Abstract
De fleste undersøgelser af morfogenese stole på kvalitative beskrivelser af, hvordan anatomiske træk påvirkes af forstyrrelser af specifikke gener og genetiske pathways. Kvantitative beskrivelser er sjældent udført, selv om genetiske manipulationer producere en række fænotypiske effekter og observeres variationer selv blandt individer inden kontrolgrupper. Nye beviser for, at morfologi, størrelse og placering af organeller spiller en tidligere underappreciated, men grundlæggende rolle i celle funktion og overlevelse. Her giver vi trin-for-trin instruktioner til at udføre kvantitative analyser af fænotyper på Drosophila larvestadiet neuromuskulære junction (NMJ). Vi bruger flere pålidelige immunhistokemisk markører kombineret med bio-imaging teknikker og morfometriske analyser til at undersøge virkningerne af genetiske mutationer på specifikke cellulære processer. Især fokuserer vi på kvantitativ analyse af fænotyper påvirker morfologi, størrelse og placering af nuclei inden for de tværstribede muskler Drosophila larver. Den Drosophila larver NMJ er et værdifuldt eksperimentel model til at undersøge de molekylære mekanismer bag strukturen og funktionen af det neuromuskulære system, både i sundhed og sygdom. Dog kan de metoder, vi beskriver her udvides til andre systemer.
Protocol
1. Eksperimentel Forberedelse
Bemærk: Dissektioner og immunhistokemisk procedurer i afsnit 2 og 3 udføres i henhold til referencer 3-6, men med modifikationer.
- Forbered 1x phosphatpufret saltvand (PBS) og PBS indeholdende 0,1% Triton-X 100 (PBT). Hold dem på is.
- Forbered Bouins fiksativ (15 pikrinsyre: 10 Formaldehyd: 1 Eddikesyremetode). Gør dette reagens frisk.
- Vælg ren rustfrit stål minutien stifter og fine pincet.
- Forbered dissektion plader indeholdende en Sylgard disk i en 5 cm petriskål.
2. Dissektion af tredje-stadium Larve NMJs
- Pick vandrer tredje stadie larver fra et hætteglas eller en flaske med en fin børste og placere dem i en 2 cm petriskål indeholdende 4 ° C PBS for at vaske det tilbageværende fødevarer væk.
- Placer en larve på toppen af Sylgard overflade dissektion plade og sørg for, at det er positioned med dens dorsale side op, så de to langsgående trakeale rør er synlige på toppen.
- Brug af pincet til at holde stiften, pin larven ned på sin forreste ende, lige under munden krog. Stræk larven ud så meget som muligt og pin sin bageste ende ned.
- Tilføj nok PBS saltvand for at nå væggene i pladen og fordybe larve.
- Gentag proceduren fra trin 2.1 til 2.3 for andre larver af samme genotype. En enkelt 5 cm petriskål dissektion plade kan nemt rumme op til 8 larver.
- Brug af mikro-dissektion saks, lidt løft dorsale neglebånd og lave et lille vandret snit i den bageste ende nær stiften.
- Indsæt saks i indsnittet, klippe larve hele vejen til den forreste ende langs midterlinien mellem de to langsgående skrifter af luftrøret. Sørg for, at midterlinjen nedskæringer er overfladiske nok bare passere gennem neglebånd og at undgå at skære gennem musklerne påden ventrale side.
- Ved hver ende, skære to indhak på både venstre og højre side.
- Åbn filet ved at placere to stifter på begge sider af den forreste indsnit. Gentag det samme med den bageste ende. Når du placerer benene, så sørg for at sprede kropsvæggen hinanden.
- Rens de indre organer ved hjælp af pincet og PBS saltvand. Efterlad centralnervesystemet intakt. strække forsigtigt larve med hjørne stifter indtil den er helt strakt, men sørg for, at musklerne ikke revet under denne proces.
- Gentag den samme dissektion procedure for den anden larver på samme dissektion plade.
- Vask med PBS saltvand tre gange for at fjerne alle de indre organer.
- Erstatte PBS med Bouins fiksativ og henstår ved stuetemperatur i 10 min.
- vaskes flere gange med PBT.
- Fjern benene omhyggeligt og overføre alle de præparater, som nu er temmelig stive, i en 1,5 ml mikro-centrifuge rør til immunfarvning.
3. Immuno-histokemisk Farvning af Drosophila NMJs med antistoffer specifikke for Muskler og Myonuclei
- Hurtigt skylle larver fileter i PBT.
- Blokere præparater ved inkubering med 10% normalt gedeserum (NGS) i PBT i 2 timer under konstant omrøring.
- Inkuber et sæt af dissekerede NMJs i PBT indeholdende 5% NGS og et kanin-anti-lamin antistof (ved en koncentration på 1: 500) og med et marsvine-anti-DVAP antistof (ved en koncentration på 1: 500) i 2 timer ved stuetemperatur eller ved 4 * C natten over. Den anti-DVAP antistof pletter de tværstribede muskler, mens anti-lamin farvning registrerer konturen af myonuclei.
- Der vaskes én gang hurtigt i PBT at fjerne antistofferne i overskud. Vask i PBT i 2 timer ved at ændre PBT buffer hver 15 min.
