Abstract
Coxiella burnetii, агент , вызывающий лихорадку Q, является облигатным внутриклеточным бактерии. ПЦР - диагностические анализы , основанные были разработаны для обнаружения C. burnetii ДНК в клеточных культурах и клинических образцах. ПЦР требует специального оборудования и обширный обучение пользователей, и, следовательно, он не подходит для рутинной работы, особенно в ограниченных ресурсов области. Мы разработали цикл опосредованной изотермические амплификации (LAMP) анализа для обнаружения присутствия C. burnetii в образцах пациентов. Этот способ осуществляют при одной температуре около 60 ° С на водяной бане или нагревательном блоке. Чувствительность этой лампы анализа очень похож на ПЦР с пределом обнаружения около 25 копий на реакцию. Этот отчет описывает получение реакции с использованием лиофилизованных реагентов и визуализации результатов с использованием hydroxynaphthol синего (HNB) или УФ-лампы с люминесцентным интеркалирующего красителя в реакции. Лампа реагенты lyophiliзет и хранили при комнатной температуре (КТ) в течение одного месяца без потери чувствительности обнаружения. Эта лампа анализ особенно эффективен потому, что препарат реакционной смеси не включает в себя сложные шаги. Этот метод идеально подходит для использования в условиях ограниченных ресурсов, где Q лихорадка является эндемическим заболеванием.
Introduction
Небольшой грамотрицательная бактерия Coxiella burnetii является возбудителем лихорадки Ку, который является во всем мире зоонозов. В связи с распространением по всему миру лихорадки Ку и высокой инфекционности C. burnetii, американские военные и гражданский персонал , развернутые за рубежом находятся под угрозой заражения в эндемичных районах.
Q лихорадка проявляется в двух формах: острых и хронических инфекций. Острый Q-лихорадка представляет себя с симптомами гриппа, гепатита или пневмонии, и, как правило, самоограничения заболевание с низкой смертностью. Хронический Q-лихорадка, в то время как менее распространены, часто приводит к эндокардит, который имеет гораздо более высокий уровень смертности при отсутствии лечения 1,2. Таким образом, ранняя диагностика, чтобы направлять соответствующее лечение имеет решающее значение для ухода за пациентами. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) и количественный ПЦР в реальном времени (КПЦР) анализы были разработаны для обнаружения C. burnetii ДНК в клеточных культурах и клинических образцах 3-5 </ SUP>. Оба ПЦР и КПЦР являются дорогостоящими и часто не легко доступны в условиях ограниченных ресурсов областей для рутинной работы.
Первоначально описанный Notomi 6, петля-опосредованной изотермические амплификации (LAMP) предлагает альтернативный метод амплификации ДНК. ЛАМПА использует Bst ДНК - полимеразы для синтеза ДНК замещения цепи вместе со специально разработанными наборов праймеров , которые распознают по меньшей мере , шесть независимых областей гена - мишени. Наиболее важным преимуществом является то, что ЛАМПА усиление происходит в изотермических условиях. Таким образом, только на водяной бане, нагревательный блок или инкубатор требуется. Этот метод был использован для обнаружения нескольких риккетсиозные патогены 7-9. Визуализация продуктов амплификации ДНК с помощью гель-электрофореза является наиболее точным методом, который может отличить истинные срабатываний от ложных срабатываний за счет неспецифической амплификации. Однако процедуры, связанные с гель-электрофореза не практичны для ограниченных ресурсов арEAS. Было разработано несколько альтернативных методов для обнаружения продуктов реакции. Эти альтернативные, такие как помутнение полученный из формации пирофосфат магния 10 или с использованием флуоресцентного красителя интеркалирования быть визуализированы под действием УФ - света 11,12 являются более благоприятными , чем при запуске геля. Лампа реагенты были стабильны в течение одного месяца при хранении при температуре 25 ° C и 37 ° C, которые являются температура окружающей среды в тропических и субтропических странах , где Q лихорадка является эндемическим 13.
Пробирного лампа была разработана в нашей лаборатории , чтобы обнаружить присутствие C. burnetii в образцах 14 плазмы. Здесь мы опишем простой протокол для приготовления реакционной смеси в количестве от ЛАМПА лиофилизированных реагентов. Лиофилизированные реагенты стабильны в течение одного месяца при хранении при комнатной температуре. В сочетании с легким методом визуализации, это идеальный способ , чтобы использовать для обнаружения C. burnetii в установлении ограниченных ресурсов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовить плазмидной ДНК разведений в качестве стандарта для LAMP-реакции
- С помощью спектрофотометра для измерения оптической плотности (OD) при 260 нм , чтобы определить плазмиду (содержащую гена - мишени IS1111a 493 С. burnetii RSA) концентрации ДНК. OD 260 1 приравнивает до 50 мкг / мкл ДНК.
