Introduction
지혈은 제한된 시공간 상황 (1) 세포, 단백질, 이온 및 조직의 결합과 규제 활동을 필요로한다. 제어되지 않은 활동은 혈액 응고 관련 질환의 스펙트럼에 출혈이나 혈전증 및 이환율이나 사망률의 원인이됩니다. 미세 유체 흐름 챔버 실험은 시험관 내에서 지혈을 모방 도전적인 기술이다. 이 방법은 혈소판에 대한 선도적 인 역할과 지혈에 참여 프로세스의 복잡한 상호 작용의 조사를 할 수 있습니다.
혈관 손상에 따라, 혈소판은 혈액 손실을 방지하기 위해 피하 노출 매트릭스 (글리코) 단백질에 부착. 접착 후, 혈소판 활성화 및 답변 집합체 자동 - 최종적 혈소판 네트워크의 형성에 의해 안정화 피브린 및 회사의 결과에 이르게 분비 시그널링 혈전이 밀봉 권취. 대부분 혈소판 기능 검사, 체험관 달리흐름 챔버와 사항이 고려 혈류의 물리적 파라미터 따라서 멀티플 세포 및 생체에 3,4- 레올의 영향을.
흐름 챔버 실험은 접착제 매트릭스, 유동성 및 흐름 프로필, 세포 성분, 독성 물질이나 약물, 이온 강도 및 더 많은 존재 포함되는 프로세스 지혈 (하위)에 영향을 미치는 주요 매개 변수를 변화시켜 지혈과 혈전의 랜드 마크 통찰력을 생성했다. 지난 20 년에 큰 샘플 볼륨 (10 ~ 100 ml)에 요구되는 낮은 처리량 흐름 챔버 실험은 미세 유체 챔버 종종 작은 평행 판 챔버로 구성된 제어 벽 전단 조건 5에서 전체 혈액 관류를 위해 현대 기술을 포함하여 진화했다. 하드웨어 설치가 간단하고 이하 (혈액) 볼륨이 필요한 대부분 때문에 Microscaling 크게 실험이 더 접근하고 versati 렌더링, 분석 처리량을 증가르. 예를 들어, 작은 실험실 동물에서 혈액 해주기 동물을 희생하지 않고도 사용될 수있다. 유전자 변형 생쥐의 혈액 샘플 따라서 지혈을 촉진 또는 억제 키 분자의 식별과 새로운 기본적인 통찰력 6 도움을했습니다.
전문 연구소들은 여전히 소프트웨어에 의해 청사진을 할 수 석판 금형에 중합 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 7에서 예를 들어 사용자 정의 만든 흐름 챔버를 사용합니다. 그 결과 챔버는 저렴한 일회용하고 쉽게 사후 분석을 위해 분해 할 수 있습니다. 또한, 기본적으로 선박을 포함 분기점 또는 날카로운 회전의 디자인은 명령에 구축 할 수 있습니다. 이러한 장점은 표준화가 이미 흐름 챔버 실험과 기본 문제 이후의 단점이며, PDMS 사용자 정의 챔버이 도움하지 않은했다. 이 특정 문제의 위에, 코팅 (조건), 형광 프로브, 항응고제, 온도에샘플링과 분석 사이 erature와 시간이 모두 제대로 팔을 표준화하고 있습니다. 이러한 변수의 표준화에 도전하지만, 그럼에도 불구하고 실험실 간 결과의 비교를 가능하게 할 필요가 있습니다. 이 항목에서는 Biorheology 9,10에 과학 및 표준화 소위원회에서 혈전증 및 지혈에 관한 국제 사회의 주요 주제이다.
혈소판 농축액 (PC)는 혈소판 감소증 및 / 또는 출혈의 원인이 다양한 질병을 앓고있는 환자에 수혈된다. 그러나 PC 혈소판 특히 저장 시간 (11)의 기능에 둔감하도록 공지되어 열화 과정 노화 일반적 혈소판 기억 장애라고 링크. 때때로 혈소판 번 (12) 수혈 혈액 순환에 복원 주장하지만, 이것에 대한 증거는 부족하다. 또한, PC를 구성하는 혈소판의 기능은 통상적으로 시험되지 않기 때문에 이러한 분석법과의 관계치료 또는 예방 효과는 불분명 (13)이다. 미세 유동 챔버 수집 및 발의 조작 사이의 사슬을 최적화하는 PC에서 혈소판 기능을 조사하기위한 수단을 제공한다. 우리가 이전에 14,15을 발표하고 여기에 설명 된 바와 같이 PC의 직접 (쌍) 비교를위한 강력한 연구 도구입니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
이 프로토콜은 인간의 샘플에 대한 연구에 대한 기관 윤리 지침을 다음과 동의서가 포함 된 모든 기증자로부터 얻은 것입니다. 여기에 설명 된 실험에 대한 승인은 앤트워프 대학 병원의 임상 시험 심사 보드에서 얻었다.
주 : 지정하지 않는 온도 표시는 항상 실온이다.
1. 준비 유량 용기 설치
- 준비 레인, 튜브와 핀
- 격렬하게 소용돌이 콜라겐 현탁액를 50㎍ / ㎖의 최종 농도 제공자에 의해 공급되는 등장 글루코스 용액 1/20 희석.
