Introduction
Hæmostase kræver den kombinerede og regulerede aktivitet af celler, proteiner, ioner og væv i et begrænset Spatiotemporal kontekst 1. Ukontrolleret aktivitet kan føre til blødning eller blodprop og sygelighed eller dødelighed i et spektrum af lidelser relateret til blod koagulation. Mikrofluidapparat strømningskammer eksperiment er en udfordrende teknik, der efterligner hæmostase in vitro. Denne fremgangsmåde giver mulighed undersøgelse af det komplekse samspil af processer, der deltager i hæmostase med en ledende rolle for blodplader.
Efter vaskulær beskadigelse, blodplader klæber til den eksponerede subendoteliale matrix (glyco) proteiner for at forhindre blodtab. Efter vedhæftning, blodplader aktivere og aggregat som reaktion på auto- og parakrin signalering som endelig fører til dannelsen af en blodplade netværk, stabiliseret med fibrin og resulterer i en virksomhed, sår forsegling blodprop 2. I modsætning til de fleste andre trombocytfunktionen tests, erfamenter med strømningskamre tage hensyn til fysisk parameter af blodgennemstrømning og dermed indflydelse af rheologi for de deltagende celler og biomolekyler 3,4.
Strømningskammeret eksperimenter har genereret skelsættende indsigt i hæmostase og thrombose ved at variere nøgleparametre, der påvirker hæmostatiske (sub) processer inklusive den klæbende matrix, rheologi og strømnings- profiler, cellulære sammensætning, tilstedeværelse af toksiner eller lægemidler, ionstyrke og mange flere. I de seneste to årtier har lav throughput flow kammer eksperimenter kræver store prøvevolumener (10-100 ml) udviklet sig til mikrofluide kamre ofte består af små parallel-plade kamre og med moderne teknologi til perfusion fuldblod på kontrollerede væg forskydningsbetingelser 5. Microscaling steget betydeligt assay gennemløb mest fordi opsætningen hardwaren har forenklet og der kræves mindre (blod) volumen, hvilket gør forsøget mere tilgængelig og versatile. For eksempel kan blod fra små forsøgsdyr nu bruges uden behov for at ofre dyr. Blodprøver af genetisk modificerede mus har således hjulpet til identifikation af centrale molekyler, der fremmer eller hæmmer hæmostase og i nye grundlæggende indsigter 6.
Specialized forskningslaboratorier ofte stadig bruge specialfremstillede flow kamre for eksempel fra polydimethylsiloxan (PDMS) 7, der polymeriserer på litograferede forme, som kan blueprinted af software. Den resulterende kammer er billig, engangsbrug og kan let skilles ad for post-hoc analyse. Desuden dybest set ethvert design af fartøjer, herunder bifurkationer eller skarpe sving kan bygges på kommando. Denne fordel er også sin ulempe, da standardisering var allerede den primære problem med flow kammer eksperimenter, og PDMS specialfremstillede kamre har ikke hjulpet dette. Oven i dette særlige spørgsmål, belægning (betingelser), fluorescerende prober, antikoagulerende, tempratur og tid mellem prøvetagning og analyse er alle dårligt standardiseret 8. Standardisering af disse variabler er udfordrende, men ikke desto mindre forpligtet til at tillade sammenligning af resultater mellem laboratorier. Dette emne er den største genstand for International Society for Trombose og Hæmostase i videnskabelig og Standardisering underudvalg om Biorheology 9,10.
Blodpladekoncentrater (PC) er transfunderet i patienter, der lider af forskellige sygdomme, der forårsager trombocytopeni og / eller blødning. Men blodplader i PC er kendt til desensibilisering, især som funktion af opbevaringstiden 11, en forringelse proces forbundet med ældning og benævnes almindeligvis blodpladeopbevaring læsion. Det hævdes undertiden, at sådanne blodplader gendannes i omløb engang transfunderet 12, men bevis for dette er knappe. Endvidere er funktionaliteten af blodplader, der udgør en PC ikke rutinemæssigt testet fordi forholdet mellem sådanne assays ogterapeutisk eller profylaktisk virkning er uklar 13. Mikrofluide flow kamre tilbyde et middel til at undersøge trombocytfunktionen i PC for at optimere kæden af manipulationer mellem indsamling og udstedelse. Det er et kraftfuldt forskning værktøj til direkte (parret) sammenligninger af PC, som vi tidligere har offentliggjort 14,15 og er beskrevet her.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokol følger de institutionelle etiske retningslinjer for forskning i humane prøver og informeret samtykke blev opnået fra alle donorer, der er involveret. Godkendelse til eksperimenterne beskrevet her blev opnået fra den institutionelle gennemgang bestyrelsen for Antwerpen Universitetshospital.
Bemærk: Temperatur indikationer er altid stuetemperatur, medmindre andet er angivet.
