Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Hvorfor Kvantifisering Matters: Karakterisering av fenotyper på Published: May 12, 2016 doi: 10.3791/53821
Automatic Translation
*1, *2, 1
1Euan MacDonald Centre for Motor Neurone Disease Research, University of Edinburgh, 2School of Biomedical Sciences, University of Edinburgh
* These authors contributed equally

Abstract

De fleste studier på morphogenesis stole på kvalitative beskrivelser av hvordan anatomiske trekk påvirkes av forstyrrelser i spesifikke gener og genetiske veier. Kvantitative beskrivelser er sjelden utført, selv om genetiske manipulasjoner produsere et spekter av fenotypiske effekter og varianter er observert selv blant individer innenfor kontrollgrupper. Emerging bevis viser at morfologi, størrelse og plassering av organeller spille en tidligere underappreciated, men grunnleggende rolle i celle funksjon og overlevelse. Her gir vi steg-for-trinn-instruksjoner for å utføre kvantitative analyser av fenotyper i Drosophila larve nevromuskulære krysset (NMJ). Vi bruker flere pålitelige immuno-histokjemisk markører kombinert med bio-avbildningsteknikker og morfometriske analyser for å undersøke effekten av genetiske mutasjoner i spesifikke cellulære prosesser. Spesielt har vi fokus på kvantitativ analyse av fenotyper som påvirker morfologi, størrelse og plassering av nuclei innenfor tverrstripet musklene i Drosophila larver. Drosophila larve NMJ er en verdifull eksperimentell modell for å undersøke de molekylære mekanismer som ligger til grunn for konstruksjonen og funksjonen av det nevromuskulære system, både helse og sykdom. Imidlertid kan de metoder vi beskriver her bli utvidet til andre systemer i tillegg.

Protocol

1. Eksperimentell Forberedelse

Merk: disseksjoner og immun-histokjemi prosedyrer i avsnitt 2 og 3 er utført i henhold til referanser 3-6, men med modifikasjoner.

  1. Fremstille 1 x fosfatbufret saltløsning (PBS) og PBS inneholdende 0,1% Triton-X 100 (PBT). Hold dem på is.
  2. Forbered Bouin er fiksativ (15 Picric Acid: 10 Formaldehyd: en Glacial Eddiksyre). Gjør dette reagenset frisk.
  3. Velg ren rustfritt stål minutien pinner og fin pinsett.
  4. Forbered disseksjon plater som inneholder en Sylgard plate i en 5 cm petriskål.

2. Disseksjon av tredje instar Larve NMJs

  1. Plukk vandrende tredje instar larver fra et hetteglass eller en flaske med en fin pensel og plassere dem i en 2 cm petriskål som inneholder 4 ° C PBS for å vaske den gjenværende mat unna.
  2. Plasser en larve på toppen av Sylgard overflaten av disseksjon plate og sørg for at det er positioned med sin dorsal side opp, slik at de to langsgående trakealtubers er synlige på toppen.
  3. Ved hjelp av pinsett til å holde pinnen, pin larven ned på sitt fremre enden, rett under munnen kroken. Strekk larven ut så mye som mulig og feste sin bakre ende ned.
  4. Legg nok PBS saltvann for å nå veggene av platen og fullstendig fordype larven.
  5. Gjenta prosedyren fra trinn 2.1 til 2.3 for andre larver av samme genotype. En enkelt 5 cm petriskål disseksjon plate kan lett romme opptil åtte larver.
  6. Bruke mikro-disseksjon saks, litt løft ryggskjellaget og gjøre en liten horisontal snitt på bakre enden nær pinnen.
  7. Sett saks inn i snittet, kuttet larven hele veien til den fremre ende langs midtlinjen mellom de to langsgående områder av luftrøret. Pass på at midtlinje kuttene er overfladisk nok å bare passere gjennom hårstråene og for å unngå å skjære gjennom musklene påventral side.
  8. I hver ende, kuttet to hakk på både venstre og høyre side.
  9. Åpne fileten ved å plassere to tapper på begge sider av den fremre snittet. Gjenta det samme med den bakre enden. Når du plasserer pinnene, sørg for å spre kroppsveggen fra hverandre.
  10. Rengjør de indre organer ved hjelp av pinsett og PBS saltvann. La det sentrale nervesystemet intakt. Forsiktig strekke larven med hjørne pinner til den er helt strukket, men sørg for at musklene ikke er revet i løpet av denne prosessen.
  11. Gjenta den samme disseksjonen fremgangsmåten for den andre larver på den samme disseksjonen plate.
  12. Vask med PBS saltvann tre ganger for å fjerne alle de indre organene.
  13. Sett på PBS med Bouin er fiksativ og la ved romtemperatur i 10 min.
  14. Vask flere ganger med PBT.
  15. Fjern pinnene nøye og overføre alle forberedelsene, som nå er ganske stiv, i en 1,5 ml mikro-sentrifugerør for immunofarging.

