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Biology

प्रोटीन अभिव्यक्ति और सह स्थानीयकरण मल्टिप्लेक्स इम्यूनो-histochemical धुंधला और multispectral इमेजिंग का उपयोग के quantitation

doi: 10.3791/53837 Published: April 8, 2016

Introduction

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Immunohistochemistry (आईएचसी) ऊतक के भीतर प्रोटीन का पता लगाने के लिए एक मानक प्रयोगशाला तकनीक है, और अभी भी व्यापक रूप आईएचसी दोनों अनुसंधान और नैदानिक ​​विकृति में प्रयोग किया जाता है। आईएचसी धुंधला के मूल्यांकन अक्सर परिणामों की व्याख्या में संभावित पूर्वाग्रह शुरू अर्द्ध मात्रात्मक है। कई अर्द्ध मात्रात्मक दृष्टिकोण विकसित किया गया है जो अंतिम निदान 1-4 में दोनों धुंधला तीव्रता और धुंधला हद तक शामिल। अन्य प्रणालियों के लिए बेहतर अभिव्यक्ति 5 स्थानीयकरण करने में स्कोरिंग तीव्रता और subcellular स्थान शामिल हैं। औसत कई दर्शकों से स्कोर का निगमन अक्सर क्रम में एक दर्शक के पूर्वाग्रह 6 के प्रभाव को कम करने के लिए उपयोग किया जाता है। इन प्रयासों के बावजूद, विश्लेषण में आत्मीयता अभी भी बनी हुई है, खासकर जब धुंधला हो जाना 7 की हद तक का मूल्यांकन। प्रोटोकॉल मानकीकरण और मानव इनपुट से आत्मीयता को कम से कम सही, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य आईएचसी परिणाम बनाने के लिए सर्वोपरि है।

सामग्री "> ऊतकों के भीतर प्रोटीन अभिव्यक्ति का निर्धारण करने के लिए आईएचसी के अलावा अन्य विकल्प नहीं है। अनुसंधान की स्थापना के भीतर, immunohistochemistry परंपरागत रूप से, प्रोटीन स्थानीयकरण 8 की जांच के लिए एक साधन के रूप में देखा गया है, जबकि इस तरह के immunoblotting के रूप में अन्य तकनीकों प्रोटीन अभिव्यक्ति की जांच के लिए सोने के मानक के रूप में देखा जाता है । निर्धारण ऊतक या सेल डिब्बे विशिष्ट अभिव्यक्ति इस तरह के सेल विभाजन या लेजर कब्जा microdissection 9,10 के रूप में उन्नत तकनीकों को शामिल करने के बिना मुश्किल है। ऊतक स्लाइड पर फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी का उपयोग एक उचित समझौता प्रदान करता है, लेकिन NADPH के कारण पृष्ठभूमि autofluorescence, lipofuscins, जालीदार फाइबर, कोलेजन और elastin सटीक quantitation मुश्किल 11 बना सकते हैं।

स्वचालित कम्प्यूटेशनल विकृति प्लेटफार्मों विकृति धुंधला 12-15 से अधिक उद्देश्य quantitation के लिए एक होनहार दिशा रहे हैं। ऊतक के साथ multispectral इमेजिंग का मेलबड़ा नमूना आकार में प्रोटीन अभिव्यक्ति के उच्च throughput विश्लेषण की सुविधा। इन तकनीकों के साथ, प्रोटीन सह स्थानीयकरण, धुंधला विविधता, और ऊतक और subcellular स्थानीयकरण के विश्लेषण संभव है, जबकि काफी हद तक दोनों निहित पूर्वाग्रहों और विश्लेषण के लिए आवश्यक समय को कम करते हुए स्पष्ट प्रारूप 16 से एक सतत में डेटा लौटने के बजाय है। इसलिए, इस अध्ययन का उद्देश्य, विश्लेषण के साथ मल्टिप्लेक्स immunohistochemistry प्रदर्शन multispectral इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करने के लिए की उपयोगिता और कार्यप्रणाली प्रदर्शित करने के लिए किया गया था।

इस प्रोटोकॉल चार अनुकूलित मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के साथ एक एकल ऊतक अनुभाग स्लाइड के मैनुअल, मल्टीप्लेक्स immunohistochemical धुंधला के लिए लिखा है। एक प्रतिनिधि प्रयोग के रूप में, परमाणु विरोधी खरगोश एस्ट्रोजन रिसेप्टर अल्फा (ERα) और एण्ड्रोजन रिसेप्टर (एआर) झिल्ली ही सीमित विरोधी माउस CD147 और झिल्ली ही सीमित विरोधी माउस ई cadherin के साथ मल्टिप्लेक्स रहे हैं। पसंद के किसी भी एंटीबॉडी substitut जा सकता हैइस के साथ साथ सूचीबद्ध एंटीबॉडी के लिए एड, लेकिन एंटीबॉडी के प्रत्येक संयोजन अलग अनुकूलन की आवश्यकता है। सभी एंटीबॉडी के लिए पूर्व उपचार के लिए समान होना चाहिए। ए.आर. और CD147 एंटीबॉडी को व्यक्तिगत रूप से और फिर एक कॉकटेल के रूप में अनुकूलित किया जाना चाहिए। प्रत्येक एंटीबॉडी एक बायोटिन मुक्त बहुलक प्रणाली और 4 अद्वितीय chromogens में से एक का उपयोग कर पता लगाया है।

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Protocol

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नोट: प्रोटोकॉल के साथ साथ धुंधला हो जाना और एक ऊतक माइक्रोएरे (टीएमए) के विश्लेषण, पहले से 12,17,18 वर्णित वर्णन करता है। 4 माइक्रोन मोटी टीएमए खंड एक मानक microtome का उपयोग कर एक पैराफिन ब्लॉक से प्राप्त हुई थी।

नोट: 4 chromogens और counterstain के लिए एक वर्णक्रम पुस्तकालय की छवि quantitation के लिए बनाया जाना चाहिए। आदेश में यह करने के लिए, प्रत्येक व्यक्ति एंटीबॉडी के लिए अनुकूलित प्रोटोकॉल स्लाइड प्रति एक एंटीबॉडी, शून्य से अंतिम counterstain के साथ चलाया जाना चाहिए। एक पांचवें स्लाइड वर्णक्रम पुस्तकालय बनाने की जरूरत 5 छवियों को उत्पन्न करने के लिए hematoxylin के साथ दाग किया जाना चाहिए।

