीडॉग्लीकैन के खिलाफ एक अज्ञात प्रोटीन रोगाणुरोधी की गतिविधियों का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। अज्ञात रोगाणुरोधी के 10 माइक्रोग्राम प्रति पीबीएस के 20 μl में निलंबित अच्छी तरह से एक microslides के लिए जोड़ा गया है। पीबीएस अकेले एक नकारात्मक रूप में इस्तेमाल किया गया थापरख (अच्छी तरह से बी) के लिए नियंत्रण। सेल के क्षेत्र 37 डिग्री सेल्सियस पर एक 6 घंटे ऊष्मायन के बाद imaged किया गया था। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3:। एक प्रोटीन के लिए इष्टतम प्रतिक्रिया तापमान रोगाणुरोधी डाई रिलीज परख की चंचलता ब्याज 6 के एंजाइम की गतिविधि पर उनके प्रभाव का निर्धारण करने के लिए इस तरह के ऊष्मायन तापमान और buffers के रूप में भौतिक और रासायनिक पैरामीटर, की भिन्नता की अनुमति देता है। जैसा कि इस आंकड़े में सचित्र, अज्ञात प्रोटीन रोगाणुरोधी (1 माइक्रोग्राम) की गतिविधि ऊष्मायन तापमान की एक श्रृंखला के तहत RBB लेबल गर्मी की मौत हो बेसिलस subtilis के खिलाफ पीबीएस में मूल्यांकन किया गया था। गतिविधि इकाइयों (एयू) में (ए), RBB-बी के absorbance के रूप में प्रदर्शितound उत्पादों सतह पर तैरनेवाला में जारी करने के बाद हाइड्रोलिसिस 595 एनएम पर मापा गया था एक microplate स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग। प्रत्येक तापमान हालत में कोई एंजाइम के साथ जोड़ा प्रतिक्रियाओं किसी भी विमोचन किया डाई कि विभिन्न तापमान पर ऊष्मायन से हुई के प्रभाव को घटाने के लिए इस्तेमाल किया गया। प्रतिक्रिया प्रत्येक ऊष्मायन के तापमान को इसी supernatants absorbance के माप (बी) के लिए पहले imaged थे। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4:। एक प्रोटीन के लिए गतिविधि रेंज रोगाणुरोधी अज्ञात प्रोटीन रोगाणुरोधी गतिविधि श्रृंखला के लिए 0, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, और 1000 एनजी रात भर incubations के बाद गतिविधि इकाइयों के रूप में मापा गया था , बीसीए prot द्वारा मापा के रूप मेंein परख (ए)। इन प्रतिक्रियाओं के लिए, RBB लेबल बी subtilis सब्सट्रेट स्तर को सुनिश्चित करने के लिए कि एंजाइम (1,000 एनजी) की सबसे अधिक राशि के साथ प्रतिक्रिया पूरी तरह से प्रतिक्रिया ऊष्मायन अवधि के भीतर सभी उपलब्ध सब्सट्रेट hydrolyze नहीं किया 595 एनएम पर 5.0 की एक ऑप्टिकल घनत्व देने के लिए बढ़ा दिया गया था। कोई एंजाइम के साथ जोड़ा नियंत्रण प्रतिक्रियाओं किसी भी विमोचन किया अकेले ऊष्मायन की वजह से डाई के प्रभाव को घटाने के लिए इस्तेमाल किया गया। प्रतिक्रिया प्रत्येक एंजाइम राशि के लिए इसी supernatants absorbance के माप (बी) के लिए पहले imaged थे। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5:। Α-काइमोट्रिप्सिन α-काइमोट्रिप्सिन के लिए गतिविधि श्रृंखला के लिए गतिविधि रेंज activ के रूप में मापा गया थाके लिए रात भर incubations के बाद अल्पसंख्यक इकाइयों 0, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, और एंजाइम (ए) के 1,000 एनजी। इन प्रतिक्रियाओं के लिए, RBB लेबल बी subtilis सब्सट्रेट स्तर को सुनिश्चित करने के लिए कि एंजाइम (1,000 एनजी) की सबसे अधिक राशि के साथ प्रतिक्रिया पूरी तरह से प्रतिक्रिया ऊष्मायन अवधि के भीतर सभी उपलब्ध सब्सट्रेट hydrolyze नहीं किया 595 एनएम पर 5.0 की एक ऑप्टिकल घनत्व देने के लिए बढ़ा दिया गया था। कोई एंजाइम के साथ जोड़ा नियंत्रण प्रतिक्रियाओं किसी भी विमोचन किया अकेले ऊष्मायन की वजह से डाई के प्रभाव को घटाने के लिए इस्तेमाल किया गया। प्रतिक्रिया प्रत्येक एंजाइम राशि के लिए इसी supernatants absorbance के माप (बी) के लिए पहले imaged थे। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