3. Immuno-histokjemisk Farging av Drosophila NMJs med antistoffer spesifikke for muskler og myonuclei

  1. Raskt skyll larve fileter i PBT.
  2. Blokkere preparatene ved inkubering med 10% normalt geiteserum (NGS) i PBT i 2 timer under konstant omrøring.
  3. Inkuber et sett av dissekert NMJs i PBT inneholdende 5% av NGS og et kanin-anti-lamin-antistoff (ved en konsentrasjon på 1: 500) og med et marsvin anti-DVAP antistoff (ved en konsentrasjon på 1: 500) i 2 timer ved romtemperatur eller ved 4 ° C over natten. Den anti-DVAP antistoff flekker tverrstripet muskler mens anti-lamin flekker oppdager konturene av myonuclei.
  4. Vask en gang raskt i PBT for å fjerne antistoffene i overskudd. Vask i PBT for to timer ved å endre PBT buffer hvert 15 min.
  5. Inkuber prøvene i PBT inneholdende 5% NGS og fluorescensmerkede sekundære antistoffer ved 1: 500 fortynning i 2 timer ved romtemperatur. De samme prøvene cet underkastes farging med flere antistoffer på samme tid hvis sekundære antistoffer konjugert med forskjellige kromoforene er brukt.
  6. Fjern sekundære antistoffer, og vaskes i PBT i 2 timer ved endring av PBT buffer hvert 15 min.
  7. Å farge det indre av myonuclei vaske prøvene tre ganger med PBS og fortsett som følger:
    1. Tilsett atom markør TO-PRO-3 ved en fortynning på 1: 1000 i PBS og inkuberes i 20 minutter under konstant omrøring. Denne markøren er brukt i denne undersøkelsen, men hvilket som helst annet kommersielt tilgjengelige kjerne markør kan anvendes i tillegg.
    2. Vask raskt tre ganger i PBS før montering.

4. Montering Prøver på lysbildene

  1. Plukk prøvene opp med pinsett fra 1,5 ml mikro-sentrifugerør og legge dem ned på et behandlings lysbilde.
  2. Ved å bruke mikro-disseksjon saks, klippe hodet og halen av filetene og holde sin indre overflate opp.
  3. Forbered the montering lysbilde ved å vikle rundt tre strimler av cellulose tape på hver side av en ren glide i en avstand på omtrent 1 cm fra hverandre. Når dekkglass er plassert på toppen av de to strimler, vil et gap bli generert som vil unngå utflating av prøvene. Dette er avgjørende for at tredimensjonale volum gjengivelser av strukturer skal gjøres.
  4. Sette en liten dråpe av ca. 20 ul av monteringsmedium i midten av monteringsglide mellom de tre cellulose tapestrimlene.
  5. Etter å spre monteringsmedium med rene tang, drar dissekert larvene til monterings lysbilde i monteringsmedium, mens den indre overflate opp. Prøv å montere dem i rader med fire eller fem.
  6. Forsiktig slippe en dekkglass på toppen av monterings lysbilde og sørge for at ingen luftbobler blir generert. Tett lysbilde med gjennomsiktig neglelakk. La prøvene tørke i minst 10 minutter før avbildning.

5. Confocal Innstillinger for Imaging

Merk: Bildene som presenteres i denne studien er tatt med et Nikon A1R konfokal enhet integrert på en Ti: E invertert mikroskop. Imidlertid er en hvilken som helst konfokalt mikroskop med et minimum på tre laser enheter som er tilgjengelige i de bølgelengdeområdene av 488 nm, 561 nm og 642 nm og en 3-kanal deteksjonssystem som er egnet for dette formål.

  1. Slå på lasere, detektor enhet, kvikksølv pære, scene kontrolleren, mikroskop og PC. Start kontroll programvare og feste den på scenen holderen.
  2. For å gjøre bildebehandling raskere, velge og merke alle regioner av interesse (ROI) på prøven ved å bruke en 20X objektiv.
  3. svinge revolveren nøye til 60X høyere forstørrelse objektiv (60x Plan Apo VC / NA 1,4 OIL).
  4. Plasser en dråpe immersjonsolje på objektiv og velg ett av merket ROI fra XYZ oversiktsvinduet på datamaskinen.
  5. Begynn bildebehandling ved hjelp av følgende optiske innstillinger: Velg den første dichroic speil: 405/488/561/640. Velg 488 nm laser med utslipp filter 525/50 nm i kanal 1, 561 nm laser med 595/50 utslipp filter i kanal 2 og 642 nm laser med lange pass filter 650 nm i kanal 3.
  6. Bruk følgende skanneinnstillingene før bildet oppkjøpet: Velg Galvano skanner; Scan retning én vei; Skannehastighet: 0,5 bilder per sekund.
  7. Velg Channel-serien for å unngå kanal blø gjennom.
  8. Juster pin-hull størrelse til en luftig enhet. Skanne og å justere lasereffekt, deteksjon forsterkning og offset hensiktsmessig for hver kanal for å unngå metning piksel og bakgrunnsnivå.
  9. Acquire z-stabler ved hjelp voxel størrelse 0,2 x 0,2 x 0,5 mikrometer 3 for hele Rois og glidemidler. Hvis bildene vil bli utsatt for deconvolution deretter sette voxel størrelse 0,06 x 0,06 x 0,15 mikrometer tre.
  10. Lagre bildene i .nd2 filformat eller .ics formatet.

