Introduction
Иммуногистохимия (IHC) является стандартным методом лаборатории для обнаружения белка в ткани, и IHC до сих пор широко используется в обоих исследованиях и диагностике патологий. Оценка IHC окрашивания часто полуколичественный, представляя потенциальную систематическую ошибку в интерпретации результатов. Многие Полуколичественные подходы были разработаны , которые включают как интенсивность окрашивания и окрашивания степени в окончательный диагноз 1-4. Другие системы включают балльной интенсивности и субклеточном положение для того , чтобы лучше локализовать выражение 5. Включение средних баллов из нескольких зрителей часто используется для того , чтобы свести к минимуму влияние единого зрителя смещения 6. Несмотря на эти усилия, субъективность в анализе до сих пор остается, в частности , при оценке степени окрашивания 7. стандартизации протокола и сведение к минимуму субъективность от человеческого фактора имеет первостепенное значение для создания точных и воспроизводимых результатов IHC.
Содержание "> Есть и другие варианты , кроме IHC для определения экспрессии белка в тканях. В условиях исследования, иммуногистохимии традиционно рассматривается как средство для изучения локализации белка 8, в то время как другие методы , такие как иммуноблоттинга рассматриваются как золотой стандарт для исследования экспрессии белка . Определение ткани или экспрессии компартмент клетки конкретных трудно без включающее в себя передовые методы , такие как фракционирования клеток или лазерной захвата микродиссекции 9,10. использование флуоресцентных антител на слайдах ткани предлагает разумный компромисс, но фон аутофлуоресценция из - за NADPH, lipofuscins, ретикулярная волокна, коллаген, эластин и может сделать точные количественное трудно 11.Автоматизированная вычислительная патология платформы являются перспективным направлением для более объективной количественной оценки патологии окрашивания 12-15. Сочетание мультиспектральных изображений с микрочипов тканиспособствует высокой пропускной анализ экспрессии белка в больших размерах выборки. С помощью этих методов, анализ белка совместной локализации, окрашивая гетерогенности и ткани и внутриклеточной локализации возможно при существенном снижении как неотъемлемые уклоны и время , необходимое для анализа, при возвращении данных в непрерывном , а не категорическим формате 16. Таким образом, цель данного исследования состояла в том, чтобы продемонстрировать полезность и методологии для выполнения мультиплексированный иммуногистохимии с анализом, с использованием мультиспектральных изображений программного обеспечения.
Этот протокол написан для ручного, мультиплекс иммуногистохимического окрашивания одной секции ткани слайде с четырьмя оптимизированными моноклональных антител. В качестве показательного эксперимента, ядерный анти-кроличий альфа-рецептора эстрогена (ERα) и рецептор андрогена (AR) мультиплексируются с мембраной анти-мышиного CD147 и мембраносвязанного анти-мышиного Е-кадгерина. Любое антитело выбора может быть substitutе изд антител, перечисленных в данном описании, но каждая комбинация антител требует отдельной оптимизации. Предварительная обработка для всех антител, должны быть идентичными. АР и CD147 антитела должны быть оптимизированы индивидуально, а затем в виде коктейля. Каждое антитело обнаруживают с использованием биотин-свободной полимерной системы, и один из 4-х уникальных хромогенами.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Примечание: Протокол здесь , описывает окрашивание и анализ микрочипов ткани (TMA), описанный ранее 12,17,18. Толстая секция ТМА 4 мкм, была получена из парафинового блока с использованием стандартного микротом.
Примечание: Спектральный библиотека для 4 хромогенами и контрастирующая должны быть созданы для количественной оценки изображения. Для того чтобы сделать это, оптимизированный протокол для каждого отдельного антитела должны работать с одним антителом на слайд, за вычетом окончательной контрастирующая. Пятый слайд должен быть окрашивали гематоксилином, чтобы генерировать 5 изображений, необходимых для создания спектральной библиотеки.
1. Мультиплекс Immunohistochemistry
- Выпечка скользит в печи 60 ° С в течение 20 мин. Использование химического вытяжку, погрузите слайд в 100% ксилола. Повторите эти действия для 2 смены ксилола. Погрузите слайд в 100% этаноле в течение 5 мин. Повторите со свежим 100% -ным этанолом.
- Погрузите слайд в 95% этаноле в течение 3 мин. Повторите со свежими95% -ного этилового спирта. Погрузите слайд в 70% этаноле в течение 3 мин. Погрузите слайд в дистиллированной воде в течение 3 мин. Повторите со свежей дистиллированной водой. Нажмите слайд вертикально, чтобы слить воду из слайда. Применить 200 мкл готового к употреблению эндогенной пероксидазы блокирующим в течение 5 мин.
- Слив пероксидазной блокиратор от ползуна и погружают в 45 мл готового к использованию буфера извлечения (рН менее 7,0). Место слайд-контейнер в скороварке и начать программу установить до 124 ° С в течение 4 мин. Дайте скороварке остыть в течение 20 мин. перед открытием.
- Удалить контейнер поиска информации буфера и дайте ему остыть еще 10 мин. Промыть слайд в дистиллированной воде в течение 10 мин. Слить воду из ползуна и тщательно разграничить ткани на слайде с гидрофобным барьерного ручкой.
- Добавьте 200 мкл фосфатно-солевого буферного раствора (PBS) .Transfer горкой на плоскую емкость с крышкой (инкубационной камере), содержащей влажную марлю.
- Готовят 1 л 1x Трис-солевой буферный раствор с Tween-20 (TBST), путем разбавления 50 мл 20х Трис-солевой буферный раствор, содержащий 1% Tween-20 и 950 мл дистиллированной воды.