microslide प्रसार परख और डाई रिलीज परख का पता लगाने और पहले से अज्ञात प्रोटीन antimicrobials निस्र्पक के लिए लाभ प्रदान करते हैं। ये तेजी से और संवेदनशील तरीकों हित के एंजाइमों अधिक से अधिक अनुसंधान संसाधनों के निवेश करने से पहले की पहचान के लिए जीव स्रोत पुस्तकालयों के उच्च throughput स्क्रीनिंग अनुमति देते हैं। उच्च प्रोफ़ाइल लक्ष्य एंजाइमों के रूप में पहचाने जाते हैं, पता लगाने assays के रूपांतरों तेजी से एंजाइम का पता लगाने के लिए या एंजाइम की जैव रासायनिक विशेषताओं का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, एक multistep प्रोटीन शुद्धि योजना के दौरान, microslide प्रसार परख तेजी से ब्याज की एंजाइम युक्त भिन्न पता लगा सकते हैं। इसके अलावा, एंजाइम के लिए प्रतिक्रिया ऑप्टिमा डाई रिलीज परख में प्रतिक्रिया buffers और ऊष्मायन तापमान में फेरबदल के द्वारा निर्धारित किया जा सकता है।

एंजाइम microslide प्रसार परख में पता लगाने के लिए आवश्यक जन की रेंज एंजाइम characteri का एक समारोह हैStics। परख का पता लगाने सीमाओं आम तौर पर डाई रिहाई परख की तुलना में एंजाइम की उच्च मात्रा के उपयोग की आवश्यकता है। इस अध्ययन में, microslide प्रसार परख (चित्रा 1) डाई रिलीज परख (चित्रा 4) के पता लगाने सीमा की तुलना सचित्र कि microslide प्रसार परख डाई रिहाई परख की तुलना में एक कम संवेदनशील तकनीक है। जब एंजाइम एकाग्रता एक चिंता का विषय नहीं है, microslide परख कम श्रम और उपकरणों की मांग के साथ लक्ष्य substrates के खिलाफ प्रोटीन antimicrobials के उत्पादन के लिए पुस्तकालयों का तेजी से प्रारंभिक जांच के लिए अनुमति देता है। और अधिक प्रयास और उपकरणों की आवश्यकता होती है, डाई रिलीज परख मात्रात्मक परिणाम है कि एक दिया सब्सट्रेट के लिए ही है या अलग अलग एंजाइमों की डाई रिलीज assays के बीच तुलना की अनुमति उपज, अधिक संवेदनशील और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है। दो तरीकों आसानी से अति विशिष्ट उपकरण के लिए कोई जरूरत के साथ सबसे सूक्ष्मजीवविज्ञानी प्रयोगशालाओं में प्रदर्शन कर रहे हैं। प्रतिनिधि मेंसक्रिय assays, नियंत्रण एंजाइम, α-काइमोट्रिप्सिन, 100 एनजी (चित्रा 5) डाई रिहाई परख का उपयोग कर के रूप में के रूप में कम मात्रा में पता चला है, जबकि कम से कम microslide प्रसार परख में पता चला राशि 1 माइक्रोग्राम (नहीं दिखाया डेटा) था।