6. Beregning av avstanden mellom kjernene innenfor Striated60, Muscles av metode for nærmeste nabo Analysis

  1. For denne analysen bruker confocal bilder viser larvekroppen-veggen muskler farget med DVAP antistoffer å visualisere musklene og med Lamin antistoffer og en kjernefysisk markør for å markere kjerner.
  2. For å estimere den nærmeste avstanden mellom atomkjerner, bruke målepunkter innenfor MeasurementPro modul av bildeanalyse programvare (f.eks Imaris). Andre lignende programmer for bildeanalyse kan brukes til samme formål.
  3. Åpne confocal bilder. For å starte, dobbeltklikk på programvareikonet. Dra og slipp confocal z-stack bilder inn i Arena.
  4. Dobbelklikk på bildene for å åpne dem automatisk i overgå View, under meny verktøylinjen ikonet image 1 . Den overgå View har tre hovedarbeidsområdet paneler: Se kartet, objektliste og objektegenskapene området.
  5. Opprett et volum gjengitt three kanal bilde ved å klikke på menyikonet 3D-visning bilde 2 .
  6. Klikk på Legg til ny målepunktene ikonet bilde 3 fra Objekter verktøylinje og følg veiviseren som vises i Object Properties området.
  7. Fra veiviseren velger du fanen Rediger først og deretter bestemt kanal. Velg enten atom markør eller lamin kanalen for å markere kjerner.
  8. Sett pekeren til Velg modus ved å trykke på fanen Esc på tastaturet.
  9. Juster størrelsen på 3D-markøren boks med musehjulet for å inneholde et gitt kjernen i bildet. Legg et målepunkt ved å holde nede Skift-tasten og venstre museklikk på den samme kjernen.
  10. Legg det andre punktet på en nærliggende kjerne på samme muskel ved å gjenta forrige trinn. En linje trekkes automatisk mellom de to punktene og den målte avstand mellom de to kjerner vises. Avstanden mellom de to kjernene er nå registrert som en statistisk variabel i Object Properties området under fanen Statistikk> Detaljert> Avstands data.
  11. Gjenta prosedyren fra trinn 6.6 til 6.10 for alle kjerner rundt en gitt kjerne.
  12. Fra Statistikk> Detaljert> Avstand data som viser alle innsamlede målepunkter, velge den korteste distansen.
  13. Ved å klikke på eksportstatistikken på Tab Skjerm til fil bilde 4 tilgjengelig under Object Properties-området, vil dataene lagres på et regneark.
  14. Gjenta samme prosedyre for de andre omkringliggende kjerner og for et valgt antall muskelfibre per genotype.
  15. Bruk av data eksporteres til et regneark, beregne gjennomsnittlig korteste avstanden (D ave) for hele M antall muskler ved hjelp av følgende ligning:
    OAD / 53821 / 53821eq1.jpg "/>
    Di er den korteste avstanden til nabokjernen for en gitt kjerne i hvor i varierer fra 0 til N, og N er antallet av kjerner som ble analysert pr muskel. Summering av verdiene fra j = 0 til j = m angir M antallet analyserte muskler.
  16. Alternativt kan du bruke Spots veiviseren og flekker til Spots nærmest mulig avstand anslå den gjennomsnittlige avstanden til nærmeste nabo kjernen. For dette er en Matlab tilleggsmodul nødvendig.
    1. Dobbeltklikk på en bestemt bilde på Arena og et 3D-volum bildet vises i visningsområdet. Klikk på ikonet Object Creation og legge til nye Spots bilde 5 fra Objekter verktøylinjen.
    2. Fra veiviseren i Object Properties-området, klikker du på alternativet Skip automatisk oppretting, Rediger manuelt.
    3. Velg enten lamin eller kjernefysisk markør kanal for å vise kjerner.
    4. Shift og klikk LSFt museknapp på alle kjerner av en bestemt muskel i bildet. En flekk på hver kjerne vises.
    5. Velg Spots til Spots nærmeste avstanden oppført under kategorien Verktøy i Object Properties området. Velg Spots Statistikk under Resultat modus og en Matlab vises.
    6. Under fanen Statistikk, velg Detalj og deretter bestemte verdier. Klikk på Distmin og verdiene av minsteavstander for hver kjerne vises.
    7. Eksportere dataene til et regneark og beregne gjennomsnittet av disse avstandene per muskel. Gjenta prosedyren for alle musklene i en gitt genotype.