1. Forberedelse Flow Chamber Setup
- Forberedelse Lanes, slanger og Pins
- Vortex kollagen suspension kraftigt og fortyndes 1/20 i isotonisk glucoseopløsning opgivet af tjenesteyderen til en slutkoncentration på 50 ug / ml.
Bemærk: Vi bruger heste sene kollagen, hovedsageligt består af type I fibriller. Heste collagen type I omtales ofte som "Horm" collagen og er den gyldne standard for denne type af assay 9 for både historiske såvel som biologiske årsager. Humane type III collagen kan også anvendes, men the fibriller coat mindre godt og trombocytrespons er ikke så stærk. Andre coating overflader kan også anvendes, for eksempel von Willebrand Faktor (VWF), fibrinogen, fibronectin, laminin, vitronectin, thrombospondin-1 eller kombinationer af disse 16. - Tag en ny engangs biochip fra udbyderens container. Dimensionerne af biochips anvendt her, er 0,4 W x 0,1 H x 20L i mm3.
- Pipette 0.8 pi ind lane (e) af mikrofluid biochip den ene ende af chippen og varemærke som udløb. Sørg for, at banen er fyldt 5 / 6th med collagen som indeholder coating klargjort i 1.1.1. Sørg for, at der ikke er nogen luftbobler.
Bemærk: Kanaler er delvist overtrukket at undgå akkumulering af kollagenfibre ved indgangen af kanalen (se diskussionen). - Der inkuberes ved 4 ° C i 4 timer eller natten over i en fugtig og lukket beholder.
- Blokere de coatede kanaler ved pipettering blokerende buffer (1,0% (vægt / volumen) okseserumalbumin end 0,1% (w / v) glucose i 10 mM 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazinethansulfonsyre (HEPES) saltvand (HBS; 0,9% (w / v) NaCl, pH 7,4) i den anden ende og mærke som indløb. Sørg for, at banen er helt fyldt med blokerende buffer undgå luftbobler.
- Skær slange på samme længde (12 cm). Brug én per bane og forbinde hver slange med en nål. For eksempel vil et eksperiment sammenligner to betingelser, kørt in duplo kræve fire slanger strækninger og fire ben, der skal fremstilles.
- Skyl slangen med destilleret vand under anvendelse af en sprøjte og en 26 G nål eller de ledsagende stik.
- Mæt slangen med blokerende buffer. Opbevares i en lukket og befugtet beholder i mindst 1 time.
- Vortex kollagen suspension kraftigt og fortyndes 1/20 i isotonisk glucoseopløsning opgivet af tjenesteyderen til en slutkoncentration på 50 ug / ml.
- Forberedelse pumpe og manifold
- Skyl pumpen og manifold med destilleret vand, fjerne luftbobler.
- Aspirer blokerende buffer ud af biochip bane (r) ved hjælp af den faste 10 pi spids ved udløbet. Rengør overfladen afden biochip med en præcision støvfrit tørre og denatureret alkohol til at fjerne udskrifter og støv.
- Fastgør biochip på et automatiseret mikroskop scenen. Hvis der anvendes mere end én vognbane samtidig i et løb, tilslutte otte-lane manifold splitter til biochip stikkontakt.
Bemærk: De otte-lane manifold splitter er et stykke hardware (fig S1) forbundet til pumpen og biochippen. Den tillader drift af alle til rådighed (otte) baner på en biochip eller en kombination af baner, som kan være operatør-defineret i den tilhørende software. - Brug benene i slangen til at løse dem i biochip indløb. Anbring den anden ende af røret (uden nål) i et 1,5 ml konisk reagensglas fyldt med HBS. Skyl alle rør og deres forbundne baner med 1 ml HBS anvendelse af pumpen, for at fjerne resterende blokerende buffer og dårligt vedhæftende collagen.
2. Forberedelse af blodprøver
- Indsamling og adskillelse affrisk fuldblod fra en rask frivillig. 17
- Saml de første milliliter blod i en evakueret rør indeholdende Ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) som en antikoagulant og udelukkende bruge denne prøve for komplet blodtælling (CBC) med en automatiseret hæmatologianalysator.
- Saml et volumen af blod i en egnet antikoagulant ved hjælp evakuerede rør. Standard antikoagulanter til strømningskammeret eksperimenter er heparin eller hirudin når fibrindannelse er ikke en del af forsøgsprotokollen og natriumcitrat når det er.
Bemærk: Heparin blev anvendt som en antikoagulant for alle forsøgene beskrevet i resultaterne.
Bemærk: Den mængde blod, afhænger af antallet af forsøg, der skal udføres. Ca. 1 rør (7 ml) i 3 baner. - Placer rørene på en rotator verserende blod rekonstituering.