- Слить PBS с горкой и применять 200 мкл 1x TBST. Выдержите 2 мин. Слить TBST из слайдов и возврата слайд в инкубационной камере. Применить 200 мкл готового к употреблению блок универсального белка, близкой камере и инкубировать в течение 7 мин.
- Дренажный блок белка и вернуть слайд в инкубационной камере. Развести анти-ERα антитела 1: 400 путем добавления 0,6 мкл антител к 239,4 мкл разбавителя антител. Применить 200 мкл разведенного антитела к скользят и тесной камере.
- Инкубировать слайд при комнатной температуре в течение 2-х часов. Слив антитела из ползуна и полоскание с TBST с последующим погружением на 5 минут в TBST.
- Слить TBST из слайдов и возврата слайд в инкубационной камере. Применить 200 мкл готового к употреблению козы против кролика пероксидазы полимера и тесной камере. Инкубировать в течение 30 мин. при комнатной температуре. Полоскание слайд с TBST и место слайда в контейнер TBST в течение 5 мин. </ Li>
- Приготовьте коричневый пероксидаза хрена-3,3'-диаминобензидина (HRP-DAB) хромогена путем добавления 8 мкл хромогена DAB в 250 мкл буфера для субстрата ДАБ и хорошо перемешивая.
- Слить TBST из слайда, обратного слайда к инкубационной камере и применять 200 мкл коричневого хромогена HRP-DAB в течение 6 мин. Тщательно промойте слайд дистиллированной водой и поместите горкой в сосуд с дистиллированной водой.
- Смешайте денатурирующего раствора путем объединения 50 мкл первого элюирования реагента 150 мкл второго реактива буфера. Слить воду с горкой и применять разбавленный раствор денатурации к слайду в течение 3 мин. при комнатной температуре. Слейте и промойте денатурирующих реагента с TBST. Погрузите слайд в TBST в течение 5 мин.
- Готовят AR / CD147 антитела коктейль разбавлением 4,2 мкл анти-AR антитела и 2,8 мкл анти-CD147 антитела с 203 мкл разбавителя антитела. Слить TBST из слайда, вернуть слайд в инкубационной камере и применять 200 мкл AR / CD147 Cocktail к слайду. Закрыть камера и инкубировать в течение 1 часа при комнатной температуре. Полоскание слайд с TBST и погружают в TBST в течение 5 мин.
- Слить TBST, обратный сползания к инкубационной камере и применять 200 мкл готового к употреблению козы против кролика щелочной фосфатазы полимера. Закрыть камеру и инкубировать слайд в течение 30 мин. при комнатной температуре. Полоскание слайд с TBST и погружают в TBST в течение 5 мин.
- Подготовить красный щелочной фосфатазы хромогена путем добавления 3,2 мкл красного хромогена до 250 мкл красного хромогена буфера и хорошо перемешать.
- Слить TBST из слайдов и возврата слайд в инкубационной камере. Применить 200 мкл разбавленного красного хромогена щелочной фосфатазы в слайд, близкой камере и инкубировать в течение 7 мин.
- Слить хромогена и тщательно промойте слайд дистиллированной водой. Поместите слайд в сосуд с дистиллированной водой в течение 5 мин. Слить воду из слайда, промыть TBST и вернуться к инкубационной камере. Применить 200 мкл козьего антитела против мышиных-HRP полимера к слайду и Клосаэлектронной камеры. Инкубировать в течение 30 мин. при комнатной температуре.
- Слить полимера из слайда и смыть TBST. Поместите слайд в TBST в течение 5 мин. Подготовьте 200 мкл HRP-фиолетовой связаны хромогена добавлением 3,2 мкл стабилизирующего реагента к 250 мкл буфера и хорошо перемешать. Добавить 3,2 мкл фиолетовый хромогена и хорошо перемешать, затем 3,2 мкл реагента пероксида водорода и хорошо перемешать.
- Слить TBST от слайда и применить 200 мкл приготовленного фиолетового хромогена, чтобы скользить и инкубировать в течение 7 мин. при комнатной температуре. Полоскание слайд с дистиллированной водой и поместите горкой в сосуд с дистиллированной водой в течение 5 мин.
- Смешайте денатурирующего раствора путем смешивания 50 мкл первого элюирования реагента 150 мкл второго реактива буфера. Слить воду с горкой и применять разбавленный раствор денатурации к слайду в течение 3 мин. при комнатной температуре.
- Полоскание денатурирующих реагент прочь с TBST. Поместите слайд в контейнер TBST в течение 5 мин. Развести анти-Е-кадгерин антителдо 1: 200 путем добавления 1,1 мкл антитела к 218,9 мкл разбавителя антитела. Слить TBST с горкой, обратного слайда к инкубационной камере и применять 200 мкл Е-кадгерина к слайду. Закрыть камеру и инкубировать 30 мин. при комнатной температуре.
- Полоскание слайд с TBST и место слайда в контейнер TBST в течение 5 мин. Слить TBST из слайда, возвращают слайд в инкубационной камере и применять 200 мкл козьего против мышиного HRP полимера. Инкубируют при комнатной температуре в течение 30 мин. Полоскание слайд с TBST и место слайда в контейнер TBST в течение 5 мин.
- Подготовьте черный HRP-связанный хромоген добавлением 8 мкл хромогена 250 мкл буфера. Применить 200 мкл хромогена, чтобы скользить и развиваться в течение 2 мин. Тщательно промойте слайд дистиллированной водой и погружают в сосуд с дистиллированной водой.
