Introduction
الارقاء يتطلب النشاط المشترك والمنظم للخلايا وبروتينات وأيونات والأنسجة في سياق الزمانية المكانية محدود 1. النشاط غير المنضبط قد يؤدي إلى نزيف أو تجلط الدم واعتلال أو وفيات في مجموعة من الاضطرابات المتعلقة تخثر الدم. والموائع الدقيقة تجربة غرفة التدفق هي تقنية الصعبة التي يحاكي الارقاء في المختبر. هذا النهج يتيح التحقيق للتفاعل معقدة من العمليات التي تشارك في الارقاء مع الدور القيادي للالصفائح الدموية.
بعد إصابة الأوعية الدموية والصفائح الدموية تلتصق البروتينات يتعرض مصفوفة تحت البطانة (غليكو) لمنع فقدان الدم. وبعد التصاق، الصفائح الدموية تنشط ومجموع ردا على صناعة السيارات وإشارات نظير الصماوي الأمر الذي يؤدي في النهاية إلى تشكيل شبكة الصفائح الدموية، استقرت الفيبرين ومما أدى إلى شركة، جرح ختم خثرة 2. وخلافا لمعظم غيرها من اختبارات وظائف الصفائح الدموية، من experiالإدلاء بالبيانات مع الدوائر تدفق تأخذ بعين الاعتبار المعلمة المادية من تدفق الدم وبالتالي تأثير الريولوجيا على الخلايا والجزيئات الحيوية 3،4 المشاركة.
وقد ولدت التجارب غرفة تدفق الأفكار بارزة في الارقاء وتجلط الدم عن طريق المعايير الأساسية التي تؤثر على وقف نزيف الدم (الفرعية) العمليات بما في ذلك مصفوفة لاصقة، الريولوجيا وتدفق ملامح، وتكوين الخلايا، ووجود السموم والمخدرات، والقوة الأيونية وغيرها الكثير متفاوتة. في العقدين الماضيين، وانخفاض الإنتاجية التجارب غرفة التدفق تتطلب كميات عينة كبيرة (10-100 مل) تطورت إلى غرف الموائع الدقيقة غالبا ما تتكون من غرف موازية لوحة صغيرة ودمج التكنولوجيا الحديثة لperfusing الدم الكامل في الظروف جدار القص تسيطر 5. Microscaling زادت بشكل ملحوظ فحص الإنتاجية لأن معظمهم من إعداد الجهاز ومبسطة ومطلوب أقل (الدم) حجم، مما يجعل تجربة أكثر سهولة وversatiجنيه. على سبيل المثال، والدم من الحيوانات المختبرية الصغيرة يمكن الآن أن تستخدم من دون الحاجة للتضحية الحيوانات. وهكذا ساعد عينات الدم من الفئران المعدلة وراثيا في تحديد الجزيئات الأساسية تعزيز أو إعاقة الارقاء والأفكار الأساسية رواية 6.
مختبرات الأبحاث المتخصصة في كثير من الأحيان لا تزال تستخدم غرف تدفق العرف على سبيل المثال من ثنائي ميثيل بولي سيلوكسان (PDMS) 7 أن يبلمر على القوالب مطبوعة بالحجر والتي يمكن صورت من قبل البرامج. غرفة الناتجة غير مكلفة، يمكن التخلص منها، ويمكن تفكيكها بسهولة عن التحليل اللاحق. وعلاوة على ذلك، في الأساس أي تصميم السفن، بما في ذلك التشعبات أو المنعطفات الحادة يمكن أن يبنى على الأوامر. هذه الميزة هي أيضا الجانب السلبي له منذ كان توحيد بالفعل المشكلة الرئيسية مع التجارب غرفة التدفق، وPDMS العرف وغرف لا ساعد هذا. على رأس هذه المسألة بالذات، طلاء (الشروط)، تحقيقات الفلورسنت، تخثر، درجة الحرارةerature والوقت بين أخذ العينات وتحليلها كلها سيئة موحدة 8. توحيد هذه المتغيرات هو أمر صعب، ولكن مع ذلك حاجة للسماح مقارنة النتائج بين المختبرات. هذا الموضوع هو الموضوع الرئيسي للجمعية الدولية على تجلط الدم وتخثر الدم في اللجنة الفرعية العلمية والتقييس على الجريانيات الأحيائية 9،10.
يتم نقل مركزات الصفائح الدموية (PC) في المرضى الذين يعانون من مختلف الأمراض التي تسبب نقص الصفيحات الدموية و / أو النزيف. لكن الصفائح الدموية في الكمبيوتر ومن المعروف أن توعي، وخاصة في وظيفة من الوقت تخزين 11، تدهور العملية مرتبطة الشيخوخة ويشار إلى آفة تخزين الصفائح الدموية. ويقال أحيانا أن هذه الصفائح استعادة المتداولة مرة واحدة المنقول 12، ولكن الدليل على ذلك هو ندرة. وعلاوة على ذلك، لا يتم اختبار وظائف الصفائح الدموية التي تشكل جهاز كمبيوتر بشكل روتيني وذلك لأن العلاقة بين هذه المقايسات وفعالية علاجية أو وقائية غير واضح 13. غرف تدفق الموائع الدقيقة توفر وسيلة لتحقيق وظائف الصفائح الدموية في جهاز الكمبيوتر لتحسين سلسلة من المناورات بين جمع وإصدار. وإنما هي أداة بحث قوية ل(الاقتران) مقارنات مباشرة من جهاز الكمبيوتر كما نشرنا سابقا 14،15 ويوصف هنا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
يتبع هذا البروتوكول المبادئ التوجيهية الأخلاقية المؤسسية للبحث في العينات البشرية وتم الحصول على الموافقة المسبقة من جميع الجهات المانحة المعنية. تم الحصول على الموافقة لوصف التجارب هنا من مجلس المراجعة المؤسسية من مستشفى جامعة أنتويرب.