Bemærk: Analysen skal være afsluttet inden for 3 timer efter tapning. - Centrifuger i 15 minutter ved 250 g til fremstilling af blodpladerigt plasma (PRP). Brug ikke centrifugen pause for at forhindre forstyrrelse af den løst pakket pellet.
- Når mere end ét rør blev opsamlet, pool blodet i en enkelt konisk centrifugerør.
Bemærk: Centrifugering kan udføres langsommere eller mindre lange, afhængigt af PRP udbytte og differentieret celle "kontaminering" foretrækkes.
- Når mere end ét rør blev opsamlet, pool blodet i en enkelt konisk centrifugerør.
- Fjern og kassér PRP og buffy coat giver pakkede røde blodceller med få blodplader.
Bemærk: blodpladetal i pakkede røde blodlegemer fraktion er 13 ± 5 x 10 3 pr pi (middelværdi ± SD, n = 12) i gennemsnit i vores hænder.
- Blood Rekonstituering
- Tø blodgruppe AB (Rhesus D negative) plasma ved 37 ° C i 5 min og 20 sek pr 4 ml.
- Bestem hæmatokritværdien af de pakkede røde blodceller fremstillet i 2.1.5 anvendelse af en automatiseret hæmatologianalysator.
- Bestem blodplader koncentrationen i blodbanken forberedt trombocytkoncentrat that vil blive anvendt til at rekonstituere den røde cellefraktion ovenfor.
- Beregn mængden af pakkede røde blodlegemer og blodpladekoncentrat, der vil give 40% hæmatokrit og 250 x 10³ blodplader / ul i en 1 ml prøve.
Bemærk: Andre target titre af celler kan indstilles arbitrært, afhængigt af forsøgsprotokollen. - Overførsel pakkede røde blodceller og plasma i et frisk glas med en klippet pipettespids og tilsæt blodpladekoncentrat indtil en prøve volumen på 1 ml nås.
Bemærk: Afhængigt af undersøgte variable, bør plasmafraktionen være ens i alle rekonstituerede prøver, fordi plasma har en betydelig indflydelse på trombedannelse sats. For eksempel gentagne fryse-optøning eller plasma taget fra forskellige donorer eller på forskellige antikoagulanter kan påvirke resultatet. - Bland det rekonstituerede blod forsigtigt ved at vende og udføre en CBC.
- Der fremstilles en "blank" kontrolprøve, hvor volumenet af blodplade fraktion erstattesved det samme volumen 0,9% (m / v) natriumchlorid i vand til bestemmelse af koncentrationen af endogene blodplader (dvs. ikke-blodbank blodplader) i det rekonstituerede blod under anvendelse af en CBC.
- mærkning
- Pipetter 1 ml rekonstitueret blod i et reagensglas indeholdende 1 pi 5 mM Calcein AM (5 uM slutkoncentration).
Bemærk: Andre celle farvestoffer kan bruges 14. - Bland forsigtigt ved at vende.
- Der inkuberes i 5 minutter ved 37 ° C før brug.
- Pipetter 1 ml rekonstitueret blod i et reagensglas indeholdende 1 pi 5 mM Calcein AM (5 uM slutkoncentration).
3. Perfusion Assay
- Fokus målet på collagenfibrene klæbet på bunden af banerne. Ideelt set bruge fase-kontrast eller differential interferens kontrast (DIC) indstillinger for denne fokusering strategi. Vælg 'Sæt strøm Z for udvalgte flise regioner "i eksperimentet software til digitalt fastsætte de udvalgte Z-positioner.
- Vælg et område af interesse (ROI) i lane (xy) i forsøget software af microscope der vil blive registreret under eksperimentet.
Bemærk: Den ROI kan være enhver overflade arbitrært vælges inden en perfusion lane. Det er tilrådeligt ikke at analysere thrombedannelse tæt på ind- og udløb af en lane så for at undgå bivirkninger af den variable strømningsprofil i dette område, selv om dette er relativt lille. ROI overfladeareal bør indeholde et betydeligt antal af blodplader eller tromber at tillade nivellering af signalet. I denne protokol ROI er et digitalt syet aggregat af tre lige store side-by-side billeder resulterer i 0,62 mm 2 i midten af 2 cm lange bane. - Bland prøverne forsigtigt ved at vende og placere disse ved siden af biochip på automatiserede scenen.
- Placer slangen, som er forbundet med indløbet af biochip i reagensglassene indeholdende de rekonstituerede blodprøver.
- Start pumpen ved 50 dyn / cm 2 (eller andre forskydningsspændinger som ønsket) for disse kanaler knyttet til reagensglasindeholdende de rekonstituerede blodprøver ved hjælp af softwaren af pumpen.
Bemærk: Andre forskydningsspændinger kan anvendes. - Optage billeder hver 15 sek i 5 minutter i realtid ved hjælp erhvervelse og eksperiment software af mikroskopet.
