Abstract
De flesta studier om morfogenes lita på kvalitativa beskrivningar av hur anatomiska drag påverkas av störningar i specifika gener och genetiska vägar. Kvantitativa beskrivningar sällan utförs, även om genetiska manipulationer producerar en rad fenotypiska effekter och variationer observeras även mellan individer inom kontrollgrupper. Emerging bevis visar att morfologi, storlek och placering av organ spela en tidigare underskattad, men grundläggande roll i cellernas funktion och överlevnad. Här ger vi steg-för-steg-instruktioner för att utföra kvantitativa analyser av fenotyper på Drosophila larver neuromuskulära förbindelsen (NMJ). Vi använder flera tillförlitliga immun histokemisk markörer i kombination med bio-avbildningstekniker och morfometriska analyser för att undersöka effekterna av genetiska mutationer på specifika cellulära processer. Framför allt fokuserar vi på kvantitativ analys av fenotyper som påverkar morfologi, storlek och position nuclei inom de tvärstrimmiga muskler i Drosophila larver. Drosophila larver NMJ är en värdefull experimentell modell för att undersöka de molekylära mekanismerna bakom struktur och funktion neuromuskulära systemet, både i hälsa och sjukdom. Däremot kan de metoder vi beskriver här utökas till andra system.
Protocol
1. Experimentell Beredning
Obs: Dissektioner och immun histokemi förfaranden i avsnitten 2 och 3 utförs enligt referenserna 3-6, men med modifikationer.
- Förbereda 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och PBS innehållande 0,1% Triton-X 100 (PBT). Hålla dem på is.
- Förbereda Bouins fixativ (15 pikrinsyra: 10 Formaldehyd: 1 isättika). Gör detta reagens färskt.
- Välj ren rostfritt stål minutien stift och fin pincett.
- Förbered dissektion plattor innehållande en Sylgard-skiva i en 5 cm petriskål.
2. Dissekering av tredje stadiet Larv NMJs
- Plocka vandrande tredje stadiets larver från en ampull eller en flaska med en fin pensel och placera dem i en 2 cm petriskål med 4 ° C PBS för att tvätta rest maten bort.
- Placera en larv på toppen av sylgard ytan på dissekering plattan och se till att det är positioned med ryggsidan uppåt så att de två längsgående Trakealtuber syns på toppen.
- Med hjälp av pincett för att hålla stiftet, stift larven ner vid sin främre ände, precis under munnen kroken. Sträck larven ut så mycket som möjligt och stift dess bakre änden ned.
- Tillsätt tillräckligt PBS saltlösning för att nå väggarna i plattan och fullständigt doppa larven.
- Upprepa proceduren från steg 2,1 till 2,3 för andra larver av samma genotyp. En enda 5 cm petriskål dissektion plattan kan lätt rymma upp till 8 larver.
- Med hjälp av mikro dissektion sax, något lyft rygg nagelband och göra en liten horisontellt snitt vid den bakre änden nära stiftet.
- Infoga sax i snittet, skär larven hela vägen till den främre änden längs mittlinjen mellan de två längsgående områden av luftstrupen. Se till att mittlinjen nedskärningar är ytlig nog att bara passera genom nagelband och för att undvika att skära igenom musklerna påden ventrala sidan.
- Vid varje ände, skär två skårorna på både vänster och höger sida.
- Öppna filén genom att placera två stift på båda sidor av den främre snittet. Upprepa samma sak med den bakre änden. När du placerar stiften, se till att sprida kroppsväggen isär.
- Rengör de inre organen med hjälp av pincett och PBS saltlösning. Låt det centrala nervsystemet intakt. sträcka försiktigt larven med hörn stift tills den är helt sträckt men se till att musklerna inte slits under denna process.
- Upprepa samma dissektion förfarande för andra larver på samma dissekering plattan.
- Tvätta med PBS saltlösning tre gånger för att avlägsna alla de inre organen.
- Ersätta PBS med Bouins fixativ och låt stå i rumstemperatur under 10 min.
- Tvätta flera gånger med PBT.
- Ta bort stiften noga och överföra alla förberedelser, som nu ganska styva, i ett 1,5 ml mikro-centrifugrör för immunfärgning.
3. Immuno-histokemisk färgning av Drosophila NMJs med antikroppar som är specifika för Muskler och Myonuclei
- Snabbt skölja larver filéer i PBT.
- Blockera beredningar genom inkubering med 10% normalt getserum (NGS) i PBT under 2 timmar under konstant omrörning.
- Inkubera en uppsättning av de dissekerade NMJs i PBT innehållande 5% av NGS och en kanin-anti-lamin antikropp (vid en koncentration av 1: 500) och med ett marsvin-anti-DVAP antikropp (vid en koncentration av 1: 500) under 2 timmar vid rumstemperatur eller vid 4 ° C över natten. Anti-DVAP antikropp fläckar de tvärstrimmiga muskler medan anti-lamin färgning detekterar kontur myonuclei.
- Tvätta en gång snabbt i PBT att ta bort antikroppar i överskott. Tvätta i PBT under 2 h genom att ändra PBT buffert var 15 min.