ملاحظة: مؤشرات درجة الحرارة هي دائما درجة حرارة الغرفة، ما لم يذكر.
إعداد 1. إعداد غرفة التدفق
- إعداد الممرات، الأنابيب ودبابيس
- دوامة تعليق الكولاجين بقوة وتمييع 1/20 في محلول الجلوكوز متساوي التوتر المقدمة من مزود إلى تركيز النهائي من 50 ميكروغرام / مل.
ملاحظة: نحن نستخدم الخيول الكولاجين وتر، مصنوعة أساسا من النوع الأول الألياف. وفرسي نوع الكولاجين وأنا غالبا ما يشار إليها باسم "Horm" الكولاجين وهو المعيار الذهبي لهذا النوع من الفحص 9 لأسباب تاريخية وكذلك البيولوجية على حد سواء. ويمكن أيضا نوع البشري الثالث الكولاجين استخدامها، ولكن الالبريد الألياف معطف أقل جودة واستجابة الصفائح الدموية ليست قوية كما. ويمكن أيضا طلاء الأسطح الأخرى يمكن استخدامها، على سبيل المثال عامل فون ويلبراند (VWF)، الفيبرينوجين، فبرونيكتين، laminin، vitronectin، thrombospondin-1 أو مزيج من هذه 16. - اتخاذ بيوشيب المتاح جديد من الحاويات الموفر. أبعاد biochips المستخدمة هنا هي 0.4W خ 0.1H س 20L في ملم 3.
- الماصة 0.8 ميكرولتر في حارة (ق) من بيوشيب ميكروفلويديك على نهاية واحدة من رقاقة وعلامة ك منفذ. تأكد من أن ممر شغل في 5/6 مع الكولاجين تحتوي على حل طلاء أعد 1.1.1. تأكد من عدم وجود فقاعات الهواء.
والمغلفة القنوات جزئيا لتجنب تراكم ألياف الكولاجين في مدخل قناة (انظر المناقشة): مذكرة. - احتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 4 ساعات أو بين عشية وضحاها في وعاء ترطيب والمغلقة.
- منع القنوات المغلفة من قبل pipetting عازلة تمنع (1.0٪ (ث / ت) المصل البقري ألبومين لد 0.1٪ (ث / ت) الجلوكوز في 10 ملي 4- (2-هيدروكسي) حامض -1-piperazineethanesulfonic (HEPES) مخزنة المالحة (HBS؛ 0.9٪ (ث / ت) كلوريد الصوديوم، ودرجة الحموضة 7.4) في النهاية وعلامة أخرى كما المدخل. تأكد من أن ممر شغل تماما مع عازلة تمنع تجنب فقاعات الهواء.
- قطع الأنابيب في نفس الطول (12 سم). استخدام واحد لكل حارة وربط كل أنابيب مع دبوس. على سبيل المثال، فإن تجربة المقارنة بين اثنين من الظروف، تشغيل نسختين يتطلب أربعة تمتد أنابيب وأربعة دبابيس أن نكون مستعدين.
- شطف الأنبوب بالماء المقطر باستخدام محقنة وإبرة G 26 أو الروابط المرفقة.
- تشبع أنابيب مع عازلة تمنع. تخزينها في حاوية مغلقة وترطيب مدة لا تقل عن 1 ساعة.
- دوامة تعليق الكولاجين بقوة وتمييع 1/20 في محلول الجلوكوز متساوي التوتر المقدمة من مزود إلى تركيز النهائي من 50 ميكروغرام / مل.
- إعداد مضخة والمنوع
- شطف المضخة والمنوع مع الماء المقطر، وإزالة فقاعات الهواء.
- نضح عازلة تمنع من حارة بيوشيب (ق) باستخدام ثابت غيض 10 ميكرولتر عند مخرج. تنظيف سطحوبيوشيب مع الغبار الدقة مجانا مسح والكحول denaturated لإزالة بصمات والغبار.
- إصلاح بيوشيب على المسرح المجهر الآلي. إذا تم استخدام حارة أكثر من واحد في وقت واحد في تشغيل واحد، ربط ثماني حارات الخائن المتعددة لمنفذ بيوشيب.
ملاحظة: الخائن المتعددة ثماني حارات هو قطعة من الأجهزة (الشكل S1) متصلا المضخة وبيوشيب. لأنها تتيح تشغيل جميع (ثمانية) الممرات المتاحة على بيوشيب أو مزيج من الممرات التي يمكن أن تكون في البرنامج المصاحب المعرفة من قبل المشغل. - استخدام المسامير في أنابيب لاصلاحها في مدخل بيوشيب. وضع الطرف الآخر من الأنبوب (بدون دبوس) في 1.5 مل أنبوب اختبار المخروطية مليئة HBS. شطف جميع أنابيب وممرات متصلة مع 1 مل HBS باستخدام مضخة، وذلك لإزالة ما تبقى عازلة تمنع وضعيف التي تنضم الكولاجين.
2. إعداد عينات الدم
- جمع وفصلالدم الطازج كامل من المتطوعين الأصحاء. 17
- جمع ملليلتر الأولى من الدم في الأنابيب المفرغة التي تحتوي على ثنائي أمين الإيثيلين رباعي حمض الخل (EDTA) كمضاد للتجلط واستخدام حصرا هذه العينة لتعداد الدم الكامل (CBC) مع محلل أمراض الدم الآلي.