Bemærk: Andet tidsserier kan anvendes afhængigt af den eksperimentelle opstilling.
Bemærk: Vi bruger generelt en 100X forstørrelse (10X objektiv og 10X objektiver), men højere (eller lavere) forstørrelse kan nemt bruges som et alternativ.
4. Vask Out
- Udvaske alle rør fastgjort til udløbet og forbundet til multikanal manifold eller pumpe anvendelse af destilleret vand, efterfulgt af natriumhypochlorit (blegemiddel) 0,5% (v / v) og endelig 0,1 M NaOH i vand. Kassér slangen fastgjort til biochip si som farligt affald.
5. Data Analysis
- Bestem trombe vækstkinetik med billedanalysesoftware. Følgende kommandoer er specifikke for ZEN2012.
- Sæt fluorescens tærskel i analyse Interaktiv Tab for at definere pixel intensitet, der korrelerer med et positivt signal, dvs en klæbet blodplader eller klæber blodplader.
- Brug oprette tabeller til automatisk at generere et regneark, der vil indeholde de særskilte arealer (i um 2) af disse "objekter", der indeholder pixel med et signal mellem de valgte tærskler. Dette udføres for hvert tidspunkt.
Bemærk: Når fluorescens tærskler har været valgt, analysen softwaren registrerer automatisk "objekter" i det synspunkt felt, der opfylder kriterierne. Disse objekter er tromber, små blodpladeaggregater eller enkelte blodplader og dækker et antal pixels. Hvert objekt er angivet i regnearket separat. - Gem disse regneark i xml-format og åbne dem i et regnearksprogramfor yderligere beregninger.
- Total overfladen områder af de valgte objekter ved summation og dividere resultatet med det samlede areal af målingen feltet (um 2). Dette vil give den relative overflade dækning (%). Gør det for hvert tidspunkt.
- Plotte disse overflade dækningsområder i funktion af perfusion tid og beregne hældningen af lineær regression, hvilket gav thromben vækst kinetiske af den pågældende tilstand.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For at demonstrere intra-assay variation blev tre identiske rekonstituerede fuldblodsprøver perfunderet samtidigt over collagen coatede overflader (figur 1). Dette resulterede i en variationskoefficient på 8,7%. Denne statistik tyder acceptabel intra-assay og intralaboratorie variation tillader pålidelig sammenligning mellem relaterede prøver.
Indløbet af den kommercielle strømningskammeret vi beskriver her er vinkelret på målekammeret og dette kan forårsage lidt turbulent stedet for laminar strømning på det tidspunkt. Især i eksperimenter uden antikoagulation dette kan medføre tilstopning på grund af den forøgede kontakttid mellem blodet og den immobiliserede agonist. Den tilstoppede indløb kan forvirre udlæsningen nedstrøms i kammeret. Derfor blev opsætningen optimeres ved delvist at overtrække strømningskammeret (figur 2), der forladerindløb blottet for blodplade-agonist, og dermed undgå utidig aktivering af primær og sekundær hæmostase. Delvis belægning af klæbende overflader i øvrigt med held bruges af andre forskergrupper på området 16. Desuden denne ligetil praktisk trick er et aktiv at studere "overgang" zone, hvor blodet flyder over ikke-reaktivt (uden overtræk) overflade fortsætter over den reaktive (belagte) del.
Transfusion blev simuleret ved at rekonstituere blod med den mangelfulde komponent. Til dette formål, antikoaguleret helblod fra en rask donor blev gjort trombocytopenisk ved differentialcentrifugering og PC blodplader blev tilsat for at øge blodpladetal. Et vigtigt spørgsmål her var, hvad trombocyttal at sigte efter? I de fleste tilfælde gør det virkelige liv transfusioner ikke medføre normalisering af trombocyttal i trombocytopenisk patient. Snarere en værdi over en vis grænse er rettet til,selv om den nøjagtige målværdi er dårligt defineret 19. For at forstå betydningen af skiftende blodpladetællinger på mikrofluide strømningskamre resultater i forbindelse med blod rekonstitution blev adskillige rekonstitutioner udført med faldende blodplade-koncentrationer (figur 3). Som forventet, lavere blodpladetal resulterede i mindre vedhæftning i funktion af perfusion tid. Derfor inden for en given undersøgelse, blodpladetal bør standardiseres for at muliggøre sammenligning mellem prøve vilkår 20. Den omstændighed, at der er færre vedhæftning når trombocyttallet er lavt betyder dog ikke, at analysen ikke kan bruges til at måle blodpladeaflejring i trombocytopeniske prøver, fordi mikroskopi og kameraindstillinger kan tilpasses for at øge følsomheden. Endelig er der i de fleste tilfælde trombocytopenisk prøve anvendes til rekonstitution indeholder resten autologe blodplader, som ligner situationen i de fleste transfusion krævende patienter 19. Det er currladende uklart, om og hvilken rolle autologe blodplader er i forbindelse med transfusion med allogene blodplader, men er et interessant spørgsmål for fremtidig forskning.