रोगाणुरोधी एंजाइमों के लिए एक गुणात्मक परख का पता लगाने के रूप में उपयोगिता प्रदान करना, प्रसार परख के रूपांतरों के एक नंबर 11,13 सूचना दी गई है। इन assays की समीक्षा में, microslide प्रसार परख एक प्रारंभिक स्क्रीन के रूप में अपने अपेक्षाकृत उच्च संवेदनशीलता के लिए और प्रतिक्रिया पालन के अपने आसानी के लिए विकसित किया गया था। अल। Lachica एट 11 का काम है, जो में agarose ओवरले स्ताफ्य्लोकोच्चुस के तनाव से न्युक्लिअसिज़ के उत्पादन का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया से संशोधित, microslide प्रसार परख रेडियल immunodiffusion विधि 14 को इसी तरह से चल रही है के रूप में प्रोटीन में अच्छी तरह से diffuses agarose सब्सट्रेट युक्त। रेडियल immunodiffuसायन पद्धति के immunoprecipitation के क्षेत्र के विस्तार रुकती है जब सिस्टम diffusing प्रतिजन और एंटीबॉडी agarose भीतर के बीच एक जटिल गठन संतुलन तक पहुँचता है। इसके विपरीत, microslide प्रसार परख के सब्सट्रेट शुरू में अच्छी तरह से आसपास के सेल की एक लगातार विस्तार क्षेत्र में diffusing प्रोटीन रोगाणुरोधी से पच जाता है। क्षेत्र की बढ़ती व्यास जारी है जब तक एंजाइम खो देता है गतिविधि या सब्सट्रेट समाप्त हो रहा है। सेल के क्षेत्र के उत्पादन की दर एंजाइम की, पवित्रता, और इस तरह विशिष्ट गतिविधि के रूप में जिलाया है या एंजाइम की एकाग्रता बढ़ जाती है अच्छी तरह से करने के लिए जोड़ा।

मात्रात्मक गर्मी मारे बी के खिलाफ प्रोटीन antimicrobials के enzymatic गतिविधि का आकलन करने के लिए subtilis, डाई-रिहाई परख चुना गया था। Remazol खूब ब्लू आर डाई (RBB) का उपयोग वर्णमिति assays -labeled substrates प्रोटीन रोगाणुरोधी गतिविधियों के बहुमुखी और संवेदनशील मूल्यांकन की अनुमतिTy। घुलनशील नीले उत्पादों की रिहाई है कि आसानी से 595 एनएम पर एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर से मापा जा सकता है में RBB लेबल सब्सट्रेट परिणामों के enzymatic हाइड्रोलिसिस। RBB डाई रिलीज परख के कई रूपों, अन्य प्रोटीन रोगाणुरोधी एंजाइमों को चिह्नित करने के लिए विकसित की है, अन्य substrates के साथ आवेदन के लिए इस परख का लचीलापन दिखा। उदाहरण के लिए, bacteriolytic गतिविधि lysostaphin के प्रभाव का निर्धारण करने में, झोउ, एट अल।, RBB रंगे staphylococcal कोशिकाओं और substrates 12 के रूप में staphylococcal पेप्टीडॉग्लीकैन का उपयोग कर एक डाई रिलीज परख की सूचना दी। इस RBB डाई रिलीज परख के आवेदन की एक संशोधन में, RBB लेबल Micrococcus luteus सब्सट्रेट ऐसे जीवाणु संक्रमण और एक घातक कार्सिनोमा की उपस्थिति, जैसे रोगों के लिए एक तेजी से और संवेदनशील साधन के रूप में उपयोग के निदान के लिए और स्क्रीन के लिए प्रस्तावित किया गया था जो कर सकते हैं रक्त सीरम 15 में मानव लाइसोजाइम अभिव्यक्ति के स्तर को सहसंबद्ध किया। एक इसके अलावा, RBB लेबल बैक्टीरिया कोशिका substrates हैLSO लाइसोजाइम 16 का पता लगाने के लिए एक zymogram विधि में इस्तेमाल किया गया।

हम उतारा सीमा का पता लगाने, सुविधा, और डाई रिलीज परख के reproducibility का प्रदर्शन, एंजाइम उत्पादन के लिए तेजी से पुस्तकालय स्क्रीनिंग के लिए अनुमति देता है। परख का संशोधन तापमान, पीएच, और लवणता के प्रभाव के रूप में अच्छी तरह से रोगाणुरोधी प्रोटीन 6 की गतिविधि पर अन्य एंजाइमों के प्रभाव सहित नीचे की ओर मात्रात्मक जैव रासायनिक लक्षण वर्णन assays, के लिए अनुमति देते हैं। इसके अलावा, मात्रात्मक डाई रिलीज परख एक दिया सब्सट्रेट के लिए कई एंजाइमों की गतिविधियों की तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। RBB डाई रिलीज परख लक्षण और प्रोटीन रोगाणुरोधी एजेंटों का पता लगाने के अलावा polysaccharides के खिलाफ गतिविधि के साथ एंजाइमों के लिए उपयोगिता की सूचना दी है। Pettersson और एरिकसन endoglycanase गतिविधि का पता लगाने अनाकार, सेल्यूलोज, xylan, मन्नान, और चिट के RBB रंगे polysaccharide मनकों का उपयोग के लिए एक परख सूचना दी17 में। इन निष्कर्षों का एक विस्तार में, काइटिनेस बेसिलस thuringiensis बीटी -107 द्वारा उत्पादित एंजाइमों का पता लगाने के लिए एक संवेदनशील तरीका कोलाइडयन काइटिन RBB 18 के साथ लेबल का उपयोग कर विकसित किया गया था। इन और अन्य अध्ययनों से, RBB रंगे substrates के व्यावसायिक रूप से उपलब्ध स्रोतों केरातिन, amylopectin, amylose, ग्लाइकोजन, laminarin, डी-xylan, azo-जौ Glucan, और स्टार्च के खिलाफ उन सहित glycolytic गतिविधि का पता लगाने के लिए उपयोग में उभरा है।