- جمع حجم الدم في تخثر مناسبة باستخدام الأنابيب المفرغة. مضادات التخثر القياسية للتجارب غرفة التدفق هي الهيبارين أو هيرودين عندما الفيبرين تشكيل ليست جزءا من بروتوكول الدراسة وسيترات الصوديوم عندما يكون.
ملاحظة: تم استخدام الهيبارين كمضاد للتجلط لجميع التجارب وصفها في النتائج.
ملاحظة: كمية الدم يعتمد على عدد من التجارب التي يتعين القيام بها. ما يقرب من 1 أنبوب (7 مل) لمدة 3 حارات. - وضع أنابيب على محور دوار بانتظار إعادة الدم.
ملاحظة: يجب الانتهاء من الفحص خلال 3 ساعة من الفصد. - أجهزة الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة في 250 غرام لتحضير الصفائح الدموية البلازما الغنية (PRP). لا تستخدم استراحة للطرد المركزي لمنع اضطراب بيليه معبأة فضفاضة.
- عندما تم جمع أنبوب أكثر من واحد، تجمع الدم في أنبوب الطرد المركزي مخروطي الشكل واحد.
ملاحظة: يمكن أن يتم الطرد المركزي ببطء أكثر أو أقل طويلة، اعتمادا على المحصول PRP والتفضيلية خلية "تلوث" المفضل.
- عندما تم جمع أنبوب أكثر من واحد، تجمع الدم في أنبوب الطرد المركزي مخروطي الشكل واحد.
- إزالة والتخلص من الحزب الثورى ومعطف الشهباء العائد خلايا الدم الحمراء محملة القليلة الصفائح الدموية.
ملاحظة: عدد الصفائح الدموية في جزء الخلية الحمراء معبأة هو 13 ± 5 × 10 3 في ميكرولتر (يعني ± SD، ن = 12) في المتوسط في أيدينا.
- إعادة إعماره الدم
- فصيلة الدم AB ذوبان الجليد (القرد D سلبي) البلازما عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق و 20 ثانية في 4 مل.
- تحديد الهيماتوكريت من خلايا الدم الحمراء معبأة أعد 2.1.5 باستخدام محلل أمراض الدم الآلي.
- تحديد تركيز الصفائح الدموية في بنك الدم أعدت الصفائح الدموية التركيز ثاتي سيتم استخدامها لإعادة بناء جزء الخلية الحمراء أعلاه.
- حساب حجم خلايا الدم الحمراء معبأة والتركيز الصفائح الدموية من شأنها أن تسفر عن 40٪ الهيماتوكريت و 250 س 10³ الصفائح الدموية / ميكرولتر في عينة 1 مل.
ملاحظة: التتر الأخرى المستهدفة من الخلايا يمكن ضبط تعسفي، اعتمادا على بروتوكول الدراسة. - نقل معبأة خلايا الدم الحمراء والبلازما في أنبوب جديد باستخدام طرف الماصة قص وإضافة الصفائح الدموية المركزة حتى يتم التوصل إلى حجم عينة من 1 مل.
ملاحظة: اعتمادا على متغيرات الدراسة، يجب أن يكون جزء البلازما على قدم المساواة في جميع العينات تشكيلها بسبب البلازما له تأثير كبير على معدل تشكيل خثرة. على سبيل المثال، تكرار تجميد الذوبان أو البلازما المأخوذة من مختلف الجهات المانحة أو على مضادات التخثر مختلفة قد تؤثر على النتيجة. - مزيج من الدم أعيد بلطف بواسطة قلب وإجراء CBC.
- إعداد "فارغة" العينة الضابطة التي يتم استبدال حجم جزء الصفائح الدمويةمن نفس الحجم من 0.9٪ (م / ت) كلوريد الصوديوم في الماء لتحديد تركيز الصفائح الدموية الذاتية (أي غير الدم الصفائح الدموية البنك) في الدم أعيد تشكيلها باستخدام CBC.
- وسم
- الماصة 1 مل أعادت الدم في أنبوب اختبار يحتوي على 1 ميكرولتر 5 ملي Calcein AM (5 ميكرومتر تركيز النهائي).
ملاحظة: الأصباغ خلية أخرى يمكن استخدام 14. - المزيج بلطف عكس.
- احتضان لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية قبل استخدامها.
- الماصة 1 مل أعادت الدم في أنبوب اختبار يحتوي على 1 ميكرولتر 5 ملي Calcein AM (5 ميكرومتر تركيز النهائي).
3. الإرواء الفحص
- التركيز على الهدف على ألياف الكولاجين الالتزام في أسفل الممرات. من الناحية المثالية، استخدام إعدادات فرق التدخل النقيض (DIC) على النقيض من المرحلة أو لهذه الاستراتيجية التركيز. اختر 'Z الحالي تعيين لمناطق البلاط المختارة في البرنامج تجربة لإصلاح رقميا Z-الوظائف المختارة.
- تحديد المنطقة ذات الاهتمام (ROI) في حارة (س ص) في برنامج تجربة مicroscope التي سيتم تسجيلها خلال التجربة.
ملاحظة: العائد على الاستثمار يمكن أن يكون أي مساحة مختارة عشوائيا داخل ممر الارواء. ومن المستحسن عدم لتحليل تشكيل خثرة على مقربة من في- ومخرج ممر وذلك لتجنب الآثار الجانبية لمحة تدفق متغير في تلك المنطقة، على الرغم من أن هذا هو صغير نسبيا. يجب أن تحتوي على مساحة العائد على الاستثمار في عدد كبير من الصفائح الدموية أو الجلطة الدموية للسماح تسوية للإشارة. في هذا البروتوكول العائد على الاستثمار هو مجموع مخيط رقميا من ثلاث صور متساوية الحجم جنبا إلى جنب مما أدى إلى 0.62 مم 2 في وسط 2 سم ممر طويل. - خلط العينات بلطف عكس ووضع هذه بجوار بيوشيب على المسرح الآلي.
