Immunohistochemistry is a powerful lab technique for evaluating protein localization and expression within tissues. Current semi-automated methods for quantitation introduce subjectivity and often create irreproducible results. Herein, we describe methods for multiplexed immunohistochemistry and objective quantitation of protein expression and co-localization using multispectral imaging.
Immunohistochemistry is a commonly used clinical and research lab detection technique for investigating protein expression and localization within tissues. Many semi-quantitative systems have been developed for scoring expression using immunohistochemistry, but inherent subjectivity limits reproducibility and accuracy of results. Furthermore, the investigation of spatially overlapping biomarkers such as nuclear transcription factors is difficult with current immunohistochemistry techniques. We have developed and optimized a system for simultaneous investigation of multiple proteins using high throughput methods of multiplexed immunohistochemistry and multispectral imaging. Multiplexed immunohistochemistry is performed by sequential application of primary antibodies with secondary antibodies conjugated to horseradish peroxidase or alkaline phosphatase. Different chromogens are used to detect each protein of interest. Stained slides are loaded into an automated slide scanner and a protocol is created for automated image acquisition. A spectral library is created by staining a set of slides with a single chromogen on each. A subset of representative stained images are imported into multispectral imaging software and an algorithm for distinguishing tissue type is created by defining tissue compartments on images. Subcellular compartments are segmented by using hematoxylin counterstain and adjusting the intrinsic algorithm. Thresholding is applied to determine positivity and protein co-localization. The final algorithm is then applied to the entire set of tissues. Resulting data allows the user to evaluate protein expression based on tissue type (ex. epithelia vs. stroma) and subcellular compartment (nucleus vs. cytoplasm vs. plasma membrane). Co-localization analysis allows for investigation of double-positive, double-negative, and single-positive cell types. Combining multispectral imaging with multiplexed immunohistochemistry and automated image acquisition is an objective, high-throughput method for investigation of biomarkers within tissues.
İmmünohistokimya (IHC) doku içinde proteinin tespit edilmesi için standart bir laboratuar tekniğidir ve IHC hala yaygın olarak araştırma ve teşhis patoloji hem de kullanılır. İHK boyama değerlendirme sonuçlarının yorumlanması içine potansiyel önyargı tanıtan genellikle yarı-kantitatif olduğunu. Birçok yarı nicel yaklaşımlar son tanıya 1-4 içine boyanma yoğunluğu ve boyama ölçüde hem dahil olan geliştirilmiştir. Diğer sistemler daha iyi ifade 5. lokalize etmek için puanlama yoğunluğu ve hücre içi konumunu içerir. Birden fazla izleyiciler ortalama puanları Ortaklığın genellikle tek izleyici önyargı 6 etkilerini en aza indirmek için kullanılmaktadır. Bu çabalara rağmen, analiz öznellik hala 7 boyanma ölçüde değerlendirirken, özellikle kalır. İnsan girişten Protokol standardizasyon ve minimize öznellik doğru, tekrarlanabilir İHK sonuçlar yaratmak için her şeyden önemlidir.
içerik "> dokular içinde protein ifadesini belirlemek için İHK yanı sıra diğer seçenek vardır. Böyle immunoblotting gibi diğer teknikler, protein ifadesini araştırmak için altın standart olarak görülüyor ise araştırma ayarı içinde, immünhistokimya geleneksel, protein lokalizasyonu 8 incelemek için bir araç olarak görülmüştür . belirlenmesi doku veya hücre bölmesi özgü ifade doku slaytlar üzerinde floresan antikor kullanımı makul bir uzlaşma vardır. hücre parçalanması veya lazer yakalama mikrodiseksiyon 9,10 olarak gelişmiş teknikler içeren olmadan zordur, ama nedeniyle NADPH arka plan otofloresansı, lipofuscins, retiküler lifler, kollajen, elastin ve 11 doğru niceleme zorlaştırabilir.Otomatik hesaplama patoloji platformları patoloji boyaması 12-15 daha objektif kantitatif için umut verici yönü vardır. Doku mikrodizinlerinde ile çok bantlı görüntüleme birleştirenbüyük örnek boyutlarda protein ekspresyonu yüksek verimli analizini kolaylaştırır. Kategorik biçimi 16 yerine, sürekli bir veri dönerken esas içsel hatalar ve analizi için gerekli zamanı hem de azaltarak, bu teknikler ile, protein, eş-lokalizasyonu, boyama heterojenliği ve doku ve hücre içi lokalizasyonu analizi mümkündür. Bu nedenle, bu çalışmanın amacı, çok bantlı görüntüleme yazılımı kullanılarak analiz ile çoklanmış immünohistokimyasal gerçekleştirmek için yararını ve metodolojisini göstermekti.
Bu protokol, dört optimize monoklonal antikorlar ile tek bir doku bölüm slayt kılavuzu, multipleks immünohistokimyasal için yazılmıştır. bir temsili olarak, çekirdek anti-tavşan östrojen reseptörü alfa (ÖRa) ve androjen reseptörü (AR) zara-bağlı anti-fare CD147 ve membrana bağlı anti-fare E-kaderin ile çoklanır. tercih edilen herhangi bir antikorun substitut edilebilirBurada listelenen antikorlar için ed, ancak antikorların her kombinasyonu ayrı optimizasyon gerektirir. Tüm antikorlar için ön işleme tabi tutulması aynı olmalıdır. AR ve CD147 antikorlar, bir kokteyl olarak ayrı ayrı ve optimize edilmelidir. Her antikor, biyotin-bir polimer sistemi ve 4 benzersiz kromojenler biri kullanılarak tespit edilir.