- Развести гематоксилин путем добавления 40 мкл гематоксилином в 200 мкл дистиллированной воды. Слить воду из слайде и применять 200 мкл разведенной гематоксилином скользить в течение 30 секунд. Полоскание слайдтщательно проточной водопроводной водой в течение 2 мин., а затем промыть в дистиллированной воде в течение 30 секунд. Поместите слайд в печи C 60 ° в течение 15-30 мин.
- Погрузите слайд в свежеприготовленного 100% ксилола в течение 30 секунд, вытрите избыток ксилола от и добавить одну каплю постоянных монтажных средств массовой информации. Покровное с п 1.5 покровное.
2. Автоматическое Получение изображения и анализ
- Загрузите запятнанные слайды на автоматизированный сканер слайдов. На основе диаметра, разделения и количества ядер ТМА, создать автоматизированный протокол сканирования согласно инструкции по эксплуатации завода-изготовителя.
- Открытое программное обеспечение мультиспектральных изображений для построения спектральной библиотеки из контрольных слайдов, окрашенных с отдельными хромогенами и гематоксилин окрашивали слайд. Открыть куб изображение, полученное с помощью ползунка и выбрать четыре-пять положительно окрашенных областей, чтобы определить, что оптически хромогена. Повторите с изображением кубиков из других слайдах управления до полной спектральной библиотеки representiнг все хромогены создается, а затем сохранить спектральную библиотеку.
- Начните новый проект в рамках мультиспектральных ПО для обработки изображений. Выберите "мультиспектральных (.im3)" для опции формата изображения и "Светлое" для формата образца. Во-первых, настроить проект, выбрав нужные параметры: "Сегмент ткань", "Найти функций", "фенотипа", "Оценка" и "Экспорт". На данный момент, разрешение изображения может быть изменено, чтобы ускорить время проведения анализа, при желании.
3. Ткань Сегментация
- Импорт ранее созданную спектральную библиотеку и выбрать все хромогены, которые будут включены в анализ.
- Открытые кубы изображения, которые будут включены в учебные набора данных, выбрав опцию "Открыть куб изображения". Для обеспечения точности обучения, выбрать по крайней мере 18% от общего количества изображений, которые будут проанализированы. Выберите изображения, которые представляют все болезненные состояния, чтобы повысить точность сегментации. Эта часть изображений яs называется тренировочный набор изображений.
- Белые изображения баланс в обучающей выборки, выбрав инструмент Пипетка и выбрать область в одном изображении, что белый.
- Выберите кнопку "Advance" для перехода к сегментации ткани. Используйте "Tissue Категории" панели , чтобы выбрать типы тканей для анализа (т.е. "ткань" и "не-ткань"). Для более точного локализации белка ткани, множественные категории ткани могут быть использованы (например. "Эпителий", "строма" и "не-ткань").
- Начните создание алгоритма и определения категорий ткани, нарисовав вокруг группы ячеек в тренировочных образов. Закончив с одной категории ткани, повторяют для других категорий ткани. Не забудьте выбрать группы ячеек в пределах изображений, характерных для данного типа ткани категории.
- Повторите эту процедуру для всех изображений в рамках тренировочного набора изображений.
- Выбор компонентов (Хромогены), которые будут включены в Traiнин для "Tissue Сегментер". При выполнении анализа изображений иммуногистохимических светлого, все компоненты, как правило, включены в обучение. Включите обильные отрицательные образы окрашивания в обучающей выборки, чтобы избежать предвзятости во время этого шага.
- Выберите подходящий шаблон "Масштаб" для тренировки Сегментер ткани. Под 20X увеличении, большая картина масштаба, как правило, необходимо. При работе с тканями с прекрасной архитектурой под большим увеличением, меньший масштаб модели является более целесообразным.
- Нажмите кнопку "Поезд Tissue Сегментер", чтобы начать обучение Сегментер ткани. Обратите внимание на всплывающее окно, отображающее точность, отражающий долю пикселей в учебных регионах, которые должным образом классифицированы.
Примечание: Программное обеспечение постоянно пытается улучшить точность алгоритма, пока вручную не будет остановлено. Ранее мы показали , что обучение на 18% изображений приводит к 97% точности учебной 12. После того, как Сегментер ткани обучен, выбрать соответствующее разрешение сегмента. Разрешение по сегментам соответствует времени, необходимому для изображений сегмента с низкой разрешающей способностью, требующей меньше времени и высокое разрешение, требующее больше времени. - Сегмент весь учебный набор изображений, нажав кнопку "Сегмент изображения". Разрешить программное обеспечение достаточно времени, чтобы применить алгоритм для всех тренировочных образов. По завершении обзора обучающей выборки, чтобы найти какой-либо неправильно классифицирован ткани с текущим алгоритмом обучения.
- Для точной настройки процесса сегментации ткани, добавлять, редактировать или удалять ткани учебные регионы. Используйте опцию "Trim края", если пиксели распространяются по краям одной категории ткани в другую. Если небольшие группы пикселов неправильно классифицирован, отрегулируйте порог по минимальному размеру сегмента.
- Когда редактирование завершены, выберите "Сегмент изображения", это будет повторно обучить Сегментер ткани, чтобы создать новый алгоритм сегментации ткани. Предыдущий алгоритмавтоматически сохраняется и может быть возвращен при необходимости.
- Когда уверенно с результатами сегментации ткани алгоритма, перейти к сегментации ячейки, выбрав кнопку "Advance".
4. Сегментация Cell
- Выберите субклеточных отсеков, которые будут включены в сегментации клеток. Убедитесь в том, что "Ядра" уже выбран, чтобы выбрать "цитоплазмы" или "мембрана".