- وضع أنابيب متصلة مع مدخل للبيوشيب في أنابيب الاختبار تحتوي على عينات الدم تشكيلها.
- إطلاق مضخة في 50 داين / سم 2 (أو الضغوط القص أخرى حسب الرغبة) لتلك القنوات المرتبطة اختبار أنابيبتحتوي على عينات الدم تشكيلها باستخدام برنامج للمضخة.
ملاحظة: ضغوط القص أخرى يمكن استخدامها. - تسجيل صور كل 15 ثانية لمدة 5 دقائق في الوقت الحقيقي باستخدام اقتناء وتجربة البرنامج المجهر.
ملاحظة: سلسلة زمنية أخرى يمكن استخدامها تبعا لانشاء التجريبية.
ملاحظة: نحن نستخدم عادة التكبير 100X (الهدف 10X 10X والعدسات)، ولكن يمكن بسهولة أعلى (أو أقل) التكبير أن تستخدم كبديل.
4. غسل خارج
- تغسل جميع الأنابيب التي تعلق على منفذ ومتصلا متعددة الأقنية أو مضخة باستخدام الماء المقطر، تليها هيبوكلوريت الصوديوم (التبييض) 0.5٪ (ت / ت)، وأخيرا 0.1 M هيدروكسيد الصوديوم في الماء. تجاهل أنابيب معلقة على مدخل بيوشيب كنفايات خطرة.
تحليل 5. البيانات
- تحديد حركية النمو خثرة مع برنامج تحليل الصور. الأوامر التالية هي محددة لZEN2012.
- تعيين عتبة مضان في علامة التبويب تحليل التفاعلي لتحديد كثافة بكسل الذي يرتبط مع إشارة إيجابية، أي على الصفائح الدموية الالتزام أو الصفائح الدموية الانضمام.
- استخدام إنشاء جداول لتوليد تلقائيا البيانات التي سوف تحتوي على مساحات منفصلة (في ميكرون 2) من تلك "الأشياء" التي تحتوي على بكسل مع الإشارة بين عتبات المحدد. يتم تنفيذ هذا عن كل نقطة زمنية.
ملاحظة: عندما يكون عتبات مضان اختار، وبرامج التحليل بالكشف عن "الأجسام" في مجال الرأي القائل بأن تفي بالمعايير تلقائيا. هذه الكائنات هي الجلطة الدموية، وحدات صفائح صغيرة أو الصفائح الدموية واحدة وتغطي عددا من بكسل. يتم سرد كل كائن في جدول منفصل. - حفظ هذه جداول البيانات في شكل أكس أم أل وفتحها في برنامج جدول بياناتلمزيد من العمليات الحسابية.
- مجموع المناطق على سطح الكائنات المحددة من قبل الجمع وتقسم النتيجة على مساحة إجمالية قدرها مجال القياس (ميكرون 2). هذا وسوف تسفر عن تغطية السطح النسبية (٪). القيام بذلك عن كل نقطة زمنية.
- رسم هذه التغطيات السطح في وظيفة من الوقت نضح وحساب المنحدر من الانحدار الخطي، مما أسفر عن الحركية النمو خثرة من أن حالة معينة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
لإظهار التباين داخل الفحص، تم perfused ثلاث عينات الدم الكامل أعيد متطابقة في وقت واحد على الكولاجين المغلفة السطوح (الشكل 1). وأدى ذلك إلى معامل الاختلاف من 8.7٪. وتشير هذه الإحصائية مقبول داخل فحص وتباين intralaboratory السماح مقارنة موثوقة بين العينات ذات الصلة.
مدخل للغرفة التدفق التجاري وصفنا هنا هو عمودي على غرفة قياس وهذا يمكن أن يسبب اضطرابا قليلا بدلا من تدفق الصفحي في تلك المرحلة. خصوصا في التجارب دون تخثر الدم وهذا قد يسبب انسداد بسبب زيادة وقت الاتصال بين الدم وناهض يجمد. مدخل انسداد يمكن أن يربك قراءات المصب في الغرفة. لذلك، وكان محسن الإعداد عن طريق طلاء جزئيا غرفة التدفق (الشكل 2) تركمداخل خالية من ناهض الصفائح الدموية، وبالتالي تجنب تفعيل المفاجئة من الارقاء الابتدائي والثانوي. وعلاوة على ذلك تستخدم طلاء جزئي من السطوح لاصقة بنجاح من قبل مجموعات بحثية أخرى في مجال 16. وبالإضافة إلى ذلك، هذه خدعة العملية مباشرة هو أحد الأصول لدراسة منطقة "انتقالية" حيث يستمر تدفق الدم على سطح غير التفاعلي (غير المصقول) على (مغلفة) جزء رد الفعل.