- Inkuber prøverne i PBT indeholdende 5% NGS og fluorescensmærkede sekundære antistoffer ved 1: 500 fortynding i 2 timer ved stuetemperatur. De samme prøver cen underkastes farvning med flere antistoffer samtidigt, hvis der anvendes sekundære antistoffer konjugeret med forskellige kromoforer.
- Fjern sekundære antistoffer og vask i PBT i 2 timer ved at ændre PBT buffer hver 15 min.
- For at plette det indre af myonuclei vaske prøverne tre gange med PBS og gør følgende:
- Tilsæt nukleare markør TO-PRO-3 ved en fortynding på 1: 1.000 i PBS og inkuberes i 20 min under konstant omrøring. Denne markør er anvendt i denne undersøgelse, men enhver anden kommercielt tilgængelig nuklear markør kan anvendes.
- Vask hurtigt tre gange i PBS før montering.
4. Montering Prøver på Slides
- Saml prøverne op med en pincet fra 1,5 ml mikro-centrifugerør og lægge dem ned på en behandling dias.
- Ved at bruge mikro-dissektion saks, klippe hovedet og halen af fileterne og holde deres indre overflade op.
- Forbered the monteringsglideren af indpakning omkring tre strimler af cellulose tape på hver side af et rent objektglas i en afstand på ca. 1 cm fra hinanden. Når dækglasset er placeret på toppen af de to strimler, vil et hul genereres der vil undgå udfladning af prøverne. Dette er afgørende, hvis der skal foretages tredimensionelle volumen gengivelser af strukturer.
- Sætte en lille dråbe på ca. 20 pi af monteringsmedium midt monteringsglideren mellem de tre cellulose tape strips.
- Efter sprede montering medium med rene pincet trække det dissekerede larver til montering glide ind i montering medium, idet den indre overflade op. Prøv at montere dem i rækker af fire eller fem.
- Forsigtigt droppe en dækglas oven på montering dias og sørg for, at der genereres ingen luftbobler. Forsegl dias med gennemsigtig neglelak. Lad prøverne tørre i mindst 10 min før billeddannelse.
5. Konfokal Indstillinger for Imaging
Bemærk: Billeder præsenteres i denne undersøgelse er taget med et Nikon A1R konfokal enhed integreret på en Ti: E inverteret mikroskop. Men enhver konfokalt mikroskop med et minimum af 3 laser enheder til rådighed i bølgelængdeområder af 488 nm, 561 nm og 642 nm og en 3-kanals påvisningssystem er egnet til dette formål.
- Tænd for lasere, detektor enhed, kviksølv pære, scene controller, mikroskop og den pc. Start kontrol software og sikre slide på holderen scenen.
- For at gøre billedbehandling hurtigere, skal du vælge og markere alle regioner af interesse (ROI) på prøven ved hjælp af en 20X mål.
- svinge forsigtigt næsestykket til 60X større forstørrelse objektiv (60X Plan Apo VC / NA 1.4 OIL).
- Placer en dråbe immersionsolie på objektiv og vælg en af de markerede ROI fra XYZ overblik vindue på computeren.
- Start imaging ved hjælp af følgende optiske indstillinger: Vælg den første Dichroic Mirror: 405/488/561/640. Vælg 488 nm laser med emission filter 525/50 nm i kanal 1, 561 nm laser med 595/50 emission filter i kanal 2 og 642 nm laser med lange-pass filter 650 nm i kanal 3.
- Brug følgende scanningsindstillinger, før du starter erhvervelse billede: Vælg Galvano scanner; Scan retning: én måde; Scan hastighed: 0,5 billeder pr sek.
- Vælg Channel serie for at undgå kanal gennemblødning.
- Juster pin-hole størrelse til 1 luftige enhed. Scan og justere laser magt, afsløring gain og offset passende for hver kanal for at undgå pixel mætning og baggrundsniveau.
- Anskaf z-stakke ved at bruge voxel størrelse 0,2 x 0,2 x 0,5 um 3 for alle ROI'er og slide præparater. Hvis billederne vil blive udsat for udfoldning derefter indstille voxelstørrelsen til 0,06 x 0,06 x 0,15 um 3.
- Gem billeder i .nd2 filformat eller .ics format.
6. Beregning af afstanden mellem kerner inden Striated60, Muskler ved fremgangsmåden i nærmeste nabo Analysis
- Til denne analyse, at bruge konfokale billeder viser larver krop-væg muskler farvet med DVAP antistoffer at visualisere musklerne og med Lamin antistoffer og en nuklear markør for at fremhæve de kerner.
- For at estimere den nærmeste afstand mellem kerner, bruge målepunkter inden for MeasurementPro modul af billedanalysesoftware (f.eks Imaris). Andre lignende programmer, for billedanalyse kan anvendes til samme formål.
- Åbn konfokale billeder. For at starte, skal du dobbeltklikke på ikonet software. Træk og slip konfokale z-stak billeder i arenaen.