Примечание: сегментация "Мембрана" следует выбирать только тогда, когда мембрана-специфический белок маркер был включен в IHC, такие как E-кадгерина. - На вкладке "ядра", есть несколько вариантов. Начните с выбора соответствующих настроек для ядерной сегментации (см шаг 4.3). Выберите, будет ли включать отдельные или все категории ткани в сегментации.
- Выберите подход к ядерной сегментации
- Выберите "контрастное основе пикселей (Threshold)" подход для упрощенного способа получения хорошоРезультаты не зная много о параметрах обработки изображений.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это часто делает хороший первый выбор. При выборе подхода, "Pixel-Based (Threshold)" является более подходящим, когда есть надежный ядерный счетчик-пятно, в то время как "объектно-ориентированный" следует использовать, если есть отсутствие последовательной ядерной контрастирующая. - Выберите "пиксельный метод (Threshold)" подход, когда есть надежный ядерный контрастирующая.
Примечание: Этот подход является чисто на основе пикселей. Такой подход может также использоваться для других целей анализа изображений, которые могут быть удовлетворены с помощью простого порогового значения, например, обнаруживать все пиксели в пределах категории ткани, окрашивать положительным для окрашивания IHC. - Выберите подход объектно-ориентированный, если ядерная контрастирующая не обеспечивает последовательное и специфическое окрашивание ядерных объектов, а также более продвинутые подходы морфометрия на основе необходимы для обнаружения ядер.
- Выберите "Компоненты для ядерных Сегментация", "Nuclуха Размер "и" Очистка ", если пользователь желает дальнейшего определения ядер параметров сегментации.
- Выберите "контрастное основе пикселей (Threshold)" подход для упрощенного способа получения хорошоРезультаты не зная много о параметрах обработки изображений.
- Выберите цитоплазме параметры формы
- Нажмите кнопку "Advance", чтобы перейти к цитоплазме сегментации.
Примечание: Есть несколько вариантов сегментации в пределах цитоплазмы на выбор. Опция называется «внутреннее расстояние до ядра" пиксель на основе. Это отражает расстояние между внешней стороны ядра и внутренней части цитоплазмы. Увеличение этого значения уменьшает вероятность того, что ядерный сигнал пересекает в цитоплазму отсек. - Далее выберите "внешнее расстояние до ядра".
Примечание: Это также пикселя на основе. Внешнее расстояние до ядра отражает расстояние между внешней стороны ядра и внешней стороне клетки. Это значение может быть установлено большим или достаточно мал, чтобы включить или исключить мембранные сигналы при желании. - Далее выберите "минимальный размер".
Примечание: Минимальный размер, PIXEл на основе, отражает минимальный размер цитоплазма выборки должны быть включены в анализ. Если размер цитоплазма меньше в конкретной клетке, например, когда клетки плотно упакованы вместе, сегментация цитоплазма исключен из анализа. - Выберите следующий параметр, "компонент" с "Primary", "Secondary", и выберите "третичном" в качестве вторичных вариантов.
Примечание: Здесь можно выбрать конкретный цитоплазмы маркер. Подобно ядерной сегментации, если был использован специфический цитоплазматический ВВК маркер, этот компонент может быть использован для определения цитоплазму путем нахождения минимального порогового значения. Это помогает в определении цитоплазму, но не является необходимым для приемлемой точностью. - Переход к последней из трех вкладках опций "Мембрана". Здесь, пользователь определяет мембранный отсек с протеином маркером. Выберите "Primary", "Secondary", и / или "третичный" для каждого мембранного специфического маркера, используемого. Adjust "Full Scale OD ", чтобы найти минимальный порог или положительный для каждого маркера на клеточные мембраны.
- Продолжение на вкладке "пленочного" и выберите опцию "Максимальный размер ячейки".
Примечание: Это расстояние до значения мембраны, в пикселях, которая определяет максимальный размер ячеек. Значение 12, как правило, подходит для снимков, сделанных при увеличении 20Х. - После выбора всех параметров выберите "Сегмент изображения" или "Сегмент всех". Применить настройки к изображениям и наблюдать их «по отдельности» или в режиме "Галерея".
Примечание: Настройка параметров и пороговых значений, при необходимости, и повторно сегмент до удовлетворен результатами сегментации клеток в обучающем наборе изображений.
- Нажмите кнопку "Advance", чтобы перейти к цитоплазме сегментации.
5. Фенотипирование клеток
Примечание: Точная сегментации клеток требуется для того, чтобы получить точные ячейки фенотипирования, а функция Фенотипирование обучаемостью.
- Используйте кнопку "Добавить &# 34; Кнопка для добавления фенотипы в список "фенотипов". Пользователи могут выбрать цвет для фенотипа.
- Нажмите на кнопку "Редактировать" фенотипов назначить фенотип клетки. Нажмите на конкретную ячейку, чтобы вызвать выпадающее меню, что позволяет пользователю выбрать фенотип, а затем двигаться дальше. Определить по крайней мере, пять (5) клеток в каждом фенотипа, чтобы продолжить. Выбор 25 или более клеток каждого фенотипа необходима для достижения оптимальных результатов.
6. Подсчет очков IHC и совместной локализации
- Выберите "Advance" для перехода к "Счет IHC или IF" шаг. Выберите "Tissue Категория", чтобы забить.
Примечание: только одна категория ткани может быть засчитан в течение конкретного анализа, но если результаты скоринга в другую категорию ткани желательно, анализ можно повторить позже с различными настройками. - Выберите нужный тип "Scoring".
Примечание: Позитивность создает два бункера (положительные и отрицательные) для компонента интереса, В то время как двойной положительность используется для анализа совместной локализации. Другие варианты включают 4-бен, 10-бен, и 50-бен анализы для маркера выбора. - Выберите ячейку "купе", который будет использоваться в выигрыше анализа.