وقد عززت نقل خلال إعادة تأسيس الدم مع عنصر ناقص. لهذا الغرض، anticoagulated الدم الكامل من متبرع سليم صدر الصفيحات التي كتبها التفاضلية الطرد المركزي وجهاز الكمبيوتر الصفائح الدموية أضيفت إلى زيادة عدد الصفائح الدموية. سؤال مهم هنا كان ما الصفائح الدموية لهدف ل؟ في معظم الحالات، نقل من واقع الحياة لا يؤدي إلى تطبيع تعداد الصفيحات في المريض الصفيحات. بدلا يهدف قيمة أعلى من عتبة معينة لل،على الرغم من أن القيمة المستهدفة بالضبط هو سوء المعرفة 19. لفهم تأثير متفاوتة تعداد الصفيحات على ميكروفلويديك النتائج غرف التدفق في سياق إعادة الدم، وأجريت العديد من reconstitutions مع تناقص تركيز الصفائح الدموية (الشكل 3). كما هو متوقع، أسفرت يقل فيها عدد الصفائح الدموية في الالتصاق أقل في وظيفة من الزمن الارواء. ولذلك، ضمن دراسة معينة، يجب أن تكون موحدة تعداد الصفيحات للسماح مقارنة بين الظروف العينة 20. مجرد حقيقة أن هناك عددا أقل من التصاق عند تعداد الصفيحات منخفضة لا ولكن لا يعني أن الفحص لا يمكن أن تستخدم لقياس ترسب الصفائح الدموية في عينات نقص الصفيحات بسبب إعدادات المجهر والكاميرا يمكن تكييفها لزيادة حساسية. وأخيرا، في معظم الحالات، وعينة نقص الصفيحات تستخدم لإعادة تحتوي تبقى الصفائح الدموية ذاتي الذي يشبه الوضع في معظم نقل يطالبون المرضى 19. ومن داءغير واضح مستديم إذا وما دور الصفائح الدموية ذاتي في سياق نقل الصفائح الدموية مع خيفي لكن مسألة مثيرة للاهتمام للبحث في المستقبل.
بعد جمع الدم من المتبرعين الصحية، وغالبا ما يتم تبريد الدم كله والاحتفاظ بها في درجة حرارة الغرفة ثابتة قبل إعداد المكون. الصفائح الدموية هي إلا حساسة للتغيرات في درجة الحرارة. ويبين الشكل 4 تأثير درجات الحرارة انخفضت بعد جمع الدم وخلال نضح. تم العثور على التجلط لبناء أكثر ببطء عندما تم تبريد الدم إلى درجة حرارة الغرفة (الشكل 4A) مقارنة مع (الاقتران) عينة مطابقة أبقى عند 37 درجة مئوية طوال فترة الدراسة (الشكل 4B).
في الدورة الدموية والصفائح الدموية ربط لمواقع إصابة السفينة في ظروف ارتفاع ضغط جدار القص. تفاوت معدلات القص في الموائع الدقيقة غرف تدفق جoated مع VWF / أدى الفيبرينوجين في الخلافات لمجموع التصاق الصفائح الدموية في نقطة النهاية (الشكل 5A) وحركية النمو خثرة (الشكل 5B).
وأخيرا، لشرح كيفية غرف تدفق ميكروفلويديك يمكن استخدامها لتحقيق الكمبيوتر المستخدمة لنقل الدم، تم التحقيق حركية النمو خثرة في وظيفة تخزين الكمبيوتر. تم موحدة عن المتغيرات في إعداد العينات وانشاء التجريبية خلال فترة الدراسة. ومن هنا، كانت معلمة متغير وحيد PC تخزين الوقت. ويشير الشكل 6 انخفاض النمو خثرة في وظيفة من فترة التخزين مما يدل على تأثير الآفة تخزين الصفائح الدموية على الارقاء في المختبر.
الشكل 1: تباين البينية الفحص في التجارب غرفة تدفق الموائع الدقيقة فلو ميكروفلويديك أجريت تجارب غرفة ث على الكولاجين ثبتوا في 50 داين / سم ². تم perfused جميع عينات الدم ثلاثة متطابقة تشكيلها كلها في نفس الوقت وفي نفس الوقت. وتظهر النتائج على النحو مجموعة (شعيرات) لتغطية السطح في وظيفة من الزمن الارواء. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
تم العثور على قناة المغلفة جزئيا (أ) ألياف الكولاجين تصور بواسطة المجهر النقيض من المرحلة فقط في المنطقة المغلفة: الرقم 2. (ب) لقطة بعد 5 دقائق من نضح مع عينة دم كاملة Calcein AM المعنون باسم أعيد ضخها في 50 داين / سم 2 ويرد. اتخذت كل من الصور في التكبير 100X. ig2large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل (3): حركية النمو خثرة تعتمد على تعداد الصفيحات في الدم أعيد أعيد (A) في الدم باستخدام الصفائح الدموية بنك الدم ركاز العائد تركيز الصفائح الدموية مختلفة: 245 س 10³ / ميكرولتر (●)، 42 × 10³ / ميكرولتر (■) و 12 س 10³ / ميكرولتر (▲). أجريت تجارب غرفة تدفق الموائع الدقيقة مع قنوات الكولاجين المغلفة في وقت واحد لجميع العينات الثلاث في إجهاد القص من 50 داين / سم ². (ب) والمنحدرات وتحسب على الانحدار الخطي من البيانات الخام في لوحة ووصفت. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