- Inkubera proverna i PBT innehållande 5% NGS och fluorescensmärkta sekundära antikroppar vid 1: 500 spädning under 2 h vid rumstemperatur. Samma prover cen utsättas för färgning med flera antikroppar vid samma tid om sekundära antikroppar konjugerade med olika kromoforer används.
- Ta sekundära antikroppar och tvätta i PBT under 2 h genom att ändra PBT buffert var 15 min.
- Att färga det inre av myonuclei tvätta proverna tre gånger med PBS och gör så här:
- Lägga den nukleära markör TO-PRO-3 vid en utspädning av 1: 1000 i PBS och inkubera under 20 min under konstant omrörning. Denna markör används i denna studie, men något annat kommersiellt tillgängligt nukleär markör kan användas också.
- Tvätta snabbt tre gånger i PBS före montering.
4. Monterings Prover på bilderna
- Plocka proverna upp med pincett från 1,5 ml mikro-centrifugrör och fastställa dem på en bearbetnings bild.
- Genom att använda mikro-dissektion sax, klippa huvudet och svansen på filéerna och hålla sin interna yta upp.
- förbereda the monterings glida genom att linda runt tre remsor av cellulosa tejp på vardera sidan av en ren glid på ett avstånd av ca 1 cm från varandra. När täckglas placeras på toppen av de två remsorna, kommer ett gap att genereras som kommer att undvika tillplattning av proverna. Detta är avgörande om tredimensionella volym tolkningar av konstruktioner ska göras.
- Sätta en liten droppe av ca 20 | il av monteringsmedium i mitten av monterings sliden mellan de tre cellulosatejpremsor.
- Efter spridning monterings medium med rena pincett, dra dissekeras larver till monterings glida in i monteringsmedium, varvid den inre ytan upp. Försök att montera dem i rader av fyra eller fem.
- Försiktigt släppa ett täckglas ovanpå monterings bilden och se till att inga luftbubblor bildas. Täta bilden med genomskinliga nagellack. Låt proverna torka under minst 10 minuter innan avbildning.
5. Confocal Inställningar för Imaging
Notera: Bilder som presenteras i denna studie tas med hjälp av en Nikon A1R konfokala enhet integreras på ett Ti: E inverterat mikroskop. Emellertid är vilken som helst konfokalmikroskop med ett minimum av tre laserenheterna som är tillgängliga i de våglängdsområden av 488 nm, 561 nm och 642 nm och en 3 kanal detektionssystem lämpligt för detta ändamål.
- Slå på lasrarna, detektor enhet, kvicksilver lampa, scen controller, mikroskop och PC. Starta styrprogram och säkra bilden på scenen hållaren.
- För att göra imaging snabbare väljer och markera alla områden av intresse (ROI) på provet med hjälp av en 20X objektiv.
- Noggrant svänga revolvern till 60X högre förstoring objektiv (60X Plan Apo VC / NA 1,4 OIL).
- Placera en droppe immersionsolja på objektiv och välj en av de markerade ROI från XYZ översiktsfönster på datorn.
- Börja avbildning med hjälp av följande optiska inställningar: Välj den första dikroiska spegeln: 405/488/561/640. Välj 488 nm laser med emissionsfilter 525/50 nm i kanal 1, 561 nm laser med 595/50 emissionsfilter i kanal 2 och 642 nm laser med lång passfilter 650 nm i kanal 3.
- Använd följande skanningsinställningar innan bildtagning: Välj Galvano scanner; Scan riktning: ett sätt; Skanningshastighet: 0,5 bilder per sekund.
- Välj Channel-serien att undvika kanalgenomblödning.
- Justera knappnålsstorlek till en luftig enhet. Skanna och justera lasereffekt, förstärkning upptäckt och offset på lämpligt sätt för varje kanal för att undvika pixel mättnad och bakgrundsnivå.
- Förvärva z-stackar med voxelstorlek 0,2 x 0,2 x 0,5 pm 3 för alla ROI och glid preparat. Om bilderna kommer att utsättas för avfaltning ställ sedan in voxelstorleken till 0,06 x 0,06 x 0,15 um 3.
- Spara bilder i .nd2 filformat eller ICS-format.
6. Beräkning av avståndet mellan Kärnor inom Striated60, muskler genom metoden av grannen Analys
- För denna analys använder konfokala bilder visar larv kroppen väggen muskler färgade med DVAP antikroppar för att visualisera musklerna och med Lamin antikroppar och en nukleär markör för att markera kärnorna.
- För att uppskatta den närmaste avståndet mellan kärnor, använder mätpunkter inom MeasurementPro modulen i bildanalysmjukvara (t.ex. Imaris). Andra liknande program för bildanalys kan användas för samma ändamål.
- Öppna konfokala bilder. Att initiera, dubbelklicka på ikonen programvara. Dra och släpp konfokala z-stack bilder i arenan.