- Преобразование количества плазмидной ДНК в количестве копий. Поскольку размер плазмиды составляет 6330 п.н., молекулярная масса этой плазмиды 4,1 х 10 6 г (6330 п.о. х 649 г / BP). Концентрацию ДНК плазмиды составляет 34,2 нг / мкл (как определено из шага 1.1). 1 мкл этого образца ДНК содержит 34,2 нг ДНК плазмиды, приравнивая к 5 × 10 9 копий (34,2 х 10 -9 г / 4,1 х 10 6 Gx 6,02 × 10 23) ДНК.
- Добавить 10 мкл ДНК плазмиды (5 × 10 9 копий / мкл) в 90 мкл воды в течение 10-кратного разведения , чтобы сделать образец ДНК из 5 х 10 8 копий / мкл,
- Повторите шаг 1.3 подготовить образцы ДНК 5 х 10 7, 5 × 10 6, 5 × 10 5, 5 × 10 4, 5 × 10 3, 5 х 10 2, 5 х 10 1, и 5 х 10 0 копий / мкл.
2. Подготовка шаблона ДНК из образцов для LAMP-реакции
- Выполните извлечение ДНК из образцов плазмы крови человека с использованием коммерческого набора ДНК мини в соответствии с протоколом производителя. Используйте в общей сложности 200 мкл образца для экстракции и элюции извлеченную ДНК в объеме 20 мкл.
3. Подготовьте 2x буфера ЛАМПА Реакция
- Смешайте 200 мкл 10 - кратного буфера для Pol, 320 мкл 5 М триметилглицина, 12 мкл 1 М MgSO 4, 280 мкл смеси дНТФ (10 мМ каждый) и 188 мкл воды , чтобы 1 мл буфера 2х лампы. Смешайте импульсно-встряхиванием в течение 10 сек.
4. Выполните стандартную лампу Реакция
- Смешайте 12,5 мкл 2x LAБуфер МП (как полученного на стадии 3, 40 мМ Трис-HCl (рН 8,8), 20 мМ КСl, 16 мМ MgSO 4, 20 мМ (NH 4) 2 SO 4, 0,2% Тритон Х-100, 1,6 М триметилглицин, 1,4 мМ дНТФ смесь), 1,2 мкл смеси праймера, 1 мкл ДНК - полимеразы Bst (8 ед / мкл) и 5,3 мкл воды для приготовления реакционной смеси (20 мкл) в 0,2 мл ПЦР - пробирку.
- Добавьте 5 мкл ДНК (со стадии 1 или 2) в 20 мкл реакционной смеси и хорошо перемешать.
- Закрыть трубки и инкубировать при 60 ° С в течение 60 мин на водяной бане или нагревательном блоке. Это оптимальная температура реакции определяется ранее.
- Добавьте 5 мкл 10х гель загрузочного буфера для остановки реакции.
- Нагрузка 5 мкл продуктов реакции в агарозном геле 2%, окрашенном интеркаляции пятно нуклеиновой кислоты.
- Выполнить гель при 100 В в течение 35 мин в буфере 1x КЭ.
- Визуализируйте результаты от УФ-излучения.
5. Выполните ЛАМПЫ реакции с водостойкихРеагенты
- Смешайте 125 мкл 10 - кратного буфера для Pol 200 мкл 5 М триметилглицина, 7,5 мкл 1 М MgSO 4, 667,5 мкл воды , чтобы 1 мл восстанавливающий буфер. Смешайте импульсно-встряхиванием в течение 10 сек.
- Снимите трубки, которые содержат лиофилизированные реагенты из запечатанном пакете из алюминиевой фольги. Не следует использовать трубы, если мешок алюминиевой фольги не запечатан или если он поврежден.
- Добавьте 20 мкл восстанавливающий буфер в каждую пробирку, чтобы повторно приостанавливать лиофилизированные реагенты.
- Смешайте с помощью пипетки буфера вверх и вниз 5 раз. Посмотрите, чтобы убедиться, что лиофилизированные реагенты полностью ресуспендировали. Белый порошок должен исчезнуть в трубке.
- Добавьте 5 мкл ДНК-матрицы (от стадии 1 или 2) реконструированных реагентов и хорошо перемешать.
