Abstract
Coxiella의 burnetii는 Q 열병을 일으키는 원인이되는 에이전트는 의무적 세포 내 세균이다. PCR 기초 진단 분석법 C. 검출을 위해 개발되어왔다 세포 배양 및 임상 시료에서 burnetii DNA. PCR은 특수 장비와 다양한 최종 사용자 교육을 필요로하며, 따라서, 특히 자원이 제한된 지역에서 일상적인 작업에 적합하지 않습니다. 우리는 C.의 존재를 검출하는, 루프 - 매개 등온 증폭 (LAMP) 분석법을 개발 환자 샘플에서 burnetii. 이 메소드는 수조 또는 히팅 블록에 60 ° C의 주위에 하나의 온도에서 수행된다. 이 LAMP 분석의 감도는 반응 당 25 카피의 검출 한계 PCR 매우 유사하다. 이 보고서는 동결 건조 된 시약 및 hydroxynaphthol 청색 (HNB) 또는 반응 인터 형광 염료와 UV 램프를 사용하여 결과를 시각화하여 반응의 제조를 설명한다. 램프 시약은 lyophili했다평탄화 및 검출 감도의 손실없이 한달 동안 실온 (RT)에 저장된다. 반응 혼합물을 준비 복잡한 단계를 포함하지 않기 때문에이 LAMP 분석법이 특히 강하다. 이 방법은 Q 열병이 발병 자원 제한 설정에서 사용하기에 이상적이다.
Introduction
작은 그람 음성 박테리아 Coxiella burnetii는 전 세계적으로 인수 공통 전염병 인 Q 열병의 원인 물질이다. 때문에 Q 열병의 전세계 유통 및 C의 높은 감염에 burnetii는 해외 배치 미군과 민간인은 발병 지역에서 감염 될 위험이 있습니다.
급성 및 만성 감염 : Q 열병은 두 가지 형태로 나타난다. Q-급성 발열 독감 유사 증상, 간염, 폐렴 자체를 제공하고, 일반적으로 낮은 사망률 자기 한정 질환이다. 만성 Q-열이 덜 유행하면서, 자주 1,2 방치하면 훨씬 더 높은 사망률을 가지고 심내막염, 발생합니다. 따라서 조기 진단 적절한 치료가 환자 치료에 중요 안내합니다. 중합 효소 연쇄 반응 (PCR) 및 실시간 정량 PCR (qPCR에) 분석법 C. 검출을 위해 개발되어왔다 세포 배양 및 임상 샘플 3-5 <에 burnetii DNA/ SUP>. PCR 및 qPCR에 모두 비용과 일상적인 작업을위한 자원이 제한된 지역에서 자주 쉽게 사용할 수 없습니다.
원래 Notomi 6 설명, 루프 - 매개 등온 증폭 (LAMP)는 다른 DNA 증폭 방법을 제공합니다. LAMP은 표적 유전자의 적어도 6 독립 영역을 인식 특별히 설계된 프라이머 세트와 함께 나선 치환 DNA 합성 BST DNA 중합 효소를 사용한다. LAMP의 가장 중요한 장점은 증폭 등온 조건에서 발생한다는 것이다. 따라서, 단지 수욕 가열 블록 또는 인큐베이터가 필요하다. 이 방법은 여러 리케차 7-9 병원균을 검출하기 위해 사용되어왔다. 겔 전기 영동에 의해 증폭 된 DNA 제품의 시각화에 의한 비특이적 증폭 오탐 (false positive)에서 진정한 양성을 차별화 할 수있는 가장 정확한 방법입니다. 그러나 겔 전기 영동에 관련된 절차 리소스 제한 AR위한 실용적이지 않다EAS. 몇몇 다른 방법이 반응 생성물을 검출하기 위해 개발되었다. 피로 인산 마그네슘을 형성 (10) 또는 인터 형광 염료를 사용하여 유도 된 탁도 11,12 UV 광 하에서 가시화 될 수 등이 대안은 겔을 실행하는 것보다 더 유리하다. Q 열병이 발병 13 곳 열대 및 아열대 국가에서 주위 온도가있는, 25 ° C, 37 ° C에서 보관하면 램프 시약은 1 개월 안정적이었다.