Efter opsamling af blod fra raske frivillige donorer, er fuldblod ofte nedkøles til og holdes ved konstant rumtemperatur inden komponent forberedelse. Blodplader er dog følsom over for temperaturændringer. Figur 4 viser effekten af faldet temperaturer efter blodtapning og under perfusion. Thrombi fandtes at bygge mere langsomt, når blodet blev afkølet til stuetemperatur (figur 4A) sammenlignet med en identisk (parret) prøve holdt ved 37 ° C under hele undersøgelsen (Figur 4B).
I omløb, blodplader binder til karbeskadigelse sites i betingelser med forhøjet væg forskydningsspænding. Varierende shear satser i mikrofluide flow kamre coated med VWF / fibrinogen resulterede i forskelle for total blodpladeadhæsion ved slutpunktet (figur 5A) og for thrombe vækstkinetik (figur 5B).
Endelig, for at vise, hvordan mikrofluid flow kamre kan anvendes til at undersøge PC anvendes til transfusion, blev trombe vækstkinetik i funktion af PC opbevaring undersøgt. Alle variabler i prøveforberedelse og forsøgsopstilling blev standardiseret i hele den undersøgte periode. Derfor er den eneste variable parameter var PC opbevaringstid. Figur 6 viser faldende trombe vækst i funktion af opbevaringstiden viser effekten af blodplade opbevaring læsion på hæmostase in vitro.
Figur 1:. Intra-assay variation i mikrofluide flow kammer eksperimenter Mikrofluid flo w kammer eksperimenter blev udført på immobiliseret collagen ved 50 dyn / cm. Alle tre identiske rekonstituerede fuldblodsprøver blev perfunderet parallelt og samtidigt. Resultaterne er vist som range (whiskers) til overfladen dækning i funktion af perfusion tid. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2:. Delvist overtrukket kanal (A) Collagenfibre visualiseret ved fasekontrastmikroskopi fandtes kun i den coatede region. (B) Et snapshot efter 5 min af perfusion med en Calcein AM mærket rekonstituerede prøve af helblod pumpet ved 50 dyn / cm 2 er vist. Begge billeder er taget på et 100X forstørrelse. ig2large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: blodprop vækst kinetik afhænger blodpladetal i rekonstitueret blod (A) Blod blev rekonstitueret ved hjælp af en blodbank trombocytkoncentrat giver forskellige blodplader koncentrationer:. 245 x 10³ / ul (●), 42 x 10³ / ul (■) og 12 x 10³ / pl (▲). Mikrofluid flow kammer eksperimenter med kollagen coatede kanaler blev udført samtidig for alle tre prøver på en forskydningsspænding på 50 dyn / cm. (B) Skråningerne beregnet ved lineær regression af de rå data i panel A er afbildet. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4:. Temperatur og mikrofluide strømningskamre Helblod opsamles i heparin vacutainere blev bevaret i 15 minutter i et vandbad ved stuetemperatur (A) eller ved 37 ° C (B). Mikrofluid perfusion på immobiliseret collagen i en forskydningsspænding på 50 dyn / cm 2 blev udført. Snap skud på slutpunktet (5 min perfusion) er afbildet. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Rolle forskydningsspænding på blodpladeadhæsion til immobiliseret VWF / fibrinogen (A). Fire identiske, calcein AM mærket, rekonstitueret fuldblodprøver blev perfunderet over en VWF / fibrinogen overflade med variabel stress shear: 4.5 dyn / cm (●), 50 dyn / cm (■), 90 dyn / cm (▲) og 225 dyn / cm (♦). Efter 3 minutters perfusion blev en snap shot taget af alle fire kanaler. (B) Surface dækningsområder i funktion af tiden af prøverne, der er beskrevet i (A) er vist illustrerer forskelle i blodprop vækst kinetik. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6:. Trombedannelse af blodpladekoncentrater i funktion af opbevaringstid blev udført Alle mikrofluid flow chamber eksperimenter under standardiserede betingelser på collagen-coatede overflader ved en forskydningshastighed på 50 dyn / cm2. Blod var reconstidan- net med blodplade prøver af testet i to eksemplarer på dag tre (●) samme koncentrat, syv (■) og ti (▲) indlæg donation. Surface dækninger i funktion af perfusion tid er afbildet. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur S1:. Mikrofluid strømningskammer opsætning af udstyret (A) A Vena 8 Fluoro + biochip er monteret på den automatiserede stadium af mikroskopet og er forbundet via fleksible slange til en sprøjtepumpe med manifold at opsplitte pumpefunktion i otte separate kanaler. (B) Kunstigt blod strømmer gennem engangs slange på højre side i de valgte kanaler i biochip (indgang). Den disponible slange er fastgjort i indløbet gennem en rustfriess stål engangs pin følger med opsætningen. Blodgennemstrømningen i (B) er fra højre til venstre og opsamles i lange fleksible slanger. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mikrofluide strømningskammer eksperimenter er et udmærket redskab til at undersøge blodpladefunktion i strømmende blod og anvendes til at evaluere hæmostase in vitro i varierende eksperimentelle sammenhænge. Trods dårlig interkalibrering standardisering 9, viser vi, at den eksperimentelle variation inden for vores laboratorium er acceptabel. Dette gør det muligt på pålidelig sammenligne (parret) prøver inden for en given undersøgelse. Dette blev valideret ved anvendelse af veldokumenterede fænomen blodpladeopbevaring læsion, som er en skadelig konsekvens af blodplade opbevaring i blodbank betingelser 11. Derudover har vi for nylig offentliggjorde virkningen af tre tilgængelige patogen inaktivering teknologier på PC trombocytfunktionen i mikrofluide flow kamre efter rekonstituering af blod 14,15.