- Dobbeltklik på billederne for automatisk at åbne dem i overgå View, under bar ikon menu værktøj
. Den overgå View har tre primære arbejdsområde paneler: View Area, Objekt List og objektegenskaberne Area. - Opret en volumen afsmeltet three kanal billede ved at klikke på menuen ikonet 3D-visning
. - Klik på Points ikonet Tilføj ny måling
fra Objekter værktøjslinje og følg skabelsen guiden, der vises i Object Properties Area. - Fra guiden oprettelsen vælge fanen Rediger først og derefter bestemt kanal. Vælg enten den nukleare markør eller lamin kanal at fremhæve kerner.
- Indstil markøren til Vælg tilstand ved at trykke på fanen Esc på tastaturet.
- Juster størrelsen på 3D-markøren boks med musehjulet til at indeholde en given kerne i billedet. Tilføj et målepunkt ved at holde Shift-tasten nede og venstre museklik på den samme kerne.
- Tilføj det andet punkt på en nærliggende kerne på samme muskel ved at gentage de forrige trin. En linje trækkes automatisk mellem de to punkter og den målte afstand mellem de to kerner vises. Afstanden mellem de to kerner er nu registreret som en statistisk variabel i Object Properties-området under fanen Statistik> Detaljerede> Distance data.
- Gentag proceduren fra trin 6.6 til 6.10 for alle kerner omkring en given kerne.
- Fra Statistik> Detaljeret> Distance datavisningstrin alle indsamlede målepunkter, skal du vælge den korteste afstand.
- Ved at klikke på Export Statistik på Tab Display til fil
tilgængelig under Object Properties Area, vil data blive gemt på et regneark. - Gentag den samme procedure for de andre omkringliggende kerner og for et udvalgt antal muskelfibre pr genotype.
- Brug af data eksporteres til et regneark fil, beregne den gennemsnitlige korteste afstand (D ave) for alle M antal muskler ved hjælp af følgende ligning:
OAD / 53821 / 53821eq1.jpg "/>
Di er den korteste afstand til den nærliggende kernen for en given kerne i, hvor i varierer fra 0 til N og N er antallet af kerner er analyseret pr muskel. Den summation af værdier fra j = 0 til j = m angiver M antallet af analyserede muskler. - Alternativt kan du bruge Steder Creation guiden og Steder til pletter tætteste afstand til at estimere den gennemsnitlige afstand til nærmeste kernen. Til dette er der behov for en Matlab udvidelsesmodul.
- Dobbeltklik på et bestemt billede på Arena og en 3D-volumen billede vil blive vist i View-området. Klik på ikonet Object Creation og tilføje nye steder
fra Objects værktøjslinjen. - Fra oprettelsen guiden i Object Properties Area, skal du klikke på indstillingen Skip Automatisk oprettelse, Rediger manuelt.
- Vælg enten lamin eller nukleare markør kanal at vise kerner.
- Shift og klik left museknap på alle kernerne i en specifik muskel i billedet. En plet på hver kerne vises.
- Vælg Steder til Steder tætteste afstand angivet under fanen Funktioner i Object Properties-området. Vælg spots Statistik under Resultat mode og en Matlab vises.
- Under fanen Statistik, vælg detaljerede og derefter specifikke værdier. Klik på Distmin og værdierne af de minimumsafstande for hver kerne vises.
- Eksportere data til et regneark fil og beregne gennemsnittet af disse afstande pr muskel. Gentag proceduren for alle musklerne i en given genotype.
- Dobbeltklik på et bestemt billede på Arena og en 3D-volumen billede vil blive vist i View-området. Klik på ikonet Object Creation og tilføje nye steder
. Den overgå View har tre primære arbejdsområde paneler: View Area, Objekt List og objektegenskaberne Area. 
. 
fra Objekter værktøjslinje og følg skabelsen guiden, der vises i Object Properties Area. 
tilgængelig under Object Properties Area, vil data blive gemt på et regneark. 
fra Objects værktøjslinjen. 7. Bestemmelse Form af kerner i kroppen-væg Muskler af Drosophila Larver
- Til denne analyse, at bruge konfokale billeder af kroppen-væg muskler farvet med lamin og en nuklear markør til at visualisere kerner.
- For at evaluere formen af myonuclei, foranstaltning kugleform (defineret som forholdet mellem den suransigtet området af en kugle med det samme volumen som den givne kerne, med overfladearealet af kernen) eller ellipseform (skelner mellem fladtrykte / prolate ellipsoider og sfæroider).
- Åbn billedet som tidligere beskrevet. Klik på ikonet Objekter værktøjslinjen Tilføj ny Overflader
. - I skabelsen guiden, der vises i Object Properties Area, vælg den nukleare markør farvning som kilde Kanal for at vise kerner.
- Sæt indstillingen Absolutte Intensitet som tærskel. Sørg for, at de fleste af de kerner viser en glat og ikke overbelastes gengivelse ved at ændre værdien på tærsklen kurven. Samtidig, undgå tilstedeværelsen af huller eller ufuldstændige maske til enhver nucleus anvendelse af den samme kurve.
- Brug Filter værktøj til at udelukke enhver støj i overfladen rendering. Under fanen Rediger i den nyoprettede overfladelag, Split eller Flet de kerner overflader, der er forkert rendered.