تم الحفاظ على درجة الحرارة وغرف تدفق الموائع الدقيقة الدم الكامل التي تم جمعها في vacutainers الهيبارين لمدة 15 دقيقة في حمام مائي عند درجة حرارة الغرفة (A) أو عند 37 درجة مئوية (ب): الشكل 4. / تم تنفيذ سم 2 نضح ميكروفلويديك على الكولاجين ثبتوا في إجهاد القص من 50 داين. لقطات المفاجئة في نقطة النهاية (5 دقائق نضح) وصفت. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: دور إجهاد القص على التصاق الصفائح الدموية ليجمد VWF / الفيبرينوجين (A). أربعة متطابقة، calcein أكون المسمى، أعيد الدم الكاملتم perfused عينات على السطح المطلي VWF / الفيبرينوجين مع التوتر متغير القص: 4.5 داين / سم ² (●)، 50 داين / سم ² (■)، 90 داين / سم ² (▲) و 225 داين / سم ² (♦). بعد 3 دقائق من نضح، أجري تسديدة مفاجئة للجميع القنوات الأربع. وأظهرت التغطيات (ب) السطح في وظيفة من الوقت للعينات وصفها في الفقرة (أ) يوضح الاختلافات في حركية النمو خثرة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 6: يركز تشكيل خثرة الصفيحات في وظيفة من الوقت تخزين أجريت جميع التجارب غرفة تدفق ميكروفلويديك في ظل ظروف موحدة على الكولاجين الأسطح المطلية بمعدل القص من 50 داين / سم 2. كان الدم reconstituted مع عينات الصفائح الدموية من نفس التركيز اختبارها في مكررة في اليوم الثالث (●)، سبعة (■) وعشرة (▲) آخر التبرع. التغطيات السطح في وصفت ظيفة من الزمن الارواء. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
شخصية S1: تدفق ميكروفلويديك إعداد الجهاز غرفة (A) وفينا 8 الفلوري + بيوشيب هي التي شنت على المسرح الآلي المجهر ويتم توصيل عبر أنابيب مرنة إلى ضخ حقنة مع مشعب لتقسيم وظيفة الضخ إلى ثماني قنوات منفصلة. يتدفق (ب) في الدم اعادة تشكيل ومن خلال أنابيب القابل للتصرف على الجانب الأيمن في القنوات مختارة من بيوشيب (مدخل). يتم إصلاح أنابيب القابل للتصرف في مدخل طريق الفولاذوفاق سطيف الصلب دبوس المتاح توفيره مع الإعداد. تدفق الدم في الفقرة (ب) من اليمين إلى اليسار ويتم جمع في الأنابيب المرنة طويلة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ميكروفلويديك التجارب غرفة التدفق هي أداة ممتازة لتحقيق وظائف الصفائح الدموية في الدم المتدفقة وتستخدم لتقييم الارقاء في المختبر في سياقات تجريبية. وعلى الرغم من ضعف التوحيد بين المختبرات 9، علينا أن نبرهن على داخل المختبر لدينا تباين التجريبية غير مقبول. وهذا يسمح للمقارنة موثوق (الاقتران) العينات ضمن دراسة معينة. تم التحقق من صحة هذه باستخدام ظاهرة موثقة جيدا من آفة تخزين الصفائح الدموية، التي هي نتيجة الضارة للتخزين الصفائح الدموية في ظروف بنك الدم 11. وعلاوة على ذلك، نشرنا مؤخرا تأثير ثلاث تقنيات الممرض تعطيل المتاحة على جهاز كمبيوتر وظيفة الصفائح الدموية في غرف تدفق الموائع الدقيقة التالية إعادة تشكيل 14،15 الدم.
الصفائح الدموية تستجيب بشكل مختلف عندما المعلمات الفيزيائية الحيوية و-chemical متنوعة 20. لذلك، إجهاد القص، عدد الخلايا وcomposi الخلوينشوئها، ودرجة الحرارة، والطلاء، مضاد للتخثر والعديد من العوامل يمكن تعديلها خلال هذا البروتوكول اعتمادا على سؤال البحث. يستخدم هذا البروتوكول المتاحة تجاريا فقط أدوات بجهد جهيد والبرمجيات، والسماح غيرها من المختبرات لإجراء فحص مماثل. لأغراض البحوث الأساسية يمكن أن يكون هذا العيب وخاصة لأن الأجهزة المتوفرة هي أقل تنوعا من الاجهزة حسب الطلب. الفحص في حد ذاته هو قوي ولكن استنساخ يعاني من الاختلاف البيولوجي والزماني. لذلك، لا بد من إقران قدر الإمكان ودراسة أحجام يجب أن تكون كبيرة بما فيه الكفاية عينات الفحص. تحتاج عينات أيضا إلى أن يقترن في الوقت المناسب، لأن الدم تشكيلها لا يمكن تخزينها لفترة قصيرة.
على الرغم من أن الدوائر تدفق الموائع الدقيقة للدراسات وظائف الصفائح الدموية وعززت مجال البحوث، وينبغي اتخاذ الحذر لoverinterpret الاعتماد الصفائح الدموية على الريولوجيا الدم. أولا، على شكل مستطيل من غرفة التدفق ليس فيزيولوجي، بوتي أفضل ما لدينا للسماح البصرية التي تركز على تنمية الجلطة الدموية. ثانيا، ليست مصنوعة الأوعية الدموية من البلاستيك وتأثير مرونة الأوعية الدموية على وظيفة الصفيحات بالتالي، لا يمكن دراستها في هذا البروتوكول. ثالثا، قلب يسبب تدفق نابض، بينما مضخات الحقنة هي أكثر الخطية (على الرغم أيضا نابض قليلا). وأخيرا، اكتب ييفي أنا الكولاجين هو المادة القياسية المستخدمة للدراسات الصفيحات تحت التدفق، والذي هو من أصل حيواني. وتجدر الإشارة إلا أن نوع ييفي أنا الكولاجين والنتائج السريرية من أجل وظيفة الصفائح الدموية ترتبط بشكل جيد في كثير من الحالات كما هو مبين من خلال عقود من الخبرة في (نقل الضوء) قياس التكدس 21،22.