- Dubbelklicka på bilderna för att öppna dem automatiskt i Surpass View, under bar ikonmenyn verktyg
. Den Surpass View har tre huvudsakliga arbetsytan paneler: View-området, objektlistan och objektegenskaper området. - Skapa en volym återges three kanalbild genom att klicka på menyikonen 3D-vy
. - Klicka på ikonen Lägg till ny mätpunkter
från Objekt verktygsfält och följ guiden för att skapa som visas i Object Properties området. - Från guiden skapandet välj fliken Redigera först och sedan specifik kanal. Välj antingen kärn markör eller lamin kanalen för att markera kärnorna.
- Ställ markören till läget för val genom att trycka på fliken Esc på tangentbordet.
- Justera storleken på 3D-markören rutan med mushjulet för att innehålla en given kärna i bilden. Lägg till en mätpunkt genom att hålla Skift-tangenten och vänster musklick på samma kärna.
- Lägg den andra punkten på en närliggande kärna på samma muskel genom att upprepa de tidigare stegen. En linje dras automatiskt mellan de två punkterna och det uppmätta avståndet mellan de två kärnorna visas. Avståndet mellan de två kärnorna nu redovisas som en statistisk variabel i Objektegenskaper området under fliken Statistik> Detaljerad> avståndsdata.
- Upprepa proceduren från steg 6,6 till 6,10 för alla kärnor som omger en given kärna.
- Från Statistik> Detaljerad> avståndsdata visar alla insamlade mätpunkter väljer det kortaste avståndet.
- Genom att klicka på Exportstatistiken Tab Display till fil
tillgänglig under Objektegenskaper området, kommer uppgifterna att sparas på ett kalkylblad. - Upprepa samma procedur för andra omgivande kärnorna och för ett antal utvalda muskelfibrer per genotyp.
- Med hjälp av data som exporteras till ett kalkylblad, beräkna den genomsnittliga kortaste avståndet (D ave) för alla M antalet muskler med hjälp av följande ekvation:
oad / 53821 / 53821eq1.jpg "/>
Di är det kortaste avståndet till den angränsande cellkärnan för en given kärna i där i varierar från 0 till N och N är antalet kärnor som analyserats per muskel. Summering av värden från j = 0 till j = m anger M antalet analyserade muskler. - Alternativt kan du använda Ställen Creation guiden och fläckar på ställen kortaste avståndet för att uppskatta medelavståndet till närmaste angränsande kärnan. För detta krävs en Matlab utbyggnadsmodul.
- Dubbelklicka på en specifik bild på arenan och en 3D-volym bilden visas i View-området. Klicka på ikonen Objekt Creation och lägga till nya ställen
från objekt i verktygsfältet. - Från guiden för att skapa i Objektegenskaper området, klicka på alternativet Skip skapas automatiskt, manuellt redigera.
- Välj antingen lamin eller kärnmarkeringskanal att visa kärnor.
- Skift och klicka left musknappen på alla kärnor av en specifik muskel i bilden. En plats på varje kärna visas.
- Välj Ställen till fläckar kortaste avståndet visas under fliken Verktyg i Objektegenskaper området. Välj fläckar Statistik under Resultat läge och ett Matlab öppnas.
- Under fliken Statistik, välj Detalj och sedan specifika värden. Klicka på Distmin och värdena för de minimiavstånd för varje kärna kommer att visas.
- Exportera data till ett kalkylark och beräkna medelvärdet av dessa avstånd per muskel. Upprepa proceduren för alla muskler i en bestämd genotyp.
- Dubbelklicka på en specifik bild på arenan och en 3D-volym bilden visas i View-området. Klicka på ikonen Objekt Creation och lägga till nya ställen
. Den Surpass View har tre huvudsakliga arbetsytan paneler: View-området, objektlistan och objektegenskaper området. 
. 
från Objekt verktygsfält och följ guiden för att skapa som visas i Object Properties området. 
tillgänglig under Objektegenskaper området, kommer uppgifterna att sparas på ett kalkylblad. 
från objekt i verktygsfältet. 7. Fastställande av form av kärnor i kroppen-vägg Muskler av Drosophila Larver
- För denna analys använder konfokala bilder av kroppen väggen muskler färgade med lamin och en nukleär markör för att visualisera kärnor.
- För att utvärdera formen på myonuclei, mått sfäriskhet (definierad som förhållandet mellan suransiktet området av en sfär med samma volym som den given kärna, till ytarean av kärnan) eller ellipticiteten (skiljer mellan oval / prolate ellipsoider och sfäroider).
- Öppna bilden som tidigare beskrivits. Klicka på ikonen Objekt verktygsfältet Lägg till ny Ytor
. - I guiden skapelse som visas i objekt fastigheter area, väljer kärn markör färgning som källkanalen för att visa kärnorna.
- Ställ in alternativet Absolut intensitet som tröskeln. Se till att de flesta av kärnorna uppvisar en slät och inte överbelastas rendering genom att ändra värdet på tröskeln kurvan. Samtidigt, undvika förekomsten av hål eller ofullständig mask till varje kärna med användning av samma kurva.
- Använd Filter verktyg för att utesluta någon buller i ytrendering. Under fliken Redigera i den nyskapade ytskiktet, Split eller Merge kärnorna ytor som är felaktigt rendered.