참고 : 우리는 주로 유형 I 피 브릴의 구성, 말 건 콜라겐을 사용합니다. 말의 콜라겐 타입 I은 종종 "HORM"콜라겐로하고, 과거뿐만 아니라 생물학적 분석 이유 모두 9 이러한 유형의 황금 표준이다. 인간 타입 III 콜라겐도 사용되지만, 일 수있다E는 덜 코트 브릴 및 혈소판 반응은 강하지 않다. 기타 코팅 표면은 예 폰 빌레 브란트 인자 (VWF), 피브리노겐, 피브로넥틴, 라미닌, 비트로 넥틴, 트롬 보스 폰딘 -1 (16) 또는 이들의 조합을 위해 사용될 수있다. - 공급자의 컨테이너에서 새로운 일회용 바이오칩을 가져 가라. 여기에 사용되는 바이오칩의 크기는 mm 3 0.4W X 0.1H의 X 20L입니다.
- 피펫 출구로 칩과 마크의 한쪽 끝에서 미세 유체 바이오 칩의 레인 (들)에 0.8 μL. 차선은 1.1.1에서 제조 된 코팅 용액을 포함하는 콜라겐과 5 / 6를 충전되어 있는지 확인합니다. 기포가 없는지 확인합니다.
주 : 채널은 부분적으로 (논의를 참조)의 채널의 입구에서 콜라겐 섬유의 축적을 방지하기 위해 도포된다. - 가습 및 밀폐 용기에 4 시간 또는 밤새 4 ° C에서 품어.
- / v)의 소 혈청은 알부민 승 (버퍼를 차단 (1.0 % 피펫 팅으로 코팅 된 채널을 차단타단 마크에서, D는 0.1 % (w / v) 글루코오스 된 10 mM 4- (2- 히드 록시 에틸) -1- 피페 라진 에탄 술폰산 (HEPES) 완충 된 염수 (/ v)의 염화나트륨, pH 7.4의 0.9 % w (HBS)에서 입구로. 차선이 완전히 공기 방울을 방지 차단 버퍼 충전되어 있는지 확인합니다.
- 동일한 길이 (12cm)에서 튜브를 잘라. 레인 당 하나를 사용하여 핀 각 튜브를 연결합니다. 예를 들어, 중복에서 실행되는 두 가지 조건을 비교 실험는 4 개의 튜브 뻗어과 4 개의 핀을 준비 할 필요합니다.
- 주사기 및 26 G 바늘 또는 첨부 커넥터를 사용하여 증류수로 튜브를 씻어.
- 버퍼를 차단와 튜브를 포화. 1 시간의 최소 폐쇄 및 가습 용기에 보관할 것.
- 격렬하게 소용돌이 콜라겐 현탁액를 50㎍ / ㎖의 최종 농도 제공자에 의해 공급되는 등장 글루코스 용액 1/20 희석.
- 펌프 및 매니 폴드 준비
- 기포를 제거 펌프 린스 증류수 매니 폴드.
- 출구에서의 고정 된 10 ㎕의 팁을 사용하여 바이오칩 레인 (들)에서 차단 완충액 대기음. 의 표면을 청소정밀 무료로 닦아 먼지와 변성 알코올로 바이오 칩은 지문과 먼지를 제거합니다.
- 자동화 된 현미경 무대에 바이오칩을 수정합니다. 하나 이상의 레인 하나의 실행에서 동시에 사용되는 경우, 바이오칩 콘센트 8 레인 매니 스플리터를 연결한다.
참고 : 8 레인 매니 폴드 스플리터는 하드웨어의 조각 (그림 S1)는 펌프와 바이오칩에 연결. 그것은 바이오칩 또는 운영자 정의 첨부 된 소프트웨어에있을 수 레인의 조합에 사용 가능한 모든 (팔) 레인의 작업을 할 수 있습니다. - 바이오칩 입구에서 그들을 해결하기 위해 튜브에 핀을 사용합니다. HBS 가득 1.5 ML 원뿔 테스트 튜브 (핀없이) 튜브의 다른 쪽 끝을 놓습니다. 나머지는 버퍼를 차단하고 제대로 콜라겐을 준수 제거하기 위해, 모든 튜브 1 ML의 HBS는 펌프를 사용하여와의 연결 차선을 씻어.
혈액 샘플 2. 준비
- 수집 및 분리건강한 지원자에서 신선한 전혈. (17)
- 항응고제로 에틸렌 디아민 산 (EDTA)를 포함하는 진공 튜브에 혈액의 첫 번째 밀리리터를 수집하고 독점적으로 자동 혈액 분석기 전체 혈액 카운트 (CBC)이 샘플을 사용합니다.
- 대피 튜브를 사용하여 적절한 항 응고 혈액의 부피를 수집합니다. 피브린을 형성하는 연구 프로토콜과는 구연산 나트륨의 일부가 아닌 경우 유동 챔버 실험 표준 항응고제 헤파린 또는 히 루딘이다.
주 : 헤파린 결과에 기재된 모든 실험에서 항응고제로 사용되었다.
주 : 혈액의 양이 수행되는 실험의 수에 의존한다. 약 3 차선 1 튜브 (7 ㎖). - 회 전자 출원중인 혈액 재구성에 튜브를 놓습니다.
참고 : 분석은 정맥 절개의 3 시간 이내에 완료해야합니다. - 혈소판 풍부 혈장을 제조 250 g에서 15 분 동안 원심 분리기 (PR피). 느슨하게 포장 된 펠릿의 교란을 방지하기 위해 원심 브레이크를 사용하지 마십시오.
- 하나 이상의 튜브가 수집 될 때, 하나의 원추형 원심 분리 튜브 내의 혈액 풀링.
참고 : 원심 분리가 PRP 수율 및 차등 셀 "오염"에 따라, 더 느리게 이하 긴 수행 할 수 있습니다 바람직하다.
- 하나 이상의 튜브가 수집 될 때, 하나의 원추형 원심 분리 튜브 내의 혈액 풀링.
- 제거하고 몇 혈소판 가득 적혈구를 맺는 PRP과 버피 코트를 폐기합니다.
우리의 손에 평균 μL 당 13 ± 5 × 10 (3) 포장 붉은 세포 분획의 혈소판이 (SD ± 의미, N = 12) : 참고.
- 혈액에서 재구성
- 5 분 4 ml의 당 20 초 동안 37 ° C에서 해동 혈액형 AB (히말라야 D 음) 플라즈마.
- 자동 혈액 분석기를 사용 2.1.5에서 제조 한 포장 적혈구 용적률을 결정한다.
- 혈액 은행에서 혈소판 농도를 결정 혈소판 농축 그쪽 제조t 위 적혈구 분획을 재구성하는데 사용된다.
- 1 mL의 샘플을 40 %의 적혈구 용적 및 250 × 10³ 혈소판 / μl를 산출 할 것이다 충전 적혈구 및 혈소판 농축 물의 양을 계산한다.
주의 : 다른 타겟 셀의 역가가 연구 프로토콜에 따라 임의로 설정할 수있다. - 전송은 클리핑 된 피펫 팁을 사용하고, 1 mL의 샘플 볼륨에 도달 할 때까지 혈소판 농축 물을 추가 새로운 튜브로 적혈구와 혈장을 포장.
주 : 플라즈마 혈전 형성 비율에 큰 영향이 있기 때문에 변수 연구에 따라, 혈장 분획 모든 재구성 된 샘플에서 동일해야한다. 예를 들어, 결과에 영향을 미칠 수있는 다른 도너 또는 다른 항응고제 촬영 동결 해동 또는 플라즈마를 반복했다. - 부드럽게 반전에 의해 재구성 된 혈액을 혼합하고 CBC를 수행합니다.
- 혈소판 부분의 볼륨이 교체되는 "빈"제어 샘플을 준비0.9 % 물 (m / v)의 염화나트륨 같은 볼륨하여 CBC를 사용하여 재구성 된 혈액 내인성 혈소판의 농도 (즉, 비 - 혈액 은행 혈소판)을 결정한다.
- 라벨링
- 1 mL를 정확하게 취하여 1 ㎕의 5 mM의 칼 세인 AM (5 μM 최종 농도)를 함유하는 시험관에 혈액을 재구성.
주의 : 다른 세포 염료 (14)를 사용할 수있다. - 반전에 의해 부드럽게 섞는다.
- 사용하기 전에 37 ℃에서 5 분 동안 인큐베이션.
- 1 mL를 정확하게 취하여 1 ㎕의 5 mM의 칼 세인 AM (5 μM 최종 농도)를 함유하는 시험관에 혈액을 재구성.
3. 관류 분석
- 차선의 하단에 부착 된 콜라겐 섬유에 대물 초점. 이상적으로,이 집중 전략 위상차 또는 차등 간섭 대비 (DIC) 설정을 사용합니다. 디지털 선택된 Z-위치를 해결하기 위해 실험 소프트웨어 '를 선택 타일 영역에 대한 설정 현재 Z'를 선택합니다.
- 제 m의 실험 소프트웨어 차선 (XY)에서의 ROI를 선택실험 기간 동안 기록됩니다 icroscope.
참고 : ROI가 임의로 관류 차선 내에서 선택하는 표면적이 될 수 있습니다. 너무이 비교적 작은 경우에도, 그 영역에서 가변 유동 프로파일의 부작용을 방지하기 위해 근접 차선의 유입구들 및 배출구 혈전 형성을 분석 할 수없는 것이 바람직하다. 관심 영역의 표면적은 혈소판의 상당수를 포함하거나, 신호의 수평 있도록 혈전한다. 이 프로토콜에서, ROI는 2 ㎝ 길이 차선의 중앙에 0.62 mm 2의 결과로 동일한 크기의 세 개의 나란히 이미지의 디지털 스티치 집합체이다. - 부드럽게 반전 샘플을 혼합하고 자동화 된 단계에있는 바이오 칩에이 옆에 위치.
- 재구성 된 혈액 샘플을 함유하는 시험관에 바이오칩의 입구와 연결되어 튜브를 놓는다.
- 튜브를 테스트하기 위해 연결하는 채널 (필요에 따라 또는 다른 전단 응력) 50 다인 / ㎝ 2에서 펌프를 실행펌프의 소프트웨어를 사용하여 재구성 된 혈액 시료를 포함.
참고 : 다른 전단 응력 사용할 수 있습니다. - 이미지를 기록 현미경의 수집 및 실험 소프트웨어를 사용하여 실시간으로 5 분 동안 매 15 초.
주의 : 다른 시계열 실험적 셋업에 따라 사용될 수있다.
참고 : 우리는 일반적으로 100 배의 배율 (10 배 대물 렌즈 10 배)를 사용하지만, 더 높은 (또는 낮은) 배율 쉽게 대체 할 수있다.
4. 워시 아웃
- 차아 염소산 나트륨 (표백제) 0.5 %이어서 모든 튜브 출구에 부착 된 증류수를 사용하여 멀티 매니 폴드 또는 펌프에 연결을 세척 (v / v)의 물에 마지막으로 0.1 M의 NaOH. 유해 폐기물로 바이오 칩 입구에 고정 튜브를 폐기하십시오.
5. 데이터 분석
- 이미지 분석 소프트웨어 혈전 성장 반응 속도를 결정한다. 다음 명령은 ZEN2012에 대한 구체적인이다.
- ㄱ 긍정적 인 신호와 상관 픽셀 강도를 정의하는 대화 형 분석 탭, 즉 부착 식 혈소판 또는 부착 혈소판의 형광 임계 값을 설정합니다.
- 자동으로 선택한 임계 값 사이의 신호로 픽셀을 포함하는 "객체"의 (μm의 2) 별도의 표면 영역을 포함하는 스프레드 시트를 생성 할 테이블을 작성합니다. 이는 각각의 시점에 대해 수행된다.
참고 : 형광 임계 값이 선택되고 나면, 분석 소프트웨어가 자동으로 기준을 충족보기 필드에서 '개체'를 검색합니다. 이러한 개체는 혈전 작은 혈소판 응집 또는 단일 혈소판되며 다수의 픽셀을 커버한다. 모든 개체는 별도 스프레드 시트에 나열됩니다. - XML 형식으로 이러한 스프레드 시트를 저장하고 스프레드 시트 프로그램에서 열더 계산.
- 합산하여 선택된 객체의 전체 표면적과 측정 영역 (μm의 2)의 합계 면적 결과를 나눈다. 이것은 상대적 흡착율 (%)을 수득한다. 각 시점에 대해 그렇게.
- 재관류 시간 함수 이러한 표면 커버리지를 플롯 및 특정 조건의 혈전 성장 동역학을 수득 선형 회귀에 의해 기울기를 계산한다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
내부 분석 변화를 설명하기 위해, 3 개의 동일한 복원 된 전혈 시료를 콜라겐 코팅 된 표면 (도 1)를 통해 동시에 관류 하였다. 이는 8.7 %의 변동 계수가 발생했습니다. 이 통계는 관련 샘플 간의 신뢰성있는 비교를 허용 허용 내 분석 및 intralaboratory 변화를 의미한다.
우리는 여기 설명 상업적 유동 챔버의 입구는 상기 측정 챔버에 수직이며,이 대신에 그 시점에서 층류 약간 난류가 발생할 수있다. 특히 항응고제가없는 실험에서 이는 혈액과 고정화 효능의 증가 된 접촉 시간에 막힘이 발생할 수있다. 막힌 유입 챔버의 하류 판독을 혼동 할 수있다. 따라서, 설치가 부분적으로 유량 용기 (그림 2) 떠나 코팅하여 최적화 된혈소판 효능없는 입구는하여 기본 및 보조 지혈의 불의의 활성화를 피하는. 접착 표면의 부분 코팅은 또한 성공적 필드 (16)의 다른 연구 그룹에 의해 사용된다. 또한,이 간단한 실제적인 트릭은 비 반응성 (코팅) 표면에 흐르는 혈액이 반응 (코팅) 부분을 통해 계속 위치를 "전환"영역을 연구하는 자산입니다.
수혈은 부족한 성분과 피를 재구성하여 시뮬레이션 하였다. 이 목적을 위해, 건강한 기증자 혈소판 수를 증가시키기 위해 추가 된 차동 원심 분리 및 PC 혈소판에 의해 혈소판 렌더링되었다에서 전체 혈액을 응고. 여기서 중요한 문제는 무엇 혈소판을 목표로 계산되었다? 대부분의 경우, 실제 수혈은 혈소판 환자에서 혈소판 수치의 정상화가 발생하지 않습니다. 오히려 특정 임계 값 이상의 값을 목적으로하고,정확한 목표 값이지만 19 불명확. 혈액 재구성의 맥락에서 미세 유동 챔버 결과에 혈소판 변화의 영향을 이해하기 위해서, 여러 reconstitutions 혈소판 농도를 (도 3)로 감소 하였다. 예상대로, 낮은 혈소판 수는 관류 시간의 함수 덜 접착 결과. 따라서, 특정 연구에서, 혈소판 카운트는 샘플 조건 (20) 사이의 비교를 허용하도록 표준화되어야한다. 혈소판 카운트 그러나 현미경 카메라 설정은 감도를 증가하도록 구성 될 수 있으므로 상기 분석은 혈소판 샘플에서 혈소판 침착을 측정 할 수 없다는 것을 의미하지는 않는다 낮은 적은 밀착성이 있다는 단순한 사실. 마지막으로, 대부분의 경우에는, 재구성에 사용되는 혈소판 샘플은 19 명의 환자를 요구 수혈 대부분의 상황과 유사 나머지자가 혈소판을 포함한다. 그것은 CURR입니다만약 어떤자가 혈소판의 역할은 동종 혈소판과 수혈의 맥락에 있지만 향후 연구에 대한 흥미로운 질문이다 고한다면 분명하지.
건강한 공여자로부터 자발적 혈액 수집 후, 전혈은 종종 냉각시키고 성분 제제 이전에 일정한 실온에서 유지. 혈소판은 온도 변화에 그러나 민감하다. (4) 채혈 후 및 관류 동안 감소 온도의 효과를 보여줍니다. 혈전은 혈액을 실온 (도 4A)로 냉각 될 때 동일한 (페어링) 샘플에 비해 더 느리게 만들 것으로 연구 (도 4b)에 걸쳐 37 ℃로 유지 하였다.
순환, 혈소판은 높은 벽 전단 응력의 조건에서 혈관 손상 사이트에 바인딩합니다. 미세 유체 흐름 챔버 C에서 다양한 전단 속도VWF와 oated / 피브리노겐 최종 지점에서 총 혈소판 접착 (그림 5A)에 대한 차이와 혈전 성장 속도론 (그림 5B)에 대한 결과.
마지막으로, 수혈에 사용되는 PC를 조사하는데 사용될 수있는 방법 마이크로 유체 유동 챔버 보여, PC 스토리지 함수 혈전 성장 반응 속도를 조사 하였다. 샘플 준비 및 실험 장치의 모든 변수는 연구 기간 전반에 걸쳐 표준화되었다. 따라서, 유일한 변수 파라미터이었다 PC 저장 시간.도 6은 시험 관내에서 혈소판 지혈 저장 병변 효과를 입증 저장 시간의 함수 혈전 성장을 감소 나타낸다.
그림 1 :. 미세 유체 흐름 챔버 실험에서 인트라 분석 변동 미세 유체 플로 w 챔버 실험은 50 다인 / cm² 고정화 콜라겐 수행 하였다. 모든 3 개의 동일한 복원 된 전혈 샘플을 병렬로 동시에 관류 하였다. 결과는 관류 시간의 함수 표면 커버리지 범위 (수염)로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 위상차 현미경으로 가시화 부분적 코팅 채널 (A) 콜라겐 섬유에만 피복 영역에서 발견되었다. (B) (50) 다인에서 펌핑 칼 세인 오전 재구성라고 표시된 전체 혈액 샘플과 관류의 5 분 후 스냅 샷은 / cm 2가 표시됩니다. 두 이미지는 100 배의 배율로 촬영되었다. ig2large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 혈전 성장 반응 속도가 재구성 혈액에서 혈소판 수에 따라 (A) 혈액은 혈액 은행의 혈소판을 사용하여 재구성 된 다른 혈소판 농도를 산출 농축액 :. 245 X 10³ / μL (●), 42 X 10³ / μL (■) 및 (12) X 10³ / μL (▲). 콜라겐 코팅 채널 미세 유체 흐름 챔버 실험 / cm² (50) 다인의 전단 응력에 세 가지 샘플을 동시에 수행 하였다. (B) 묘사되어 패널 A의 원시 데이터의 선형 회귀에 의해 계산 된 슬로프입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4. 온도 및 미세 유동 챔버 헤파린 vacutainers 수집 전혈 실온 (A)에서 또는 37 ℃ (B)의 수욕상에서 15 분간 유지 하였다. 50 다인의 전단 응력에서의 고정화에 콜라겐 미세 관류 / cm 2 실시 하였다. 종점 (5 분 관류) 묘사되어에서 스냅 샷. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5 : 고정 VWF / 피브리노겐에 혈소판 접착에 전단 응력의 역할 (A). 4 개의 동일한, 칼 세인이 표시된 전체 혈액을 재구성 AM4.5 다인 / cm² (●), 50 다인 / cm² (■), 90 다인 / cm² (▲), 225 다인 / cm² (♦) : 샘플 변수 전단 응력과 VWF / 피브리노겐 코팅 표면 관류 하였다. 관류 3 분 후 스냅 샷은 네 개의 채널로 하였다. (A)에 기술 된 시료의 시간의 함수 (B) 표면 커버리지가 혈전 성장 속도론의 차이를 나타내는 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 6 :. 혈소판 혈전 형성을 저장 시간의 함수에 집중 모든 미세 유동 챔버 실험은 50 다인 / ㎠ 전단 속도에서 콜라겐 코팅 된 표면 상에 표준화 된 조건 하에서 수행 하였다. 혈액 reconsti했다하루 세 (●)에 중복 시험 같은 농축 혈소판 샘플, 칠 (■)과 열 (▲) 포스트 기부와 환 된. 관류 시간의 함수가 묘사되어있는 표면 적용 범위. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 S1 :. 미세 유체 흐름 챔버 하드웨어 설정 (A)는 베나 8 플루오 + 바이오칩 현미경의 자동 스테이지 상에 장착되고, 여덟 별도 채널로 펌핑 기능을 분할 매니 주사기 펌프 유연한 튜브를 통해 연결된다. (B) 재구성 된 혈액은 바이오칩 (입구) 상기 선택된 채널로 우측 일회용 튜브를 통해 흐른다. 일회용 튜브는 스테인레스를 통해 입구에서 해결ESS는 철강 일회용 핀은 설치와 함께 제공. (B)의 혈액 흐름이 오른쪽에서 왼쪽입니다 긴 유연한 호스에 수집됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
미세 유체 흐름 챔버 실험은 혈액을 흐르는 혈소판 기능을 조사하는 훌륭한 도구입니다 실험 상황 변화에 체외에서 지혈을 평가하는 데 사용됩니다. 가난한 실험실 간 표준화 (9)에도 불구하고, 우리는 우리의 실험실에서 실험 변동이 허용되는 것을 보여줍니다. 이것은 확실하게 주어진 연구에서 (쌍) 샘플을 비교할 수 있습니다. 이것은 혈액 은행 조건 11 혈소판 저장 해로운 결과이다 혈소판 저장 병변의 문서화 현상을 이용하여 검증 하였다. 또한, 최근의 혈액 14,15 재구성 다음 미세 유동 챔버의 PC 혈소판 기능에 대한 세 가지 가능한 병원체 불활 화 기술의 영향을 출판.
생물 물리학 및 - 화학 매개 변수를 20 다양 때 혈소판은 다르게 반응한다. 따라서, 전단 응력, 세포 수 및 세포 성분 조성기, 온도, 코팅, 항응고제 등 많은 요인은 연구 문제에 따라이 프로토콜 내에서 변형 될 수있다. 이 프로토콜은 다른 실험실 유사한 분석을 수행 할 수 있도록 만 시판 하드 및 소프트웨어 툴을 사용한다. 사용 가능한 하드웨어를 맞춤 설정보다 다양한 특히 때문에 기초 연구의 목적이 단점이 될 수 있습니다. 자체의 분석은 강력하지만 재현성 생물학 및 시간 변화에서 겪고있다. 따라서, 시험 샘플은 가능한 한 쌍의 충분히 커야 크기를 연구 할 필요가있다. 샘플은 재구성 된 혈액을 짧은 시간 동안 저장 될 수 있기 때문에, 시간에 페어링 할 필요가있다.
혈소판 기능 연구를위한 마이크로 유체 유동 챔버는 연구 분야를 증폭되었지만,주의 혈액 유 동학에 혈소판 의존성 overinterpret주의해야한다. 첫째, 유동 챔버의 직사각형이 생리적 아니다 BU최고의 t를 우리는 성장 혈전에 초점을 맞추고 광학 수 있도록해야합니다. 둘째, 혈관 따라서이 프로토콜을 연구 할 수없는 플라스틱 혈소판 기능에 대한 혈관 탄성의 영향이 이루어지는 것은 아니다. 주사기 펌프가 더 선형 (비록 또한 약간 박동) 동안 셋째, 심장, 박동 흐름을 발생합니다. 마지막으로, 콜라겐 섬유의 종류는 동물의 기원 인 흐름에서 혈소판 연구에 사용되는 표준 물질이다. 참고로하지만, 섬유의 유형은 내가 콜라겐과 (광 전송)에서 수십 년간의 경험에서와 같이 혈소판 기능에 대한 임상 결과는 21, 22 aggregometry 많은 경우에 잘 상관 관계.
혈소판 기능 (23)을 연구하는 많은 분석이있다. 이 주소 하나 혈소판 기능의 부부의 대부분은 퍼팅 혈소판은 지혈 (의 모델)에서 작동 할 수있다. 여기에서 입증 된 바와 같이 혈전 형성의 실시간 영상은 현재까지 가장 포괄적이다. 이 괞 찮아의 대부분의 측면을 의미한다혈관 손상에 telet의 응답이 포함되어 있습니다. 독특한 장점은 혈류를 포함 모든 혈액 세포의 존재이다. 상기 분석은 항 혈소판제 (24)뿐만 아니라 비정상적 혈소판 기능 (25)에 생성 된 유전자 변화에 현재 사용되는 약물에 민감하다. 이것은 혈소판 기능의 중요한 지표로서의 가치를 보여준다. 이 분석의 포괄적 인 성격은 그럼에도 불구하고 또한 혈소판의 응답의 특정 기능을 측정하는 분석보다 분석이다 것을 의미한다. 혈소판 농축에 혈액 은행 조작의 효과 따라서 의해 흐름 챔버 분석에 의해 포착 할 수 있지만, 그 원인이 무엇인지 해석, 추가 분석이 필요합니다. 예를 들어, 우리의 데이터는 온도가 상당히 미세 유체 흐름 챔버에서 혈소판 접착에 영향을 나타냅니다. 그러나 추가에 대한 자세한 분석은 냉장 혈소판이 모양을 변경 것으로 나타났습니다 클러스터 GPIbα 26 수용체.
등. (16)의 최근 연구는 시스템 생물학을 혈소판하는 기판 정의의 관련성을 보여 주었다. 이것은 콜라겐 결합 덜 중요하지만 고정화 VWF 혈소판의 결합, 높은 전단 속도를 필요로하기 때문에 그리고, 기판의 기능에 전단 속도를 변화의 조합이 중요하다. 따라서, 조사의 질문에 따라, 선택은 어떤 기판 상에 만들어진 각 유량이 포함되도록 할 수있다.
결론적으로 마이크로 유체 유동 챔버 실험 혈액 은행 및 수혈 의학의 맥락에서 혈소판 기능을 연구하기위한 프로토콜을 제시한다. 표준화 노력은 9,10,28-30 진행하고 이러한 권장 사항의 대부분은 제시된 프로토콜에 포함되어 있습니다. 혈액의 재구성을위한 모델이다수혈하지만 추가 검증 작업은 임상 결과에 대한 관련성을 표시해야합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD vacutainer tube with EDTA | Becton, Dickinson and Company | 368856 | |
| BD vacutainer tube with Heparin | Becton, Dickinson and Company | 368480 | |
| BD vacutainer tube with Sodium Citrate | Becton, Dickinson and Company | 366575 | |
| Hirudin Blood tube | Roche | 6675751 001 | |
| BD vacutainer Eclipse | Becton, Dickinson and Company | 368650 | Blood collection needle with preattached holder |
| Pipette tips 100-1,000 | Greiner bio-one | 740290 | |
| Pipette tips 2-200 | Greiner bio-one | 739280 | |
| Pipette tips 1-10 | Eppendorf | A08928 | |
| Tube 5 ml | Simport | 11691380 | |
| Conical tube 15 ml | Greiner bio-one | 1888271 | |
| Conical tube 50 ml | Greiner bio-one | 227261 | |
| 10 ml Syringe | BD | 309604 | |
| Precision wipes | Kimtech | 5511 | |
| Vena8 Fluoro+ Biochips | Cellix | 188V8CF-400-100-02P10 | Named in Figure S1 A as 'Biochip' |
| Vena8 Tubing | Cellix | TUBING-TYGON-B1IC-B1OC-ROLL 100F | Named in Figure S1 B as 'Disposable tubing' |
| Vena8 Needles | Cellix | SS-P-B1IC-B1OC-PACK200 | Named in Figure S1 B as 'Pin' |
| Connectors for single inlet cables of biochips | Cellix | CONNECTORS-B1IC-PACK100 | |
| Multiflow8 connect | Cellix | MF8-CONNECT-BIC3-N-THROMBOSIS | Named in Figure S1 B as 'Reusable tubing' and 'Splitter' |
| Humidified box | Cellix | HUMID-BOX | |
| Software microfluidic pump | Cellix | N/A | Venaflux Assay |
| Horm Collagen | Takeda/Nycomed | 1130630 | Native equine tendon collagen (type I) Isotonic glucose solution to dilute collagen is supplemented |
| HEPES buffered saline (HBS) | in house preparation | in house preparation | 10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) buffered saline (0.9% (w/v) NaCl, pH 7.4) |
| Blocking buffer | in house preparation | in house preparation | 1.0% (w/v) bovine serum albumin and 0.1% (w/v) glucose in HBS |
| Calcein AM | Molecular probes | C1430 | |
| Bleach 10% | in house preparation | in house preparation | |
| 0.1 M NaOH | in house preparation | in house preparation | |
| Denaturated alcohol | Fiers | T0011.5 | |
| Mirus Evo Nanopump | Cellix | 188-MIRUS-PUMP-EVO | with Multiflow8. Named in Figure S1 A as 'Pump' and 'Manifold' |
| Microscope | Zeiss | Axio Observer Z1 | equipped with a colibri-LED and high resolution CCD camera |
| Software microscope | Zeiss | N/A | ZEN 2012 |
| Hematology analyzer | Sysmex | N/A | |
| Table Top Centrifuge | Eppendorf | 521-0095 | |
| Platelet incubater | Helmer | PF-48i | |
| Incubation water bath | GFL | 1013 | |
| Pipette | Brand | A03429 | |
| Tube Roller | Ratek | BTR5-12V | |
| Sterile docking device | Terumo BCT | TSCD | |
| Tubing Sealer | Terumo BCT | AC-155 | |
| Vortex | VWR | 58816-121 |
References
- Broos, K., Feys, H. B., De Meyer, S. F., Vanhoorelbeke, K., Deckmyn, H. Platelets at work in primary hemostasis. Blood Rev. 25, 155-167 (2011).
- Stalker, T. J., et al. Hierarchical organization in the hemostatic response and its relationship to the platelet-signaling network. Blood. 121, 1875-1885 (2013).
- Sakariassen, K. S., Bolhuis, P. A., Sixma, J. J. Human blood platelet adhesion to artery subendothelium is mediated by factor VIII-Von Willebrand factor bound to the subendothelium. Nature. 279, 636-638 (1979).
- Savage, B., Saldivar, E., Ruggeri, Z. M. Initiation of platelet adhesion by arrest onto fibrinogen or translocation on von Willebrand factor. Cell. 84, 289-297 (1996).
- Westein, E., de Witt, S., Lamers, M., Cosemans, J. M., Heemskerk, J. W. Monitoring in vitro thrombus formation with novel microfluidic devices. Platelets. 23, 501-509 (2012).
- Varga-Szabo, D., et al. The calcium sensor STIM1 is an essential mediator of arterial thrombosis and ischemic brain infarction. J Exp Med. 205, 1583-1591 (2008).
- Westein, E., et al. Atherosclerotic geometries exacerbate pathological thrombus formation poststenosis in a von Willebrand factor-dependent manner. Proc Natl Acad Sci USA. , (2013).
- Grabowski, E. F., Yam, K., Gerace, M. Evaluation of hemostasis in flowing blood. Am J Hematol. 87 (Suppl 1), S51-S55 (2012).
- Roest, M., et al. Flow chamber-based assays to measure thrombus formation in vitro: requirements for standardization. J Thromb Haemost. 9, 2322-2324 (2011).
- Heemskerk, J. W. M., et al. Collagen surfaces to measure thrombus formation under flow: possibilities for standardization. J Thromb Haemost. 9, 856-858 (2011).
- Shrivastava, M. The platelet storage lesion. Transfus Apher Sci. 41, 105-113 (2009).
- Miyaji, R., et al. Decreased platelet aggregation of platelet concentrate during storage recovers in the body after transfusion. Transfusion. 44, 891-899 (2004).
- Goodrich, R. P., et al. Correlation of in vitro platelet quality measurements with in vivo platelet viability in human subjects. Vox Sang. 90, 279-285 (2006).
- Van Aelst, B., et al. Riboflavin and amotosalen photochemical treatments of platelet concentrates reduce thrombus formation kinetics in vitro. Vox Sang. 108, 328-339 (2015).
- Van Aelst, B., Devloo, R., Vandekerckhove, P., Compernolle, V., Feys, H. B. Ultraviolet c light pathogen inactivation treatment of platelet concentrates preserves integrin activation but affects thrombus formation kinetics on collagen in vitro. Transfusion. , (2015).
- de Witt, S. M., et al. Identification of platelet function defects by multi-parameter assessment of thrombus formation. Nat Commun. 5, 4257 (2014).
- Cazenave, J. P., et al. Preparation of washed platelet suspensions from human and rodent blood. Methods Mol Biol. 272, 13-28 (2004).
- Jackson, S. P., Nesbitt, W. S., Westein, E. Dynamics of platelet thrombus formation. J Thromb Haemost. 7 (Suppl 1), 17-20 (2009).
- Diedrich, B., Remberger, M., Shanwell, A., Svahn, B. M., Ringden, O. A prospective randomized trial of a prophylactic platelet transfusion trigger of 10 x 10(9) per L versus 30 x 10(9) per L in allogeneic hematopoietic progenitor cell transplant recipients. Transfusion. 45, 1064-1072 (2005).
- Neeves, K. B., et al. Sources of variability in platelet accumulation on type 1 fibrillar collagen in microfluidic flow assays. PloS one . 8, e54680 (2013).
- Born, G. V. Aggregation of blood platelets by adenosine diphosphate and its reversal. Nature. 194, 927-929 (1962).
- Cattaneo, M., et al. Recommendations for the Standardization of Light Transmission Aggregometry: A Consensus of the Working Party from the Platelet Physiology Subcommittee of SSC/ISTH. J Thromb Haemost. 11, 1183-1189 (2013).
- Deckmyn, H., Feys, H. B. Assays for quality control of platelets for transfusion. ISBT Sci Series. 8, 221-224 (2013).
- Andre, P., et al. Anticoagulants (thrombin inhibitors) and aspirin synergize with P2Y12 receptor antagonism in thrombosis. Circulation. 108, 2697-2703 (2003).
- Casari, C., et al. von Willebrand factor mutation promotes thrombocytopathy by inhibiting integrin alphaIIbbeta3. J Clin Invest. 123, 5071-5081 (2013).
- Gitz, E., et al. Improved platelet survival after cold storage by prevention of Glycoprotein Ibα clustering in lipid rafts. Haematologica. , (2012).
- Maurer-Spurej, E., Labrie, A., Brown, K. Routine Quality Testing of Blood Platelet Transfusions with Dynamic Light Scattering. Part Part Syst Char. 25, 99-104 (2008).
- Van Kruchten, R., Cosemans, J. M., Heemskerk, J. W. Measurement of whole blood thrombus formation using parallel-plate flow chambers - a practical guide. Platelets. 23, 229-242 (2012).
- Zwaginga, J. J., et al. Flow-based assays for global assessment of hemostasis. Part 2: current methods and considerations for the future. J Thromb Haemost. 4, 2716-2717 (2006).
- Zwaginga, J. J., et al. Flow-based assays for global assessment of hemostasis. Part 1: Biorheologic considerations. J Thromb Haemost. 4, 2486-2487 (2006).