1. मल्टीप्लेक्स Immunohistochemistry

  1. 20 मिनट के लिए एक 60 डिग्री सेल्सियस ओवन में बनाओ स्लाइड। एक रासायनिक धूआं हुड का प्रयोग, 100% xylene में स्लाइड विसर्जित कर दिया। xylene के 2 में परिवर्तन के लिए दोहराएँ। 5 मिनट के लिए 100% इथेनॉल में स्लाइड विसर्जित कर दिया। ताजा 100% इथेनॉल के साथ दोहराएँ।
  2. 3 मिनट के लिए 95% इथेनॉल में स्लाइड विसर्जित कर दिया। ताजा के साथ दोहराएँ95% इथेनॉल। 3 मिनट के लिए 70% इथेनॉल में स्लाइड विसर्जित कर दिया। 3 मिनट के लिए आसुत जल में विसर्जित कर दिया स्लाइड। ताजा आसुत जल के साथ दोहराएँ। ठोकर स्लाइड खड़ी स्लाइड से पानी के निकास के लिए। 5 मिनट के लिए तैयार करने के लिए उपयोग अंतर्जात peroxidase अवरोधक के 200 μl लागू करें।
  3. स्लाइड से peroxidase अवरोधक नाली और (की तुलना में 7.0 कम पीएच) 45 मिलीलीटर में विसर्जित तैयार करने के लिए उपयोग पुनर्प्राप्ति बफर। एक प्रेशर कुकर में रखें स्लाइड कंटेनर और कार्यक्रम शुरू 4 मिनट के लिए 124 डिग्री सेल्सियस के लिए निर्धारित किया है। प्रेशर कुकर 20 मिनट के लिए शांत करने के लिए अनुमति दें। उद्घाटन से पहले।
  4. पुनः प्राप्ति के बफर के कंटेनर निकालें और अतिरिक्त 10 मिनट शांत करने के लिए अनुमति देते हैं। 10 मिनट के लिए आसुत जल में स्लाइड कुल्ला। स्लाइड से पानी के निकास और ध्यान से एक हाइड्रोफोबिक बाधा कलम के साथ स्लाइड पर ऊतक को चित्रित।
  5. ढक्कन (ऊष्मायन कक्ष) के साथ एक फ्लैट संदूक नम धुंध से युक्त करने के लिए फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) .Transfer स्लाइड के 200 μl जोड़ें।
  6. बीच -20 (TBST) के साथ बफर Tris 1x 1 लीटर तैयार 50 मीटर गिराए द्वारा खारा20x Tris के एल बीच -20 और 950 मिलीलीटर आसुत जल से युक्त 1% खारा बफर।
  7. स्लाइड से पीबीएस नाली और 1x TBST के 200 μl लागू होते हैं। 2 मिनट सेते हैं। स्लाइड से TBST नाली और ऊष्मायन कक्ष में लौटने के स्लाइड। तैयार करने के लिए उपयोग सार्वभौमिक प्रोटीन ब्लॉक, बंद कक्ष के 200 μl लागू करें और 7 मिनट के लिए सेते हैं।
  8. प्रोटीन ब्लॉक नाली और ऊष्मायन कक्ष में लौटने के स्लाइड। एंटीबॉडी मंदक के 239.4 μl के लिए एंटीबॉडी के 0.6 μl जोड़कर 400: पतला विरोधी ERα एंटीबॉडी 1। स्लाइड को पतला एंटीबॉडी और बंद कक्ष के 200 μl लागू करें।
  9. 2 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर स्लाइड सेते हैं। स्लाइड से एंटीबॉडी नाली और TBST में 5 मिनट के लिए विसर्जन के द्वारा पीछा TBST से कुल्ला।
  10. स्लाइड से TBST नाली और ऊष्मायन कक्ष में लौटने के स्लाइड। तैयार करने के लिए उपयोग बकरी विरोधी खरगोश हॉर्सरैडिश peroxidase बहुलक और करीब चैम्बर के 200 μl लागू करें। 30 मिनट के लिए सेते हैं। कमरे के तापमान पर। 5 मिनट के लिए TBST के कंटेनर में TBST और जगह स्लाइड के साथ कुल्ला स्लाइड। </ Li>
  11. भूरे रंग के हॉर्सरैडिश peroxidase-3,3'-diaminobenzidine (एचआरपी-थपका) 250 μl थपका सब्सट्रेट बफर करने के लिए थपका वर्णकोत्पादक के 8 μl जोड़ने और अच्छी तरह से मिश्रण से वर्णकोत्पादक तैयार करें।
  12. स्लाइड, ऊष्मायन चैम्बर के लिए वापसी स्लाइड से TBST नाली और 6 मिनट के लिए भूरे रंग के एचआरपी-थपका वर्णकोत्पादक के 200 μl लागू होते हैं। अच्छी तरह से आसुत जल के एक कंटेनर में आसुत जल और जगह स्लाइड के साथ स्लाइड कुल्ला।
  13. दूसरी बफर अभिकर्मक के 150 μl के साथ पहली क्षालन अभिकर्मक के 50 μl के संयोजन से अप्राकृतिकरण समाधान मिश्रण। स्लाइड बंद नाली के पानी और 3 मिनट के लिए स्लाइड को पतला अप्राकृतिकरण समाधान लागू होते हैं। कमरे के तापमान पर। छानना और TBST के साथ अभिकर्मक denaturing कुल्ला। 5 मिनट के लिए TBST में स्लाइड विसर्जित कर दिया।
  14. विरोधी एआर एंटीबॉडी के 4.2 μl और एंटीबॉडी मंदक के 203 μl के साथ विरोधी CD147 एंटीबॉडी के 2.8 μl गिराए द्वारा एआर / CD147 एंटीबॉडी कॉकटेल तैयार करें। स्लाइड से TBST नाली, ऊष्मायन कक्ष में लौटने के स्लाइड और एआर / CD147 ग के 200 μl लागूस्लाइड के लिए ocktail। बंद चैम्बर और कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए सेते हैं। TBST के साथ कुल्ला स्लाइड और 5 मिनट के लिए TBST में विसर्जित कर दिया।
  15. TBST, ऊष्मायन चैम्बर के लिए वापसी स्लाइड नाली और तैयार करने के लिए उपयोग बकरी विरोधी खरगोश alkaline फॉस्फेट बहुलक के 200 μl लागू होते हैं। बंद कक्ष और 30 मिनट के लिए सेते स्लाइड। कमरे के तापमान पर। TBST के साथ कुल्ला स्लाइड और 5 मिनट के लिए TBST में विसर्जित कर दिया।
  16. लाल alkaline फॉस्फेट लाल वर्णकोत्पादक बफर 250 μl के लिए लाल वर्णकोत्पादक के 3.2 μl जोड़कर वर्णकोत्पादक को तैयार है और अच्छी तरह मिलाएँ।
  17. स्लाइड से TBST नाली और ऊष्मायन कक्ष में लौटने के स्लाइड। स्लाइड, बंद कक्ष के लिए पतला लाल alkaline फॉस्फेट वर्णकोत्पादक के 200 μl लागू करें और 7 मिनट के लिए सेते हैं।
  18. वर्णकोत्पादक नाली और अच्छी तरह से आसुत जल के साथ स्लाइड कुल्ला। 5 मिनट के लिए आसुत जल के एक कंटेनर में स्लाइड रखें। स्लाइड से पानी के निकास, TBST से कुल्ला और ऊष्मायन कक्ष में लौटने। स्लाइड और क्लोस के लिए 200 μl बकरी विरोधी माउस एचआरपी बहुलक लागू करेंई चैंबर। 30 मिनट के लिए सेते हैं। कमरे के तापमान पर।
  19. स्लाइड से बहुलक नाली और TBST से कुल्ला। 5 मिनट के लिए TBST में जगह स्लाइड। बफर के 250 μl को स्थिर अभिकर्मक के 3.2 μl जोड़कर बैंगनी एचआरपी-लिंक्ड वर्णकोत्पादक के 200 μl तैयार है और अच्छी तरह मिलाएँ। बैंगनी वर्णकोत्पादक के 3.2 μl जोड़ें और मिश्रण अच्छी तरह से, तो हाइड्रोजन पेरोक्साइड अभिकर्मक के 3.2 μl और अच्छी तरह मिलाएँ।
  20. TBST स्लाइड बंद नाली और स्लाइड और 7 मिनट के लिए सेते के लिए तैयार बैंगनी वर्णकोत्पादक के 200 μl लागू होते हैं। कमरे के तापमान पर। 5 मिनट के लिए आसुत जल के एक कंटेनर में आसुत जल और जगह स्लाइड के साथ कुल्ला स्लाइड।
  21. दूसरी बफर अभिकर्मक के 150 μl के साथ पहली क्षालन अभिकर्मक के 50 μl मिश्रण से अप्राकृतिकरण समाधान मिश्रण। स्लाइड बंद नाली के पानी और 3 मिनट के लिए स्लाइड को पतला अप्राकृतिकरण समाधान लागू होते हैं। कमरे के तापमान पर।
  22. अभिकर्मक TBST के साथ बंद denaturing कुल्ला। TBST के कंटेनर में स्लाइड 5 मिनट के लिए रखें। पतला विरोधी ई cadherin एंटीबॉडीएंटीबॉडी मंदक μl 218,9 के लिए 1.1 μl एंटीबॉडी जोड़कर 200: 1 करने के लिए। स्लाइड, ऊष्मायन चैम्बर के लिए वापसी स्लाइड से TBST नाली और स्लाइड के लिए ई cadherin के 200 μl लागू होते हैं। बंद कक्ष और 30 मिनट सेते हैं। कमरे के तापमान पर।
  23. 5 मिनट के लिए TBST के कंटेनर में TBST और जगह स्लाइड के साथ कुल्ला स्लाइड। स्लाइड से TBST नाली, ऊष्मायन कक्ष में लौटने के स्लाइड और 200 μl बकरी विरोधी माउस एचआरपी बहुलक लागू होते हैं। 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं। 5 मिनट के लिए TBST के कंटेनर में TBST और जगह स्लाइड के साथ कुल्ला स्लाइड।
  24. तैयार काले एचआरपी से जुड़े 250 μl बफर करने के लिए वर्णकोत्पादक के 8 μl जोड़कर वर्णकोत्पादक। स्लाइड और 2 मिनट के लिए विकसित करने के लिए वर्णकोत्पादक 200 μl लागू करें। अच्छी तरह से आसुत जल के साथ स्लाइड कुल्ला और आसुत जल के कंटेनर में विसर्जित कर दिया।
  25. आसुत जल के 200 μl 40 μl hematoxylin जोड़कर hematoxylin पतला। स्लाइड से पानी के निकास और 30 सेकंड के लिए स्लाइड करने के लिए पतला hematoxylin के 200 μl लागू होते हैं। कुल्ला स्लाइडअच्छी तरह से 2 मिनट के लिए नल का पानी चल रहा है।, फिर 30 सेकंड के लिए आसुत पानी में कुल्ला। 15-30 मिनट के लिए एक 60 डिग्री सेल्सियस ओवन में रखें स्लाइड।
  26. 30 सेकंड के लिए हौसले से तैयार 100% xylene में स्लाइड को विसर्जित कर दिया, अतिरिक्त xylene पोंछ और स्थायी बढ़ते मीडिया की एक बूंद जोड़ें। एक नहीं, 1.5 coverslip के साथ coverslip।