- Exportera till ett kalkylblad ellipticiteten och sfärisk värden för ytan återges kärnor som finns under fliken Statistik.
- Alternativt, använda ImageJ eller Fiji programvara för att mäta cirkularitet av kärnor där cirkularitet (C) definieras som C
. Ett värde på ett representerar en perfekt cirkel medan ett värde som närmar sig noll indikerar en allt långsträckt form. - Skapa maximal intensitet projektioner av z stackar från menybilder> Staplar> Z Project. Ställ projektion typ Max intensitet.
- Split kanalerna och Välj kärnmarkeringskanalen.
- Från huvudmenyn väljer Bild> Justera> Tröskel.
- Segment kärnorna genom att justera tröskelnivån. Om de närliggande kärnor segmenteras som en enda enhet, klicka på Process> Binary> Watershed verktyg för att koppla bort kärnorna.
- Från huvudmenyn, välj Redigera> Sval> Skapa val.
- Lägg till alla de valda ROI till ROI genom att klicka på menyn Analysera> Verktyg> ROI Manager. I Manager-fönstret ROI klicka på Lägg till. Inom samma fönster väljer du Mer> Split.
- Välj formdeskriptorer i Analysera> Ställ mätningar. I Manager-fönstret ROI klicka på fliken Mäta. Detta kommer att visa en lista över cirkel värden för alla valda kärnor.
- Förutom att mäta den nukleära volymen, följ guiden för att skapa yta med hjälp av nukleär markör färgnings kanal som beskrivs i avsnitten 7,3-7,7.
. 
. Ett värde på ett representerar en perfekt cirkel medan ett värde som närmar sig noll indikerar en allt långsträckt form. 8. 3D Volym renderingar av Selected Nuclei inom Drosophila larvkroppen väggs Muskler att utvärdera Intranuclear Lokalisering av ett specifikt protein
- Använd konfokala bilder rapporterar kroppen väggen muskler färgas med en nukleär markör och med antikroppar som är specifika för lamin och DVAP.
- Öppna bilderna genom att initiera programmet och select den specifika kärna som skall analyseras. Detta kan göras genom att välja huvudmenyalternativet Redigera> Beskär 3D.
- Följ guiden för att skapa yta med hjälp av lamin kanal som beskrivs i avsnitt 7,3-7,7.
- När ytan är skapad, klicka på Redigera i objekt Egenskaper området och sedan välja Mask alla att isolera signalen inuti kärnan. Detta skapar ett nytt fönster.
- Välj DVAP signal från rullgardinsmenyn Välj kanal. Välj DVAP immunoreaktivitet signal inuti kärnan genom att klicka på det alternativ som voxlar utanför ytan till noll. En ny maskerad kanal skapas och finns i fönstret justerings display för val.
- För att visualisera närvaron av signalen i kärnan skapar en kontur plan genom att klicka på ikonen Lägg till ny klippning Plane
från objekt i verktygsfältet. - Interaktivt justera vinkeln på klippningsplanet och dess position för att visualisera fördelningen av signalen inuti kärnan.
från objekt i verktygsfältet. Representative Results
ALS är en degenerativ sjukdom som särskilt drabbar motoriska nervceller som leder till en progressiv och dödlig förlamning av tvärstrimmig muskulatur 7. Missense mutationer i människans VAMP-associerat protein B (hVAPB) orsaka en rad motorneuronsjukdomar inklusive ALS typ 08-12 augusti. En missense-mutation (V234I) i hVAPB genen har nyligen identifierats i ett fall av typiska ALS hos människor 13. För att bedöma dess patogena potential, vi genererade transgena flugor som uttrycker hVAPB Drosophila ortolog DVAP bär sjukdomsframkallande mutation (DVAP-V260I). Uttrycket av denna transgen var riktad till musklerna med hjälp av UAS / GAL4 systemet och muskel drivrutin BG57-Gal4 14,15. Effekten av DVAP-V260I transgen expression jämfördes och kontraste med den hos två andra transgener (DVAP-WT1 och DVAP-WT2), som uttrycker olika nivåer av vildtyp DVAP protein 16. More specifikt är ökningen i DVAP immunreaktivitet 2,2 gånger högre än i kontrollgruppen för DVAP-WT2 linje medan DVAP-V260I och DVAP-WT1 uppvisar jämförbara och lägre nivåer av samma signal 16.
Nukleära förändringar har satts i samband med åldrande och flera neurodegenerativa sjukdomar, bland annat Parkinsons sjukdom 17,18. För att bedöma om våra flyga modell för ALS8 uppvisar förändringar i kärn arkitektur, läge och storlek, färgade vi kärnor inom tvärstrimmiga muskler lämpliga genotyper med en nukleär markör och anti-lamin antikropp 19-22, som visualiserar kärnhöljet. Att belysa de musklerna gjordes en DVAP-specifik antikropp också till samma prover (figur 1). Konfokala bilder samlades och detaljerade morfometriska analyser utfördes med hjälp av ett bildanalysprogram. I kontrollmuskler, har kärnorna visade sig vara jämnt fördelade längs muskelnfibrer medan DVAP-V260I och DVAP-WT uttrycker muskler, kärnor uppvisar en tendens att omfördela i närstående kluster (Figur 1).