- Закрыть трубки и инкубировать при 60 ° С в течение 60 мин на водяной бане или нагревательном блоке.
- Добавьте 5 мкл 10х гель загрузочного буфера для остановки реакции.
- Нагрузка 5 мкл реакцииПродуктами агарозном геле 2%, окрашенном интеркаляции пятно нуклеиновой кислоты.
- Выполнить гель при 100 В в течение 35 мин в буфере 1x КЭ.
- Визуализируйте результаты от УФ-излучения.
6. Выполните ЛАМПЫ реакции с Воссоздание буфером, содержащим HNB или флуоресцентная интеркалирования Dye
- Смешайте 125 мкл 10х Pol буфера, 200 мкл 5 М триметилглицина, 7,5 мкл 1 М MgSO 4, 7,5 мкл 20 мМ HNB (или 12,5 мкл 100x флуоресцентного интеркалирующего красителя) и 660 мкл (или 655 мкл) , воды для составляют 1 мл восстанавливающей буфера. Смешайте импульсно-встряхиванием в течение 10 сек.
- Используйте водостойких буфер, приготовленный в разделе 6, чтобы повторить шаги 5.2 - 5.6.
- Визуализируйте результаты невооруженным глазом (реакционной смеси, содержащей HNB) или УФ-света (реакционной смеси, содержащей флуоресцентный краситель интеркалирования).
7. Выполнить в режиме реального времени ЛАМПЫ реакции с сканера Tube
- Добавьте 5 мкл ДНК к reconstitutе изд реагенты, содержащие флуоресцентный краситель интеркалирования, закройте трубку и вставить его к сканеру трубки.
- Заданная температура инкубации при 60 ° С. Измерение флуоресценции при длине волны 520 нм в течение 60 мин.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Лиофилизированные ЛАМПЫ реагенты внутри 0,2 мл трубки содержит Bst ДНК - полимеразы, праймеров и дНТФ. 20 мкл восстанавливающий буфер используется для повторной приостанавливают лиофилизированные реагенты. На рисунке 1 показаны результаты реакции лампа на агарозном геле с свежеприготовленными реагентами и лиофилизированных реагентов. Лиофилизированный реагент не снижает его активность. ЛАМПА реакции , полученные обоими реагентами может обнаружить 25 копий ДНК шаблона. На рисунке 2 показано обнаружение продуктов реакции с HNB или флуоресцентного интеркалирующего красителя , присутствующего в реакции. Добавление к HNB реакции производит визуальное изменение цвета от фиолетового до синего с 25, 50 и 100 копий матрицы ДНК, присутствующих в реакциях. Включение флуоресцентного красителя интеркалирующего в реакции показывает сильный сигнал флуоресценции с помощью УФ-светом при 25, 50, и 100 копий ДНК-матриц, присутствуют. Сканер трубка была использованаВ данном исследовании для обнаружения в режиме реального времени. Эта машина может выполнять 8 реакций одновременно. На рисунке 3 показана с помощью сканера трубки для мониторинга сигналов флуоресценции в режиме реального времени с наличием флуоресцентного красителя Интеркалирующий. Флуоресцентные сигналы выше исходного уровня после того, как 14, 18, 21, и 23 мин при 10 6, 10 4, 10 3, и 100 копий ДНК - матрицы в реакции.