Blodplader reagerer forskelligt, når biofysiske og kemikalier parametre er varieret 20. Derfor forskydningsspænding, celleantal og cellulær kompositionention, temperatur, belægning, antikoagulerende og mange flere faktorer kan modificeres inden denne protokol afhængigt af problemstilling. Denne protokol bruger kun kommercielt tilgængelige hard- og software-værktøjer, så andre laboratorier til at udføre en lignende analyse. For grundlæggende forskningsformål kan det være en ulempe, især fordi den tilgængelige hardware er mindre alsidig end skræddersyede opsætninger. Assayet i sig selv er robust men reproducerbarhed lider biologisk og tidsmæssige variation. Derfor skal parres så meget som muligt og studere størrelser bør være tilstrækkelig stor assayprøven. Prøver skal også blive parret i tide, fordi rekonstitueret blod kun kan opbevares i kort tid.
Selvom mikrofluide flow kamre til trombocytfunktionen undersøgelser har sat skub forskningsområdet, bør der udvises forsigtighed for at overfortolke blodplade afhængighed af blod reologi. Først, den rektangulære form af strømningskammeret er ikke fysiologisk, but det bedste, vi er nødt til at tillade optisk fokus på voksende tromber. For det andet er blodkar ikke lavet af plastik og indflydelsen fra blodkarret elasticitet på blodpladefunktion kan derfor ikke undersøgt i denne protokol. Tredje, hjertet forårsager pulserende flow, mens sprøjtepumper er mere lineær (selvom også lidt pulserende). Endelig fibrillært type I collagen er den standard, der anvendes til Trombocytundersøgelser under strømning, som er af animalsk oprindelse. Af note dog fibrillær type I collagen og kliniske resultater for trombocytfunktionen korrelerer godt i mange tilfælde som det fremgår af årtiers erfaring med (lystransmission) aggregometry 21,22.
Der er mange assays til at studere blodpladefunktion 23. De fleste af disse adressen én eller et par blodplade funktioner samtidig lægge blodplader til at arbejde i (modeller af) hæmostase. Tidstro billeddannelse af trombedannelse som demonstreret her er den mest omfattende til dato. Det betyder fleste aspekter af platelet reaktion på fartøj skade er inkluderet. Unikke fordele er medtagelsen af blodgennemstrømningen og tilstedeværelsen af alle blodceller. Assayet er følsomt over for de for tiden anvendte lægemidler til trombocythæmmende behandling 24 samt til genetiske ændringer resulterer i aberrerende blodpladefunktion 25. Dette viser sin værdi som en relevant indikator af trombocytfunktionen. Den omfattende karakter af denne analyse indebærer dog også, at det er mindre analytisk end disse analyser måler specifikke træk ved trombocyt svar. Virkninger af blod bank manipulationer på blodplade koncentrater kan derfor ved samlet op af flow kammer analyser, men at fortolke, hvad der forårsager dem, der kræves yderligere analyser. For eksempel, indikerer vore data, at temperaturen væsentligt påvirker blodpladeadhæsion i mikrofluide strømningskamre. Men yderligere detaljeret analyse har vist, at kølede blodplader ændrer form og klynge GPlba receptorer 26.
et al. 16 viste relevansen af substrat definition blodplade systembiologi. Desuden er en kombination af varierende forskydningshastigheder i funktion af substratet er vigtigt, fordi binding af blodplader til immobiliseret VWF vil kræve høje forskydningshastigheder, medens dette er mindre vigtige for binding til collagen. Derfor, afhængigt af problemstilling, valg kan foretages på hvilke underlag og deres respektive strømningshastigheder skal indgå.