7. bestemme formen på Nuclei i kroppen-veggen muskler av Drosophila Larve

  1. For denne analysen bruker confocal bilder av kroppen-veggen muskler farget med Lamin og en kjernefysisk markør for å visualisere kjerner.
  2. For å evaluere form av myonuclei, måle sphericity (definert som forholdet mellom suransiktet området av en sfære med det samme volum som den gitte kjernen, til overflatearealet av kjernen) eller elliptisitet (skiller mellom flattrykte / prolate ellipsoider og sfæroider).
  3. Åpne bildet som tidligere beskrevet. Klikk på ikonet Objekter verktøylinjen Legg til ny Overflater bilde 6 .
  4. I veiviseren som vises i Object Properties området, velger atom markør flekker som kilde Channel for å vise kjerner.
  5. Sett valget Absolute Intensitet som terskelen. Sørge for at de fleste av de kjerner viser en jevn og ikke overbelastet gjengivelse ved å endre verdien på terskelen kurve. På samme tid, unngå tilstedeværelsen av hull eller ufullstendig maske til en hvilken som helst kjerne ved hjelp av den samme kurve.
  6. Bruke Filter verktøy for å utelukke noe støy i overflaten rendering. Under fanen Rediger for den nyopprettede overflatelaget, Split eller Flett kjerner overflater som er feilaktig gjenndered.
  7. Eksporter til et regneark arkivere ellipticity og sphericity verdier av overflaten gjengis kjerner som er tilgjengelige under fanen statistikk.
  8. Alternativt kan bruke ImageJ eller Fiji programvare for å måle sirkularitet av kjerner hvor sirkulariteten (C) er definert som C- ligning 2 . En verdi på en representerer en perfekt sirkel, mens en verdi som nærmer seg null indikerer en stadig langstrakt form.
  9. Lag maksimal intensitet projeksjoner av z stabler fra meny Bilder> Stabler> Z Project. Sett projeksjonstypen til Max intensitet.
  10. Splitte kanalene og velg atom markør kanal.
  11. Fra hovedmenyen velger du Bilde> Juster> Threshold.
  12. Segment kjernene ved å justere intensiteten terskel. Hvis de nærliggende kjerner er segmentert som en enkelt enhet, klikk på Process> Binary> Watershed verktøy for å koble kjernene.
  13. Fra hovedmenyen, velg Rediger> SValg> Opprett utvalg.
  14. Legg alle de valgte Rois til ROI Manager ved å klikke på menyen Analyze> Verktøy> ROI Manager. I vinduet ROI klikk på Legg til. Innenfor det samme vinduet velger du Mer> Split.
  15. Velg formbeskrivelser i Analyser> Angi Målinger. I vinduet ROI klikk på fanen Måle. Dette vil vise en liste over sirkularitet verdier av alle de valgte kjerner.
  16. I tillegg til å måle kjernefysisk volum, følg veiviseren overflaten skapelsen hjelp av kjernekraft markør flekker kanal som beskrevet i nr 7,3-7,7.

8. 3D-volum gjengivelser av valgte kjerner innenfor Drosophila Larve Body-veggen muskler for å evaluere intranuclear Lokalisering av et spesifikt protein

  1. Bruk confocal bilder rapportering kroppen veggen muskler farget med et kjernefysisk markør og med antistoffer som er spesifikke for Lamin og DVAP.
  2. Åpne bildene ved å initiere programvare og select den bestemte kjerne som skal analyseres. Dette kan gjøres ved å velge hovedmenypunktet Edit> Beskjær 3D.
  3. Følg veiviseren overflaten skapelsen bruker lamin kanal som beskrevet i punkt 7.3 til 7.7.
  4. Når overflaten er opprettet, klikker du på Rediger i Objects Properties området, og velg deretter Mask alle for å isolere signal inne i kjernen. Dette skaper et nytt vindu.
  5. Velg DVAP signal fra Select Channel rullegardinmenyen. Velg DVAP immuno-reaktivitet signal inne i kjernen ved å klikke på alternativet satt voxel Outside The Surface til null. En ny maskert kanal opprettet og er tilgjengelig i displayet justeringsvinduet for valg.
  6. For å visualisere tilstedeværelsen av signal inne i kjernen skape en kontur plan ved å klikke på ikonet Legg til ny klippeplan bilde 7 fra Objekter verktøylinjen.
  7. Interaktivt justere vinkelen på klippingflyet og dens posisjon for å visualisere fordelingen av signalet inne i kjernen.

Representative Results

ALS er en degenerativ sykdom spesielt påvirker motoriske nevroner som fører til en progressiv og dødelig lammelse av tverrstripet muskler 7. Missense mutasjoner i menneske VAMP-Associated Protein B (hVAPB) føre til en rekke motor neuron sykdommer som ALS type 8 8-12. En missense mutasjon (V234I) i hVAPB genet har nylig blitt identifisert i ett tilfelle av typiske ALS hos mennesker 13. For å vurdere sin patogene potensial, genererte vi transgene fluer uttrykker hVAPB Drosophila orthologue DVAP bærer sykdomsfremkallende mutasjon (DVAP-V260I). Uttrykket av denne transgenet ble rettet til musklene ved hjelp av UAS / GAL4 system og muskel-spesifikk driver BG57-Gal4 14,15. Effekten av DVAP-V260I transgen ekspresjon ble sammenlignet, og i motsetning til det av to andre transgener (DVAP-WT1 og DVAP-WT2), som uttrykker forskjellige nivåer av vill-type protein DVAP 16. More spesielt økningen i DVAP immunoreaktivitets er 2,2 ganger høyere enn i kontrollene for DVAP-WT2 linje mens DVAP-V260I og DVAP-WT1 utstillingssammenlign og lavere nivåer av det samme signalet 16.

Kjernefysiske endringer er forbundet med aldring og en rekke neurodegenerative sykdommer så som Parkinsons sykdom 17,18. For å vurdere om våre fly modell for ALS8 viser endringer i atom arkitektur, posisjon og størrelse, farget vi kjerner innenfor tverrstripet musklene passende genotyper med et kjernefysisk markør og anti-Lamin antistoff 19-22, som visualiserer atom konvolutten. For å fremheve musklene, ble en DVAP-spesifikt antistoff også lagt til de samme prøvene (figur 1). Confocal bilder ble samlet inn og detaljerte morfometriske analyser ble utført ved hjelp av en bildeanalyse programvare. I kontroll muskler, ble kjerner funnet å være jevnt fordelt langs muskelenfiber mens i DVAP-V260I og DVAP-WT uttrykke muskler, kjerner viser en tendens til å omfordele i nær tilknytning klynger (figur 1).