Рисунок 1. ЛАМПА Результаты на агарозном геле свежеприготовленными реагентами (А) и после лиофилизации реагентов (В). Реакционные смеси инкубировали при 60 ° С в течение 60 мин. (A) Lane 1, 100 пар оснований лестницы; Дорожка 2 - 3, 4 - 5, 6 - 7 и 8 - 9 представляют собой реакции с 2,5 × 10 3, 2,5 х 10 2, 2,5 х 10, и никаких копий ДНК плазмиды. (Б) Дорожка 10 - 11, 12 - 13, 14 - 15, и 16 - 17 являются REActions с 2,5 × 10 3, 2,5 х 10 2, 2,5 х 10, и 0 копий ДНК плазмиды. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. Методы для обнаружения лампах. HNB (A) или флуоресцентный краситель Интеркалирующий (В) были использованы для обнаружения лампах. Реакции проводили при 60 ° С в течение 60 мин. Полоса 1 до 5, реакции с 0, 10, 25, 50 и 100 копий плазмиды. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3. режиме реального времени обнаружения лампах. Реакции проводили при 60 ° С в течение 60 мин. Реакции с 10 6 копий плазмиды (черный), 10 4 (красный), 10 3 (зеленый), 100 (желтый), 10 (синий), 1 (оранжевый) и 0 (коричневый и светло - коричневый). Три обнаружений были выполнены независимо друг от друга. Они были очень воспроизводимые. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ранее мы разработали чувствительный и специфический анализ ЛАМПЫ таргетирования вставки элемента IS1111a 14. Элемент IS1111 был выбран потому , что он высоко консервативна среди различных штаммов C. burnetii и его высокое число копий ( от 7 до 110) в бактериях (Кли 2006). Наши результаты показали , что ЛАМПА может обнаружить около 25 копий IS1111 элемента, который может коррелировать до всего лишь одной хромосомной копии Coxiella ДНК. В этом исследовании, Bst ДНК - полимераза, Омыватель праймеры и дНТФ лиофилизировали и упакованы в сумке на молнии из алюминиевой фольги. Чувствительность этих лиофилизованных реагентов остается на 25 копий; похожие на свежеприготовленные реагенты, по крайней мере одного месяца при хранении при комнатной температуре. Очень важно, чтобы убедиться, что мешок алюминиевой фольги надлежащим образом запечатаны перед его открытием. Не следует использовать трубы, если мешок алюминиевой фольги не запечатан или если он поврежден. Это может привести к регидратации Oе лиофилизированных реагентов, что приводит к потере его реакционной способности. Другим важным шагом является повторное приостановление лиофилизированных реагентов с восстанавливающей буфером. Реакция ЛАМПА не будет работать должным образом с реагентами, которые не полностью повторно приостановлено. Из-за высоких концентраций солей в буфере для реакции и высокой вязкости раствора триметилглицина, они не могут быть успешно лиофилизировали с помощью ДНК - полимеразы Bst, ламповая праймеров и дНТФ. Особый шаг необходим для подготовки восстанавливающий буфер с этими компонентами. Потенциально реакция ЛАМПЫ может быть протестирована при низких концентрациях соли с низким или вообще без триметилглицина. Если есть условие реакции, который имеет ту же чувствительность обнаружения, но с низким содержанием соли и низкой концентрацией триметилглицин, Лиофилизированный реагент должен быть разведен с водой только. Это позволит еще больше упростить стадии реакции.
В последнее время Ван и др. 15 по сравнению двенадцать в-House ЛАМПЫ анализы с коммерциализированной изотермическим комплектом Master Mix и нашел в доме анализы имеют ложно-положительных результатов. В нашей лаборатории, мы разработали несколько ЛАМПЫ анализов для обнаружения различных бактерий и никогда не находили ложно-положительных результатов в этих анализах в доме. Кроме того, в начальной стадии разработки метода фару, анализы были испытаны с обоими в доме подготовили мастер-микс и коммерциализированного мастер-микс и никакой разницы не наблюдалось в чувствительности и специфичности анализов.
Наше исследование также представляет несколько методов, которые не только могут обнаружить лампах, не открывая реакционные трубы, чтобы уменьшить вероятность лабораторного перекрестного загрязнения, но и имеют более короткое время процесса, чтобы прочитать результаты по сравнению с методом гель-электрофореза. Преимущество использования этих методов обнаружения значительно повысит нашу способность быстро выполнить анализ и диагностику индивидуума с C. burnetii