Protein ifade değerlendirmek için geleneksel immunohistokimyasal kullanımı analizi 22,23 öznel, yarı nicel yöntemler ile sınırlıdır. Peşin platformları biyobelirtecin ifade ve lokalizasyon yüksek verimlilik analizi için yaratılmıştır. doku ve hücre içi bölmeleri hem Detaylı segmentasyon kullanıcıları diğer ilgi işaretleri ile biyobelirteç ifade, yerelleştirme ve ko-lokalizasyon çalışma sağlar. Daha önceki çalışmalarda, aynı hücresel bölme 18,20,21 lokalize p…
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar kendi imkanları ve hizmetlerin kullanımı için, Patoloji ve Laboratuar Tıp UW Bakanlığı tarafından desteklenen bir parçası ve UWCCC hibe P30 CA014520 olarak, Patoloji laboratuvarında Wisconsin çeviriyle ilgili araştırma Girişimleri Üniversitesi teşekkür ederim.
Xylene | Fisher Chemical | X3F1GAL | NFPA rating:Health – 2, Fire – 3 , Reactivity-0 |
Ethyl Alcohol-200 proof | Fisher Scientific | 4355223 | NFPA rating:Health – 0, Fire – 3 , Reactivity-0 |
Tris Base | Fisher Scientific | BP152-500 | NFPA rating:Health – 2, Fire – 0 , Reactivity-0 |
Tris Hydroxymethyl aminomethane HCl | Fisher Scientific | BP153-1 | NFPA rating:Health – 2, Fire – 0 , Reactivity-0 |
Tween 20 | Chem-Impex | 1512 | NFPA rating:Health – 0, Fire –1 , Reactivity-0 |
Phosphate-buffered saline | Fisher Scientific | BP2944-100 | NFPA rating:Health – 1, Fire –0 , Reactivity-0 |
Peroxidazed | Biocare Medical | PX968 | Avoid contact with skin and eyes. May cause skin irritation and eye damage. |
Diva Decloaker | Biocare Medical | DV2004 | This product has been classified as non‐hazardous based on the physical and/or chemical nature and/or concentration of ingredients. |
Estrogen Receptor alpha | Thermo Fisher Scientific-Labvision | RM9101 | Not classified as hazardous |
Androgen Receptor | SCBT | sc-816 | Not classified as hazardous |
CD147 | Biodesign | P87535M | Not classified as hazardous |
E-cadherin | Dako | M3612 | Not classified as hazardous |
Renoir Red Andibody Diluent | Biocare Medical | PD904 | It is specially designed to work with Tris-based antibodies |
DeCloaking Chamber | Biocare Medical | Model DC2002 | Take normal precautions for using a pressure cooker |
Barrier pen-Immuno Edge | Vector Labs | H-4000 | |
Denaturing Kit-Elution step | Biocare Medical | DNS001H | Not classified as hazardous |
Mach 2 Goat anti-Rabbit HRP Polymer | Biocare Medical | RHRP520 | Not classified as hazardous |
Mach 2 Goat anti-Rabbit AP Polymer | Biocare Medical | RALP525 | Not classified as hazardous |
Mach 2 Goat anti-Mouse HRP Polymer | Biocare Medical | M3M530 | Not classified as hazardous |
Betazoid DAB Chromogen Kit | Biocare Medical | BDB2004 | 1. DAB is known to be a suspected carcinogen. 2. Do not expose DAB components to strong light or direct sunlight. 3. Wear appropriate personal protective equipment and clothing. 4. DAB may cause sensitization of skin. Avoid contact with skin and eyes. 5. Observe all federal, state and local environmental regarding disposal |
Warp Red Chromogen Kit | Biocare Medical | WR806 | Corrosive. Acid that may cause skin irritation or eye damage. |
Vina Green Chromogen Kit | Biocare Medical | BRR807 | Harmful if swallowed |
Bajoran Purple Chromogen Kit | Biocare Medical | BJP807 | Flammable liquid. Keep away from heat, flames and sparks. Harmful by ingestion or absorption. Avoid contact with skin or eyes, and avoid inhalation. |
Cat Hematoxylin | Biocare Medical | CATHE | Purple solution with a mild acetic acid (vinegar) scent. May be irritating to skin or eyes. Avoid contact with skin and eyes. Avoid ingestion. |
XYL Mounting Media | Richard Allen | 8312-4 | NFPA rating:Health – 2, Fire – 3 , Reactivity-0 |
1.5 Coverslips | Fisher Brand | 22266858 | Sharp edges |
Incubation (Humidity)Chamber | obsolete | obsolete | Multiple vendors available |
Convection Oven | Stabil- Therm | C-4008-Q | |
Background Punisher Blocking Reagent | Biocare Medical | BP974 | This product is not classified as hazardous. |
inForm software | PerkinElmer | CLS135781 | Primary multispectral imaging software used in manuscript |
Nuance software | PerkinElmer | NUANCEEX | Software used for making spectral libraries within manuscript |
Vectra microscope and slide scanner | PerkinElmer | VECTRA | Automated slide scanner and microscope for obtaining IM3 image cubes |