2. स्वचालित छवि अधिग्रहण और विश्लेषण

  1. एक स्वचालित स्लाइड स्कैनर पर दाग स्लाइड लोड। व्यास, जुदाई, और टीएमए कोर की संख्या के आधार पर, के अनुसार निर्माता के अनुदेश मैनुअल एक स्वचालित स्कैनिंग प्रोटोकॉल पैदा करते हैं।
  2. ओपन multispectral इमेजिंग सॉफ्टवेयर नियंत्रण स्लाइड व्यक्ति chromogens और hematoxylin दाग स्लाइड के साथ दाग से एक वर्णक्रमीय पुस्तकालय का निर्माण करने के लिए। एक छवि घन एक नियंत्रण स्लाइड से अर्जित खोलें और चार से पांच सकारात्मक दाग क्षेत्रों का चयन ऑप्टिकली कि वर्णकोत्पादक परिभाषित करने के लिए। एक पूरा वर्णक्रम पुस्तकालय representi जब तक अन्य नियंत्रण स्लाइड से छवि क्यूब्स के साथ दोहराएँसभी chromogens एनजी बनाई गई है, और फिर वर्णक्रम पुस्तकालय बचाने के लिए।
  3. multispectral इमेजिंग सॉफ्टवेयर के भीतर एक नई परियोजना शुरू करते हैं। चुनें "multispectral (.im3)" छवि प्रारूप विकल्प और नमूना प्रारूप के लिए "Brightfield के लिए"। , "सेगमेंट ऊतक", "phenotyping" "सुविधाएँ मिल", "स्कोर" और "निर्यात": पहले, इच्छित विकल्प का चयन करके परियोजना विन्यस्त। इस बिंदु पर, छवि संकल्प विश्लेषण समय में तेजी लाने के लिए अगर वांछित बदला जा सकता है।

3. ऊतक विभाजन

  1. पहले बनाया वर्णक्रम पुस्तकालय आयात और सभी chromogens विश्लेषण में शामिल होने के लिए चयन करें।
  2. ओपन की छवि क्यूब्स "ओपन छवि घन" विकल्प का चयन करके सेट प्रशिक्षण डेटा में शामिल किया जाना है। प्रशिक्षण सटीकता सुनिश्चित करने के लिए, चयन छवियों की कुल संख्या का कम से कम 18% का विश्लेषण किया जाए। चित्र है कि विभाजन शुद्धता बढ़ाने के लिए सभी रोग राज्यों का प्रतिनिधित्व चुनें। छवियों के इस हिस्से में खोजएस छवियों का प्रशिक्षण सेट बुलाया।
  3. प्रशिक्षण आँख dropper उपकरण का चयन और एक छवि है कि सफेद है में एक क्षेत्र का चयन करके सेट में सफेद संतुलन छवियों।
  4. ऊतक विभाजन करने के लिए स्थानांतरित करने के लिए "अग्रिम" बटन का चयन करें। (यानी "ऊतक" और "गैर-ऊतक") का विश्लेषण किया जा करने के लिए ऊतक प्रकार का चयन करने के लिए "ऊतक श्रेणियाँ" पैनल का प्रयोग करें। अधिक सटीक प्रोटीन ऊतक स्थानीयकरण के लिए, कई ऊतक श्रेणियों (यानी। "Epithelia," "स्ट्रोमा," और "गैर-ऊतक") का इस्तेमाल किया जा सकता है।
  5. एल्गोरिथ्म बनाने और प्रशिक्षण छवियों के भीतर कोशिकाओं के समूहों के आसपास ड्राइंग द्वारा ऊतक श्रेणियों को परिभाषित करने के लिए शुरू करो। जब एक ऊतक वर्ग के साथ समाप्त हो गया है, अन्य ऊतक श्रेणियों के लिए दोहराएँ। चित्र है कि है कि ऊतक श्रेणी प्रकार के लक्षण हैं के भीतर कोशिकाओं के समूह का चयन करने के लिए सुनिश्चित करें।
  6. छवियों का प्रशिक्षण सेट के भीतर सभी छवियों के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएं।
  7. घटकों का चयन (chromogens) ट्राई में शामिल होने के लिए"ऊतक Segmenter के लिए" निंग। जब brightfield immunohistochemistry छवियों का विश्लेषण प्रदर्शन, सभी घटकों को सामान्य रूप से प्रशिक्षण में शामिल किए गए हैं। प्रशिक्षण इस कदम के दौरान पूर्वाग्रह से बचने के लिए सेट में प्रचुर मात्रा में नकारात्मक धुंधला छवियों को शामिल करें।
  8. ऊतक segmenter प्रशिक्षण के लिए एक उचित "पैटर्न स्केल" चुनें। 20X आवर्धन के तहत, एक बड़े पैमाने पैटर्न आम तौर पर उपयुक्त है। जब उच्च बढ़ाई के तहत एक ठीक वास्तुकला के साथ ऊतकों के साथ काम कर रहे हैं, एक छोटे पैटर्न पैमाने अधिक उपयुक्त है।
  9. ऊतक segmenter प्रशिक्षण शुरू करने के लिए "ट्रेन ऊतक Segmenter" बटन का चयन करें। एक पॉप-अप बॉक्स प्रदर्शित सटीकता प्रशिक्षण क्षेत्रों के भीतर पिक्सल है कि ठीक से वर्गीकृत कर रहे हैं के अनुपात में दर्शाती का निरीक्षण करें।
    ध्यान दें: सॉफ्टवेयर लगातार एल्गोरिथ्म की सटीकता में सुधार करने के लिए जब तक मैन्युअल बंद कर दिया प्रयास करता है। हम पहले 97% प्रशिक्षण सटीकता 12 में छवियों के परिणाम के 18% पर है कि प्रशिक्षण का प्रदर्शन किया है। बाद ऊतक segmenter प्रशिक्षित किया जाता है, एक उपयुक्त खंड संकल्प चुनें। खंड खंड संकल्प छवियों के लिए आवश्यक समय से मेल खाती है, कम समय और ठीक संकल्प और अधिक समय की आवश्यकता होती है की आवश्यकता होती है मोटे संकल्प के साथ।
  10. खंड "सेगमेंट छवियाँ" पर क्लिक करके छवियों का पूरा प्रशिक्षण सेट। सॉफ्टवेयर पर्याप्त समय सभी प्रशिक्षण छवियों कलन विधि को लागू करने की अनुमति दें। जब समाप्त हो, प्रशिक्षण वर्तमान प्रशिक्षण एल्गोरिथ्म के साथ किसी भी misclassified ऊतकों को लगाने के लिए सेट की समीक्षा करें।
  11. ठीक धुन करने के लिए ऊतक विभाजन की प्रक्रिया, जोड़, संपादित करें, या ऊतक प्रशिक्षण क्षेत्रों को हटा दें। "ट्रिम किनारों" विकल्प का प्रयोग करें अगर पिक्सल एक ऊतक श्रेणी के किनारों पर दूसरे में विस्तार। पिक्सल के छोटे समूहों misclassified रहे हैं, तो कम से कम खंड आकार पर सीमा को समायोजित।
  12. संपादन पूरा कर रहे हैं, का चयन करें "सेगमेंट छवियाँ", यह फिर से प्रशिक्षित करेंगे ऊतक segmenter ऊतक विभाजन के लिए एक नई विधि को बनाने के लिए। पिछले एल्गोरिथ्मस्वचालित रूप से सहेजा और यदि आवश्यक हो तो लौटा जा सकता है।
  13. जब ऊतक विभाजन एल्गोरिथ्म परिणामों के साथ विश्वास है, "अग्रिम" बटन का चयन करके सेल विभाजन के लिए अग्रिम।