Afslutningsvis præsenterer vi en protokol for mikrofluide flow chamber eksperimenter for at studere blodpladefunktion i forbindelse med blod bank og transfusion medicin. Standardiseringsorganer pågår 9,10,28-30 og de fleste af disse anbefalinger indgår i den protokol præsenteres. Den rekonstituering af blod er en model fortransfusion men yderligere validering arbejde skal angive relevans for kliniske resultater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD vacutainer tube with EDTA | Becton, Dickinson and Company | 368856 | |
| BD vacutainer tube with Heparin | Becton, Dickinson and Company | 368480 | |
| BD vacutainer tube with Sodium Citrate | Becton, Dickinson and Company | 366575 | |
| Hirudin Blood tube | Roche | 6675751 001 | |
| BD vacutainer Eclipse | Becton, Dickinson and Company | 368650 | Blood collection needle with preattached holder |
| Pipette tips 100-1,000 | Greiner bio-one | 740290 | |
| Pipette tips 2-200 | Greiner bio-one | 739280 | |
| Pipette tips 1-10 | Eppendorf | A08928 | |
| Tube 5 ml | Simport | 11691380 | |
| Conical tube 15 ml | Greiner bio-one | 1888271 | |
| Conical tube 50 ml | Greiner bio-one | 227261 | |
| 10 ml Syringe | BD | 309604 | |
| Precision wipes | Kimtech | 5511 | |
| Vena8 Fluoro+ Biochips | Cellix | 188V8CF-400-100-02P10 | Named in Figure S1 A as 'Biochip' |
| Vena8 Tubing | Cellix | TUBING-TYGON-B1IC-B1OC-ROLL 100F | Named in Figure S1 B as 'Disposable tubing' |
| Vena8 Needles | Cellix | SS-P-B1IC-B1OC-PACK200 | Named in Figure S1 B as 'Pin' |
| Connectors for single inlet cables of biochips | Cellix | CONNECTORS-B1IC-PACK100 | |
| Multiflow8 connect | Cellix | MF8-CONNECT-BIC3-N-THROMBOSIS | Named in Figure S1 B as 'Reusable tubing' and 'Splitter' |
| Humidified box | Cellix | HUMID-BOX | |
| Software microfluidic pump | Cellix | N/A | Venaflux Assay |
| Horm Collagen | Takeda/Nycomed | 1130630 | Native equine tendon collagen (type I) Isotonic glucose solution to dilute collagen is supplemented |
| HEPES buffered saline (HBS) | in house preparation | in house preparation | 10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) buffered saline (0.9% (w/v) NaCl, pH 7.4) |
| Blocking buffer | in house preparation | in house preparation | 1.0% (w/v) bovine serum albumin and 0.1% (w/v) glucose in HBS |
| Calcein AM | Molecular probes | C1430 | |
| Bleach 10% | in house preparation | in house preparation | |
| 0.1 M NaOH | in house preparation | in house preparation | |
| Denaturated alcohol | Fiers | T0011.5 | |
| Mirus Evo Nanopump | Cellix | 188-MIRUS-PUMP-EVO | with Multiflow8. Named in Figure S1 A as 'Pump' and 'Manifold' |
| Microscope | Zeiss | Axio Observer Z1 | equipped with a colibri-LED and high resolution CCD camera |
| Software microscope | Zeiss | N/A | ZEN 2012 |
| Hematology analyzer | Sysmex | N/A | |
| Table Top Centrifuge | Eppendorf | 521-0095 | |
| Platelet incubater | Helmer | PF-48i | |
| Incubation water bath | GFL | 1013 | |
| Pipette | Brand | A03429 | |
| Tube Roller | Ratek | BTR5-12V | |
| Sterile docking device | Terumo BCT | TSCD | |
| Tubing Sealer | Terumo BCT | AC-155 | |
| Vortex | VWR | 58816-121 |
References
- Broos, K., Feys, H. B., De Meyer, S. F., Vanhoorelbeke, K., Deckmyn, H. Platelets at work in primary hemostasis. Blood Rev. 25, 155-167 (2011).
- Stalker, T. J., et al. Hierarchical organization in the hemostatic response and its relationship to the platelet-signaling network. Blood. 121, 1875-1885 (2013).
- Sakariassen, K. S., Bolhuis, P. A., Sixma, J. J. Human blood platelet adhesion to artery subendothelium is mediated by factor VIII-Von Willebrand factor bound to the subendothelium. Nature. 279, 636-638 (1979).
- Savage, B., Saldivar, E., Ruggeri, Z. M. Initiation of platelet adhesion by arrest onto fibrinogen or translocation on von Willebrand factor. Cell. 84, 289-297 (1996).
- Westein, E., de Witt, S., Lamers, M., Cosemans, J. M., Heemskerk, J. W. Monitoring in vitro thrombus formation with novel microfluidic devices. Platelets. 23, 501-509 (2012).