램프와 분석은 C.의 존재를 검출하기 위해 실험실에서 개발 된 플라즈마 샘플 14 burnetii. 여기서 우리는 동결 건조 된 시약의 LAMP 반응 혼합물의 제조를위한 간단한 프로토콜을 설명한다. 실온에서 저장 될 때 동결 건조 된 시약은 1 개월 안정하다. 쉽게 시각화 방법과 결합 될 때, 이는 C. 검출에 사용하는 이상적인 방법은 자원 제한 설정에서 burnetii.
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Protocol
1. LAMP 반응에 대한 표준으로 플라스미드 DNA 희석 준비
- DNA 농도 플라스미드 (C. burnetii RSA 493의 포함 대상 유전자 IS1111a)를 결정하기 위해 260 nm에서 광학 밀도 (OD)를 측정하는 분광 광도계를 사용합니다. (1)의 OD (260)는 DNA의 50 μg의 / μL 동일합니다.
- 카피 수에 플라스미드 DNA의 양을 변환합니다. 플라스미드의 크기는 6,330 bp의이기 때문에,이 플라스미드의 분자량은 4.1 × 106 G (6330 BP X 649g / BP)이다. (단계 1.1 결정) 플라스미드 DNA의 농도는 34.2 NG / μL이다. 이 DNA 샘플 1 μL는 DNA의 5 × 10 9 사본 (34.2 × 10 -9 g / 4.1 × 10 6 GX 6.02 × 10 23)에 동일시, 플라스미드 DNA의 34.2 NG가 포함되어 있습니다.
- 5 × 8 사본 DNA 샘플을 만들기 위해 10 배 희석 물을 90 μL로 플라스미드 DNA (5 × 109 카피 / μL)의 10 μL를 추가 / μL.
- 반복 단계 1.3, 5 × 7의 DNA 샘플을 준비하기 위해 5 × 106, 5 × 105, 5 × 104, 5 × 103, 5 × 2, 5 × 10 1 5 X 10 0 사본 / μL.
2. LAMP 반응에 대한 샘플에서 DNA 템플릿을 준비
- 제조사의 프로토콜에 따라 상업적 DNA 미니 키트를 사용하여 인간 혈장 시료로부터 DNA 추출을 수행한다. 추출에 200 μL 샘플의 전체를 사용하여 20 ㎕의 부피에서 추출한 DNA를 용출시킨다.
3. 배 LAMP 반응 버퍼를 준비합니다
- 10 배 폴 버퍼 200 μL, 5 M 트리메틸 320 μL, M 황산 4,의 dNTP 혼합물의 280 μL (10 mM의 각) 및 물 188 ㎕의 2 배 LAMP 버퍼의 1 mL로 한 12 μl를 섞는다. 10 초 동안 펄스 텍싱에 의해 섞는다.
4. 표준 LAMP 반응을 수행
- 배 LA의 12.5 μl를 혼합3 단계에서 제조 된 MP 완충액 (40 mM 트리스 - 염산 (PH 8.8), 20 mM의 KCl을 16 mM의 황산, 20 mM의 (NH4) 2SO4, 0.2 % 트리톤 X-100, 1.6 M 트리메틸 1.4 밀리미터의 dNTP 혼합물)의 프라이머 혼합물 1.2 μL, BST DNA 중합 효소 (8 U / μL) 1 μL, 및 0.2 ㎖의 PCR 용 튜브에 반응 혼합물 (20 μL)을 만들어 물 5.3 μL.
- 20 ㎕의 반응 혼합물에 5 (1 단계 또는 2) DNA의 μl를 넣고 잘 섞는다.
- 근접 튜브는 수조 또는 히팅 블록에 60 분 동안 60 ℃에서 배양한다. 이는 앞서 결정된 최적의 반응 온도이다.
- 반응을 종료 10 배 겔 로딩 버퍼의 5 μl를 추가합니다.