Vi genomförde en närmaste granne-analys för att utföra en kvantitativ utvärdering av fördelningen av kärnor längs muskelfibrer av varje genotyp. En närmaste granne-analys först identifierar den närmaste granne för varje kärna genom att mäta avståndet mellan centrum för en given kärna och centrum av varje annan omgivande kärnan. Detta förfarande upprepas sedan för alla andra kärnor längs muskelfiber. Slutligen, det kortaste avståndet mellan kärnor inom en viss muskel, beräknas genom att medelvärdet av de kortaste avstånden varje kärna och dess närmaste grannar. (Figur 2A - C). Jämfört med kontroller, muskler som uttrycker antingen DVAP-V260I transgen eller någon av de transgener som överuttrycker vildtyps-proteinPresenterar en dramatisk minskning av den genomsnittliga kortaste avståndet mellan kärnorna och, som en konsekvens, kärnor verkar vara nära associerad i kluster. Effekten av ALS orsakande allelen DVAP-V260I är allvarligare än den som förknippas med överuttryck av vildtyp protein, även om den starkaste DVAP-WT2 transgen används (Figur 1 och Figur 2D).
Överuttryck av antingen DVAP-V260I eller DVAP-WT-transgener uppvisar också en allvarlig försämring av kärn arkitektur vilket resulterar i deformerade kärnor med en långsträckt struktur (Figur 1). Denna strukturella avvikelse kvantifierades med hjälp av ImageJ programvara i vilken cirkularitet definieras av formel C 
, Som mäter bredden till längdförhållande av varje kärna med C = 1 representerar en perfekt cirkel och C = 0 en oändligt långsträckt polygon. i control kärnor som uppvisar en tydlig rund form, är C lika med 1, medan i de transgena mutanterna en förändring i form med åtföljande förlust av cirkel, orsakar en betydande avvikelse från detta värde (Figur 1 och Figur 3).
Vi fann också att i musklerna uttrycker samma transgener, kärnor visar en markant förstorad kärn volym jämfört med kontrollerna, även om ALS orsakande allelen tycks vara mer effektiva i att inducera denna fenotyp jämfört med DVAP-WT transgener (Figur 4).
Nästan alla neurodegenerativa sjukdomar kännetecknas av den intracellulära ackumuleringen av aggregat som innehåller den patogena proteinet. Vi gjorde 3D rekonstruktioner och volym tolkningar av kärnor och vi fann att i musklerna som uttrycker den muterade transgenen eller överuttrycker vildtyp protein, DVAP immunoreaktivitet bildade kluster ennd att några av dem var också lokaliserad i kärnan (Figur 5). Omvänt, i kontroll NMJs, DVAP immunoreaktivitet är svagt spridda över hela muskelfiber och exkluderas från kärnan 16.
. Figur 1: Konfokala bilder av myonuclei inom tvärstrimmig muskulatur som uttrycker antingen DVAP-WT eller de DVAP-260I transgener (A) BG57-Gal4 / + kontroll, (B) BG57; DVAP-V260I, (C) BG57; DVAP-WT1 och (D) BG57, DVAP-WT2 muskler som uttrycker de angivna trans färgas med antikroppar som är specifika för DVAP (röd signal), lamin (grön signal) och med en nukleär specifik markör för att visualisera kärnor (blå signal). Skala bar = 30 pm Klicka här för att se enstörre version av denna siffra.