Vi har utført en nærmeste nabo-analyse for å utføre en kvantitativ evaluering av fordelingen av kjerner langs muskelfibrene i hver genotype. En nærmeste nabo-analyse identifiserer først nærmeste nabo for hver kjerne ved å måle avstanden mellom sentrum for en gitt kjerne og midten av hver andre omgivende kjerne. Denne prosedyren gjentas for alle andre kjerner langs muskelfibrene. Til slutt, den korteste avstanden mellom atomkjerner i en bestemt muskel, beregnes ved å ta gjennomsnittet de korteste avstander på hver kjerne og sine nærmeste naboer. (Figur 2A - C). Sammenlignet med kontrollene, muskler som uttrykker enten den DVAP-V260I transgen eller noen av de transgener overekspresjon av vill-type-proteinetPresenterer en dramatisk reduksjon i den gjennomsnittlige korteste avstand mellom kjerner og, som en konsekvens, kjerner synes å være nært forbundet i klynger. Effekten av ALS forårsaker allelet DVAP-V260I er mer alvorlig enn det som er knyttet til overekspresjon av vill-type protein, selv om den sterkeste DVAP-WT2 transgenet benyttes (figur 1 og figur 2D).

Overekspresjon av enten DVAP-V260I eller DVAP-WT transgener viser også en alvorlig svekkelse av kjernearkitektur som resulterer i deformerte kjerner med en langstrakt struktur (figur 1). Denne strukturelle avvik ble kvantifisert ved hjelp av ImageJ programvare i hvilken sirkularitet er definert ved formelen C ligning 3 , Som måler bredden til lengde-forhold på hver kjerne med C = 1 representerer en perfekt sirkel og C = 0-uendelig en langstrakt polygon. i kontrol kjerner som oppviser en tydelig rund form, er C lik 1, mens i de transgene mutanter en endring i form med derav følgende tap av sirkularitet, fører til en betydelig avvik fra denne verdien (figur 1 og figur 3).

Vi har også funnet at i musklene som uttrykker de samme transgener, kjerner viser en markert større atomvolum sammenlignet med kontroller, selv om den ALS forårsaker allelet synes å være mer effektiv i å fremkalle denne fenotype i forhold til de DVAP-WT transgener (figur 4).

Nesten alle nevrodegenerative sykdommer er kjennetegnet ved den intracellulære akkumuleringen av aggregater inneholdende den patogene protein. Vi har gjort 3D rekonstruksjoner og volum gjengivelser av kjerner, og vi fant ut at i musklene som uttrykker mutant transgenet eller overekspresjon villtype protein, DVAP immun-reaktivitet dannet klynger and at noen av dem ble også lokalisert inn i kjernen (figur 5). Omvendt, i kontroll NMJs, DVAP immun-reaktivitet er svakt spredt over hele muskelfiber og er utelukket fra kjernen 16.

Figur 1
. Figur 1: Confocal bilder av myonuclei innenfor tverrstripet muskler uttrykker enten DVAP-WT eller DVAP-260I transgener (A) BG57-Gal4 / + kontroll, (B) BG57, DVAP-V260I, (C) BG57, DVAP-WT1 og (D) BG57, DVAP-WT2 muskler uttrykker de angitte transgener er farget med antistoffer spesifikke for DVAP (rødt signal), Lamin (grønt signal) og med en kjernefysisk spesifikk markør for å visualisere kjerner (blå signal). Scale bar = 30 mikrometer Klikk her for å vise enstørre versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2: Nærmeste nabo-analyse for å bestemme den gjennomsnittlige avstand mellom en kjerne og dens enkelt nærmeste nabo (B) Representative resultater som viser endret atom posisjonering i musklene overekspresjon den DVAP-WT2 transgenet sammenlignet med kontrollene i (A).. Gjennomsnittlig atom avstand i musklene i de angitte genotypene ble beregnet ved bruk av formelen i (C), og dataene er angitt i (D). Larve NMJs er farget med antistoffer spesifikke for DVAP (rødt signal), Lamin (grønn) og med en kjernefysisk markør (blå signal). Stjernene betegne statistisk signifikans. *** P <0,001, ** p <0,01. For statistisk analyse av dette eksperimentet, og alle de rapporterte forsøk under en enveis ANOVA test ble brukt og en Tukey s multiple sammenligningstest ble påført som en post-hoc test når forskjellene mellom genotypene ble funnet å være av betydning ved ANOVA-testen. Feilfelt representerer SEM. Scale bar = 30 mikrometer Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3:. Bildene viser representative trinnene i beregningen av kjernefysiske volum (A) En representant bilde som viser segmenterte kjerner bruker veiviseren for oppretting overflaten. Kjerner på grensen av bildene ble ignorert. (B) Bildet viser atom DVAP signal etter den omkringliggende DVAP flekker har blitt maskert ved hjelp overflaten opprettet i atom markør kanal. (C) Overflatelaget gir informasjon om flere parametereinkludert atom volum og sphericity. (D) Data om kjernefysisk volum av ulike genotyper. Stjernene betegne statistisk signifikans. Dissekert NMJs ble farget med anti-DVAP antistoffer (rød signal), anti-Lamin antistoffer (grønn signal) og en kjernefysisk markør (blå signal). *** P <0,001, ** p <0,01. Feilfelt representerer SEM. Scale bar = 30 mikrometer Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4: Bildene viser representative trinn i beregningen av kjernefysisk form av ImageJ.    Maksimal intensitet projeksjon av bildene ble analysert ved hjelp ImageJ å anslå sirkularitet av kjerner i musklene. (A) Et representativt eksempel på intensiteten fremspringav de tre kanalbilde som i trinn 7.9 i protokollen. (B) Bildet viser steg 7,10 av protokollen i hvilke kanaler som skal deles og atom markør kanalen er valgt. (C) En representant bilde som viser at etter påføring intensitet terskel for å segmentere kjerner og ROI leder plugin i ImageJ, kan alle kjerner av interesse velges og deres form målt gjennom formbeskrivelser (trinn 07.11 til 07.15). (D) Kvantifisering av sirkularitet av forskjellige genotyper. På larve NMJs viser den røde signal DVAP flekker, mens den grønne skisserer kjerner og svarer til lamin farging. Interiøret i hver kjerne er merket med blått på grunn av farging med et kjernefysisk markør. Stjernene betegne statistisk signifikans. *** P <0,001, ** p <0,01. Feilfelt representerer SEM. Scale bar = 30 mikrometer Vennligst klikk here for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5
Figur 5: Bilder som viser konkrete skritt i etableringen av volum gjengivelser av myonuclei. (A) Bildet viser 3D intensitet blandet riss av muskler farget med DVAP protein (rød), den lamin (grønn) og DNA-markør (blå). (B) bilde som representerer et overflatelag som genereres ved hjelp av lamin kanalen til segmentet kjernene. (C) bilde som representerer en kjerne hvor overflatelaget er blitt brukt til å maskere den DVAP signal utenfor den valgte kjerne. Uthevet i gult er et klippeplan som er lagt til bildet. Dens synsvinkel og posisjon kan bli interaktivt justeres for å visualisere fordelingen av signalet inne i kjernen. (D) Et bilde rapporterer et tverrsnitt av den nukleære overflatelaget er laget using Lamin kanal fusjonert med usminket DVAP og atom markør signaler. (E og F) Tilleggs seksjonert volum gjengivelser av samme kjernen. Scale bar = 10 mikrometer Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