- Eksport til et regneark fil ellipticiteten og kugleform værdier af overfladen afsmeltet kerner, der er tilgængelige under fanen Statistik.
- Alternativt kan du bruge ImageJ eller Fiji software til at måle cirkulær kerner hvor Cirkulariteten (C) er defineret som C
. En værdi på én repræsenterer en perfekt cirkel, mens en værdi nærmer sig nul indikerer en stadig aflang form. - Opret maksimal intensitet fremskrivninger af z stakke fra menuen Billeder> Stakke> Z Project. Indstil projektion type Max Intensitet.
- Split kanalerne og Vælg den nukleare markør kanal.
- Fra hovedmenuen skal du vælge Image> Juster> Threshold.
- Segment kernerne ved at justere tærsklen intensitet. Hvis de nærliggende kerner segmenteres som en enkelt enhed, skal du klikke på Process> Binary> Watershed værktøj til at frakoble kerner.
- Fra hovedmenuen skal du vælge Rediger> Svalg> Opret valg.
- Tilføj alle de valgte ROI'er til ROI Manager ved at klikke på menuen Analyze> Værktøjer> ROI Manager. I vinduet ROI manager klik på Tilføj. Inden for samme vindue vælge Mere> Split.
- Vælg formdeskriptorer i Analyser> Set Målinger. I vinduet ROI manager klikke på fanen Måle. Dette vil vise en liste over cirkularitet værdier for alle de valgte kerner.
- Endvidere at måle nukleare volumen, følge overfladen guiden skabelse ved hjælp af nuklear markør farvning kanal som beskrevet i underafsnit 7,3-7,7.
. 
. En værdi på én repræsenterer en perfekt cirkel, mens en værdi nærmer sig nul indikerer en stadig aflang form. 8. 3D Volume gengivelser af Selected Kerner inden for Drosophila larvestadiet Krop-væg Muskler at evaluere intranucleær Lokalisering af et specifikt protein
- Brug konfokale billeder rapportering krop væg muskler farvet med en nuklear markør og med antistoffer specifikke for lamin og DVAP.
- Åbn billederne ved at initiere softwaren og select den specifikke kerne, der skal analyseres. Dette kan gøres ved at vælge den primære menupunktet Rediger> Beskær 3D.
- Følg overflade wizard skabelse ved hjælp lamin kanal som beskrevet i underafsnit 7,3-7,7.
- Når overfladen er oprettet, skal du klikke på Rediger i Objekter Egenskaber Area og vælg derefter Mask Alle for at isolere signalet inde i kernen. Dette skaber et nyt vindue.
- Vælg DVAP signal fra Vælg kanal rullemenuen. Vælg DVAP immunreaktivitet signal inde i kernen ved at klikke på optionen Voxels Outside The Surface til nul. En ny maskeret kanal er oprettet og fås i display justering vindue til valg af.
- For at visualisere tilstedeværelsen af signal inde i kernen oprette en kontur fly ved at klikke på ikonet Tilføj ny Clipping Plane
fra Objects værktøjslinjen. - Interaktivt justere vinklen af klipningfly og dets position til at visualisere fordelingen af signalet inde i kernen.
fra Objects værktøjslinjen. Representative Results
ALS er en degenerativ sygdom især berører motoriske neuroner fører til en gradvis og dødelig lammelse af tværstribede muskler 7. Missense mutationer i humane VAMP-associeret protein B (hVAPB) forårsage en række motoriske neuronsygdomme herunder ALS Type 8 8-12. En missense mutation (V234I) i hVAPB genet er for nylig blevet identificeret i ét tilfælde af typiske ALS i mennesker 13. For at vurdere sit patogene potentiale, genereret vi transgene fluer, der udtrykker hVAPB Drosophila ortholog DVAP bærer sygdomsfremkaldende mutation (DVAP-V260I). Ekspressionen af dette transgen blev målrettet til musklerne ved hjælp af UAS / GAL4 systemet og muskel-specifikke driver BG57-Gal4 14,15. Virkningen af DVAP-V260I transgen ekspression blev sammenlignet og kontrasteret med den for to andre transgener (DVAP-WT1 og DVAP-WT2), som udtrykker forskellige niveauer af vildtype DVAP protein 16. More specifikt stigningen i DVAP immunoreaktivitet er 2,2 gange højere end i styringer til DVAP-WT2 linje, mens DVAP-V260I og DVAP-WT1 udviser sammenlignelige og lavere niveauer af det samme signal 16.
Nuclear ændringer har været forbundet med aldring og flere neurodegenerative sygdomme, herunder Parkinsons sygdom 17,18. For at vurdere, om vores flyve model for ALS8 udstiller ændringer i nukleare arkitektur, placering og størrelse, vi farvede kerner inden tværstribede muskler passende genotyper med en nuklear markør og anti-lamin antistof 19-22, der visualiserer den nukleare kuvert. At fremhæve de muskler blev en DVAP-specifikt antistof også tilsat til de samme prøver (figur 1). Konfokale billeder blev indsamlet og detaljerede morfometriske analyser blev udført ved anvendelse af et billedanalysesystem software. I kontrolforsøg muskler, fandtes kerner skal være jævnt fordelt langs musklenfibre mens i DVAP-V260I og DVAP-WT udtrykker muskler, kerner udviser en tendens til at omfordele i tæt knyttet klynger (Figur 1).