4. सेल विभाजन

  1. चुनें subcellular डिब्बों सेल विभाजन में शामिल किया जाना है। सुनिश्चित करें कि "नाभिक" पहले से ही "कोशिका द्रव्य" या "झिल्ली" का चयन करने के लिए चयन किया जाता है।
    नोट: "झिल्ली" विभाजन केवल जब एक झिल्ली विशिष्ट प्रोटीन मार्कर इस तरह के ई cadherin के रूप में आईएचसी में शामिल किया गया था, चुना जाना चाहिए।
  2. "नाभिक" टैब के भीतर, वहाँ कई विकल्प हैं। परमाणु विभाजन के लिए उपयुक्त सेटिंग्स का चयन करके शुरू (4.3 चरण देखें)। चुनें व्यक्ति या सभी ऊतक श्रेणियों के विभाजन में शामिल किया जाएगा या नहीं।
  3. परमाणु विभाजन के लिए एक दृष्टिकोण का चयन करें
    1. अच्छा प्राप्त करने के लिए एक सरल विधि के लिए counterstain "पिक्सेल आधारित (सीमा)" दृष्टिकोण का चयन करेंइमेज प्रोसेसिंग सेटिंग्स के बारे में ज्यादा जानने के बिना परिणाम है।
      नोट: यह अक्सर एक अच्छा पहली पसंद बना देता है। जब एक दृष्टिकोण, "पिक्सेल आधारित (सीमा)" का चयन अगर वहाँ लगातार परमाणु counterstain की कमी है, जबकि "वस्तु आधारित" इस्तेमाल किया जाना चाहिए, जब वहाँ एक विश्वसनीय परमाणु जवाबी दाग ​​है अधिक उपयुक्त है।
    2. "पिक्सेल आधारित (सीमा)" दृष्टिकोण का चयन करें जब वहाँ एक विश्वसनीय परमाणु counterstain है।
      नोट: यह दृष्टिकोण विशुद्ध पिक्सेल आधारित है। यह दृष्टिकोण भी अन्य छवि विश्लेषण की जरूरत है, इस तरह के एक ऊतक श्रेणी है कि एक आईएचसी दाग ​​के लिए सकारात्मक दाग के भीतर सभी पिक्सल का पता लगाने के रूप में है कि एक साधारण सीमा के साथ संतुष्ट किया जा सकता है के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
    3. यदि परमाणु counterstain परमाणु वस्तुओं की सुसंगत और विशिष्ट धुंधला प्रदान नहीं करता वस्तु आधारित दृष्टिकोण का चयन करें, और अधिक उन्नत morphometry आधारित दृष्टिकोण नाभिक का पता लगाने की जरूरत है।
    4. "परमाणु विभाजन के लिए घटक" का चयन करें, "Nuclकान का आकार ", और" क्लीन अप "उपयोगकर्ता आगे नाभिक विभाजन सेटिंग्स को परिभाषित करने के लिए चाहता है।
  4. कोशिका द्रव्य आकार मापदंडों का चयन करें
    1. कोशिका द्रव्य विभाजन करने के लिए स्थानांतरित करने के लिए "अग्रिम" बटन का चयन करें।
      नोट: कोशिका द्रव्य विभाजन के भीतर कई विकल्पों में से चुनने के लिए कर रहे हैं। विकल्प करार दिया "नाभिक के भीतरी दूरी" पिक्सेल आधारित है। यह नाभिक के बाहर और कोशिका द्रव्य के अंदर के बीच की दूरी को दर्शाता है। इस मान को बढ़ाना संभावना है कि परमाणु संकेत कोशिका द्रव्य डिब्बे में खत्म पार घट जाती है।
    2. अगला का चयन करें, "बाहरी दूरी नाभिक के लिए"।
      नोट: यह भी पिक्सेल आधारित है। नाभिक के लिए बाहरी दूरी नाभिक के बाहर और सेल के बाहर के बीच की दूरी को दर्शाता है। यह मान बड़े या छोटे के लिए पर्याप्त शामिल है या झिल्ली संकेतों को बाहर अगर वांछित करने के लिए सेट किया जा सकता है।
    3. अगला का चयन करें, "न्यूनतम आकार"।
      नोट: न्यूनतम आकार, PIXEआधारित एल, न्यूनतम कोशिका द्रव्य नमूने का आकार विश्लेषण में शामिल किया जाना दर्शाता है। कोशिका द्रव्य आकार एक विशेष सेल में छोटे जैसे कि जब कोशिकाओं को कसकर एक साथ पैक कर रहे हैं के रूप में है, तो इस कोशिका द्रव्य विभाजन विश्लेषण से बाहर रखा गया है।
    4. अगले विकल्प, "प्राथमिक", "माध्यमिक" के साथ "घटक" का चयन करें, और माध्यमिक विकल्प के रूप में "तृतीयक" का चयन करें।
      नोट: यहाँ एक एक विशिष्ट कोशिका द्रव्य मार्कर चुन सकते हैं। परमाणु विभाजन के लिए इसी प्रकार, यदि एक विशिष्ट cytoplasmic आईएचसी मार्कर इस्तेमाल किया गया है, इस घटक के लिए एक न्यूनतम सीमा मूल्य खोजने के द्वारा कोशिका द्रव्य को परिभाषित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। यह कोशिका द्रव्य को परिभाषित करने में मदद करता है लेकिन स्वीकार्य सटीकता के लिए आवश्यक नहीं है।
    5. तीन tabbed विकल्पों में से पिछले करने के लिए चल रहा है "झिल्ली" है। इधर, उपयोगकर्ता एक प्रोटीन मार्कर के साथ झिल्ली डिब्बे को परिभाषित करता है। "प्राथमिक" चुनें "माध्यमिक", और / या प्रत्येक झिल्ली विशिष्ट इस्तेमाल किया मार्कर के लिए "तृतीयक"। समायोजित करें "फुल स्केल हेडी "एक न्यूनतम सीमा या कोशिका झिल्ली पर प्रत्येक मार्कर के लिए एक सकारात्मक खोजने के लिए।
    6. "झिल्ली" टैब के तहत जारी रखने और विकल्प "अधिकतम सेल आकार" का चयन करें।
      नोट: यह झिल्ली मूल्य के लिए दूरी, पिक्सल में है, जो कोशिकाओं का अधिकतम आकार को निर्दिष्ट करता है। 12 के एक मूल्य सामान्य रूप से 20X बढ़ाई लिया छवियों के लिए उपयुक्त है।
    7. सभी विकल्पों को चुनने के बाद, चयन "सेगमेंट छवि" या "सेगमेंट सभी"। छवियों के लिए सेटिंग्स लागू करते हैं और उन्हें "व्यक्तिगत रूप से" या "गैलरी" मोड में निरीक्षण करते हैं।
      नोट: यदि आवश्यक सेटिंग्स और थ्रेसहोल्ड समायोजित करें, और छवियों के प्रशिक्षण सेट में सेल विभाजन परिणामों से संतुष्ट हैं जब तक फिर से खंड।