I det siste, ble morfologiske variasjoner innenfor og mellom forsøksgruppene sjelden tatt hensyn til. Imidlertid er anvendelsen av kvantitative metoder nå blitt normen i komparative studier av morfologi og matematisk beskrivelse av anatomiske former er beregnet. Bruken av kvantitative analyser for å vurdere effekten av genetiske manipulasjoner på bestemte cellulære prosesser, holder løftet i å forbedre vår evne til å oppdage morfologiske endringer og forbedre nøyaktigheten som disse endringene er beskrevet. Videre statistisk analyse av kvantitative data gjør at vi kan vurdere om de observerte forskjellene mellom fenotyper er betydelige.

I tverrstripet muskler, kjerner viser en tydelig avrundet struktur og er jevnt fordelt langs muskelfibrene. Selv om de molekylære mekanismer etablere og opprettholde størrelse, form og arkitektur av kjerner ikke er kjent, er disse kjernefysiske egenskaper er sannsynlig to spille en avgjørende rolle i å kontrollere muskelfunksjon. Faktisk er flere myopatier på grunn av mutasjoner i gener som regulerer morfologi og stillingen av kjerner i muskler. Den funksjonelle betydningen av form og fordeling av kjerner i en celle er ikke begrenset til muskler. Samle bevis viser at kjernefysiske defekter er også assosiert med nevrodegenerative sykdommer som Parkinsons sykdom 18,24. I tillegg er vi i ferd med å sette pris på at morfologi, størrelse og intracellulær fordeling av andre organeller inkludert endoplasmatiske retikulum og mitokondrier kan ha funksjonelle konsekvenser. For eksempel, blir endringer i mitokondriell morfologi assosiert med nevrologiske forstyrrelser slik som optisk atrofi type-1 (OPA1) og Charcot-Marie-Tooth typen 2A nevropati 25.

For å hjelpe til i prosessen med å belyse de molekylære mekanismer som ligger under disse viktige prosesser, foreslår vi å kombinere høy oppløsning konfokaldata med bildebehandlingsprogrammer og morfometriske analyser for å kvantitativt vurdere hvordan genetiske manipulasjoner kan påvirke form, størrelse og plassering av kjerner i muskelfibrene. Kraften og allsidigheten til Drosophila genetikk sammen med den sterkt stereotype arten av den nevromuskulære system i Drosophila larver gjøre larve NMJ en eksperimentell modell spesielt egnet for denne type analyser. Ved larve NMJs, kan utføres fenotypeanalyser ved en enkelt synapse oppløsning slik at en nøyaktig morfometrisk analyse hvor en rekke NMJs kan studeres i samme fly og til og med det samme identifiserbart NMJ kan sammenlignes mellom fluer med forskjellige genotyper 3,4.