- 핵산 얼룩 인터 물들 2 % 아가 로스 젤에 반응 생성물의로드 5 μL.
- 1X TBE 버퍼에서 35 분 동안 100 V에서 젤을 실행합니다.
- 자외선에 의한 결과를 시각화합니다.
5. 재구성와 LAMP 반응을 수행시약
- 10 배 폴 버퍼 125 μL, 5 M 트리메틸 200 μL, 1 M 황산의 7.5 μl를 혼합, 물 667.5 μL를 재구성 버퍼의 1 mL로한다. 10 초 동안 펄스 텍싱에 의해 섞는다.
- 밀봉 된 알루미늄 호일 가방에서 동결 건조 된 시약을 포함하는 튜브를 제거합니다. 알루미늄 박 백이 밀폐되지 않으면 튜브를 사용하지 않는되거나 손상된 경우.
- 동결 건조 된 시약을 다시 중단 각각의 튜브에 재구성 버퍼의 20 μl를 추가합니다.
- 버퍼 위아래로 5 회 피펫 팅하여 섞는다. 동결 건조 된 시약을 완전히 재현 탁하고 있는지 확인하기 위해 살펴 보자. 백색 분말은 튜브에 사라집니다.
- 재구성 된 시약 (1 단계 또는 2에서) DNA 템플릿의 5 μl를 넣고 잘 섞는다.
- 근접 튜브는 수조 또는 히팅 블록에 60 분 동안 60 ℃에서 배양한다.
- 반응을 종료 10 배 겔 로딩 버퍼의 5 μl를 추가합니다.
- 로드 반응의 5 μL핵산 얼룩 인터 물들 2 % 아가 로스 젤 제품.
- 1X TBE 버퍼에서 35 분 동안 100 V에서 젤을 실행합니다.
- 자외선에 의한 결과를 시각화합니다.
6.에서 재구성 버퍼 HNB 또는 형광 인터 염료 함유으로 LAMP 반응을 수행
- 10 배 폴 버퍼 125 μL, 5 M 트리메틸 200 μL, 1 M의 7.5 μl의 황산, 20 mM의 HNB (또는 100 배 형광 인터 염료의 12.5 μL) 660 μL (또는 655 μL)의 물에 7.5 μl를 혼합 재구성 버퍼 1 ㎖를 확인합니다. 10 초 동안 펄스 텍싱에 의해 섞는다.
- 5.6 - 단계 5.2를 반복 섹션 6에서 제조 재구성 된 버퍼를 사용합니다.
- 육안에 의한 결과 (HNB 함유 반응) 또는 UV 등 (인터 형광 염료를 함유하는 반응)을 시각화.
7. 튜브 스캐너와 실시간 LAMP 반응을 수행
- reconstitut에 DNA μL 5 추가형광 인터 염료, 가까운 튜브를 포함하는 튜브 스캐너에 삽입 에드 시약.
- 60 ° C에서 설정 배양 온도. 60 분 동안 520 nm에서의 형광을 측정한다.
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Representative Results
0.2 ML 튜브 내부의 동결 건조 램프 시약은 BST DNA 중합 효소, 프라이머, 및 dNTPs를 포함되어 있습니다. 재구성 버퍼의 20 μl를 다시 일시 동결 건조 된 시약에 사용된다. (1)가 새로 제조 한 시약 및 동결 건조 시약 아가 로스 젤에 LAMP 반응 결과를 보여줍니다. 동결 건조 된 시약의 활성을 감소하지 않습니다. DNA 주형.도 2의 25 카피를 검출 할 수있는 양의 시약에 의해 제조 LAMP 반응은 HNB 또는 반응에 존재하는 인터 형광 염료와 반응 생성물의 검출을 나타낸다. 반응에 HNB의 첨가 반응에 존재하는 DNA 템플릿의 25, 50, 100 사본 파란색 보라색에서 시각적 색상 변화를 생성합니다. 반응 인터 형광 염료를 포함하는 것이 DNA 템플릿 25, 50, 100 카피가 존재하는 자외선 강한 형광 신호를 나타낸다. 튜브 스캐너 사용한실시간 검출이 연구된다. 이 기계. 동시에 8의 반응을 수행하는 인터 형광 염료의 존재와 실시간 형광 신호를 모니터링하기 위해 상기 튜브 스캐너를 사용하여도 3도있다. 형광 시그널은 14, 18, 21 일 후에 기준선 위에있는, 10 (6) 23 분, 10 (4), 10 (3), 상기 반응에서 DNA 주형의 100 카피.