Vi gennemførte en nærmeste nabo-analyse til at udføre en kvantitativ vurdering af fordelingen af kerner langs muskelfibrene af enhver genotype. En nærmeste nabo analyse identificerer først den nærmeste nabo for hver kerne ved at måle afstanden mellem midten af en given kerne og centrum af hver anden omgivende kerne. Denne procedure gentages for alle andre kerner langs muskelfibrene. Endelig den korteste afstand mellem kerner inden for en bestemt muskel, beregnes ved at tage gennemsnittet de korteste afstande på hver kerne og de nærmeste naboer. (Figur 2A - C). Sammenlignet med kontroller, muskler udtrykker enten DVAP-V260I transgen eller et af transgenerne overudtrykker vildtypeproteinetPræsenterer en dramatisk reduktion i den gennemsnitlige korteste afstand mellem kerner og, som en konsekvens, kerner synes at være tæt forbundet i klynger. Virkningen af ALS frembringende allel DVAP-V260I er mere alvorlig end den forbundet med overekspression af vildtype-proteinet, selvom den stærkeste DVAP-WT2 transgen anvendes (figur 1 og figur 2D).
Overekspression af enten DVAP-V260I eller DVAP-WT transgener udviser også en alvorlig forværring af den nukleare arkitektur resulterer i deforme kerner med en aflang struktur (figur 1). Denne strukturelle aberration blev kvantificeret ved hjælp af ImageJ software, hvor cirkulariteten er defineret ved formlen C 
, Som måler bredden til forholdet længde hver kerne med C = 1 repræsenterer en perfekt cirkel og C = 0 en uendelig langstrakt polygon. I control kerner udviser en tydelig rund form, C er lig med 1, mens i de transgene mutanter en ændring af formen med deraf følgende tab af cirkularitet, forårsager en væsentlig afvigelse fra denne værdi (figur 1 og figur 3).
Vi fandt også, at i muskler, der udtrykker de samme transgener, kerner vise en markant forstørret nukleart volumen sammenlignet med kontroller, selv om ALS frembringende allel ser ud til at være mere effektivt til at inducere denne fænotype sammenlignet med DVAP-WT transgener (figur 4).
Næsten alle neurodegenerative sygdomme er kendetegnet ved den intracellulære akkumulering af aggregater, der indeholder den patogene protein. Vi gjorde 3D rekonstruktioner og volumen gengivelser af kerner og vi fandt, at i muskler, der udtrykker mutanten transgen eller overudtrykker vildtype-protein, DVAP immunreaktivitet dannede klynger and at nogle af dem også blev lokaliseret i kernerne (figur 5). Omvendt i kontrol NMJs, DVAP immuno-reaktivitet er svagt spredt i hele muskel fiber og er udelukket fra kernen 16.
. Figur 1: Konfokal billeder af myonuclei inden tværstribede muskler, der udtrykker enten DVAP-WT eller DVAP-260I transgener (A) BG57-Gal4 / + kontrol, (B) BG57; DVAP-V260I, (C) BG57; DVAP-WT1 og (D) BG57; DVAP-WT2 muskler udtrykker de angivne transgener farves med antistoffer specifikke for DVAP (rødt signal), lamin (grønt signal) og med en nuklear markør til at visualisere kerner (blå signal). Scale bar = 30 um Klik her for etstørre version af denne figur.
Figur 2: Nærmeste nabo analyse for at bestemme den gennemsnitlige afstand mellem en kerne og fælles nærmeste nabo (B) Repræsentative resultater, der viser ændrede nuklear positionering i muskler overudtrykker DVAP-WT2 transgen sammenlignet med kontroller i (A).. Gennemsnitlig nuklear afstand i musklerne i de angivne genotyper blev estimeret under anvendelse af formlen i (C) og de data rapporteres i (D). Larval NMJs farves med antistoffer specifikke for DVAP (rødt signal), lamin (grøn) og med en nuklear markør (blå signal). En asterisk angiver statistisk signifikans. *** P <0,001, ** P <0,01. Til statistisk analyse af dette eksperiment og alle eksperimenterne nedenfor rapporterede en envejs ANOVA-test blev anvendt, og en Tukeys multiple sammenligningstest blev påført som en post-hoc test, når forskellene mellem genotyper blev fundet at være signifikant ved ANOVA-test. Fejl- søjler repræsenterer SEM. Scale bar = 30 um Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3:. Billeder, der viser repræsentative trin i beregningen af den nukleare volumen (A) Et repræsentativt billede, der viser segmenterede kerner bruger guiden skabelsen overflade. Kerner ved grænsen af billederne blev ignoreret. (B) billede viser den nukleare DVAP signal efter det omgivende DVAP farvning er blevet maskeret ved hjælp af overfladen skabt i den nukleare markør kanal. (C) Overflade lag giver oplysninger om yderligere parametreherunder nukleare volumen og kugleform. (D) Data om nuklear volumen af forskellige genotyper. En asterisk angiver statistisk signifikans. Dissekerede NMJs blev farvet med anti-DVAP antistoffer (rødt signal), anti-Lamin antistoffer (grønt signal) og en nuklear markør (blå signal). *** P <0,001, ** P <0,01. Fejl- søjler repræsenterer SEM. Scale bar = 30 um Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Billeder viser repræsentative trin i estimeringen af nukleare form ved ImageJ. Maksimal intensitet projektion af billeder blev analyseret under anvendelse ImageJ at estimere cirkularitet af kerner inden muskler. (A) Et repræsentativt eksempel på intensiteten projektionaf de tre kanaler billedet som i trin 7.9 i protokollen. (B) billede viser trin 7.10 i protokollen i hvilke kanaler er delt og den nukleare markør kanal vælges. (C) Et repræsentativt billede, der viser, at efter anvendelse tærskel intensitet at segmentere kerner og ROI Manager plugin i ImageJ, kan alle kerner af interesse vælges og deres form målt gennem Shape deskriptorer (trin 7,11-7,15). (D) Kvantificering af cirkulær forskellige genotyper. På larval NMJs, den røde signal angiver DVAP farvning, mens den grønne skitserer kerner og svarer til lamin farvning. Det indre af hver kerne er mærket med blåt på grund af farvning med en nuklear markør. En asterisk angiver statistisk signifikans. *** P <0,001, ** P <0,01. Fejl- søjler repræsenterer SEM. Scale bar = 30 um Klik hendee for et større version af denne figur.