- Аналогично найти минимальный порог для первичного ядерного компонента выберите "View Component Data" и переместить курсор на тренировочных образов, чтобы найти соответствующие оптическую плотность минимальные пороги окрашивания для положительных клеток для компонента (ов), представляющие интерес.
- Если интенсивно окрашенные клетки должны быть исключены, снизить порог макс до соответствующего уровня. В противном случае, используйте кнопку автоматического выбора порогового максимума для анализа.
- Выберите тренировки изображения, чтобы набрать для того, чтобы подтвердить значения пороговых значений.
Примечание: Процент клеток в пределах конкретного бункера будут возвращены и их можно сравнить с помощью визуального осмотра или ручного подсчета. После завершения выберите "Advance", чтобы перейти к шагу "Экспорт".
- Тестирование алгоритма сегментации, созданный с помощью ткани, сегментации клеток и значений скоринговых путем экспорта данных для обучающей выборки. Следуйте инструкциям, чтобы создать новую папку для каталога экспорта. Выберите изображения и таблицы, которые будут созданы и включены в анализ. Выполните анализ, выбрав "Экспорт для всех».
- Таблицы экспортируются в закладке разделенных текстовых файлов и могут быть открыты в большинстве программ анализа данных.
- Когда анализ завершен, вид сегментации клеток и скоринга данных для изображений с высокой и низкой окрашивания для оценки точности настройки.
- Когда удовлетворены настройками, применить алгоритм, созданный из тренировочного набора изображений для всего набора изображений с помощью пакетного анализа. Нажмите на вкладку "Пакетный анализ" и открыт алгоритм будет скопирован из активного проекта.
- Выберите новый каталог для экспорта и выбрать изображения и TABLES должны быть включены в анализ. Под опцией входных файлов, выберите "Добавить изображения" и выберите все изображения, которые будут включены в пакетном анализе.
- Проведение анализа, выбрав опцию "Выполнить". Как и в случае анализа обучающей выборки, то этот шаг будет требовать различное время, в зависимости от конкретных параметров и количества изображений, включенных в анализ.
- После завершения перехода к вкладке "Обзор / слияния". Значения по умолчанию пакетный каталог в каталог экспорта из пакетного анализа и могут быть изменены при желании. Выберите "Включить все" и выберите "Объединить" для создания таблиц данных с помощью сводных данных для анализа.
8. Анализ экспортированных данных
- Открыть экспортируемые таблицы в области программного обеспечения для анализа данных и удалить или скрыть столбцы данных, которые не имеют отношения к анализу, например, минимальных и максимальных значений для каждого компонента. В качестве первичных данных в анализе находится в средней оптической плотности Column для каждого компонента.
- Обзор экспортироваться карты сегментации и необработанных изображений, чтобы определить, какие образцы или ядра ТМА должны быть исключены из анализа. Значения в процентах ткани помочь в определении, следует ли включать образец или нет, с произвольным обрезанию <5% наиболее часто используемых критериев исключения.
- Удалите ненужные данные или строки, содержащие образцы, которые будут исключены из анализа данных.
- Использование данных белков количественной оценки для исследования изменений в состоянии болезни или отношения с клинико-патологическими характеристиками заболевания 12,18-21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
На рисунке 1, обучение проводится на ткани простаты к изображениям сегментов в эпителиальных и стромальных участках, наряду с отделением без ткани. При использовании эпителиальной мембраны маркер E-кадгерин, сегментации клеток проводили для разделения ядра, цитоплазмы и мембраны частей, показанных на рисунке 2.
В одном эксперименте мы использовали мультиплексированный IHC для исследования экспрессии и локализации AR, ERα, E-кадгерина и CD147, как показано на рисунке 3. Используя эти методы, мы можем идентифицировать клетки положительные для ядерной экспрессии обоих ERα и AR (Рисунок 3B - 3C) , несмотря на перекрывающихся колориметрических сигналы, как показано зелеными стрелками на рисунке 3А. Мы обнаружили заметные различия в количестве двойных положительных стромальных клеток в различных состояниях прostate болезнь (рис 3D). Мы количественно-мембранную специфическую экспрессию клеток CD147 с помощью Е-кадгерина в качестве маркера белка (красные стрелки на рисунке 3А), и мы были первой группой , чтобы исследовать специфическую экспрессию CD147 мембран в тканях простаты. Мы обнаружили значительное снижение экспрессии CD147 в сочетании с прогрессированием рака простаты (рис 3Е) и обнаружили важную связь с послеоперационным прогнозом 19.
Есть случаи, когда плохой дизайн эксперимент может привести к сегментации неточной ткани. На рисунке 4, алгоритм применяется к набору тканей не точно сегмент эпителиальные и стромальные отсеки (рис 4в). В этом эксперименте, α-актин гладких мышц (α-SMA) был использован для обозначения стромы отсека. Поскольку α-SMA и гладких мышц снижается или теряется в некоторых опухолях (FIGURe 4A), алгоритм создается путем сегментации ткани (рис 4В) не смог точно различать эпителиальных и стромальных отсеков из одних морфометрических данных. Следует соблюдать осторожность при выборе белковых маркеров для тканей или клеточных отсеков.