5. प्रकोष्ठों के phenotyping

नोट: सटीक सेल विभाजन आदेश सटीक सेल phenotyping प्राप्त करने के लिए आवश्यक है, और phenotyping सुविधा trainable है।

  1. का प्रयोग करें "जोड़ें# 34; बटन "phenotypes" सूची में phenotypes जोड़ने के लिए। उपयोगकर्ता phenotype के लिए एक रंग का चयन कर सकते हैं।
  2. पर "संपादित करें phenotypes" पर क्लिक करने के लिए एक सेल एक phenotype आवंटित करने के लिए। एक विशेष सेल पर क्लिक करें ड्रॉप-डाउन मेनू ऊपर लाने के लिए, फेनोटाइप चयन करने के लिए और फिर आगे बढ़ने उपयोगकर्ता की इजाजत दी। आदेश में आगे बढ़ने के लिए कम से कम पांच (5) प्रत्येक phenotype में कोशिकाओं की पहचान। प्रत्येक phenotype के 25 या अधिक कक्षों का चयन इष्टतम परिणाम प्राप्त करने की जरूरत है।

6. स्कोरिंग आईएचसी और सह स्थानीयकरण

  1. "स्कोर आईएचसी या यदि" करने के लिए कदम स्थानांतरित करने के लिए "अग्रिम" चुनें। स्कोर करने के लिए एक "ऊतक श्रेणी" चुनें।
    नोट: केवल एक ऊतक वर्ग एक विशेष विश्लेषण के दौरान रन बनाए जा सकते हैं, लेकिन अगर एक और ऊतक श्रेणी में स्कोरिंग परिणामों वांछित हैं, विश्लेषण बाद में विभिन्न सेटिंग्स के साथ दोहराया जा सकता है।
  2. एक वांछित "स्कोरिंग" प्रकार का चयन करें।
    नोट: धनात्मकता ब्याज की एक घटक के लिए दो डिब्बे (सकारात्मक और नकारात्मक) बनाता है, जबकि डबल सकारात्मकता सह स्थानीयकरण के विश्लेषण के लिए प्रयोग किया जाता है। अन्य विकल्प 4-बिन, 10-बिन, और 50-बिन पसंद का एक मार्कर के लिए विश्लेषण शामिल हैं।
  3. सेल 'कम्पार्टमेंट "विश्लेषण स्कोरिंग में इस्तेमाल किया जा करने के लिए चुनें।
  4. प्राथमिक परमाणु घटक के लिए एक न्यूनतम सीमा पाने के लिए भी इसी तरह, "सारे घटक डाटा" का चयन और प्रशिक्षण के चित्र पर कर्सर ले जाने के हित के घटक (एस) के लिए सकारात्मक कोशिकाओं के लिए धुंधला की उचित ऑप्टिकल घनत्व न्यूनतम सीमा खोजने के लिए।
  5. तीव्रता से सना हुआ कोशिकाओं को बाहर रखा जा करने के लिए कर रहे हैं, एक उचित स्तर पर सीमा अधिकतम कम है। अन्यथा, ऑटो बटन का उपयोग विश्लेषण के लिए एक सीमा अधिकतम चुनने के लिए।
  6. आदेश thresholding मूल्यों को मान्य करने में स्कोर करने के लिए छवियों को प्रशिक्षण चुनें।
    नोट: एक विशेष बिन भीतर कोशिकाओं का प्रतिशत लौटा दी जाएगी और दृश्य निरीक्षण या मैनुअल गिनती से तुलना की जा सकती। एक बार जब पूरा करें, "अग्रिम" "निर्यात" चरण के लिए आगे बढ़ना।
<पी वर्ग = "jove_title"> 7। एल्गोरिथ्म और बैच विश्लेषण लागू करने

  1. प्रशिक्षण सेट के लिए डेटा के निर्यात से ऊतक विभाजन, विभाजन सेल, और स्कोरिंग मूल्यों के माध्यम से बनाया एल्गोरिथ्म का परीक्षण करें। निर्यात निर्देशिका के लिए एक नया फ़ोल्डर बनाने के लिए संकेतों का पालन करें। छवियों और तालिकाओं का चयन करें बनाया है और विश्लेषण में शामिल किया जाना है। "सभी के लिए निर्यात" का चयन करके विश्लेषण करते हैं।
  2. टेबल्स टैब से अलग पाठ फ़ाइलों में निर्यात कर रहे हैं और सबसे अधिक डेटा विश्लेषण कार्यक्रमों में खोला जा सकता है।
  3. जब विश्लेषण पूरा हो गया है, दोनों उच्च और निम्न धुंधला सेटिंग्स की सटीकता का मूल्यांकन करने के साथ छवियों के लिए सेल विभाजन और स्कोरिंग डेटा देख सकते हैं।
  4. जब सेटिंग्स के साथ संतुष्ट, बैच विश्लेषण के माध्यम से छवियों के पूरे सेट करने के लिए छवियों के प्रशिक्षण के सेट से बनाई एल्गोरिथ्म लागू होते हैं। "बैच विश्लेषण" टैब पर क्लिक करें और खोला एल्गोरिथ्म सक्रिय परियोजना से नकल की जाएगी।
  5. एक नए निर्यात निर्देशिका का चयन और जो छवियों और tabl चयनतों विश्लेषण में शामिल हो रहे हैं। इनपुट फाइल विकल्प के तहत, चुनें "छवियाँ जोड़ें" और चुन सभी छवियों को बैच विश्लेषण में शामिल किया जाना है।
  6. "भागो" विकल्प का चयन करके विश्लेषण करते हैं। प्रशिक्षण सेट के विश्लेषण के साथ के रूप में, इस कदम के विशेष सेटिंग्स और विश्लेषण में शामिल छवियों की संख्या पर निर्भर करता है, समय की एक चर राशि की आवश्यकता होगी।
  7. जब पूरा हो, "समीक्षा करें / मर्ज" टैब के लिए अग्रिम। अगर वांछित बैच विश्लेषण से निर्यात निर्देशिका और बैच निर्देशिका चूक बदला जा सकता है। "सभी शामिल करें" और "मर्ज" विश्लेषण के लिए सारांश डेटा के साथ डाटा शीट बनाने के लिए।