Figur 5: Billeder, der viser konkrete skridt i skabelsen af volumen gengivelser af myonuclei. (A) billede, der viser 3D intensitet blandet visning af muskler farvet med DVAP protein (rød), lamin (grøn) og DNA-markøren (blå). (B) billede, der repræsenterer et overfladelag frembringes ved brug af lamin kanal til segment kernerne. (C) billede, der repræsenterer en kerne, hvor overfladelaget er blevet anvendt til at maskere den DVAP signal uden for det valgte kerne. Markeret med gult er en klipning fly, der er blevet føjet til billedet. Dens synsvinklen og position kan interaktivt justeres til at visualisere fordelingen af signal inde i kernen. (D) Et billede rapporterer et tværsnitsbillede af det nukleare overfladelag skabt USIng af lamin kanal fusioneret med umaskeret DVAP og markør signaler nukleare. (E og F) Yderligere sektionerede volumen gengivelser af samme kerne. Scale bar = 10 um Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Før i tiden blev morfologiske variationer i og mellem forsøgsgrupper sjældent taget i betragtning. Imidlertid er anvendelsen af kvantitative metoder nu ved at blive normen i sammenlignende studier af morfologi og matematisk beskrivelse af anatomiske former beregnes. Brugen af kvantitative analyser at vurdere virkningerne af genetiske manipulationer om specifikke cellulære processer, holde løfte i at forbedre vores evne til at detektere morfologiske ændringer og forbedre nøjagtigheden, hvormed disse ændringer er beskrevet. Endvidere statistisk analyse af kvantitative data giver os mulighed for at vurdere, om observerede forskelle mellem fænotyper er betydelige.
I tværstribede muskler, kerner udviser en tydelig afrundet struktur og er jævnt fordelt langs muskelfiber. Selvom de molekylære mekanismer oprettelse og vedligeholdelse af størrelse, form og arkitektur kerner ikke er kendt, disse nukleare funktioner er sandsynligvis to spille en afgørende rolle i at kontrollere muskelfunktion. Faktisk er flere myopatier forårsaget af mutationer i gener, der regulerer morfologi og placering af kerner inden muskler. Den funktionelle betydning af form og fordeling af kerner i en celle er ikke begrænset til muskler. Viser voksende vidnesbyrd at nukleare mangler også er forbundet med neurodegenerative sygdomme, såsom Parkinsons sygdom 18,24. Derudover er vi begyndt at forstå, at morfologi, størrelse og intracellulær fordeling af andre organeller herunder endoplasmatiske reticulum og mitokondrierne kan have funktionelle konsekvenser. For eksempel er ændringer i mitokondrie morfologi forbundet med neurologiske lidelser, såsom opticusatrofi type 1 (OPA1) og Charcot-Marie-Tooth typen 2A neuropati 25.
For at hjælpe i processen med at belyse de molekylære mekanismer bag disse vigtige processer, foreslår vi at kombinere høj opløsning konfokaldata med imaging software og morfometriske analyser kvantitativt vurdere, hvor genetiske manipulationer kan påvirke form, størrelse og placering af kerner inden muskelfibre. Den styrke og alsidighed af Drosophila genetik sammen med den meget stereotype karakter af den neuromuskulære system i Drosophila larver gøre larvestadiet NMJ en eksperimentel model særlig egnet til denne type analyser. Ved de larval NMJs, kan udføres fænotypisk analyse på et enkelt synapse beslutning muliggør en nøjagtig morfometrisk analyse, hvor kan studeres en række NMJs inden for samme flue og endda den samme identificerbare NMJ kan sammenlignes mellem fluer af forskellige genotyper 3,4.