इस अध्ययन में, हम एक microplate प्रारूप में डाई रिलीज परख की उपयोगिता का प्रदर्शन, RBB लेबल सब्सट्रेट और एंजाइम वर्णमिति परिणाम का उत्पादन करने की आवश्यकता की मात्रा को कम करने। जैसा कि चित्र 4 और 5 चित्रा में सचित्र, microplate डाई रिलीज परख enzymatic गतिविधि का पता लगाने के लिए microslide प्रसार परख की तुलना में कम सीमा का पता लगाने प्रदान करता है। व्याख्या का तेजी से उपयोग के संबंध में, श्रम के संरक्षण, और आसानी के साथ, Microslide प्रसार परख रोगाणुरोधी गतिविधि की उपस्थिति के साथ ही नीचे की ओर प्रोटीन अलगाव और शुद्धि चरणों में रोगाणुरोधी प्रोटीन उपस्थिति के संकेत के लिए प्रारंभिक उच्च throughput स्क्रीन में उपयोगिता प्रदान करता है। इन दो assays के संयोजन प्रारंभिक जांच और उपन्यास प्रोटीन antimicrobials का परम लक्षण वर्णन में एक दूसरे के पूरक

Disclosures

लेखकों घोषणा की कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि। MITRE निगम एक नहीं के लिए लाभ कंपनी है कि कई संघ वित्त पोषित अनुसंधान और विकास केन्द्रों (FFRDCs) संचालित है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
48-well flat-bottom microplate with low evaporation lid Becton Dickinson 3078
96-well flat-bottom microplate (Costar 3595) Corning, Inc. 3595
agarose Fisher Scientific BP162-100
α-chymotrypsin MP Biomedicals 215227205
Bacillus subtilis 168 American Type Culture Collection 23857
C1000 Touch Thermal Cycler Bio-Rad
cork borer Humboldt H-9661
lysozyme Sigma-Aldrich L6876-1G
McFarland equivalence standard (2.0) Fisher Scientific R20412
microslides Fisher Scientific 22-38-103
nutrient broth Fisher Scientific S25959B
peptidoglycan of Bacillus subtilis 168 Sigma-Aldrich 69554-10MG-F
phosphate-buffered saline (1x) Teknova P0200
Pierce BCA Protein Assay Kit Life Technologies 23227
Synergy HT microplate spectrophotometer BioTek Instruments, Inc.
Remazol brilliant blue R dye (RBB) Sigma-Aldrich R8001
Salmonella enterica subsp. enterica American Type Culture Collection 10708
sodium azide Fisher Scientific S227-100
sodium hydroxide (NaOH) Fisher Scientific S318-500
Titer Tops pre-cut adhesive polyethylene film Diversified Biotechnology T-TOPS-50
UltraPure distilled water Invitrogen 10977-015
Name Company Catalog Number Comments
Solution
agarose solution
50 ml PBS
0.25 g agarose
Add 10% sodium azide to the molten PBS/agarose solution
nutrient broth medium
4 g nutrient broth
500 ml Type I water
250 mM sodium hydroxide (NaOH) solution
1 g NaOH
99 ml Type I water
200 mM Remazol brilliant blue R dye (RBB)
1.25 g RBB
98.75 ml 250 mM NaOH solution

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References

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जांच के लिए गुणात्मक और मात्रात्मक assays और प्रोटीन antimicrobials की विशेषता
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Farris, M. H., Ford, K. A., Doyle, R. C. Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials. J. Vis. Exp. (110), e53819, doi:10.3791/53819 (2016).More

Farris, M. H., Ford, K. A., Doyle, R. C. Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials. J. Vis. Exp. (110), e53819, doi:10.3791/53819 (2016).

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