هناك العديد من المقايسات لدراسة وظيفة الصفائح الدموية 23. معظم هذه عنوان واحد أو اثنين من ميزات الصفائح الدموية في حين الصفائح وضع للعمل في (نماذج) الارقاء. في الوقت الحقيقي التصوير من تشكيل خثرة كما هو موضح هنا هو الأكثر شمولا حتى الآن. وهذا يعني معظم جوانب جيش التحرير الشعبى الصينى يتم تضمين استجابة telet إلى إصابة السفينة. مزايا فريدة هي إدراج تدفق الدم وبحضور جميع خلايا الدم. الفحص حساس للأدوية المستخدمة حاليا لعلاج مضاد للصفيحات 24 فضلا عن التغيرات الجينية مما أدى الشاذة وظائف الصفائح الدموية 25. وهذا يدل على قيمتها كمؤشر ذات الصلة من وظائف الصفائح الدموية. طبيعة شاملة لهذا الاختبار يعني مع ذلك أيضا أنه أقل التحليلي من تلك المقايسات قياس السمات المحددة للاستجابة الصفائح الدموية. لذا قبل أن آثار التلاعب بنوك الدم على مركزات الصفائح الدموية التقطت بواسطة فحوصات غرفة التدفق، ولكن لتفسير ما يسبب لهم، والتحاليل الإضافية المطلوبة. على سبيل المثال، تشير البيانات المتوفرة لدينا أن درجة الحرارة يؤثر بشكل كبير التصاق الصفائح الدموية في غرف تدفق الموائع الدقيقة. ولكن تحليلا مفصلا إضافية أظهرت أن الصفائح الدموية المبردة تغيير الشكل والكتلة GPIbα مستقبلات 26.
معشوقة = "jove_content"> براعة التصاريح سطح لاصق لدراسة مختلف ركائز الصفائح الدموية رد الفعل أو خليط منها. العمل مؤخرا وآخرون. 16 دي ويت أثبتت أهمية تعريف الركيزة لتراكم الصفائح بيولوجيا الأنظمة. وعلاوة على ذلك، فإن الجمع بين متفاوتة معدلات القص في وظيفة الركيزة مهم جدا لأنه ملزم من الصفائح الدموية لVWF يجمد سوف تتطلب معدلات القص عالية، في حين أن هذا هو أقل أهمية للربط إلى الكولاجين. ولذلك، اعتمادا على سؤال البحث، ويمكن إجراء إختبار على ما ركائز ومعدلات تدفق كل منها والتي ينبغي إدراجها.
في الختام، نقدم بروتوكول لميكروفلويديك التجارب غرفة التدفق لدراسة وظائف الصفائح الدموية في سياق بنوك الدم والطب نقل الدم. توحيد الجهود جارية 9،10،28-30 وشملت معظم هذه التوصيات في بروتوكول المعروضة. إعادة تشكيل الدم هو نموذج لنقل ولكن العمل التحقق من صحة إضافية ينبغي أن تبين أهمية إلى النتائج السريرية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD vacutainer tube with EDTA | Becton, Dickinson and Company | 368856 | |
| BD vacutainer tube with Heparin | Becton, Dickinson and Company | 368480 | |
| BD vacutainer tube with Sodium Citrate | Becton, Dickinson and Company | 366575 | |
| Hirudin Blood tube | Roche | 6675751 001 | |
| BD vacutainer Eclipse | Becton, Dickinson and Company | 368650 | Blood collection needle with preattached holder |
| Pipette tips 100-1,000 | Greiner bio-one | 740290 | |
| Pipette tips 2-200 | Greiner bio-one | 739280 | |
| Pipette tips 1-10 | Eppendorf | A08928 | |
| Tube 5 ml | Simport | 11691380 | |
| Conical tube 15 ml | Greiner bio-one | 1888271 | |
| Conical tube 50 ml | Greiner bio-one | 227261 | |
| 10 ml Syringe | BD | 309604 | |
| Precision wipes | Kimtech | 5511 | |
| Vena8 Fluoro+ Biochips | Cellix | 188V8CF-400-100-02P10 | Named in Figure S1 A as 'Biochip' |
| Vena8 Tubing | Cellix | TUBING-TYGON-B1IC-B1OC-ROLL 100F | Named in Figure S1 B as 'Disposable tubing' |
| Vena8 Needles | Cellix | SS-P-B1IC-B1OC-PACK200 | Named in Figure S1 B as 'Pin' |
| Connectors for single inlet cables of biochips | Cellix | CONNECTORS-B1IC-PACK100 | |
| Multiflow8 connect | Cellix | MF8-CONNECT-BIC3-N-THROMBOSIS | Named in Figure S1 B as 'Reusable tubing' and 'Splitter' |
| Humidified box | Cellix | HUMID-BOX | |
| Software microfluidic pump | Cellix | N/A | Venaflux Assay |
| Horm Collagen | Takeda/Nycomed | 1130630 | Native equine tendon collagen (type I) Isotonic glucose solution to dilute collagen is supplemented |
| HEPES buffered saline (HBS) | in house preparation | in house preparation | 10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) buffered saline (0.9% (w/v) NaCl, pH 7.4) |
| Blocking buffer | in house preparation | in house preparation | 1.0% (w/v) bovine serum albumin and 0.1% (w/v) glucose in HBS |
| Calcein AM | Molecular probes | C1430 | |
| Bleach 10% | in house preparation | in house preparation | |
| 0.1 M NaOH | in house preparation | in house preparation | |
| Denaturated alcohol | Fiers | T0011.5 | |
| Mirus Evo Nanopump | Cellix | 188-MIRUS-PUMP-EVO | with Multiflow8. Named in Figure S1 A as 'Pump' and 'Manifold' |
| Microscope | Zeiss | Axio Observer Z1 | equipped with a colibri-LED and high resolution CCD camera |
| Software microscope | Zeiss | N/A | ZEN 2012 |
| Hematology analyzer | Sysmex | N/A | |
| Table Top Centrifuge | Eppendorf | 521-0095 | |
| Platelet incubater | Helmer | PF-48i | |
| Incubation water bath | GFL | 1013 | |
| Pipette | Brand | A03429 | |
| Tube Roller | Ratek | BTR5-12V | |
| Sterile docking device | Terumo BCT | TSCD | |
| Tubing Sealer | Terumo BCT | AC-155 | |
| Vortex | VWR | 58816-121 |
References
- Broos, K., Feys, H. B., De Meyer, S. F., Vanhoorelbeke, K., Deckmyn, H. Platelets at work in primary hemostasis. Blood Rev. 25, 155-167 (2011).