Fænotypisk karakterisering af nukleare position, form og størrelse på Drosophila larvestadiet NMJ starter ved at udføre immunfarvning af dissekerede NMJs med antistoffer, der fremhæver muskler og kerner inden muskler. I protokollen beskrevet i this papir, myonuclei blev farvet med polyklonale antistoffer mod lamin, en markør af kernemembranen, med en nuklear markør fremhæve de nukleare indvendige og med antistoffer specifikke for DVAP at farve hele musklen. De Lamin antistoffer anvendt i disse eksperimenter blev venligst leveret af Paul Fisher 19-22, men kan anvendes alternative anti-Lamin antistoffer. Derudover en række andre antistoffer specifikke for kernekappen er kommercielt tilgængelige. Endelig nukleare markører, såsom DAPI og propidiumiodid, er også tilgængelige, mens muskler kunne visualiseres ved farvning med anti-actin eller anti-tubulin-antistoffer. Hvis andre end dem, der anvendes i denne eksperimentelle procedure antistoffer anvendes, vil immunfarvning protokol kræver ekstra-trin, hvor fiksering betingelser og koncentrationer for de nye antistoffer vil skal optimeres. Et afgørende skridt i denne protokol, især når volumen renderinger skal analyseres, er the montering af prøverne på dias. I dette tilfælde er det vigtigt at medtage afstandsstykker mellem dias og dækglasset så, at enhederne ikke bliver klemt. Tre bånd af cellulose tape viklet rundt objektglasset på begge sider af dækglasset repræsenterer en nem måde at gøre afstandsstykker.
Mens ImageJ blev brugt til 2D-billeder, analyser meste af 3D multi-kanal billede præsenteres i dette papir, blev udført ved hjælp af Imaris på grund af sin interne tilgængelighed. Imidlertid kan enhver anden lignende kommerciel softwarepakke anvendes til disse applikationer.
Der er flere open source (f.eks ImageJ, CellProfiler, Vaa3D, Icy, KNIME og andre) og kommercielle software-platforme til rådighed for analysen af konfokale billeder. ImageJ 26, den gratis software fra NIH eller dens mere forbedret udgave, kendt som Fiji 27, har et stort antal af import filtre, makroer og plugins til rådighed for den verdensomspændende imaging kommunity. De fleste af disse plugins er fokuseret på at behandle oplysninger om en skive-by skive måde. Der er også plugins til rådighed for visualisering og analyse af multikanal 3D-billeder. Men de er ofte udviklet til en bestemt opgave, og brugere kan være nødvendigt at udvide eller tilpasse disse plugins til deres egne behov. På den anden side, kommercielle platforme målrette relativt uerfarne brugere og er ofte fokuseret på lethed at bruge, bred dækning af billedbehandling opgaver med utrolig hastighed.
Den eksperimentelle procedure sammen med den kvantitative fænotypisk analyse skitseret i denne protokol, kan hjælpe med at belyse de molekylære mekanismer, der styrer organel morfologi og deres fordeling i en celle. Men denne tilgang har den indlysende begrænsning analysere disse processer på et bestemt slutpunkt. Processen med at styre morfologi og fordeling af organeller sandsynligvis være meget dynamisk og varierer ikke kun mellem forskellige celle types men også inden for samme celle afhængigt af den udviklingsmæssige eller fysiologiske status. En videre gennemførelse af denne analyse vil være repræsenteret af tidsforskydningen imaging, der tillader ændringer i organel morfologi og position til at blive overvåget over tid.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Micro-Forceps 0.3 mm x 0.25 mm | Fine Science Tools | 11030-12 | |
| Sylgard dissection plates | SIGMA-ALDRICH | 76103 | Mix the pre-weighed elastomer base with curing agent. Poor the mixture into a 5 cm Petri dish. Let cure it at 60 °C for at least 24 hr |
| Stainless/Steel Minutien Pins 0.1 mm diameter | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Microdissection scissors (ultra-fine) | Fine Science Tools | 15200-00 | |
| 1x PBS (Phosphate Buffered Saline). Composition: 3 mM NaH2PO4, 7 mM Na2HPO4, 130 mM NaCl, pH 7 | NaH2PO4 (SIGMA-S8282), Na2HPO4 (SIGMA-S7907), NaCl (SIGMA-S7653) | ||
| Bouin's Solution. Composition: Picric Acid, Formaldehyde, Acetic Acid (15:10:1) | Picric Acid (SIGMA 197378), Formaldehyde (F8775), Acetic Acid (SIGMA-1005706) | ||
| 1x PBT (Phosphate Buffered Saline with Triton). 1x PBS + 0.1% Triton | Triton-X100. SIGMA-T8787 | ||
| Normal Goat Serum | SIGMA | G9023 | |
| Guinea Pig anti-DVAP antibody | Provided by Dr. Giuseppa Pennetta (University of Edinburgh, UK). Use at 1:200 dilution in 5% NGS | ||
| Rabbit anti-HRP (Horseradish peroxidase) | Jackson ImmunoResearch | 123-065-021 | Use at 1:500 dilution in PBT containing 5% NGS |
| Rabbit anti-Lamin antibody | Provided by Dr. Paul Fisher (State Univeristy of New York at Stony Brook). Use at 1:500 dilution in PBT containing 5% NGS | ||
| TO-PRO-3 | Molecular Probes | T3605 | |
| Goat anti-rabbit antibody, Alexa Fluor488, conjugated | Jackson ImmunoResearch | bs-295G-A555-BSS | Use at 1:500 dilution in PBT containing 5% NGS |
| Goat anti-guinea pig IgG antibody, Cy3, conjugated | Jackson ImmunoResearch | bs-0358G-Cy3-BSS | Use at 1:500 dilution in PBT containing 5% NGS |
| Vectashield mounting medium for fluorescence | Vector laboratories | H-1000 |
References
- Collins, C. A., DiAntonio, A. Synaptic development: insights from Drosophila. Curr. Opin. Neurobiol. 17 (1), 35-42 (2007).