Figur 2: Närmaste granne analys för att fastställa den genomsnittliga avståndet mellan en kärna och dess enda närmsta granne (B) Representativa resultat visar förändrad kärn positionering i muskler som överuttrycker DVAP-WT2 transgen jämfört med kontroller i (A).. Genomsnittlig kärn avstånd i musklerna i de angivna genotyper uppskattades med hjälp av formeln i (C) och data rapporteras i (D). Larval NMJs färgas med antikroppar specifika för DVAP (röd signal), lamin (grön) och med en nukleär markör (blå signal). Asterisker betecknar statistiskt signifikant. *** P <0,001, ** P <0,01. För den statistiska analysen av detta experiment och alla de experiment som rapporteras nedan ett envägs ANOVA-test användes och ett Tukeys multiple jämförande test applicerades som post-hoc-test när skillnader mellan genotyper befanns vara betydande vid ANOVA testet. Felstaplar representerar SEM. Skala bar = 30 pm Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3:. Bilder som visar representativa steg i beräkningen av kärn volym (A) En representant bild som visar segmente kärnor med hjälp av guiden för att skapa ytan. Kärnor vid gränsen av bilderna ignorerades. (B) Bild på kärn DVAP signalen efter den omgivande DVAP färgning har maskerats med hjälp av ytan som skapas i kärnmarkeringskanalen. (C) Ytskikt ger information om ytterligare parametrarinklusive kärn volym och sfärisk. (D) Uppgifter om kärnvolym av olika genotyper. Asterisker betecknar statistiskt signifikant. Dissekerade NMJs färgades med anti-DVAP antikroppar (röd signal), anti-Lamin antikroppar (grön signal) och en nukleär markör (blå signal). *** P <0,001, ** P <0,01. Felstaplar representerar SEM. Skala bar = 30 pm Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Bilder visar representativa steg i uppskattningen av kärn form av ImageJ. Maximal intensitet projektion av bilder analyserades med ImageJ att uppskatta cirkel av kärnor inom musklerna. (A) Ett representativt exempel på den intensitetsprojektionsav de tre kanalbild som i steg 7,9 i protokollet. (B) Bilden visar steg 7,10 i protokollet i vilka kanaler delas och kärnmarkeringskanal är vald. (C) En representant bild som visar att efter applicering intensitetströskel att segmentera kärnor och ROI manager plugin i ImageJ, kan alla kärnor av intresse väljas och deras form mäts genom Shape beskrivningar (steg från 7,11 till 7,15). (D) Kvantifiering av cirkel av olika genotyper. På larv NMJs, indikerar den röda signalen DVAP färgning medan den gröna skisserar kärnor och motsvarar den lamin färgning. Interiören i varje kärna är märkt i blått på grund av färgningen med en nukleär markör. Asterisker betecknar statistiskt signifikant. *** P <0,001, ** P <0,01. Felstaplar representerar SEM. Skala bar = 30 pm Klicka hennee för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Bilder som visar specifika steg i skapandet av volym tolkningar av myonuclei. (A) Bild som visar 3D intensitet blandas vy av muskler färgade med DVAP protein (röd), den lamin (grön) och DNA-markör (blå). (B) Bild representerar ett ytskikt som alstras med hjälp av lamin kanalen att segmentera kärnorna. (C) Image som föreställer en kärna, i vilken ytskiktet har använts för att maskera den DVAP signalen utanför det markerade kärnan. Gulmarkerad är en klippning plan som har lagts till i bilden. Dess bildvinkel och position kan interaktivt justeras för att visualisera fördelningen av signalen inuti kärnan. (D) En bild rapporterar en tvärsektionsvy av kärn ytskiktet skapas using lamin kanalen samman med omaskerade DVAP och nukleära markeringssignaler. (E och F) Ytterligare sektionerade volym återgivningar av samma kärna. Skala bar = 10 mikrometer Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Förr i tiden var morfologiska variationer inom och mellan experimentella grupper sällan beaktas. Dock är tillämpningen av kvantitativa metoder nu bli norm i jämförande studier av morfologi och matematisk beskrivning av anatomiska former beräknas. Användningen av kvantitativa analyser för att bedöma effekterna av genetiska manipulationer på specifika cellulära processer, hålla löftet att stärka vår förmåga att upptäcka morfologiska förändringar och för att förbättra noggrannheten med vilken dessa förändringar beskrivs. Vidare tillåter statistisk analys av kvantitativa data oss att utvärdera om observerade skillnaderna mellan fenotyper är betydande.
I tvärstrimmiga musklerna, kärnor uppvisar en tydlig rundad struktur och är jämnt fördelade längs muskelfiber. Även de molekylära mekanismerna etablera och upprätthålla storlek, form och arkitektur av kärnor inte är kända, dessa kärnfunktioner sannolikt to spela en viktig roll i att kontrollera muskelfunktion. I själva verket är flera myopatier orsakas av mutationer i gener som reglerar morfologi och position kärnor inom musklerna. Den funktionella betydelsen av form och fördelning av kärnor inom en cell är inte begränsad till muskler. Ackumulerande bevis visar att kärn defekter är också förknippade med neurodegenerativa sjukdomar, såsom Parkinsons sjukdom 18,24. Dessutom börjar vi inse att morfologi, storlek och intracellulär distribution av andra organeller, inklusive endoplasmatiska retiklet och mitokondrier kan ha funktionella konsekvenser. Till exempel är förändringar i mitokondriell morfologi i samband med neurologiska störningar, såsom optisk atrofi typ-1 (OPA1) och Charcot-Marie-Tooth typ 2A neuropati 25.
För att underlätta arbetet med att klarlägga de molekylära mekanismerna bakom dessa viktiga processer, föreslår vi att kombinera hög upplösning konfokaladata med bildbehandlingsprogram och morfometriska analyser för att kvantitativt utvärdera hur genetiska manipulationer kan påverka form, storlek och placering av kärnor inom muskelfibrer. Kraften och mångsidigheten hos Drosophila genetik tillsammans med den högt stereotypa naturen hos det neuromuskulära systemet i Drosophila larver gör larver NMJ en experimentell modell särskilt lämplig för denna typ av analyser. Vid larv NMJs kan fenotypisk analys utföras vid en enda synaps upplösning möjliggör en noggrann morfometrisk analys där kan studeras ett antal NMJs inom samma fluga och även samma identifierbara NMJ kan jämföras mellan flugor av olika genotyper 3,4.