- Stalker, T. J., et al. Hierarchical organization in the hemostatic response and its relationship to the platelet-signaling network. Blood. 121, 1875-1885 (2013).
- Sakariassen, K. S., Bolhuis, P. A., Sixma, J. J. Human blood platelet adhesion to artery subendothelium is mediated by factor VIII-Von Willebrand factor bound to the subendothelium. Nature. 279, 636-638 (1979).
- Savage, B., Saldivar, E., Ruggeri, Z. M. Initiation of platelet adhesion by arrest onto fibrinogen or translocation on von Willebrand factor. Cell. 84, 289-297 (1996).
- Westein, E., de Witt, S., Lamers, M., Cosemans, J. M., Heemskerk, J. W. Monitoring in vitro thrombus formation with novel microfluidic devices. Platelets. 23, 501-509 (2012).
- Varga-Szabo, D., et al. The calcium sensor STIM1 is an essential mediator of arterial thrombosis and ischemic brain infarction. J Exp Med. 205, 1583-1591 (2008).
- Westein, E., et al. Atherosclerotic geometries exacerbate pathological thrombus formation poststenosis in a von Willebrand factor-dependent manner. Proc Natl Acad Sci USA. , (2013).
- Grabowski, E. F., Yam, K., Gerace, M. Evaluation of hemostasis in flowing blood. Am J Hematol. 87 (Suppl 1), S51-S55 (2012).
- Roest, M., et al. Flow chamber-based assays to measure thrombus formation in vitro: requirements for standardization. J Thromb Haemost. 9, 2322-2324 (2011).
- Heemskerk, J. W. M., et al. Collagen surfaces to measure thrombus formation under flow: possibilities for standardization. J Thromb Haemost. 9, 856-858 (2011).
- Shrivastava, M. The platelet storage lesion. Transfus Apher Sci. 41, 105-113 (2009).
- Miyaji, R., et al. Decreased platelet aggregation of platelet concentrate during storage recovers in the body after transfusion. Transfusion. 44, 891-899 (2004).
- Goodrich, R. P., et al. Correlation of in vitro platelet quality measurements with in vivo platelet viability in human subjects. Vox Sang. 90, 279-285 (2006).
- Van Aelst, B., et al. Riboflavin and amotosalen photochemical treatments of platelet concentrates reduce thrombus formation kinetics in vitro. Vox Sang. 108, 328-339 (2015).
- Van Aelst, B., Devloo, R., Vandekerckhove, P., Compernolle, V., Feys, H. B. Ultraviolet c light pathogen inactivation treatment of platelet concentrates preserves integrin activation but affects thrombus formation kinetics on collagen in vitro. Transfusion. , (2015).
- de Witt, S. M., et al. Identification of platelet function defects by multi-parameter assessment of thrombus formation. Nat Commun. 5, 4257 (2014).
- Cazenave, J. P., et al. Preparation of washed platelet suspensions from human and rodent blood. Methods Mol Biol. 272, 13-28 (2004).
- Jackson, S. P., Nesbitt, W. S., Westein, E. Dynamics of platelet thrombus formation. J Thromb Haemost. 7 (Suppl 1), 17-20 (2009).
- Diedrich, B., Remberger, M., Shanwell, A., Svahn, B. M., Ringden, O. A prospective randomized trial of a prophylactic platelet transfusion trigger of 10 x 10(9) per L versus 30 x 10(9) per L in allogeneic hematopoietic progenitor cell transplant recipients. Transfusion. 45, 1064-1072 (2005).
- Neeves, K. B., et al. Sources of variability in platelet accumulation on type 1 fibrillar collagen in microfluidic flow assays. PloS one . 8, e54680 (2013).
- Born, G. V. Aggregation of blood platelets by adenosine diphosphate and its reversal. Nature. 194, 927-929 (1962).
- Cattaneo, M., et al. Recommendations for the Standardization of Light Transmission Aggregometry: A Consensus of the Working Party from the Platelet Physiology Subcommittee of SSC/ISTH. J Thromb Haemost. 11, 1183-1189 (2013).
- Deckmyn, H., Feys, H. B. Assays for quality control of platelets for transfusion. ISBT Sci Series. 8, 221-224 (2013).
- Andre, P., et al. Anticoagulants (thrombin inhibitors) and aspirin synergize with P2Y12 receptor antagonism in thrombosis. Circulation. 108, 2697-2703 (2003).
- Casari, C., et al. von Willebrand factor mutation promotes thrombocytopathy by inhibiting integrin alphaIIbbeta3. J Clin Invest. 123, 5071-5081 (2013).
- Gitz, E., et al. Improved platelet survival after cold storage by prevention of Glycoprotein Ibα clustering in lipid rafts. Haematologica. , (2012).
- Maurer-Spurej, E., Labrie, A., Brown, K. Routine Quality Testing of Blood Platelet Transfusions with Dynamic Light Scattering. Part Part Syst Char. 25, 99-104 (2008).
- Van Kruchten, R., Cosemans, J. M., Heemskerk, J. W. Measurement of whole blood thrombus formation using parallel-plate flow chambers - a practical guide. Platelets. 23, 229-242 (2012).
- Zwaginga, J. J., et al. Flow-based assays for global assessment of hemostasis. Part 2: current methods and considerations for the future. J Thromb Haemost. 4, 2716-2717 (2006).
- Zwaginga, J. J., et al. Flow-based assays for global assessment of hemostasis. Part 1: Biorheologic considerations. J Thromb Haemost. 4, 2486-2487 (2006).