- Fortini, M. E., Skupski, M. P., Boguski, M. S., Hariharan, I. K. A survey of human disease gene counterparts in the Drosophila genome. J. Cell Biol. 150 (2), 23-30 (2000).
- Ramachandran, P., Budnik, V. Dissection of Drosophila larval body-wall muscles. Cold Spring Harb Protoc. (8), (2010).
- Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D.
- Brent, J., Werner, K., McCabe, B. D.
- Ramachandran, P., Budnik, V. Immunocytochemical staining of Drosophila larval body-wall muscles. Cold Spring Harb Protoc. (8), (2010).
- Ling, S. C., Polymenidou, M., Cleveland, D. W. Converging mechanisms in ALS and FTD: disrupted RNA and protein homeostasis. Neuron. 79 (3), 416-438 (2013).
- Nishimura, A. L., et al. A mutation in the vesicle-trafficking protein VAPB causes late-onset spinal muscular atrophy and amyotrophic lateral sclerosis. Am J Hum Genet. 75 (5), 822-831 (2004).
- Chen, H. J., et al. Characterization of the properties of a novel mutation in VAPB in familial amyotrophic lateral sclerosis. J Biol Chem. 285 (51), 40266-40281 (2010).
- Funke, A. D., et al. The P56S mutation in the VAPB gene is not due to a single founder: the first European case. Clin Genet. 77 (3), 302-303 (2010).
- SOD1,ANG,VAPB,TARDBP, and FUS mutations in familial amyotrophic lateral sclerosis: genotype-phenotype correlations. J Med. Genet. Millecamps, S., et al. 47 (8), 554-560 (2010).
- Landers, J. E., et al. New VAPB deletion variant and exclusion of VAPB mutations in familial ALS. Neurology. 70 (14), 1179-1185 (2008).
- Van Blitterswijk, M., et al. VAPB and C9orf72 mutations in 1 familial amyotrophic lateral sclerosis patient. Neurobiol Aging. 33 (12), 2951-2954 (2012).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Budnik, V., et al. Regulation of synapse structure and function by the Drosophila tumor suppressor gene dlg. Neuron. 17 (4), 627-640 (1996).
- Sanhueza, M., Zechini, L., Gillespie, T., Pennetta, G. Gain-of-function mutations in the ALS8 causative gene VAPB have detrimental effects on neurons and muscles. Biol Open. 3 (1), 59-71 (2014).
- Worman, H. J., Ostlund, C., Wang, Y.
- Liu, G. H., et al. Progressive degeneration of human neural stem cells caused by pathogenic LRRK2. Nature. 491 (7425), 603-607 (2012).
- Pennetta, G., Hiesinger, P. R., Fabian-Fine, R., Meinertzhagen, I. A., Bellen, H. J. Drosophila VAP-33A directs bouton formation at neuromuscular junctions in a dosage-dependent manner. Neuron. 35 (2), 291-306 (2002).
- Fisher, P. A., Berrios, M., Blobel, G. Isolation and characterization of a proteinaceous subnuclear fraction composed of nuclear matrix, peripheral lamina, and nuclear pore complexes from embryos of Drosophila melanogaster. J Cell Biol. 92 (3), 674-686 (1982).
- Smith, D. E., Fisher, P. A. Identification, developmental regulation, and response to heat shock of two antigenically related forms of a major nuclear envelope protein in Drosophila embryos: application of an improved method for affinity purification of antibodies using polypeptides immobilized on nitrocellulose blots. J Cell Biol. 99 (1), 20-28 (1984).
- Smith, D. E., Gruenbaum, Y., Berrios, M., Fisher, P. A. Biosynthesis and interconversion of Drosophila nuclear lamin isoforms during normal growth and in response to heat shock. J Cell Biol. 105 (2), 771-790 (1987).
- Puckelwartz, M. J., et al. Disruption of nesprin-1 produces an Emery Dreifuss muscular dystrophy-like phenotype in mice. Hum Mol Genet. 18 (4), 607-620 (2009).
- Tsujikawa, M., Omori, Y., Biyanwila, J., Malicki, J. Mechanism of positioning the cell nucleus in vertebrate photoreceptors. Proc Natl Acad Sci USA. 104 (37), 14819-14824 (2007).
- Westermann, B. Mitochondrial fusion and fission in cell life and death. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (12), 872-884 (2010).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