8. निर्यात किया गया डेटा का विश्लेषण

  1. डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर निर्यात में टेबल खोलें और उसे हटाने या इस तरह के न्यूनतम और प्रत्येक घटक के लिए अधिकतम मान के रूप में डेटा स्तंभ है कि विश्लेषण के लिए अप्रासंगिक हैं, छिपाना। प्राथमिक विश्लेषण में इस्तेमाल किया डेटा मतलब ऑप्टिकल घनत्व सी में हैहर घटक के लिए olumn।
  2. समीक्षा निर्यात विभाजन नक्शे और कच्चे छवियों निर्धारित करने के लिए जो नमूने या टीएमए कोर विश्लेषण से बाहर रखा जा सकता है। ऊतक प्रतिशत मूल्यों को निर्धारित करने के लिए कि क्या एक नमूना शामिल किया जाना चाहिए या नहीं, बहिष्कार मापदंड के लिए सबसे अक्सर इस्तेमाल किया <5% की एक मनमाना कटऑफ के साथ में सहायता करते हैं।
  3. हटाये अप्रासंगिक डेटा या नमूने युक्त पंक्तियों डेटा विश्लेषण से बाहर रखा जा सकता है।
  4. रोग राज्य में परिवर्तन या रोग 12,18-21 की Clinico-रोग विशेषताओं के साथ संबंधों की जांच करने के लिए प्रोटीन की मात्रा का ठहराव डेटा का उपयोग करें।

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Representative Results

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चित्रा 1 में, प्रशिक्षण प्रोस्टेट ऊतकों पर खंड छवियों उपकला और stromal भागों में, गैर ऊतक डिब्बे के साथ किया जाता है। उपकला झिल्ली मार्कर ई cadherin का उपयोग करके, सेल विभाजन नाभिक, कोशिका द्रव्य, और झिल्ली भागों, चित्रा 2 में दिखाया अलग करने के लिए किया गया था।

एक प्रयोग में, हम मल्टिप्लेक्स आईएचसी इस्तेमाल के रूप में 3 चित्र में दिखाया गया है, अभिव्यक्ति और ए.आर., ERα, ई cadherin, और CD147 के स्थानीयकरण जांच करने के लिए। इन तकनीकों का उपयोग करते हुए, हम दोनों ERα और परमाणु अभिव्यक्ति के लिए सकारात्मक कोशिकाओं की पहचान करने में सक्षम हैं एआर (चित्रा 3 बी - 3 सी) वर्णमिति संकेतों ओवरलैपिंग के रूप में चित्रा 3 ए में हरी तीर के साथ दिखाया बावजूद। हम जनसंपर्क के विभिन्न राज्यों के भीतर डबल सकारात्मक stromal कोशिकाओं के अनुपात में उल्लेखनीय अंतर पाया गयाostate रोग (चित्रा 3 डी)। हम एक मार्कर प्रोटीन (चित्रा 3 ए में लाल तीर) के रूप में ई cadherin का उपयोग करके CD147 की कोशिका झिल्ली विशिष्ट अभिव्यक्ति की मात्रा निर्धारित की है, और हम प्रोस्टेट ऊतकों में झिल्ली विशिष्ट CD147 अभिव्यक्ति की जांच करने के पहले समूह के थे। हम एक महत्वपूर्ण प्रोस्टेट कैंसर की प्रगति (3E चित्रा) के सहयोग से CD147 अभिव्यक्ति में कमी पाया और शल्य चिकित्सा के बाद रोग का निदान 19 के साथ एक महत्वपूर्ण सहयोग मिला।

ऐसे कई उदाहरण हैं जहां गरीब प्रयोग डिजाइन गलत ऊतक विभाजन के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। चित्रा 4 में, एल्गोरिथ्म के ऊतकों का एक सेट करने के लिए आवेदन किया था सही खंड उपकला और stromal डिब्बों (चित्रा 4C) नहीं। इस प्रयोग में, α चिकनी पेशी actin (α-SMA) stromal डिब्बे चिह्नित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। Α-SMA और चिकनी मांसपेशियों में कमी आई है क्योंकि या खो कुछ ट्यूमर में (figu4 ए आरई), एल्गोरिथ्म ऊतक विभाजन (चित्रा 4 बी) के माध्यम से बनाया सही अकेले morphometric डेटा से उपकला और stromal डिब्बों के बीच अंतर करने में असमर्थ था। केयर जब ऊतक या सेल के डिब्बों के लिए प्रोटीन मार्कर चुनने लिया जाना चाहिए।

आकृति 1
चित्रा 1: ऊतक विभाजन multispectral इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग। एक प्रोस्टेट ऊतक माइक्रोएरे एण्ड्रोजन रिसेप्टर (ए आर), एस्ट्रोजन रिसेप्टर अल्फा (ERα), ई cadherin, और CD147 के लिए मल्टिप्लेक्स immunohistochemistry का उपयोग सना हुआ था। प्रशिक्षण छवियों का एक सेट multispectral इमेजिंग सॉफ्टवेयर प्रकार के ऊतकों और छवियों के पूरे सेट (ए) के रोग राज्यों का प्रतिनिधित्व करने में आयात किया गया। ऊतक श्रेणियों स्ट्रोमा (हरा), epithelia (लाल), और गैर ऊतक (नीला) सहित बनाया गया था, और श्रेणियों मैन्युअल रूप से शीर्ष पर ड्राइंग द्वारा परिभाषित किया गयाप्रशिक्षण की छवियों (बी)। प्रशिक्षण छवियों पर ड्राइंग के बाद, ऊतक विभाजन के लिए एक एल्गोरिथ्म बनाया है और छवियों (सी) के प्रशिक्षण सेट करने के लिए लागू किया गया था। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: परमाणु, cytoplasmic, और झिल्ली डिब्बों में सेल विभाजन। परमाणु डिब्बे hematoxylin counterstaining (ए) के लिए एक न्यूनतम सीमा की स्थापना करके सेल विभाजन के लिए परिभाषित किया गया था। कोशिका द्रव्य सॉफ्टवेयर (बी) के भीतर पूर्व निर्धारित एल्गोरिदम का उपयोग करके नाभिक के संबंध में परिभाषित किया गया था। ई cadherin एक झिल्ली मार्कर के रूप में इस्तेमाल किया गया था और एक न्यूनतम मतलब आयुध डिपो सीमा झिल्ली डिब्बे (सी) को परिभाषित करने के लिए लागू किया गया था। यह तकनीक सभीसभी subcellular डिब्बों (डी) में प्रोटीन अभिव्यक्ति का एक साथ quantitation OWS। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: सह स्थानीयकरण और झिल्ली विशिष्ट प्रोटीन अभिव्यक्ति का विश्लेषण। मल्टिप्लेक्स आईएचसी अभिव्यक्ति और एण्ड्रोजन रिसेप्टर (ए आर), एस्ट्रोजन रिसेप्टर अल्फा (ERα), ई cadherin, और CD147 (ए) के स्थानीयकरण जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। थपका (भूरे रंग वर्णकोत्पादक) एआर (बी) और एक लाल ERα (सी) चिह्नित करने के लिए इस्तेमाल किया वर्णकोत्पादक चिह्नित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। हम (एक में हरी तीर) ERα और एआर के परमाणु सह स्थानीयकरण के साथ कोशिकाओं के अनुपात में स्थानिक ओवरलैपिंग बायोमार्कर की पहचान करने और यों (डी) करने में सक्षम थेप्रोस्टेट स्ट्रोमा के भीतर। ई cadherin (काला वर्णकोत्पादक) का उपयोग प्लाज्मा झिल्ली (ए में लाल तीर) को परिभाषित करने के द्वारा, हम प्रोस्टेट ऊतकों (ई) 19 भीतर की झिल्ली CD147 विशिष्ट अभिव्यक्ति की मात्रा निर्धारित की। एक तरह से विचरण के विश्लेषण (एनोवा) सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया गया था, त्रुटि सलाखों के मतलब की मानक त्रुटि प्रतिबिंबित करती हैं, और तारों के पी <0.05 प्रतिनिधित्व करते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4: अपर्याप्त ऊतक विभाजन प्रायोगिक डिजाइन से उत्पन्न। , एण्ड्रोजन रिसेप्टर (लाल वर्णकोत्पादक), और एण्ड्रोजन रिसेप्टर संस्करण 7 (थपका वर्णकोत्पादक); सौम्य और घातक प्रोस्टेट ऊतकों α चिकनी पेशी actin (हरी वर्णकोत्पादक α-SMA) के लिए दाग रहे थे। अल्फा-SMA के रूप में इस्तेमाल किया गया थास्ट्रोमा के एक मार्कर और कुछ ट्यूमर में कमी आई है, प्रोस्टेट (ए) भी शामिल है। जब प्रशिक्षण प्रदर्शन किया गया था (बी) और ऊतक विभाजन एल्गोरिथ्म लागू किया गया था, stromal और उपकला डिब्बों α-SMA धुंधला (सी) के अभाव के कारण अपर्याप्त खंडों थे। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