Рисунок 1: Tissue Сегментация Использование мультиспектральных визуализации программного обеспечения. Микрочипов ткани предстательной железы окрашивали с использованием мультиплексированных иммуногистохимии для выявления рецептора андрогена (AR), эстроген-рецептор-альфа (ERα), E-кадгерина, и CD147. Набор тренировочных образов были импортированы в мультиспектральных ПО для обработки изображений , представляющих типы тканей и болезненных состояний всего набора изображений (A). Ткань категории были созданы в том числе стромы (зеленый), эпителий (красный), и не-ткани (синий), и категории были определены вручную рисунок на верхнейподготовки изображений (б). После нанесения на тренировочных образов, алгоритм сегментации ткани был создан и применен к обучающему набору изображений (C). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: Cell Сегментация в области ядерной безопасности , цитоплазматических и мембранных отсеками. Ядерный отсек был определен для сегментации клеток путем установления минимального порогового значения для гематоксилин counterstaining (A). В цитоплазме была определена по отношению к ядру , с использованием заранее заданных алгоритмов в программном обеспечении (B). Е-кадгерин был использован в качестве мембранного маркера и минимальной среднеквадратичной порог ОД был применен для определения мембранного отсека (С). Эта техника всеOWS одновременного количественного определения экспрессии белка во всех субклеточных отсеков (D). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3: Анализ совместной локализации и мембранно-специфической экспрессии белка. Multiplexed IHC был использован для изучения экспрессии и локализацию рецептора андрогена (AR), эстроген - рецептор-альфа (ERα), Е-кадгерина и CD147 (А). ДАБ (коричневый хромоген) был использован для обозначения AR (B) и красный хромоген , используемый для обозначения ERα (C). Мы смогли определить пространственно пересекающиеся биомаркеров (зеленые стрелки в А) и количественно (D) доля клеток с ядерной совместной локализации ERα и АРв пределах стромы простаты. Используя Е-кадгерина (черный хромогена) для определения плазменной мембраны (красные стрелки в А), мы количественно мембраны специфических экспрессию CD147 в тканях простаты (E) 19. Односторонний дисперсионный анализ (ANOVA) использовали для статистического анализа, Столбики ошибок отражают стандартную ошибку среднего значения, и звездочки представляют р <0,05. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4: Неадекватное ткани Сегментация причиненного в результате экспериментального проектирования. Доброкачественные и злокачественные ткани предстательной железы окрашивали на альфа-актин гладких мышц (a-SMA, зеленый хромогена), андрогенных рецепторов (красный хромогена) и андрогенных рецепторов вариант 7 (DAB хромоген). a-SMA был использован в качествемаркер стромы и уменьшается в некоторых опухолей, в том числе простаты (A). Когда обучение было выполнено (В) и алгоритм сегментации ткани был применен, стромы и эпителиальные отсеков были недостаточно сегментирован из - за отсутствия α-SMA окрашивания (C). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Использование традиционных иммуногистохимии для оценки экспрессии белка ограничивается субъективными, полуколичественного методов анализа 22,23. Advance платформы были созданы для высокой пропускной способности анализа экспрессии биомаркеров и локализации. Подробный сегментация как ткани и субклеточных отсеков позволяет пользователям изучать экспрессию биомаркеров, локализации и совместной локализации с другими маркерами интерес. В предыдущих исследованиях мы показали полезность IHC и мультиспектральных изображений, особенно при использовании для изучения белков локализованы в том же 18,20,21 клеточный компартмент. В сочетании с тканевых микрочипов 24, эти методы позволяют быстрее и более объективной количественной оценки экспрессии белка , чем это разрешено ручного анализа патологоанатомом.
Одной из проблем, с использованием иммуногистохимии для выявления белка количественному является невоспроизводимость результатов из-за тематический списокный характер анализа и присущих различий в технике и реагентов. Существенным преимуществом использования платформ, таких как многоспектральном визуализации для измерения экспрессии белка является воспроизводимость результатов. Данные из компьютеризированных патологии платформ коррелируют высоко с ручным анализом патологоанатомом при возвращении данных в непрерывном формате и существенно сократить время работы, особенно при работе с большой выборки размеров 12,16,25. Исследования показали высокую общую согласованность между результатами различных платформ мультиспектральных 14. Кроме того, ранее мы показали , что результаты окрашивания высокой воспроизводимостью , даже когда существует изменчивость количества белков исследовали 12. Использование автоматизированных патологии платформ как для окрашивания и анализа не позволит устранить все расхождения в результатах, таких как те, вытекающие из антител, созданных к различным эпитопам, но эти платформы могут существенно уменьшить смещение и ИКвоспроизводимости обычно ассоциируется с иммуногистохимии.
Существуют определенные шаги в рамках протокола, которые необходимы для возвращения точных и воспроизводимых результатов. Соответствующий план эксперимента путем подбора белков, которые будут включены в качестве ткани или субклеточных маркеров имеет важное значение для точной сегментации. При проведении анализа позитивности, выбор нижнего порога для положительного окрашивания оказывает большое влияние на окончательные результаты. При выборе порогового значения для "вкл / выкл" белков, таких как ядерные факторы транскрипции довольно проста, находя порог для более гетерогенным выраженных белков трудно. Это в идеале должно быть выполнено в сотрудничестве с сертифицированным комитетом мочеполового патологоанатомом или усредненного балла по нескольким наблюдателям, чтобы найти идеальный порог для анализа.
Важно признать некоторые ограничения текущей версии данной технологии. Когда деоклейки цитоплазматической отсек, можно использовать три подхода: (1) окрашивание цитоплазмы-специфическим маркером, (2) окрашиванием мембранно-специфическим маркером, и используя ядро-на-мембранного маркера расстояния как цитоплазма, и (3), с использованием чертеж подход вручную определить границы цитоплазме по отношению к ядру. Исходя из нашего опыта, с использованием мембранного-специфического маркера является наиболее точным методом. Ручной подход рисунок, как правило, точным, если ядра расположены в центре города или если биомаркером интерес равномерно распределяется по всей цитоплазме. Точно определяя цитоплазму клеток стромы, таких как фибробласты и клетки гладкой мускулатуры остается сложной и следует принимать во внимание при разработке эксперимента.