Fenotypisk karakterisering av kärn läge, form och storlek på Drosophila larver NMJ startar genom att utföra immunfärgning av dissekerade NMJs med antikroppar som framhäver muskler och kärnor inom musklerna. I det protokoll som beskrivs i this papper, var myonuclei färgades med polyklonala antikroppar mot lamin, en markör av kärnhöljet, med en nukleär markör som markerar de nukleära interiör och med antikroppar som är specifika för DVAP att färga hela muskeln. De Lamin antikroppar som används i dessa experiment tillhandahölls vänligen av Paul Fisher 19-22 men alternativa källor för anti-Lamin antikroppar kan användas. Dessutom kan ett antal andra antikroppar specifika för kärnhöljet är kommersiellt tillgängliga. Slutligen, kärn markörer, såsom DAPI och propidiumjodid, finns även tillgängliga muskler kan visualiseras genom färgning med anti-aktin eller anti-tubulin-antikroppar. Om andra än de som används i denna experimentella förfarande antikroppar används, kommer immunfärgning protokoll kräver extra steg där fixeringsförhållanden och arbets koncentrationer för de nya antikropparna kommer att behöva optimeras. Ett viktigt steg i detta protokoll, särskilt när volym renderingar måste analyseras, är the montering av proverna på bilden. I det här fallet är det viktigt att inkludera distanser mellan sliden och täck så att exemplaren inte får klämd. Tre band av cellulosa tejp virad runt bilden på båda sidor av täck utgör ett enkelt sätt att göra distanser.
Medan ImageJ användes för 2D-bilder, de flesta av 3D flerkanalsbild analyser presenteras i detta dokument gjordes med hjälp av Imaris på grund av dess egen tillgänglighet. Emellertid kan vilken som helst annan liknande kommersiella programvarupaket användas för dessa tillämpningar.
Det finns flera öppen källkod (t.ex. ImageJ, CellProfiler, Vaa3D, Icy, KNIME och andra) och kommersiella mjukvaruplattformar tillgängliga för analys av konfokala bilder. ImageJ 26, fri programvara från NIH eller dess mer förbättrad version, känd som Fiji 27, har ett stort antal importfilter, makron och plugins för den globala avbildning kommty. De flesta av dessa plugins är inriktade på att bearbeta informationen på en skiva-by-skiva sätt. Det finns också plugins tillgängliga för visualisering och analys av flerkanaliga 3D-bilder. Men de är ofta utformade för en specifik uppgift och användare kan behöva förlänga eller anpassa dessa plugins till sina egna behov. Å andra sidan, kommersiella plattformar rikta relativt oerfarna användare och är ofta fokuserade på enkel att använda, bred täckning av bildbehandlingsuppgifter med otrolig hastighet.
Det experimentella förfarandet tillsammans med den kvantitativa fenotypisk analys som beskrivs i detta protokoll, kan hjälpa till att belysa molekylära mekanismer som styr organell morfologi och deras fördelning i en cell. Emellertid har detta tillvägagångssätt den uppenbara begränsningen att analysera dessa processer vid en specifik ändpunkt. Processen för styrning av morfologin och distribution av organeller kommer sannolikt att vara mycket dynamisk och för att variera inte bara mellan olika cell types men även inom samma cell beroende på utvecklings eller fysiologisk status. En ytterligare tillämpning av denna analys skulle representeras av tidsförlopp avbildning som tillåter förändringar i organell morfologi och position för att följas över tid.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Micro-Forceps 0.3 mm x 0.25 mm | Fine Science Tools | 11030-12 | |
| Sylgard dissection plates | SIGMA-ALDRICH | 76103 | Mix the pre-weighed elastomer base with curing agent. Poor the mixture into a 5 cm Petri dish. Let cure it at 60 °C for at least 24 hr |
| Stainless/Steel Minutien Pins 0.1 mm diameter | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Microdissection scissors (ultra-fine) | Fine Science Tools | 15200-00 | |
| 1x PBS (Phosphate Buffered Saline). Composition: 3 mM NaH2PO4, 7 mM Na2HPO4, 130 mM NaCl, pH 7 | NaH2PO4 (SIGMA-S8282), Na2HPO4 (SIGMA-S7907), NaCl (SIGMA-S7653) | ||
| Bouin's Solution. Composition: Picric Acid, Formaldehyde, Acetic Acid (15:10:1) | Picric Acid (SIGMA 197378), Formaldehyde (F8775), Acetic Acid (SIGMA-1005706) | ||
| 1x PBT (Phosphate Buffered Saline with Triton). 1x PBS + 0.1% Triton | Triton-X100. SIGMA-T8787 | ||
| Normal Goat Serum | SIGMA | G9023 | |
| Guinea Pig anti-DVAP antibody | Provided by Dr. Giuseppa Pennetta (University of Edinburgh, UK). Use at 1:200 dilution in 5% NGS | ||
| Rabbit anti-HRP (Horseradish peroxidase) | Jackson ImmunoResearch | 123-065-021 | Use at 1:500 dilution in PBT containing 5% NGS |
| Rabbit anti-Lamin antibody | Provided by Dr. Paul Fisher (State Univeristy of New York at Stony Brook). Use at 1:500 dilution in PBT containing 5% NGS | ||
| TO-PRO-3 | Molecular Probes | T3605 | |
| Goat anti-rabbit antibody, Alexa Fluor488, conjugated | Jackson ImmunoResearch | bs-295G-A555-BSS | Use at 1:500 dilution in PBT containing 5% NGS |
| Goat anti-guinea pig IgG antibody, Cy3, conjugated | Jackson ImmunoResearch | bs-0358G-Cy3-BSS | Use at 1:500 dilution in PBT containing 5% NGS |
| Vectashield mounting medium for fluorescence | Vector laboratories | H-1000 |
References
- Collins, C. A., DiAntonio, A. Synaptic development: insights from Drosophila. Curr. Opin. Neurobiol. 17 (1), 35-42 (2007).