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प्रोटीन अभिव्यक्ति के मूल्यांकन के लिए पारंपरिक immunohistochemistry का उपयोग व्यक्तिपरक, विश्लेषण 22,23 के अर्द्ध मात्रात्मक तरीकों द्वारा सीमित है। एडवांस प्लेटफार्मों बायोमार्कर अभिव्यक्ति और स्थानीयकरण के उच्च throughput विश्लेषण के लिए बनाया गया है। दोनों ऊतक और subcellular डिब्बों की विस्तृत विभाजन उन हित के अन्य मार्कर के साथ बायोमार्कर अभिव्यक्ति, स्थानीयकरण, और सह स्थानीयकरण अध्ययन करने के लिए अनुमति देता है। पिछले अध्ययनों में, हम आईएचसी और multispectral इमेजिंग, विशेष रूप से जब एक ही सेलुलर डिब्बे 18,20,21 के लिए स्थानीय प्रोटीन का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल की उपयोगिता का प्रदर्शन किया है। जब ऊतक 24 के साथ संयुक्त, इन तकनीकों प्रोटीन अभिव्यक्ति की तेजी से और अधिक उद्देश्य quantitation के लिए अनुमति देने के एक पैथोलॉजिस्ट ने मैनुअल विश्लेषण द्वारा अनुमति से।

प्रोटीन quantitation के लिए immunohistochemistry के उपयोग के साथ एक मुद्दा subjec के कारण परिणामों के irreproducibility हैविश्लेषण और तकनीक और अभिकर्मकों में निहित मतभेद के सक्रिय प्रकृति। प्रोटीन अभिव्यक्ति को मापने के लिए multispectral इमेजिंग तरह प्लेटफार्मों का उपयोग करने का एक महत्वपूर्ण लाभ परिणामों के reproducibility है। कम्प्यूटरीकृत विकृति प्लेटफार्मों से डाटा एक पैथोलॉजिस्ट ने मैनुअल विश्लेषण के साथ अत्यधिक सहसंबंधी जबकि एक सतत स्वरूप में डेटा लौट रहे हैं और काफी हद तक काम के समय को कम करने, विशेष रूप से जब बड़ा नमूना आकार के साथ काम कर 12,16,25। अध्ययनों से अलग multispectral प्लेटफार्मों के बीच 14 परिणामों में उच्च समग्र क़बूल दिखाया है। इसके अलावा, हम पहले से दिखा दिया है कि धुंधला परिणाम बेहद प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य हैं जब भी वहाँ है परिवर्तनशीलता में प्रोटीन की संख्या की जांच 12। दोनों धुंधला और विश्लेषण के लिए स्वचालित विकृति प्लेटफार्मों का उपयोग इस तरह के अलग अलग epitopes की ओर बनाया एंटीबॉडी से उत्पन्न उन के रूप में परिणाम है, में सभी विसंगतियों को समाप्त नहीं होगा, लेकिन इन प्लेटफार्मों पूर्वाग्रह और आईआर को कम करने में काफी हैंreproducibility सामान्यतः immunohistochemistry के साथ जुड़े।

प्रोटोकॉल के भीतर विशेष कदम है कि सही, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम देने के लिए आवश्यक हैं। ऊतक या subcellular मार्कर के रूप में सही विभाजन के लिए महत्वपूर्ण है प्रोटीन के चयन के माध्यम से उचित प्रयोगात्मक डिजाइन शामिल किया जाना है। जब सकारात्मकता विश्लेषण प्रदर्शन, सकारात्मक धुंधला के लिए एक कम सीमा के चयन के अंतिम परिणाम पर एक बड़ा प्रभाव पड़ता है। देर के लिए एक सीमा के चयन में इस तरह के परमाणु प्रतिलेखन कारक के रूप में प्रोटीन "/ बंद पर" अधिक विभिन्नतापूर्वक व्यक्त प्रोटीन के लिए एक सीमा मुश्किल है खोजने, बल्कि सीधा है। यह आदर्श एक बोर्ड द्वारा प्रमाणित genitourinary रोगविज्ञानी के साथ या कई पर्यवेक्षकों भर में एक औसत स्कोर को विश्लेषण के लिए आदर्श दहलीज को खोजने के रूप में सहयोग से किया जाना चाहिए।

यह इस प्रौद्योगिकी के वर्तमान संस्करण की कुछ सीमाएं पहचान करने के लिए महत्वपूर्ण है। जब deकोशिका द्रव्य डिब्बे fining, तीन तरीकों का इस्तेमाल किया जा सकता है: (1), एक कोशिका द्रव्य विशिष्ट मार्कर के साथ धुंधला हो जाना एक झिल्ली विशिष्ट मार्कर के साथ (2) धुंधला हो जाना और नाभिक करने वाली झिल्ली कोशिका द्रव्य के रूप में मार्कर दूरी का उपयोग कर, और (3) का उपयोग एक ड्राइंग दृष्टिकोण मैन्युअल नाभिक के संबंध में कोशिका द्रव्य की सीमाओं को परिभाषित करने के लिए। हमारे अनुभव से, एक झिल्ली विशिष्ट मार्कर का उपयोग सबसे सटीक तकनीक है। मैनुअल ड्राइंग दृष्टिकोण सामान्य रूप से सटीक यदि नाभिक केन्द्र स्थित हैं या ब्याज की बायोमार्कर समान रूप से कोशिका द्रव्य भर में वितरित किया जाता है, तो है। सही fibroblasts और चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं की तरह stromal कोशिकाओं की कोशिका द्रव्य को परिभाषित मुश्किल बनी हुई है और जब एक प्रयोग डिजाइन को ध्यान में रखा जाना चाहिए।

प्रौद्योगिकी की एक और सीमा सेल विभाजन के लिए नाभिक पर निर्भरता है। खंड के विमान एक विशेष सेल के नाभिक शामिल नहीं हैं, तो इस सेल विश्लेषण में शामिल नहीं किया जाएगा। अगर वहाँ कोई नहीं हैआसन्न नाभिक या नाभिक के झुरमुटों के बीच दिखाई दे कोशिका द्रव्य, ये अक्सर एक बड़े परमाणु गांठ के रूप में, बल्कि अलग नाभिक से पहचाने जाते हैं। सामान्यतया, hematoxylin counterstain ऐसे नाभिक आकार परमाणु विभाजन के साथ सबसे अधिक मुद्दों को ठीक कर सकते हैं के लिए अधिकतम सीमा के रूप में सामान्य रूप से स्वीकार्य परमाणु विखंडन, और सॉफ्टवेयर सेटिंग्स के हेरफेर के लिए पर्याप्त है।