Другим ограничением технологии является зависимость от ядер для сегментации клеток. Если плоскость сечения исключает ядро конкретной ячейки, эта ячейка не будет включена в анализ. Если нетвидимым цитоплазма между соседними ядрами или сгустки ядер, они часто признаются как один большой комок ядерного, а не отдельных ядер. Вообще говоря, гематоксилин контрастирующая обычно достаточно для приемлемой ядерной сегментации и манипулирования настройками программного обеспечения, таких как максимальный порог для ядра размера может исправить большинство проблем с ядерной сегментации.
Окончательное ограничение автоматизированных платформ патологии является ненадежной сегментация тканей в результате плохого эксперимента. Важность выбора соответствующих тканевых и клеточных биомаркеров для ответа на интересующий нас вопрос не может быть преувеличена. Как мы показали в наших репрезентативных результатов, эпителиальной или стромальных маркер, который существенно изменяет экспрессию между болезненными состояниями могут возникнуть проблемы при создании алгоритма сегментации ткани. Стоит отметить, что существуют альтернативные варианты, когда трудно анализы, как это возникает. Например, отдельные емкES можно анализировать с помощью ручного рисования всех тканях организма, а не путем применения алгоритма из обучающего набора изображений. Это обеспечивает преимущество сегментации, который идеально соответствуют тому, что хочет пользователь, но он также вводит субъективности и может значительно увеличить время, необходимое для завершения анализа. Соответствующая экспериментальная конструкция является самым простым способом для ускорения анализа и максимальной точности ткани и сегментации клеток.
Эта технология и протокол имеют много будущих приложений. Многочисленные биомаркеры для конкретных болезненных состояний были идентифицированы, но не подтверждено. Высокая пропускная способность объективного анализа с мультиспектральных платформ облегчает проверку этих биомаркеров. Кроме того, оценка экспрессии и совместной локализации нескольких белков может обеспечить способность проникновения в плохо понимаемых сигнальных путей. Несомненно, что снижает присущий субъективности, связанный с анализом иммуногистохимического stainiнг ценен для понимания экспрессии и локализацию широкого спектра белковых маркеров.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Авторы благодарят Университета штата Висконсин трансляционных исследований инициатив в лаборатории патологии, в частности при поддержке UW кафедры патологии и лабораторной медицины и грант UWCCC P30 CA014520, для использования его объектов и услуг.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Xylene | Fisher Chemical | X3F1GAL | NFPA rating: Health – 2, Fire – 3 , Reactivity – 0 |
| Ethyl Alcohol-200 proof | Fisher Scientific | 4355223 | NFPA rating: Health – 0, Fire – 3 , Reactivity – 0 |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-500 | NFPA rating: Health – 2, Fire – 0 , Reactivity – 0 |
| Tris Hydroxymethyl aminomethane HCl | Fisher Scientific | BP153-1 | NFPA rating: Health – 2, Fire – 0 , Reactivity – 0 |
| Tween 20 | Chem-Impex | 1512 | NFPA rating: Health – 0, Fire – 1 , Reactivity – 0 |
| Phosphate-buffered saline | Fisher Scientific | BP2944-100 | NFPA rating: Health – 1, Fire – 0 , Reactivity – 0 |
| Peroxidazed | Biocare Medical | PX968 | Avoid contact with skin and eyes. May cause skin irritation and eye damage. |
| Estrogen Receptor alpha | Thermo Fisher Scientific-Labvision | RM9101 | Not classified as hazardous |
| Androgen Receptor | SCBT | sc-816 | Not classified as hazardous |
| CD147 | Biodesign | P87535M | Not classified as hazardous |
| E-cadherin | Dako | M3612 | Not classified as hazardous |
| Renoir Red Andibody Diluent | Biocare Medical | PD904 | It is specially designed to work with Tris-based antibodies |
| DeCloaking Chamber | Biocare Medical | Model DC2002 | Take normal precautions for using a pressure cooker |
| Barrier pen-Immuno Edge | Vector Labs | H-4000 | |
| Denaturing Kit-Elution step | Biocare Medical | DNS001H | Not classified as hazardous |
| Mach 2 Goat anti-Rabbit HRP Polymer | Biocare Medical | RHRP520 | Not classified as hazardous |
| Mach 2 Goat anti-Rabbit AP Polymer | Biocare Medical | RALP525 | Not classified as hazardous |
| Mach 2 Goat anti-Mouse HRP Polymer | Biocare Medical | M3M530 | Not classified as hazardous |
| Betazoid DAB Chromogen Kit | Biocare Medical | BDB2004 | 1. DAB is known to be a suspected carcinogen. 2. Do not expose DAB components to strong light or direct sunlight. 3. Wear appropriate personal protective equipment and clothing. 4. DAB may cause sensitization of skin. Avoid contact with skin and eyes. 5. Observe all federal, state and local environmental regarding disposal |
| Warp Red Chromogen Kit | Biocare Medical | WR806 | Corrosive. Acid that may cause skin irritation or eye damage. |
| Vina Green Chromogen Kit | Biocare Medical | BRR807 | Harmful if swallowed |
| Bajoran Purple Chromogen Kit | Biocare Medical | BJP807 | Flammable liquid. Keep away from heat, flames and sparks. Harmful by ingestion or absorption. Avoid contact with skin or eyes, and avoid inhalation. |
| Cat Hematoxylin | Biocare Medical | CATHE | Purple solution with a mild acetic acid (vinegar) scent. May be irritating to skin or eyes. Avoid contact with skin and eyes. Avoid ingestion. |
| XYL Mounting Media | Richard Allen | 8312-4 | NFPA rating: Health – 2, Fire – 3 , Reactivity – 0 |
| 1.5 Coverslips | Fisher Brand | 22266858 | Sharp edges |
| Incubation (Humidity)Chamber | obsolete | obsolete | Multiple vendors available |
| Convection Oven | Stabil- Therm | C-4008-Q | |
| Background Punisher Blocking Reagent | Biocare Medical | BP974 | This product is not classified as hazardous. |
| inForm software | PerkinElmer | CLS135781 | Primary multispectral imaging software used in manuscript |
| Nuance software | PerkinElmer | Nuance EX | Software used for making spectral libraries within manuscript |
| Vectra microscope and slide scanner | PerkinElmer | VECTRA | Automated slide scanner and microscope for obtaining IM3 image cubes |
References
- Valdman, A., et al. Expression of redox pathway enzymes in human prostatic tissue. Anal Quant Cytol Histol. 31 (6), 367-374 (2009).