새로 제조 한 시약 (A) 동결 건조 시약 (B)을 아가 로스 겔에서도 1 LAMP 초래한다. 반응 혼합물을 60 분 동안 60 ℃에서 배양 하였다. (A) 레인 1의 100 bp의 래더; 레인 2 - 3 - 4 7 8 - - 5, 6 (9) 2.5 × 103와 반응이다 2.5 × 10 × 10 2, 2.5, 및 플라스미드 DNA의 카피 없음. 11 12 - - (B) 레인 10 13 14 - 15 16 - 17이다 REA2.5 × 10 3 ctions, 2.5 × 10 2 × 10 2.5 및 플라스미드 DNA의 0 사본. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2 방법 LAMP 제품을 검출한다. HNB (A) 또는 인터 형광 염료 (B)는 LAMP 제품을 검색하는 데 사용 하였다. 반응은 60 분 동안 60 ℃에서 수행 하였다. 5 레인 1과 반응 0, 10, 플라스미드의 25, 50, 100 복사합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. LAMP 제품의 강한> 실시간 감지가. 반응은 60 분 동안 60 ℃에서 수행 하였다. 106 (검정), 104 (빨강), 10 세 (녹색), 100 (노란색), 10 (파란색), 1 (오렌지) 0 (갈색과 밝은 갈색) 플라스미드의 사본과 반응. 세 탐지 독립적으로 수행 하였다. 그들은 매우 재현했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이전에, 우리는 삽입 요소 IS1111a (14) 대상으로 민감하고 특정 LAMP 분석을 개발했다. 그것은 매우 C.의 다른 균주 사이에서 보존되어 있기 때문에 IS1111 소자 선택한 burnetii와 박테리아의 사본의 높은 번호 (110-7) (클레 2006). 우리의 결과는 LAMP가 Coxiella DNA의 적은 하나 염색체 사본에 상관 관계가있다 IS1111 요소의 약 25 복사본을 감지 할 수있는 것으로 나타났다. 본 연구에서는 BST DNA 중합 효소, LAMP 프라이머 및 dNTPs를 동결 건조하고 압축 된 알루미늄 호일 가방에 포장. 이 동결 건조 된 시약의 감도는 25 사본 유지; 적어도 하나의 월의 새로 제조 한 시약 유사한 RT에 저장 될 때. 알루미늄 호일 가방이 제대로을 열기 전에 봉인되어 있는지 확인하는 것이 매우 중요합니다. 알루미늄 박 백이 밀폐되지 않으면 튜브를 사용하지 않는되거나 손상된 경우. 이 재수 오 원인이 될 수 있습니다그 반응의 손실에 이르게 동결 건조 된 시약 F. 다른 중요한 단계는 재구성 버퍼 동결 건조 된 시약의 재 현탁액이다. 램프의 반응은 완전히 다시 중단되지 시약 제대로 작동하지 않습니다. 때문에, 반응 완충액 및 트리메틸 용액의 점도의 높은 염 농도들은 성공적 BST DNA 중합 효소, LAMP 프라이머 및 dNTP와 함께 동결 건조 될 수 없다. 특별한 단계는 해당 구성 요소로 재구성 버퍼를 준비 할 필요가있다. 잠재적으로 LAMP 반응은 낮거나없는 트리메틸 낮은 소금 농도에서 테스트 할 수 있습니다. 동일한 검출 감도 있지만 저염 트리메틸 낮은 농도를 갖는 반응 조건이있는 경우, 동결 건조 된 시약은 물만으로 재구성 될 필요가있다. 이것은 상기 반응 단계를 단순화한다.