स्वचालित विकृति प्लेटफार्मों की एक अंतिम सीमा गरीब प्रयोगात्मक डिजाइन से उत्पन्न ऊतकों की अविश्वसनीय विभाजन है। ब्याज के सवाल का जवाब के लिए उचित ऊतक और सेल बायोमार्कर चुनने के महत्व को अतिरंजित नहीं किया जा सकता है। हम हमारे प्रतिनिधि परिणामों में प्रदर्शन के रूप में, एक उपकला या stromal मार्कर उल्लेखनीय है कि रोग राज्यों के बीच अभिव्यक्ति में परिवर्तन समस्या पैदा ऊतक विभाजन के लिए एक एल्गोरिथ्म बनाते समय कर सकते हैं। यह ध्यान देने योग्य है कि वहाँ वैकल्पिक विकल्प हैं, जब मुश्किल की तरह इस उठता विश्लेषण करती हैं कि लायक है। उदाहरण के लिए, अलग-अलग imagतों मैन्युअल बजाय छवियों का एक प्रशिक्षण सेट से एक एल्गोरिथ्म को लागू करने से से सभी ऊतक डिब्बों ड्राइंग, द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है। इस विभाजन का लाभ यह है कि पूरी तरह से क्या उपयोगकर्ता इच्छाओं के साथ लाइन में प्रदान करता है, लेकिन यह भी आत्मीयता का परिचय और काफी समय एक विश्लेषण खत्म करने के लिए आवश्यक बढ़ा सकते हैं। उचित प्रयोगात्मक डिजाइन विश्लेषण में तेजी लाने और ऊतक और सेल विभाजन की सटीकता को अधिकतम करने के लिए सबसे आसान तरीका है।

यह तकनीक और प्रोटोकॉल कई भविष्य आवेदन किया है। विशेष रोग राज्यों के लिए कई बायोमार्कर की पहचान की गई है, लेकिन पुष्टि नहीं। multispectral प्लेटफार्म के साथ उच्च throughput उद्देश्य विश्लेषण इन बायोमार्कर के सत्यापन की सुविधा। इसके अलावा, अभिव्यक्ति और कई प्रोटीन के सह स्थानीयकरण के मूल्यांकन खराब समझ में आ संकेत दे रास्ते में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं। निस्संदेह, निहित प्रतिरक्षाऊतकरसायन staini के विश्लेषण के साथ जुड़े आत्मीयता को कम करनेएनजी अभिव्यक्ति और प्रोटीन मार्कर की एक विस्तृत श्रृंखला के स्थानीयकरण को समझने के लिए मूल्यवान है।

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Disclosures

लेखकों घोषणा की कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि।

Acknowledgments

लेखकों, पैथोलॉजी प्रयोगशाला में विस्कॉन्सिन ट्रांसलेशनल अनुसंधान पहल विश्वविद्यालय धन्यवाद हिस्सा पैथोलॉजी प्रयोगशाला और दवा के UW विभाग द्वारा समर्थित और UWCCC अनुदान P30 CA014520 में अपनी सुविधाओं और सेवाओं के उपयोग के लिए।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Xylene Fisher Chemical X3F1GAL NFPA rating: Health – 2, Fire – 3 , Reactivity – 0
Ethyl Alcohol-200 proof Fisher Scientific 4355223 NFPA rating: Health – 0, Fire – 3 , Reactivity – 0
Tris Base Fisher Scientific BP152-500 NFPA rating: Health – 2, Fire – 0 , Reactivity – 0
Tris Hydroxymethyl aminomethane HCl Fisher Scientific BP153-1 NFPA rating: Health – 2, Fire – 0 , Reactivity – 0
Tween 20 Chem-Impex 1512 NFPA rating: Health – 0, Fire – 1 , Reactivity – 0
Phosphate-buffered saline Fisher Scientific BP2944-100 NFPA rating: Health – 1, Fire – 0 , Reactivity – 0
Peroxidazed Biocare Medical PX968 Avoid contact with skin and eyes. May cause skin irritation and eye damage.
Estrogen Receptor alpha Thermo Fisher Scientific-Labvision RM9101 Not classified as hazardous
Androgen Receptor SCBT sc-816 Not classified as hazardous
CD147 Biodesign P87535M Not classified as hazardous
E-cadherin Dako M3612 Not classified as hazardous
Renoir Red Andibody Diluent Biocare Medical PD904 It is specially designed to work with Tris-based antibodies
DeCloaking Chamber  Biocare Medical Model DC2002 Take normal precautions for using a pressure cooker
Barrier pen-Immuno Edge  Vector Labs H-4000
Denaturing Kit-Elution step Biocare Medical DNS001H Not classified as hazardous
Mach 2 Goat anti-Rabbit HRP Polymer Biocare Medical RHRP520 Not classified as hazardous
Mach 2 Goat anti-Rabbit AP Polymer Biocare Medical RALP525 Not classified as hazardous
Mach 2 Goat anti-Mouse HRP Polymer Biocare Medical M3M530 Not classified as hazardous
Betazoid DAB Chromogen Kit Biocare Medical BDB2004 1. DAB is known to be a suspected carcinogen.
2. Do not expose DAB components to strong light or direct sunlight.
3. Wear appropriate personal protective equipment and clothing.
4. DAB may cause sensitization of skin. Avoid contact with skin and eyes.
5. Observe all federal, state and local environmental regarding disposal
Warp Red Chromogen Kit Biocare Medical WR806 Corrosive. Acid that may cause skin irritation or eye damage. 
Vina Green Chromogen Kit Biocare Medical BRR807 Harmful if swallowed
Bajoran Purple Chromogen Kit Biocare Medical BJP807 Flammable liquid. Keep away from heat, flames and sparks. Harmful by ingestion or absorption. Avoid contact with skin or eyes, and avoid inhalation.
Cat Hematoxylin Biocare Medical CATHE Purple  solution  with  a  mild  acetic  acid  (vinegar)  scent.  May  be
 irritating  to  skin  or  eyes.  Avoid  contact  with  skin  and  eyes.  Avoid  ingestion.
XYL Mounting Media Richard Allen 8312-4 NFPA rating: Health – 2, Fire – 3 , Reactivity – 0
1.5 Coverslips Fisher Brand 22266858 Sharp edges
Incubation (Humidity)Chamber obsolete obsolete Multiple vendors available
Convection Oven Stabil- Therm C-4008-Q
Background Punisher Blocking Reagent Biocare Medical BP974 This product is not classified as hazardous. 
inForm software PerkinElmer CLS135781 Primary multispectral imaging software used in manuscript
Nuance software PerkinElmer Nuance EX Software used for making spectral libraries within manuscript
Vectra microscope and slide scanner PerkinElmer VECTRA Automated slide scanner and microscope for obtaining IM3 image cubes

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प्रोटीन अभिव्यक्ति और सह स्थानीयकरण मल्टिप्लेक्स इम्यूनो-histochemical धुंधला और multispectral इमेजिंग का उपयोग के quantitation
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Bauman, T. M., Ricke, E. A., Drew, S. A., Huang, W., Ricke, W. A. Quantitation of Protein Expression and Co-localization Using Multiplexed Immuno-histochemical Staining and Multispectral Imaging. J. Vis. Exp. (110), e53837, doi:10.3791/53837 (2016).More

Bauman, T. M., Ricke, E. A., Drew, S. A., Huang, W., Ricke, W. A. Quantitation of Protein Expression and Co-localization Using Multiplexed Immuno-histochemical Staining and Multispectral Imaging. J. Vis. Exp. (110), e53837, doi:10.3791/53837 (2016).

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