- Rimm, D. L., Camp, R. L., Charette, L. A., Olsen, D. A., Provost, E. Amplification of tissue by construction of tissue microarrays. Exp Mol Pathol. 70 (3), 255-264 (2001).
- Jonmarker, S., et al. Expression of PDX-1 in prostate cancer, prostatic intraepithelial neoplasia and benign prostatic tissue. APMIS. 116 (6), 491-498 (2008).
- McCarty, K. S., Miller, L. S., Cox, E. B., Konrath, J., McCarty, K. S. Sr Estrogen receptor analyses. Correlation of biochemical and immunohistochemical methods using monoclonal antireceptor antibodies. Arch Pathol Lab Med. 109 (8), 716-721 (1985).
- Volante, M., et al. Somatostatin receptor type 2A immunohistochemistry in neuroendocrine tumors: a proposal of scoring system correlated with somatostatin receptor scintigraphy. Mod Pathol. 20 (11), 1172-1182 (2007).
- Muris, J. J., et al. Immunohistochemical profiling of caspase signaling pathways predicts clinical response to chemotherapy in primary nodal diffuse large B-cell lymphomas. Blood. 105 (7), 2916-2923 (2005).
- Jaraj, S. J., et al. Intra- and interobserver reproducibility of interpretation of immunohistochemical stains of prostate cancer. Virchows Arch. 455 (4), 375-381 (2009).
- Nakane, P. K., Pierce, G. B. Enzyme-labeled antibodies: preparation and application for the localization of antigens. J Histochem Cytochem. 14 (12), 929-931 (1966).
- Peters, T. J. Investigation of tissue organelles by a combination of analytical subcellular fractionation and enzymic microanalysis: a new approach to pathology. J Clin Pathol. 34 (1), 1-12 (1981).
- Emmert-Buck, M. R., et al. Laser Capture Microdissection. Science. 274 (5289), 998-1001 (1996).
- Waters, J. C. Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy. J Cell Biol. 185 (7), 1135-1148 (2009).
- Huang, W., Hennrick, K., Drew, S. A colorful future of quantitative pathology: validation of Vectra technology using chromogenic multiplexed immunohistochemistry and prostate tissue microarrays. Hum Pathol. 44 (1), 29-38 (2013).
- Rimm, D. L. C-Path: A Watson-Like Visit to the Pathology Lab. Science Translational Medicine. 3 (108), (2011).
- Fiore, C., et al. Utility of multispectral imaging in automated quantitative scoring of immunohistochemistry. J Clin Pathol. 65 (6), 496-502 (2012).
- Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: A review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
- Rizzardi, A. E., et al. Quantitative comparison of immunohistochemical staining measured by digital image analysis versus pathologist visual scoring. Diagn Pathol. 7, 42 (2012).
- Bauman, T. M., et al. Characterization of fibrillar collagens and extracellular matrix of glandular benign prostatic hyperplasia nodules. PLoS One. 9 (10), e109102 (2014).
- Bauman, T. M., et al. Beta-catenin is elevated in human benign prostatic hyperplasia specimens compared to histologically normal prostate tissue. Am J Clin Exp Urol. 2 (4), 313-322 (2014).
- Bauman, T. M., Ewald, J. A., Huang, W., Ricke, W. A. CD147 expression predicts biochemical recurrence after prostatectomy independent of histologic and pathologic features. BMC Cancer. 15 (1), 549 (2015).
- Bauman, T. M., et al. Finasteride treatment alters tissue specific androgen receptor expression in prostate tissues. Prostate. 74 (9), 923-932 (2014).
- Nicholson, T. M., Sehgal, P. D., Drew, S. A., Huang, W., Ricke, W. A. Sex steroid receptor expression and localization in benign prostatic hyperplasia varies with tissue compartment. Differentiation. 85 (4-5), 140-149 (2013).
- Taylor, C. R., Levenson, R. M. Quantification of immunohistochemistry--issues concerning methods, utility and semiquantitative assessment II. Histopathology. 49 (4), 411-424 (2006).
- Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G., da Silva Pinhal, M. A. Immunohistochemistry as an important tool in biomarkers detection and clinical practice. Biomark Insights. 5, 9-20 (2010).
- Kononen, J., et al. Tissue microarrays for high-throughput molecular profiling of tumor specimens. Nat Med. 4 (7), 844-847 (1998).
- Ong, C. W., et al. Computer-assisted pathological immunohistochemistry scoring is more time-effective than conventional scoring, but provides no analytical advantage. Histopathology. 56 (4), 523-529 (2010).