В отличие от ПЦР на основе методов, где требуется Термоциклер, нагревательный блок, водяную баню или инкубатор, поддерживая постоянную температуру около 60 ° C это все, что требуется для анализа ЛАМПЫ. Это делает анализ особенно подходящим в условиях ограниченных ресурсов обстановке. В отличие от оригинального анализа фару, Bst ДНК - полимеразы, ламповая праймеров и дНТФ необходимо хранить при -20 ° С. Эти лиофилизированные реагенты можно хранить при комнатной температуре, что делает его еще более полезным для настройки ограниченных ресурсов, где Q лихорадка является эндемическим заболеванием. Долгосрочное исследование стабильности лиофилизированных реагентов при температуре 4 ° С, 25 ° С и 37 ° С продолжается в настоящее время. В будущем мы хотели бы продемонстрировать , что этот ЛАМПА анализ с использованием лиофилизированные реагенты могут обнаружить C. burnetii с чувствительностью сходной сПЦР в удаленной настройки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано Военно-морской центр медицинских исследований, научно-исследовательское подразделение 6000.RAD1.J.A0310 работы. Мнения, выраженные в этой статье, принадлежат авторам и не обязательно отражают официальную политику или позицию Департамента военно-морского флота, Министерства обороны или правительства США. Вэй-Мэй Чинг является сотрудником правительства США. Эта работа была подготовлена в рамках своих служебных обязанностей. Название 17 USC §105 предусматривает, что «Защита авторских прав в соответствии с этим названием не доступен для любой работы правительства Соединенных Штатов. Название 17 USC §101 определяет работу правительства США в качестве работы, подготовленный членом военной службы или сотрудником правительства США в рамках служебных обязанностей этого лица.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LAMP primers | Eurofins MWG operon | 10 nmol, salt free | Sequence designed by customer |
| Bst DNA polymerase | New England Biolabs | M0275L | 8 units/ml |
| 10x Thermo pol buffer | New England Biolabs | B9004S | |
| dNTP mixture | New England Biolabs | N0447L | 10 mM each |
| Betaine | Sigma-Aldrich | B0300 | 5 M, Trimethylglycine |
| Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | M3409-1ML | 1 M |
| 10x Bluejuice | Invitrogen | 10816-015 | gel loading buffer |
| SYBR green | Invitrogen | S7585 | 10,000x, visualize products in tubes |
| GelRed | Phenix Research Products | RGB-4103 | 10,000x, visualize products in gels |
| Lyophilized reagents | Gene Reach | ||
| Hydroxynaphthol blue | Fluka | 33936-10G | |
| ESEQuant tube scanner | Qiagen | real-time detection |
References
- Anderson, A., et al. Diagnosis and management of Q fever United States, 2013: recommendations from CDC and the Q Fever Working Group. MMWR Recomm. Rep. 62 (3), 1-30 (2013).
- Rolain, J. M., Boulos, A., Mallet, M. N., Raoult, D. Correlation between ratio of serum doxycycline concentration to MIC and rapid decline of antibody levels during treatment of Q fever endocarditis. Antimicrob. Agents and Chemother. 49 (7), 2673-2676 (2005).
- Fournier, P. E., Raoult, D. Comparison of PCR and serology assays for early diagnosis of acute Q fever. J. Clin. Microbiol. 41 (11), 5094-5098 (2003).
- Schneeberger, P. M., et al. Real-time PCR with serum samples is indispensable for early diagnosis of acute Q fever. Clin. Vaccine Immunol. 17 (2), 286-290 (2010).
- Turra, M., Chang, G., Whybrow, D., Higgins, G., Qiao, M. Diagnosis of acute Q fever by PCR on sera during a recent outbreak in rural South Australia. Ann. N Y Acad. Sci. 1078, 566-569 (2006).
- Notomi, T., et al.
- Paris, D. H., Blacksell, S. D., Newton, P. N., Day, N. P. Simple, rapid and sensitive detection of Orientia tsutsugamushi. by loo-isothermal DNA amplification. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 102 (12), 1239-1246 (2008).
- Huber, E., et al. Loop-mediated isothermal amplification assay targeting the 47-kDa gene of Orientia tsutsugamushi.: A rapid and sensitive alternative to real-time PCR. J. Med. Microb. Diagn. 1 (112), (2012).
- Pan, L., Zhang, L., Wang, G., Liu, Q. Rapid, sensitive detection of the ompB gene of spotted fever group rickettsiae by loop-mediated isothermal amplification. BMC Infect. Dis. 12 (254), (2012).
- Mori, Y., Nagamine, K., Tomita, N., Notomi, T. Detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation. Biochem. Biophys. Res. Commun. 289 (1), 150-154 (2001).
- Qiao, Y. M., et al. Loop-mediated isothermal amplification for rapid detection of Bacillus anthracis.spores. Biotechnol. Lett. 29 (12), 1939-1946 (2007).
- Tomita, N., Mori, Y., Kanda, H., Notomi, T. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of gene sequences and simple visual detection of products. Nat. Protoc. 3 (5), 877-882 (2008).
- Thekisoe, O. M., et al. Stability of Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) reagents and its amplification efficiency on crude trypanosome DNA templates. J. Vet. Med. Sci. 71 (4), 471-475 (2009).
- Chen, H. W., Ching, W. M. Development of loop-mediated isothermal amplification assays for rapid and easy detection of Coxiella Burnetii. J. Microbiol Methods. 107, 176-181 (2014).
- Wang, D., et al. A Comparison of In-House Real-Time LAMP Assays with a Commercial Assay for the Detection of Pathogenic Bacteria. Molecules. 20 (6), 9487-9495 (2015).