Fenotypisk karakterisering av kjernefysisk posisjon, form og størrelse på Drosophila larve NMJ starter ved å utføre farging av dissekert NMJs med antistoffer som synliggjør muskler og kjerner i musklene. I den protokoll som er beskrevet i this papir, myonuclei ble farget med polyklonale antistoffer mot Lamin, en markør for atom konvolutt, med en kjernefysisk markør utheving atom interiør og med antistoffer som er spesifikke for DVAP å farge hele muskelen. Lamin antistoffer som brukes i disse eksperimentene ble vennligst tilveiebrakt av Paul Fisher 19-22, men alternative kilder for anti-Lamin antistoffer kan anvendes. I tillegg er en rekke andre antistoffer som er spesifikke for den kjernefysiske konvolutten er kommersielt tilgjengelige. Til slutt, atom markører, slik som DAPI og propidiumjodid, er også tilgjengelige, mens muskler kan bli visualisert ved farging med anti-actin eller anti-tubulin-antistoffer. Dersom andre enn de som anvendes i denne eksperimentelle prosedyren antistoffer anvendes, vil immunfarging protokollen krever ekstra-trinn i hvilket festeforhold og arbeids konsentrasjoner for de nye antistoffer blir må optimaliseres. Ett viktig skritt i denne protokollen, særlig når volumrende må analyseres, er the montering av prøvene på lysbildet. I dette tilfellet er det viktig å ta med avstandsstykker mellom sleiden og dekkglass, slik at prøvene ikke blir knust. Tre bånd av cellulosetape viklet rundt sleiden på begge sider av dekkglass representerer en enkel måte for fremstilling av avstandsstykker.

Mens ImageJ ble brukt til 2D-bilder, analyser meste av 3D multikanals bildet som presenteres i denne artikkelen, ble gjort ved hjelp av Imaris grunn av sin in-house tilgjengelighet. Imidlertid kan en hvilken som helst annen lignende kommersiell programvarepakke brukes for disse anvendelser.

Det er flere åpen kildekode (for eksempel ImageJ, CellProfiler, Vaa3D, Icy, KNIME og andre) og kommersielle programvareplattformer tilgjengelig for analyse av confocal bilder. ImageJ 26, den frie programvaren fra NIH eller dens mer forbedret versjon, kjent som FIJI 27, har et stort antall importfiltre, makroer og plugins tilgjengelig for det verdensomspennende bilde kommuty. De fleste av disse plugins er fokusert på å behandle informasjonen på en skive vise skive måte. Det finnes også plugins tilgjengelig for visualisering og analyse av flerkanals 3D-bilder. Men de er ofte laget for en bestemt oppgave, og brukere kan ha behov for å utvide eller tilpasse disse plugins til sine egne behov. På den annen side, kommersielle plattformer målrette relativt uerfarne brukere, og er ofte fokusert på brukervennlighet i bruk, bred dekning av bildebehandlings oppgaver med utrolig fart.

Den eksperimentelle fremgangsmåte sammen med de kvantitative fenotypeanalyser skissert i denne protokollen, kan hjelpe til å belyse de molekylære mekanismer som kontrollerer organeller morfologi og deres fordeling i en celle. Imidlertid har denne fremgangsmåten den åpenbare begrensning med å analysere disse prosessene ved en bestemt sluttpunkt. Prosessen for å kontrollere morfologien og fordelingen av organeller er sannsynlig å være svært dynamisk og til å variere ikke bare mellom forskjellige celle types, men også innenfor samme celle avhengig av utviklings eller fysiologisk status. En ytterligere gjennomføring av denne analysen vil være representert ved tidsforløp avbildning som tillater endringer i organeller morfologi og posisjon som skal overvåkes over tid.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Micro-Forceps 0.3 mm x 0.25 mm Fine Science Tools  11030-12
Sylgard dissection plates  SIGMA-ALDRICH 76103 Mix the pre-weighed elastomer base with curing agent. Poor the mixture into a 5 cm Petri dish. Let cure it at 60 °C for at least 24 hr
Stainless/Steel Minutien Pins 0.1 mm diameter Fine Science Tools  26002-10
Microdissection scissors (ultra-fine)  Fine Science Tools  15200-00
1x PBS (Phosphate Buffered Saline). Composition: 3 mM NaH2PO4, 7 mM Na2HPO4, 130 mM NaCl, pH 7 NaH2PO4 (SIGMA-S8282), Na2HPO4 (SIGMA-S7907), NaCl (SIGMA-S7653)
Bouin's Solution. Composition: Picric Acid, Formaldehyde, Acetic Acid (15:10:1) Picric Acid (SIGMA 197378), Formaldehyde (F8775), Acetic Acid (SIGMA-1005706)
1x PBT (Phosphate Buffered Saline with Triton). 1x PBS + 0.1% Triton  Triton-X100. SIGMA-T8787
Normal Goat Serum  SIGMA G9023
Guinea Pig anti-DVAP antibody Provided by Dr. Giuseppa Pennetta (University of Edinburgh, UK). Use at 1:200 dilution in 5% NGS
Rabbit anti-HRP (Horseradish peroxidase) Jackson ImmunoResearch 123-065-021 Use at 1:500 dilution in PBT containing 5% NGS
Rabbit anti-Lamin antibody Provided by Dr. Paul Fisher (State Univeristy of New York at Stony Brook). Use at 1:500 dilution in PBT containing 5% NGS 
TO-PRO-3 Molecular Probes T3605
Goat anti-rabbit antibody, Alexa Fluor488, conjugated Jackson ImmunoResearch bs-295G-A555-BSS Use at 1:500 dilution in PBT containing 5% NGS
Goat anti-guinea pig IgG antibody, Cy3, conjugated Jackson ImmunoResearch bs-0358G-Cy3-BSS Use at 1:500 dilution in PBT containing 5% NGS
Vectashield mounting medium for fluorescence Vector laboratories H-1000