- Varga-Szabo, D., et al. The calcium sensor STIM1 is an essential mediator of arterial thrombosis and ischemic brain infarction. J Exp Med. 205, 1583-1591 (2008).
- Westein, E., et al. Atherosclerotic geometries exacerbate pathological thrombus formation poststenosis in a von Willebrand factor-dependent manner. Proc Natl Acad Sci USA. , (2013).
- Grabowski, E. F., Yam, K., Gerace, M. Evaluation of hemostasis in flowing blood. Am J Hematol. 87 (Suppl 1), S51-S55 (2012).
- Roest, M., et al. Flow chamber-based assays to measure thrombus formation in vitro: requirements for standardization. J Thromb Haemost. 9, 2322-2324 (2011).
- Heemskerk, J. W. M., et al. Collagen surfaces to measure thrombus formation under flow: possibilities for standardization. J Thromb Haemost. 9, 856-858 (2011).
- Shrivastava, M. The platelet storage lesion. Transfus Apher Sci. 41, 105-113 (2009).
- Miyaji, R., et al. Decreased platelet aggregation of platelet concentrate during storage recovers in the body after transfusion. Transfusion. 44, 891-899 (2004).
- Goodrich, R. P., et al. Correlation of in vitro platelet quality measurements with in vivo platelet viability in human subjects. Vox Sang. 90, 279-285 (2006).
- Van Aelst, B., et al. Riboflavin and amotosalen photochemical treatments of platelet concentrates reduce thrombus formation kinetics in vitro. Vox Sang. 108, 328-339 (2015).
- Van Aelst, B., Devloo, R., Vandekerckhove, P., Compernolle, V., Feys, H. B. Ultraviolet c light pathogen inactivation treatment of platelet concentrates preserves integrin activation but affects thrombus formation kinetics on collagen in vitro. Transfusion. , (2015).
- de Witt, S. M., et al. Identification of platelet function defects by multi-parameter assessment of thrombus formation. Nat Commun. 5, 4257 (2014).
- Cazenave, J. P., et al. Preparation of washed platelet suspensions from human and rodent blood. Methods Mol Biol. 272, 13-28 (2004).
- Jackson, S. P., Nesbitt, W. S., Westein, E. Dynamics of platelet thrombus formation. J Thromb Haemost. 7 (Suppl 1), 17-20 (2009).
- Diedrich, B., Remberger, M., Shanwell, A., Svahn, B. M., Ringden, O. A prospective randomized trial of a prophylactic platelet transfusion trigger of 10 x 10(9) per L versus 30 x 10(9) per L in allogeneic hematopoietic progenitor cell transplant recipients. Transfusion. 45, 1064-1072 (2005).
- Neeves, K. B., et al. Sources of variability in platelet accumulation on type 1 fibrillar collagen in microfluidic flow assays. PloS one . 8, e54680 (2013).
- Born, G. V. Aggregation of blood platelets by adenosine diphosphate and its reversal. Nature. 194, 927-929 (1962).
- Cattaneo, M., et al. Recommendations for the Standardization of Light Transmission Aggregometry: A Consensus of the Working Party from the Platelet Physiology Subcommittee of SSC/ISTH. J Thromb Haemost. 11, 1183-1189 (2013).
- Deckmyn, H., Feys, H. B. Assays for quality control of platelets for transfusion. ISBT Sci Series. 8, 221-224 (2013).
- Andre, P., et al. Anticoagulants (thrombin inhibitors) and aspirin synergize with P2Y12 receptor antagonism in thrombosis. Circulation. 108, 2697-2703 (2003).
- Casari, C., et al. von Willebrand factor mutation promotes thrombocytopathy by inhibiting integrin alphaIIbbeta3. J Clin Invest. 123, 5071-5081 (2013).
- Gitz, E., et al. Improved platelet survival after cold storage by prevention of Glycoprotein Ibα clustering in lipid rafts. Haematologica. , (2012).
- Maurer-Spurej, E., Labrie, A., Brown, K. Routine Quality Testing of Blood Platelet Transfusions with Dynamic Light Scattering. Part Part Syst Char. 25, 99-104 (2008).
- Van Kruchten, R., Cosemans, J. M., Heemskerk, J. W. Measurement of whole blood thrombus formation using parallel-plate flow chambers - a practical guide. Platelets. 23, 229-242 (2012).
- Zwaginga, J. J., et al. Flow-based assays for global assessment of hemostasis. Part 2: current methods and considerations for the future. J Thromb Haemost. 4, 2716-2717 (2006).
- Zwaginga, J. J., et al. Flow-based assays for global assessment of hemostasis. Part 1: Biorheologic considerations. J Thromb Haemost. 4, 2486-2487 (2006).