최근, 왕 등. (15)에 열두 비교상용화 등온 마스터 믹스 키트 -house LAMP 분석은와 자체 분석이 거짓 양성 결과를 발견했다. 저희 연구실에서는, 우리는 다른 박테리아의 검출에 대한 몇 가지 LAMP 분석을 개발하고 이러한 자체 분석에서 위양성 결과를 발견 적이 없다. 또한, LAMP 법의 개발의 초기 단계에서의 분석은 모두 자체 제조 마스터 믹스 및 상용화 마스터 믹스 테스트하고, 차이가 세이 '민감도와 특이도 관찰되지 않았다.
본 연구는 실험실에서 교차 오염의 가능성을 감소시키기 위해 반응 튜브를 개방하지 않고 LAMP 제품 검출뿐만 아니라 결과를 전기 영동 방법과 비교 읽을 짧은 공정 시간을 가질 수뿐만 아니라 몇 가지 방법을 제시한다. 이러한 검출 방법을 사용하는 장점은 상당히 신속하게 분석을 수행 C. 가진 개인을 진단 할 수있는 능력을 향상 burnetii
60 ° C의 주위 온도를 일정하게 유지하는 PCR 계 열 순환기가 필요한 방법, 가열 블록, 수조 또는 인큐베이터 달리 모든 램프 분석이 필요하다. 이 자원 제한 설정에서 분석에 특히 적합합니다. 원래 LAMP 분석, BST DNA 중합 효소, LAMP 프라이머 및 dNTPs를 달리 -20 ° C에서 보관해야합니다. 이 동결 건조 된 시약은 더욱 유용 Q 열병이 발병하는 자원 제한 설정에 대한 만들어 실온에서 저장 될 수있다. 39 ° C, 25 ° C, 37 ° C에서의 동결 건조 된 시약의 장기 안정성 시험이 현재 진행 중이다. 앞으로 우리는이 LAMP 분석은 C.를 감지 할 수있는 동결 건조 된 시약을 사용하는 것을 증명하고 싶습니다 유사한 감도 burnetiiPCR의 원격 설정한다.
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Disclosures
저자는 공개 아무것도 없어.
Acknowledgments
이 연구는 해군 의료 연구 센터, 연구 작업 단위 6000.RAD1.J.A0310에 의해 지원되었다. 이 문서에 표현 된 의견은 저자의 것이며, 반드시 해군, 국방부, 또는 미국 정부의 부서의 공식적인 정책이나 입장을 반영하지 않습니다. 웨이 메이 칭은 미국 정부의 직원이다. 이 작품은 그녀의 공무의 일환으로 제조 하였다. 제목 17 USC §105은 '이 제목에서 저작권 보호는 미국 정부의 모든 작업에 사용할 수 없습니다.'고 제공 제목 17 USC §101은 그 사람의 공무의 일환으로 병역 구성원 또는 미국 정부의 직원에 의해 제조 된 작품으로 미국 정부의 작업을 정의합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LAMP primers | Eurofins MWG operon | 10 nmol, salt free | Sequence designed by customer |
| Bst DNA polymerase | New England Biolabs | M0275L | 8 units/ml |
| 10x Thermo pol buffer | New England Biolabs | B9004S | |
| dNTP mixture | New England Biolabs | N0447L | 10 mM each |
| Betaine | Sigma-Aldrich | B0300 | 5 M, Trimethylglycine |
| Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | M3409-1ML | 1 M |
| 10x Bluejuice | Invitrogen | 10816-015 | gel loading buffer |
| SYBR green | Invitrogen | S7585 | 10,000x, visualize products in tubes |
| GelRed | Phenix Research Products | RGB-4103 | 10,000x, visualize products in gels |
| Lyophilized reagents | Gene Reach | ||
| Hydroxynaphthol blue | Fluka | 33936-10G | |
| ESEQuant tube scanner | Qiagen | real-time detection |
References
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