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Collins, C. A., DiAntonio, A. Synaptic development: insights from Drosophila. Curr. Opin. Neurobiol. 17 (1), 35-42 (2007).
  2. Fortini, M. E., Skupski, M. P., Boguski, M. S., Hariharan, I. K. A survey of human disease gene counterparts in the Drosophila genome. J. Cell Biol. 150 (2), 23-30 (2000).
  3. Ramachandran, P., Budnik, V. Dissection of Drosophila larval body-wall muscles. Cold Spring Harb Protoc. (8), (2010).
  4. Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. Drosophila larval NMJ dissection. JoVE. (24), (2009).
  5. Brent, J., Werner, K., McCabe, B. D. Drosophila larval NMJ immunohistochemistry. JoVE. (25), (2009).
  6. Ramachandran, P., Budnik, V. Immunocytochemical staining of Drosophila larval body-wall muscles. Cold Spring Harb Protoc. (8), (2010).
  7. Ling, S. C., Polymenidou, M., Cleveland, D. W. Converging mechanisms in ALS and FTD: disrupted RNA and protein homeostasis. Neuron. 79 (3), 416-438 (2013).
  8. Nishimura, A. L., et al. A mutation in the vesicle-trafficking protein VAPB causes late-onset spinal muscular atrophy and amyotrophic lateral sclerosis. Am J Hum Genet. 75 (5), 822-831 (2004).
  9. Chen, H. J., et al. Characterization of the properties of a novel mutation in VAPB in familial amyotrophic lateral sclerosis. J Biol Chem. 285 (51), 40266-40281 (2010).
  10. Funke, A. D., et al. The P56S mutation in the VAPB gene is not due to a single founder: the first European case. Clin Genet. 77 (3), 302-303 (2010).
  11. SOD1,ANG,VAPB,TARDBP, and FUS mutations in familial amyotrophic lateral sclerosis: genotype-phenotype correlations. J Med. Genet. Millecamps, S., et al. 47 (8), 554-560 (2010).
  12. Landers, J. E., et al. New VAPB deletion variant and exclusion of VAPB mutations in familial ALS. Neurology. 70 (14), 1179-1185 (2008).
  13. Van Blitterswijk, M., et al. VAPB and C9orf72 mutations in 1 familial amyotrophic lateral sclerosis patient. Neurobiol Aging. 33 (12), 2951-2954 (2012).
  14. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  15. Budnik, V., et al. Regulation of synapse structure and function by the Drosophila tumor suppressor gene dlg. Neuron. 17 (4), 627-640 (1996).
  16. Sanhueza, M., Zechini, L., Gillespie, T., Pennetta, G. Gain-of-function mutations in the ALS8 causative gene VAPB have detrimental effects on neurons and muscles. Biol Open. 3 (1), 59-71 (2014).
  17. Worman, H. J., Ostlund, C., Wang, Y. Diseases of the nuclear envelope. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (2), a000760 (2010).
  18. Liu, G. H., et al. Progressive degeneration of human neural stem cells caused by pathogenic LRRK2. Nature. 491 (7425), 603-607 (2012).
  19. Pennetta, G., Hiesinger, P. R., Fabian-Fine, R., Meinertzhagen, I. A., Bellen, H. J. Drosophila VAP-33A directs bouton formation at neuromuscular junctions in a dosage-dependent manner. Neuron. 35 (2), 291-306 (2002).
  20. Fisher, P. A., Berrios, M., Blobel, G. Isolation and characterization of a proteinaceous subnuclear fraction composed of nuclear matrix, peripheral lamina, and nuclear pore complexes from embryos of Drosophila melanogaster. J Cell Biol. 92 (3), 674-686 (1982).
  21. Smith, D. E., Fisher, P. A. Identification, developmental regulation, and response to heat shock of two antigenically related forms of a major nuclear envelope protein in Drosophila embryos: application of an improved method for affinity purification of antibodies using polypeptides immobilized on nitrocellulose blots. J Cell Biol. 99 (1), 20-28 (1984).
  22. Smith, D. E., Gruenbaum, Y., Berrios, M., Fisher, P. A. Biosynthesis and interconversion of Drosophila nuclear lamin isoforms during normal growth and in response to heat shock. J Cell Biol. 105 (2), 771-790 (1987).
  23. Puckelwartz, M. J., et al. Disruption of nesprin-1 produces an Emery Dreifuss muscular dystrophy-like phenotype in mice. Hum Mol Genet. 18 (4), 607-620 (2009).
  24. Tsujikawa, M., Omori, Y., Biyanwila, J., Malicki, J. Mechanism of positioning the cell nucleus in vertebrate photoreceptors. Proc Natl Acad Sci USA. 104 (37), 14819-14824 (2007).
  25. Westermann, B. Mitochondrial fusion and fission in cell life and death. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (12), 872-884 (2010).
  26. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  27. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).

Tags

Neuroscience nevromuskulære krysset kjernen kjernefysiske morfologi kjernekraft posisjon synaptisk struktur, Fenotypiske kvantifisering
Hvorfor Kvantifisering Matters: Karakterisering av fenotyper på<em&gt; Drosophila</em&gt; Larve Nevromuskulær Junction
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sanhueza, M., Kubasik-Thayil, A.,… More

Sanhueza, M., Kubasik-Thayil, A., Pennetta, G. Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction. J. Vis. Exp. (111), e53821, doi:10.3791/53821 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter