Introduction
Гемостаз требует комбинированной и регулируемой активности клеток, белков, ионов и тканей в ограниченном пространственно - временном контексте 1. Неконтролируемое активность может привести к кровотечением или тромбозом и заболеваемости и смертности в спектре расстройств, связанных с свертывания крови. Микрожидком эксперимент Проточная камера представляет собой сложный метод , который имитирует гемостаза в пробирке. Такой подход позволяет исследовать сложного взаимодействия процессов, которые принимают участие в гемостаза с ведущей роли тромбоцитов в крови.
После повреждения сосудов, тромбоциты придерживаться подвергается субэндотелиальном матрица (глико) протеинов, чтобы предотвратить потерю крови. После адгезии, тромбоциты и активировать агрегат в ответ на авто- и паракринной сигнализации , которые в конечном итоге приводит к образованию сети тромбоцитов, стабилизированных фибрина и в результате фирмы, наматывают уплотнение тромба 2. В отличие от большинства других функций тромбоцитов испытаний, экспери-ные с проточных камер учитывают физический параметр кровотока и , следовательно , влияние реологических свойств на участвующих клеток и биомолекул 3,4.
Эксперименты проточной камеры породили знаковые идеи в гемостаза и тромбоза путем изменения ключевых параметров, которые влияют на кровоостанавливающее (суб) процессов, включая клеевой матрицы, реологических и потока профилей, клеточный состав, наличие токсинов или наркотиков, ионной силы и многое другое. В последние два десятилетия, низкая пропускная способность камеры потока экспериментов , требующих больших объемов образца (10-100 мл) развились до микрофлюидальных камер часто состоящих из маленьких камер плоскопараллельных и включая современную технологию для перфузии цельной крови при контролируемых условиях сдвига стенки 5. Microscaling значительно увеличил пропускную способность анализа в основном потому, что установка оборудования упростило и требуется меньше (крови) объем, что делает эксперимент более доступным и versatiле. Например, кровь из мелких лабораторных животных теперь могут быть использованы без необходимости жертвовать животных. Образцы крови генетически модифицированных мышей, таким образом , помогают в идентификации ключевых молекул , способствующих или ингибирующих гемостаз и в новых основных прозрений 6.
Специализированные научно - исследовательские лаборатории часто до сих пор используют выполненные на заказ камеры потока, например , из полидиметилсилоксана (PDMS) 7 , который полимеризуется на литографированных пресс - форм , которые могут быть blueprinted программным обеспечением. Результирующий камера является недорогим, одноразовые и может быть легко разобран для постфактум анализа. Кроме того, в основном любой конструкции судов, в том числе бифуркаций или резких поворотов могут быть построены по команде. Это преимущество является также его недостатком, поскольку стандартизация уже была основная проблема с проточной камеры экспериментов и PDMS на заказ камеры не помогли этим. Помимо этого конкретного вопроса, покрытия (условия), флуоресцентные зонды, антикоагулянта, TEMPтературы и время между отбором и анализом проб все плохо стандартизированы 8. Стандартизация этих переменных является сложной задачей, но тем не менее требуется, чтобы обеспечить сравнение результатов между лабораториями. Эта тема является основной темой Международного общества по изучению тромбозов и гемостаза в научной и стандартизации подкомиссии по Biorheology 9,10.
Концентратов тромбоцитов (ПК) переливается у пациентов, страдающих от различных заболеваний, которые вызывают тромбоцитопению и / или кровотечение. Но тромбоциты в ПК , как известно , уменьшают чувствительность, особенно в зависимости от времени хранения 11, процесс ухудшения в результате старения и обычно называют поражения хранения тромбоцитов. Иногда утверждают , что такие тромбоциты восстановить в обращении раз переливаемой 12, но доказательств этого не хватает. Кроме того, функция тромбоцитов, входящих в состав ПК не тестируется, так как связь между таких анализов итерапевтической или профилактической эффективности неясна 13. Микрожидком камеры потока предлагают средства для исследования функции тромбоцитов в ПК, чтобы оптимизировать цепочку манипуляций между сбором и выдачей. Это мощный инструмент исследования для прямых (спаренных) сравнений ПК , как мы уже ранее опубликованных 14,15 и описан здесь.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Этот протокол следует институциональные этические принципы для исследования образцов человека и информированное согласие было получено от всех участвующих доноров. Утверждение для экспериментов, описанных здесь, была получена из этическими комитетами больницы Антверпенского университета.
Примечание: показания температуры всегда при комнатной температуре, если не указано.
Установка 1. Подготовка потока камера
- Готовимся Дорожки, НКТ и штыри
- Вихревой коллаген подвеска энергично и разбавить 1/20 в изотоническом растворе глюкозы, предоставленный поставщиком до конечной концентрации 50 мкг / мл.
Примечание: Мы используем конский сухожилие коллаген, в основном состоят из фибрилл I типа. Лошадиного коллагена типа I часто называют "Horm" коллагена и является золотым стандартом для данного типа анализа 9 для обоих исторических, а также биологическим причинам. Человеческого типа III, коллаген также может быть использован, но гое фибриллы пальто менее хорошо и реакция тромбоцитов не так сильна. Другие поверхности покрытия также могут быть использованы, например , фактора фон Виллебранда (ФВ), фибриноген, фибронектин, ламинин, витронектина, тромбоспондин-1 или комбинации этих 16. - Возьмите новый одноразовый биочип из контейнера провайдера. Размеры биочипов используемых здесь 0.4W х 0.1H х 20L в мм 3.
- Пипеткой 0,8 мкл на полосу (ами) микрожидком биочипа на одном конце чипа и маркируют как розетки. Убедитесь, что полоса заполнена 5/6-е место с коллагеном, содержащим раствор для нанесения покрытия, полученного в 1.1.1. Убедитесь в том, что нет пузырьков воздуха.
Примечание: Каналы частично покрыты, чтобы избежать накопления коллагеновых волокон на входе в канал (обсуждение см). - Инкубируют при температуре 4 ° С в течение 4 часов или в течение ночи в увлажненном и закрытом контейнере.
- Блок каналы, покрытые пипеткой блокирующим буфером (1,0% (вес / об) сыворотки бычьего альбуминаг 0,1% (вес / объем) глюкозы в 10 мМ 4- (2-гидроксиэтил) -1-пиперазинэтансульфонова кислота (HEPES) буферном солевом растворе (HBS; 0,9% (вес / объем) NaCl, рН 7,4) на другом конце и отметки в качестве входного отверстия. Убедитесь, что полоса полностью заполнена с блокирующим буфером, избегая пузырьков воздуха.
- Вырезать трубки на одинаковую длину (12 см). Используйте одну на одну полосу движения и соединить каждую трубку с булавкой. Например, эксперимент, сравнивая два условия, в дубликате потребуется четыре трубки растягивает и четыре булавки, чтобы быть готовым.
- Промойте трубку дистиллированной водой с помощью шприца и иглы 26 G или сопроводительные разъемы.
- Пропитайте трубку с блокирующим буфером. Хранить в закрытом и увлажненной контейнере в течение как минимум 1 ч.
- Вихревой коллаген подвеска энергично и разбавить 1/20 в изотоническом растворе глюкозы, предоставленный поставщиком до конечной концентрации 50 мкг / мл.
- Подготовка насоса и вентильный
- Промыть насос и коллектор с дистиллированной водой, удалить пузырьки воздуха.
- Аспирируйте блокирующий буфер из биочипа полосу (ов) с использованием фиксированного наконечник 10 мкл на выходе. Очистите поверхностьбиочип с прецизионным пыли бесплатно протирать и денатурированного спирта, чтобы удалить отпечатки и пыль.
- Закрепите биочипа на автоматизированном столике микроскопа. Если более чем одна полоса одновременно используется в один проход, соединить многообразие сплиттер восемь полос к выходу биочипов.
Примечание: Коллектор Разветвитель восемь полоса является частью аппаратных средств (рис S1) соединены с насосом и биочипов. Это обеспечивает возможность работы всех доступных (восемь) полос на биочипа или комбинации полос, которые могут быть оператор, определенные в прилагаемом программном обеспечении. - Используйте булавки в трубке, чтобы установить их на входе биочипов. Поместите другой конец трубки (без PIN-кода) в 1,5 мл тест-коническую трубку, наполненную HBS. Промыть все трубки и подключенные к ним дорожки с 1 мл HBS с помощью насоса, с тем, чтобы удалить остаток блокирующий буфер и плохо придерживаясь коллаген.
2. Подготовка проб крови
- Сбор и разделениесвежей цельной крови от здорового добровольца. 17
- Соберите первые миллилитров крови в эвакуированной трубке, содержащей этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) в качестве антикоагулянта и исключительно использовать этот образец для полного анализа крови (CBC) с автоматическим гематологическим анализатором.
- Собирают объем крови в подходящем антикоагулянта, используя вакуумную трубу. Стандартные антикоагулянты для экспериментов проточной камеры являются гепарин или гирудин, когда фибрина образование не является частью протокола исследования и цитрат натрия, когда она есть.
Примечание: Гепарин использовался в качестве антикоагулянта для всех экспериментов, описанных в результатах.
Примечание: количество крови зависит от количества экспериментов, которые будут выполнены. Примерно 1 трубка (7 мл) в течение 3-х полос. - Поместите трубки на ротатор в ожидании крови восстановления.
Примечание: Анализ должен быть завершен в течение 3 часов от кровопускания. - Центрифуга в течение 15 мин при 250 г для приготовления плазмы, обогащенной тромбоцитами (PRП). Не используйте перерыв центрифуг, чтобы предотвратить нарушение неплотно упакованных гранул.
- Когда более чем одна трубка была собрана, объединить кровь в одной конической трубе центрифугирования.
Примечание: Центрифугирование может быть сделано более медленно или менее долго, в зависимости от выхода PRP и сота "загрязнение" дифференциальном предпочтительным.
- Когда более чем одна трубка была собрана, объединить кровь в одной конической трубе центрифугирования.
- Удаляют PRP и поглощающее покрытие, дающую эритроцитарной с небольшим количеством тромбоцитов.
Примечание: Количество тромбоцитов в упакованном красной фракции клеток составляет 13 ± 5 × 10 3 на мкл (среднее значение ± SD, п = 12) в среднем в наших руках.
- Кровь Воссоздание
- Оттепели группы крови АВ (резус-D отрицательный) в плазме при 37 ° С в течение 5 мин и 20 сек на 4 мл.
- Определение гематокрита уплотненных красных кровяных клеток, полученных в 2.1.5 с использованием автоматического гематологического анализатора.
- Определить концентрацию тромбоцитов в банке крови готовят концентрат тромбоцитов ТНАт будет использоваться для восстановления красной фракции клеток выше.
- Рассчитайте объем упакованных красных кровяных клеток и концентрата тромбоцитов, что будет с выходом 40% гематокрита и 250 х 10³ тромбоциты / мкл в 1 мл образца.
Примечание: Другие целевые титры клеток могут быть установлены произвольно, в зависимости от протокола исследования. - Передача уплотненные красные клетки крови и плазму в свежую пробирку, используя усеченную концом пипетки и добавить концентрат тромбоцитов до объема образца 1 мл не будет достигнута.
Примечание: В зависимости от переменных, изученных Фракцию плазмы должна быть одинаковой во всех разведенных образцах, так как плазма оказывает существенное влияние на скорость образования тромба. Например, повторные замораживания-оттаивания или плазму, взятую из различных доноров, так и на разных антикоагулянтов могут влиять на результат. - Смешайте водостойких кровь осторожно переворачиванием и выполнить CBC.
- Подготовить "пустой" контрольный образец, в котором заменяется объем тромбоцитов фракцииодним и тем же объемом 0,9% (м / об) раствором хлорида натрия в воде для определения концентрации эндогенных тромбоцитов (т.е. не банка крови Тромбоциты) в разведенном крови с использованием CBC.
- этикетирование
- Внесите 1 мл восстановленной крови в пробирку, содержащую 1 мкл 5 мМ кальцеина AM (5 мкМ конечная концентрация).
Примечание: Другие красители клеток могут быть использованы 14. - Аккуратно перемешайте переворачиванием.
- Выдержите в течение 5 мин при 37 ° С до использования.
- Внесите 1 мл восстановленной крови в пробирку, содержащую 1 мкл 5 мМ кальцеина AM (5 мкМ конечная концентрация).
3. Анализ Перфузия
- Фокус цель на волокна коллагена, прилипших в нижней части полос движения. В идеале, используйте настройки дифференциального интерференционного контраста (DIC) фазового контраста или для фокусировки этой стратегии. Выберите "Установить текущий Z для выбранных областей плитки" в программном обеспечении эксперимента в цифровом исправить выбранные Z-позиции.
- Выберите интересующую область (ROI) в переулке (ху) в эксперименте программном обеспечении мicroscope, которые будут записаны в ходе эксперимента.
Примечание: ROI может быть любая площадь поверхности произвольно выбранной в перфузионной полосе. Желательно не проанализировать образование тромба близко к входом и выходом из полосы движения таким образом, чтобы избежать побочных эффектов профиля переменного потока в этой области, несмотря на то, что это относительно небольшой. Площадь поверхности ROI должна содержать значительное количество тромбоцитов или тромбы, чтобы обеспечить выравнивание сигнала. В этом протоколе ROI представляет собой цифровой сшитые совокупность трех одинаковых по размеру расположенных бок о бок изображений в результате 0,62 мм 2 в середине 2 см длиной полосы. - Смешайте образцы осторожно переворачиванием и расположите их рядом с биочипа на автоматизированной стадии.
- Поместите трубку, которая соединена с входным отверстием биочипа в пробирках, содержащих восстанавливаемые образцы крови.
- Запустите насос на 50 дин / см 2 (или других напряжений сдвига по желанию) для этих каналов , связанных с пробиркисодержащий восстанавливаемые образцы крови, используя программное обеспечение насоса.
Примечание: Другие напряжения сдвига могут быть использованы. - Запись изображений каждые 15 секунд в течение 5 минут в режиме реального времени с помощью сбора и эксперимента программное обеспечение микроскопа.
Примечание: Другие временные ряды могут быть использованы в зависимости от экспериментальной установки.
Примечание: Как правило, мы используем 100-кратном увеличении (объектив 10X и 10X линзы), но выше (или ниже) увеличение может быть легко использован в качестве альтернативы.
4. Промойте
- Промыть все трубки, присоединенные к выходному отверстию, и подключенный к многоканальному коллектор или насос с использованием дистиллированной воды, а затем раствором гипохлорита натрия (отбеливатель) 0,5% (об / об), и, наконец, 0,1 М NaOH в воде. Откажитесь трубку возлагали к входному отверстию биочипов как опасные отходы.
5. Анализ данных
- Определение кинетики роста тромба с помощью программного обеспечения для анализа изображений. Следующие команды используются для ZEN2012.
- Установите порог флуоресценции в Анализировать Интерактивная вкладку для определения интенсивности пикселей , что коррелирует с положительным сигналом, т.е. приклеена тромбоцитов или прилипших тромбоцитов.
- Использование Создание таблиц для автоматического создания таблицы , которая будет содержать отдельные участки поверхности (в мкм 2) этих "объектов" , содержащих пиксели с сигналом между выбранными пороговыми значениями. Это выполняется для каждой временной точки.
Примечание: После того, как пороговые значения флуоресценции были выбрали, программное обеспечение анализа автоматически обнаруживает "объекты" в поле зрения, которые отвечают критериям. Эти объекты являются тромбы, небольшие агрегаты тромбоцитов или отдельные тромбоциты и охватывают ряд пикселей. Каждый объект занесен в таблицу отдельно. - Сохраните эти электронные таблицы в формате XML и открыть их в программе электронных таблицдля дальнейших расчетов.
- Всего площади поверхности выбранных объектов путем суммирования и разделить результат на общей площади области измерения (мкм 2). Это даст относительную покрытие поверхности (%). Сделайте это для каждой временной точки.
- Участок этих поверхностных покрытий в зависимости от времени перфузионного и вычислить крутизну с помощью линейной регрессии, что дает кинетику роста тромба этого конкретного состояния.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Для демонстрации изменения внутри анализа, три идентичных реконструированные образцы цельной крови перфузировались одновременно над коллагеновых покрытием поверхности (рисунок 1). Это привело к коэффициент вариации 8,7%. Эта статистика предполагает приемлемую внутрисистемных анализа и внутрилабораторной изменение позволяет надежное сравнение между связанных образцов.
Входное отверстие камеры коммерческого потока мы описываем здесь перпендикулярно к измерительной камере, и это может привести к слегка турбулентный вместо ламинарного потока в этой точке. Особенно в опытах без антикоагуляции это может привести к засорению из-за увеличенного времени контакта между кровью и иммобилизованного агониста. Забиваются на входе может сбить с толку отсчет вниз по течению в камере. Таким образом, установка была оптимизирована за счет частичного покрытия проточную камеру (рисунок 2) , выходящий извходные отверстия, лишенные тромбоцитов агониста, что позволяет избежать несвоевременного активации первичного и вторичного гемостаза. Частичное покрытие липких поверхностей, кроме того , успешно используется другими исследовательскими группами в области 16. Кроме того, этот простой практический трюк является активом для изучения «перехода» зону, где кровь течет по неактивного (без покрытия) поверхности продолжается по реактивной (с покрытием) части.
Переливание моделировалась воссоздании крови с дефицитом компонента. С этой целью, антикоагулянтом цельной крови от здорового донора была оказана тромбоцитопеническая с помощью дифференциального центрифугирования и ПК тромбоцитов были добавлены к увеличению количества тромбоцитов. Важный вопрос здесь было то, что количество тромбоцитов стремиться? В большинстве случаев в реальной жизни переливание не приводят к нормализации количества тромбоцитов в тромбоцитопеническая пациента. Скорее значение выше определенного порога направлено на,хотя точное целевое значение плохо определен 19. Для того, чтобы понять влияние изменения количества тромбоцитов на микрофлюидальных результатов проточных камер в контексте восстановления крови, несколько reconstitutions были выполнены с уменьшением концентрации тромбоцитов (рисунок 3). Как и ожидалось, снижение количества тромбоцитов приводит к уменьшению адгезии в зависимости от времени перфузии. Таким образом, в рамках данного исследования, количество тромбоцитов должно быть стандартизирован , чтобы обеспечить сравнение между образцами условий 20. Сам по себе тот факт, что существует меньше адгезии тромбоцитов, когда низкие, однако, не означает, что анализ не может быть использован для измерения тромбоцитов осаждения в тромбоцитопенической образцах, так как микроскопия и камеры настройки могут быть адаптированы для повышения чувствительности. Наконец, в большинстве случаев, тромбоцитопеническая выборка , используемая для восстановления содержит остаточные аутологичных тромбоциты , которые напоминает ситуацию в большинстве переливании с требованием пациентов 19. Это CURRмому неясно, будет ли и какова роль аутологичных тромбоцитов в контексте переливания с аллогенных тромбоцитов, но это интересный вопрос для будущих исследований.
После сбора крови от здоровых добровольных доноров, цельной крови часто охлаждают до и выдерживали при постоянной комнатной температуре до подготовки компонентов. Тромбоциты, однако чувствительны к изменениям температуры. На рисунке 4 показано влияние температуры после уменьшилось сбора крови и во время перфузии. Тромбы были найдены строить более медленно , когда кровь охлаждали до комнатной температуры (фиг.4А) по сравнению с идентичным (парную) образца выдерживали при 37 ° С на протяжении всего исследования (фиг.4В).
В обращении, тромбоциты связываются с судна травмы участков в условиях повышенного напряжения сдвига стенки. Различные скорости сдвига в микрофлюидальных проточных камерах Coated с VWF / фибриногена приводит к различиям для полной адгезии тромбоцитов в конечной точке (рис 5А) и кинетики роста тромба (рис 5б).
И, наконец, чтобы продемонстрировать, как Микрожидкостных потока камеры могут быть использованы для исследования ПК, используемых для переливания, кинетика роста тромба в функции хранения ПК исследовалась. Все переменные в подготовке проб и экспериментальной установки были стандартизированы в течение всего периода исследования. Следовательно, единственным переменным параметром был ПК для хранения времени. Рисунок 6 показывает замедление роста тромба в зависимости от времени хранения , демонстрирующая влияние поражения хранения тромбоцитов на гемостаз в пробирке.
Рисунок 1:. Intra-анализ вариации в микрофлюидальных экспериментах проточной камеры Микрожидкостных Flo ж эксперименты камеры были выполнены на иммобилизованным коллагена при 50 дин / см. Все три идентичных реконструированные образцы цельной крови были перфузию параллельно и одновременно. Результаты представлены в виде диапазона (усов) для покрытия поверхности в зависимости от времени перфузионной. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рис . 2: канал , частично покрытая (A) Коллагеновые волокна , визуализированные фазово - контрастной микроскопии были обнаружены только в регионе с покрытием. (Б) Снимок через 5 мин перфузии с Кальцеин А.М. меченого водостойких образце цельной крови прокачивали при 50 дин / см 2 показана. Оба изображения были взяты при увеличении 100X. ig2large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3: тромба кинетика роста зависит от количества тромбоцитов в разведенной крови (А) Кровь была восстановлена с использованием банка крови тромбоцитов концентрат получают различные концентрации тромбоцитов:. 245 х 10³ / мкл (●), 42 х 10³ / мкл (■) и 12 х 10³ / мкл (▲). Микрожидкостных проточную камеру эксперименты с коллагеном покрытием каналов были выполнены одновременно для всех трех образцов при напряжении сдвига 50 дин / кв.см. (B) Наклоны , рассчитанные методом линейной регрессии исходных данных в панели A изображены. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4:. Температура и микрофлюидальные проточных камер цельную кровь собирали в гепарин vacutainers сохранялся в течение 15 мин на водяной бане при комнатной температуре (а) или при 37 ° С (В). Микрожидкостных перфузия на иммобилизованной коллагена при напряжении сдвига 50 дин / см 2 была выполнена. Snap Shots в конечной точке (5 мин) перфузионной изображены. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 5: Роль напряжения сдвига на адгезии тромбоцитов к иммобилизованным VWF / фибриногена (А). Четыре одинаковые, кальцеина AM маркированы, восстанавливали цельной кровиОбразцы перфузировались над поверхностью ФВ / фибриногена с покрытием с переменным напряжением сдвига: 4,5 дин / см² (●), 50 дин / см² (■), 90 дин / см² (▲) и 225 дин / см² (♦). Через 3 минуты перфузии, оснастки выстрел был сделан из всех четырех каналов. (В) Поверхностные покрытия в зависимости от времени образцов , описанных в (А) показаны иллюстрирующий различия в кинетике роста тромба. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 6:. Тромб образование концентратов тромбоцитов в зависимости от времени хранения Все эксперименты камеры Микрожидкостных потока были выполнены в стандартных условиях на коллагене поверхностей с нанесенным покрытием при скорости сдвига 50 дин / см 2. Кровь была reconstiщённые с образцами тромбоцитов одного и того же концентрата испытания в двух экземплярах на три дня (●), семь (■) и десять (▲) пост пожертвования. Поверхностные покрытия в функции времени перфузионной изображены. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок S1:. Настройка камера Аппаратные средства Микрожидкостных потока (А) полую 8 Фтор + биочип монтируется на автоматизированном столик микроскопа и соединяется с помощью гибкой трубки к шприцевой насос с коллектором , чтобы разделить насосную функцию на восемь отдельных каналов. (В) Водостойких кровь течет через располагаемого трубки с правой стороны в выбранные каналы биочипа ( на входе). Одноразовый трубка закреплена на входе через из неESS стали одноразовыми штифт поставляется с установкой. Кровоток в (В) справа налево и собирается в длинных гибких НКТ. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Микрожидком эксперименты проточной камеры являются отличным инструментом для изучения функции тромбоцитов в потоке крови и используются для оценки гемостаза в пробирке в различных экспериментальных контекстах. Несмотря на плохую межлабораторной стандартизации 9, мы показали , что в нашей лаборатории экспериментально изменение является приемлемым. Это позволяет надежно сравнить (парную) образцов в пределах данного исследования. Это было подтверждено с использованием хорошо документированный явление поражения хранения тромбоцитов, что является вредным последствием хранения тромбоцитов в крови банковских условиях 11. Кроме того, мы недавно опубликовали влияние трех доступных технологий патоген инактивации на функцию тромбоцитов PC в микрофлюидальных проточных камерах следующий воссоздание 14,15 крови.
Тромбоциты реагируют по- разному , когда биофизических и -химические параметры различны 20. Таким образом, напряжение сдвига, число клеток и клеточный composiции, температуры, покрытие, антикоагулянтная и многие другие факторы, могут быть изменены в пределах этого протокола в зависимости от исследования вопроса. Этот протокол использует только имеющиеся в продаже аппаратного и программного обеспечения инструменты, позволяющие другие лаборатории проводить подобный анализ. Для основных исследовательских целей это может быть недостатком, особенно потому, что имеющееся оборудование является менее универсальным, чем заказных установок. Анализ сама по себе является надежной, но воспроизводимости страдает от биологической и временной изменчивости. Таким образом, образцы анализа должны быть спарены в максимально возможной степени и изучить размеры должны быть достаточно большим. Образцы также должны быть спарены во времени, так как восстановленный кровь можно хранить только в течение короткого промежутка времени.
Хотя микрофлюидальные камеры потока для исследования функции тромбоцитов повысили области исследований, следует проявлять осторожность, чтобы overinterpret зависимость тромбоцитов на реологические свойства крови. Во-первых, прямоугольная форма проточной камеры не физиологическая, бушельт лучшее, что мы должны позволить оптической фокусировки на растущем тромбов. Во-вторых, кровеносные сосуды не сделаны из пластика и влияние эластичности кровеносных сосудов на функцию тромбоцитов поэтому не могут быть изучены в этом протоколе. В-третьих, сердце вызывает поток пульсирующего, в то время как шприцевые насосы более линейны (хотя и слегка пульсирующим). И, наконец, тип фибриллярный коллаген I является стандартным материалом, используемым для исследования тромбоцитов в потоке, которая имеет животное происхождение. Следует отметить , однако, тип фибриллярный коллаген I и клинические результаты для функции тромбоцитов хорошо коррелируют во многих случаях , как показано многолетним опытом работы в (светопропускания) агрегометрия 21,22.
Есть много анализов для изучения функции тромбоцитов 23. Большинство из них адрес одного или нескольких признаков тромбоцитов при отдаче тромбоциты работать в (модели) гемостаза. В реальном масштабе времени изображений образования тромба, как показано здесь, является наиболее включительно, на сегодняшний день. Это означает, что большинство аспектов опалубответ Телет на повреждение сосуда включены. Уникальные преимущества являются включение кровотока и наличие всех клеток крови. Анализ чувствителен к используемым в настоящее время препаратов для антитромбоцитарной терапии 24, а также генетических изменений , что приводит к аберрантной функции тромбоцитов 25. Это демонстрирует свою ценность в качестве соответствующего показателя функции тромбоцитов. Комплексный характер этого анализа, тем не менее, также подразумевает, что она меньше, чем аналитический тех анализов измерения специфических особенностей реакции тромбоцитов в. Поэтому эффектами крови банковских манипуляций на концентратов тромбоцитов может подхвачены проточную камеру анализов, но интерпретировать то, что заставляет их, требуется дополнительный анализ. Например, наши данные свидетельствуют о том, что температура существенно влияет на адгезию тромбоцитов в микрофлюидальных проточных камерах. Но дополнительный детальный анализ показал , что охлажденные тромбоциты изменяют форму и кластера GPIbα рецепторов 26.
соавт. 16 продемонстрировали важность определения субстрата для тромбоцитов системной биологии. Кроме того, сочетание различной скорости сдвига в зависимости от субстрата имеет важное значение, так как связывание тромбоцитов с иммобилизованным VWF требует высокой скорости сдвига, в то время как это менее важно для связывания коллагена. Таким образом, в зависимости от исследования вопроса, выбор может быть сделан на каких подложках и их соответствующие скорости потока должны быть включены.
В заключение мы приводим протокол для микрофлюидальные экспериментов проточной камеры для изучения функции тромбоцитов в контексте банков крови и трансфузионной медицины. Усилия по стандартизации продолжаются 9,10,28-30 и большинство из этих рекомендаций включены в протокол , представленный. Восстановление крови является модельюПереливание но дополнительная работа валидации следует указать отношение к клиническим результатам.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD vacutainer tube with EDTA | Becton, Dickinson and Company | 368856 | |
| BD vacutainer tube with Heparin | Becton, Dickinson and Company | 368480 | |
| BD vacutainer tube with Sodium Citrate | Becton, Dickinson and Company | 366575 | |
| Hirudin Blood tube | Roche | 6675751 001 | |
| BD vacutainer Eclipse | Becton, Dickinson and Company | 368650 | Blood collection needle with preattached holder |
| Pipette tips 100-1,000 | Greiner bio-one | 740290 | |
| Pipette tips 2-200 | Greiner bio-one | 739280 | |
| Pipette tips 1-10 | Eppendorf | A08928 | |
| Tube 5 ml | Simport | 11691380 | |
| Conical tube 15 ml | Greiner bio-one | 1888271 | |
| Conical tube 50 ml | Greiner bio-one | 227261 | |
| 10 ml Syringe | BD | 309604 | |
| Precision wipes | Kimtech | 5511 | |
| Vena8 Fluoro+ Biochips | Cellix | 188V8CF-400-100-02P10 | Named in Figure S1 A as 'Biochip' |
| Vena8 Tubing | Cellix | TUBING-TYGON-B1IC-B1OC-ROLL 100F | Named in Figure S1 B as 'Disposable tubing' |
| Vena8 Needles | Cellix | SS-P-B1IC-B1OC-PACK200 | Named in Figure S1 B as 'Pin' |
| Connectors for single inlet cables of biochips | Cellix | CONNECTORS-B1IC-PACK100 | |
| Multiflow8 connect | Cellix | MF8-CONNECT-BIC3-N-THROMBOSIS | Named in Figure S1 B as 'Reusable tubing' and 'Splitter' |
| Humidified box | Cellix | HUMID-BOX | |
| Software microfluidic pump | Cellix | N/A | Venaflux Assay |
| Horm Collagen | Takeda/Nycomed | 1130630 | Native equine tendon collagen (type I) Isotonic glucose solution to dilute collagen is supplemented |
| HEPES buffered saline (HBS) | in house preparation | in house preparation | 10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) buffered saline (0.9% (w/v) NaCl, pH 7.4) |
| Blocking buffer | in house preparation | in house preparation | 1.0% (w/v) bovine serum albumin and 0.1% (w/v) glucose in HBS |
| Calcein AM | Molecular probes | C1430 | |
| Bleach 10% | in house preparation | in house preparation | |
| 0.1 M NaOH | in house preparation | in house preparation | |
| Denaturated alcohol | Fiers | T0011.5 | |
| Mirus Evo Nanopump | Cellix | 188-MIRUS-PUMP-EVO | with Multiflow8. Named in Figure S1 A as 'Pump' and 'Manifold' |
| Microscope | Zeiss | Axio Observer Z1 | equipped with a colibri-LED and high resolution CCD camera |
| Software microscope | Zeiss | N/A | ZEN 2012 |
| Hematology analyzer | Sysmex | N/A | |
| Table Top Centrifuge | Eppendorf | 521-0095 | |
| Platelet incubater | Helmer | PF-48i | |
| Incubation water bath | GFL | 1013 | |
| Pipette | Brand | A03429 | |
| Tube Roller | Ratek | BTR5-12V | |
| Sterile docking device | Terumo BCT | TSCD | |
| Tubing Sealer | Terumo BCT | AC-155 | |
| Vortex | VWR | 58816-121 |
References
- Broos, K., Feys, H. B., De Meyer, S. F., Vanhoorelbeke, K., Deckmyn, H. Platelets at work in primary hemostasis. Blood Rev. 25, 155-167 (2011).
- Stalker, T. J., et al. Hierarchical organization in the hemostatic response and its relationship to the platelet-signaling network. Blood. 121, 1875-1885 (2013).
- Sakariassen, K. S., Bolhuis, P. A., Sixma, J. J. Human blood platelet adhesion to artery subendothelium is mediated by factor VIII-Von Willebrand factor bound to the subendothelium. Nature. 279, 636-638 (1979).
- Savage, B., Saldivar, E., Ruggeri, Z. M. Initiation of platelet adhesion by arrest onto fibrinogen or translocation on von Willebrand factor. Cell. 84, 289-297 (1996).
- Westein, E., de Witt, S., Lamers, M., Cosemans, J. M., Heemskerk, J. W. Monitoring in vitro thrombus formation with novel microfluidic devices. Platelets. 23, 501-509 (2012).
- Varga-Szabo, D., et al. The calcium sensor STIM1 is an essential mediator of arterial thrombosis and ischemic brain infarction. J Exp Med. 205, 1583-1591 (2008).
- Westein, E., et al. Atherosclerotic geometries exacerbate pathological thrombus formation poststenosis in a von Willebrand factor-dependent manner. Proc Natl Acad Sci USA. , (2013).
- Grabowski, E. F., Yam, K., Gerace, M. Evaluation of hemostasis in flowing blood. Am J Hematol. 87 (Suppl 1), S51-S55 (2012).
- Roest, M., et al. Flow chamber-based assays to measure thrombus formation in vitro: requirements for standardization. J Thromb Haemost. 9, 2322-2324 (2011).
- Heemskerk, J. W. M., et al. Collagen surfaces to measure thrombus formation under flow: possibilities for standardization. J Thromb Haemost. 9, 856-858 (2011).
- Shrivastava, M. The platelet storage lesion. Transfus Apher Sci. 41, 105-113 (2009).
- Miyaji, R., et al. Decreased platelet aggregation of platelet concentrate during storage recovers in the body after transfusion. Transfusion. 44, 891-899 (2004).
- Goodrich, R. P., et al. Correlation of in vitro platelet quality measurements with in vivo platelet viability in human subjects. Vox Sang. 90, 279-285 (2006).
- Van Aelst, B., et al. Riboflavin and amotosalen photochemical treatments of platelet concentrates reduce thrombus formation kinetics in vitro. Vox Sang. 108, 328-339 (2015).
- Van Aelst, B., Devloo, R., Vandekerckhove, P., Compernolle, V., Feys, H. B. Ultraviolet c light pathogen inactivation treatment of platelet concentrates preserves integrin activation but affects thrombus formation kinetics on collagen in vitro. Transfusion. , (2015).
- de Witt, S. M., et al. Identification of platelet function defects by multi-parameter assessment of thrombus formation. Nat Commun. 5, 4257 (2014).
- Cazenave, J. P., et al. Preparation of washed platelet suspensions from human and rodent blood. Methods Mol Biol. 272, 13-28 (2004).
- Jackson, S. P., Nesbitt, W. S., Westein, E. Dynamics of platelet thrombus formation. J Thromb Haemost. 7 (Suppl 1), 17-20 (2009).
- Diedrich, B., Remberger, M., Shanwell, A., Svahn, B. M., Ringden, O. A prospective randomized trial of a prophylactic platelet transfusion trigger of 10 x 10(9) per L versus 30 x 10(9) per L in allogeneic hematopoietic progenitor cell transplant recipients. Transfusion. 45, 1064-1072 (2005).
- Neeves, K. B., et al. Sources of variability in platelet accumulation on type 1 fibrillar collagen in microfluidic flow assays. PloS one . 8, e54680 (2013).
- Born, G. V. Aggregation of blood platelets by adenosine diphosphate and its reversal. Nature. 194, 927-929 (1962).
- Cattaneo, M., et al. Recommendations for the Standardization of Light Transmission Aggregometry: A Consensus of the Working Party from the Platelet Physiology Subcommittee of SSC/ISTH. J Thromb Haemost. 11, 1183-1189 (2013).
- Deckmyn, H., Feys, H. B. Assays for quality control of platelets for transfusion. ISBT Sci Series. 8, 221-224 (2013).
- Andre, P., et al. Anticoagulants (thrombin inhibitors) and aspirin synergize with P2Y12 receptor antagonism in thrombosis. Circulation. 108, 2697-2703 (2003).
- Casari, C., et al. von Willebrand factor mutation promotes thrombocytopathy by inhibiting integrin alphaIIbbeta3. J Clin Invest. 123, 5071-5081 (2013).
- Gitz, E., et al. Improved platelet survival after cold storage by prevention of Glycoprotein Ibα clustering in lipid rafts. Haematologica. , (2012).
- Maurer-Spurej, E., Labrie, A., Brown, K. Routine Quality Testing of Blood Platelet Transfusions with Dynamic Light Scattering. Part Part Syst Char. 25, 99-104 (2008).
- Van Kruchten, R., Cosemans, J. M., Heemskerk, J. W. Measurement of whole blood thrombus formation using parallel-plate flow chambers - a practical guide. Platelets. 23, 229-242 (2012).
- Zwaginga, J. J., et al. Flow-based assays for global assessment of hemostasis. Part 2: current methods and considerations for the future. J Thromb Haemost. 4, 2716-2717 (2006).
- Zwaginga, J. J., et al. Flow-based assays for global assessment of hemostasis. Part 1: Biorheologic considerations. J Thromb Haemost. 4, 2486-2487 (2006).