- Fortini, M. E., Skupski, M. P., Boguski, M. S., Hariharan, I. K. A survey of human disease gene counterparts in the Drosophila genome. J. Cell Biol. 150 (2), 23-30 (2000).
- Ramachandran, P., Budnik, V. Dissection of Drosophila larval body-wall muscles. Cold Spring Harb Protoc. (8), (2010).
- Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D.
- Brent, J., Werner, K., McCabe, B. D.
- Ramachandran, P., Budnik, V. Immunocytochemical staining of Drosophila larval body-wall muscles. Cold Spring Harb Protoc. (8), (2010).
- Ling, S. C., Polymenidou, M., Cleveland, D. W. Converging mechanisms in ALS and FTD: disrupted RNA and protein homeostasis. Neuron. 79 (3), 416-438 (2013).
- Nishimura, A. L., et al. A mutation in the vesicle-trafficking protein VAPB causes late-onset spinal muscular atrophy and amyotrophic lateral sclerosis. Am J Hum Genet. 75 (5), 822-831 (2004).
- Chen, H. J., et al. Characterization of the properties of a novel mutation in VAPB in familial amyotrophic lateral sclerosis. J Biol Chem. 285 (51), 40266-40281 (2010).
- Funke, A. D., et al. The P56S mutation in the VAPB gene is not due to a single founder: the first European case. Clin Genet. 77 (3), 302-303 (2010).
- SOD1,ANG,VAPB,TARDBP, and FUS mutations in familial amyotrophic lateral sclerosis: genotype-phenotype correlations. J Med. Genet. Millecamps, S., et al. 47 (8), 554-560 (2010).
- Landers, J. E., et al. New VAPB deletion variant and exclusion of VAPB mutations in familial ALS. Neurology. 70 (14), 1179-1185 (2008).
- Van Blitterswijk, M., et al. VAPB and C9orf72 mutations in 1 familial amyotrophic lateral sclerosis patient. Neurobiol Aging. 33 (12), 2951-2954 (2012).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Budnik, V., et al. Regulation of synapse structure and function by the Drosophila tumor suppressor gene dlg. Neuron. 17 (4), 627-640 (1996).
- Sanhueza, M., Zechini, L., Gillespie, T., Pennetta, G. Gain-of-function mutations in the ALS8 causative gene VAPB have detrimental effects on neurons and muscles. Biol Open. 3 (1), 59-71 (2014).
- Worman, H. J., Ostlund, C., Wang, Y.
- Liu, G. H., et al. Progressive degeneration of human neural stem cells caused by pathogenic LRRK2. Nature. 491 (7425), 603-607 (2012).
- Pennetta, G., Hiesinger, P. R., Fabian-Fine, R., Meinertzhagen, I. A., Bellen, H. J. Drosophila VAP-33A directs bouton formation at neuromuscular junctions in a dosage-dependent manner. Neuron. 35 (2), 291-306 (2002).
- Fisher, P. A., Berrios, M., Blobel, G. Isolation and characterization of a proteinaceous subnuclear fraction composed of nuclear matrix, peripheral lamina, and nuclear pore complexes from embryos of Drosophila melanogaster. J Cell Biol. 92 (3), 674-686 (1982).
- Smith, D. E., Fisher, P. A. Identification, developmental regulation, and response to heat shock of two antigenically related forms of a major nuclear envelope protein in Drosophila embryos: application of an improved method for affinity purification of antibodies using polypeptides immobilized on nitrocellulose blots. J Cell Biol. 99 (1), 20-28 (1984).
- Smith, D. E., Gruenbaum, Y., Berrios, M., Fisher, P. A. Biosynthesis and interconversion of Drosophila nuclear lamin isoforms during normal growth and in response to heat shock. J Cell Biol. 105 (2), 771-790 (1987).
- Puckelwartz, M. J., et al. Disruption of nesprin-1 produces an Emery Dreifuss muscular dystrophy-like phenotype in mice. Hum Mol Genet. 18 (4), 607-620 (2009).
- Tsujikawa, M., Omori, Y., Biyanwila, J., Malicki, J. Mechanism of positioning the cell nucleus in vertebrate photoreceptors. Proc Natl Acad Sci USA. 104 (37), 14819-14824 (2007).
- Westermann, B. Mitochondrial fusion and fission in cell life and death. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (12), 872-884 (2010).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
