Abstract
Q熱リケッチア 、Q熱を引き起こす因子は、偏性細胞内細菌です。 PCRに基づく診断アッセイは、Cを検出するために開発されています細胞培養物および臨床試料中バーネッティ DNA。 PCRは、特殊な装置や大規模なエンドユーザのトレーニングを必要とし、したがって、それは、特に、リソースに制約のある領域にルーチン作業には適していません。我々は、Cの存在を検出するためのループ媒介等温増幅（LAMP）アッセイを開発しました患者サンプル中バーネッティ 。この方法は、水浴または加熱ブロック中60℃付近の単一の温度で行われます。このLAMPアッセイの感度は、反応当たり約25コピーの検出限界を用いたPCRに非常に類似しています。このレポートでは、凍結乾燥試薬およびhydroxynaphtholブルー（HNB）または反応中の蛍光挿入色素とUVランプを使用して結果の可視化を用いて反応の調製を記載します。 LAMP試薬はlyophiliました検出感度を損なうことなくZED 1ヶ月室温（RT）で保存しました。反応混合物の調製は、複雑な工程を必要としないので、このLAMPアッセイは、特に頑強です。この方法は、Q熱が流行しているリソースが制限された設定での使用に最適です。
Introduction
小さ いグラム陰性菌コクシエラバーネッティは、世界中の人獣共通感染症であり、Q熱の原因物質です。 Q熱の世界的な分布とCの高い感染へ海外展開バーネッティ 、米軍と文民要員が流行地域に感染しているの危険にさらされています。
急性および慢性の感染症：Q熱は、2つの形で現れます。急性Q熱は、インフルエンザ様症状、肝炎、または肺炎で自身を提示し、通常、低い死亡率と自己制限疾患です。慢性Q熱は、あまり普及しているが、多くの場合、1,2-放置すれば、はるかに高い死亡率を有している心内膜炎、になります。したがって、適切な治療を導くために早期診断は患者のケアのために重要です。ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）および定量的リアルタイムPCR（定量PCR）アッセイは、Cを検出するために開発されています細胞培養物および臨床サンプル3-5 <中バーネッティ DNA/ SUP>。 PCRおよび定量PCRの両方がルーチンワークのリソースに制約のある地域でのコストがかかり、多くの場合、容易に入手できません。
もともと納富6で説明した、LAMP法（LAMP）は、代替のDNA増幅法を提供しています。 LAMPは、標的遺伝子の少なくとも6つの独立した領域を認識する特別に設計されたプライマーセットと共に、鎖置換型DNA合成のためのBst DNAポリメラーゼを使用します。 LAMPの最も重要な利点は、増幅が等温条件下で起こることです。したがって、唯一の水浴、加熱ブロックまたはインキュベータが必要です。この方法は、いくつかのリケッチア病原体7-9を検出するために使用されてきました。ゲル電気泳動により増幅されたDNA産物の可視化は、非特異的な増幅に起因する偽陽性から真陽性を区別することができる最も正確な方法です。しかし、ゲル電気泳動に関わる手順は、リソースが制限されたARのための実用的ではありませんEAS。いくつかの代替方法は、反応生成物を検出するために開発されました。このようなピロリン酸マグネシウムの形成10またはUV光11,12の下で可視化する蛍光挿入色素を使用してから派生した濁度としてこれらの代替は、ゲルを実行するよりも有利で す。 Q熱が流行し13である熱帯および亜熱帯の国では、周囲温度である25℃、37℃、で保存した場合LAMP試薬は、1ヶ月間安定でした。
LAMPアッセイはCの存在を検出するために我々の研究室で開発されました血漿試料中のバーネッティ 14。ここでは、凍結乾燥試薬からLAMP反応液を調製するためのシンプルなプロトコルを記述します。室温で保存した場合、凍結乾燥試薬は、1ヶ月間安定です。簡単に可視化手法と組み合わせると、これはCを検出するために使用するのに理想的な方法であり、リソース制限の設定においてバーネッティ 。
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Protocol
1. LAMP反応のための標準としてプラスミドDNA希釈液を調製
- （C.バーネッティ RSA 493の標的遺伝子IS1111aを含む）プラスミドを決定するために、260nmの光学密度（OD）を測定し、DNA濃度を分光光度計を使用します。 1のOD 260は、DNAを50μg/μlに相当します。
- コピー数にプラスミドDNAの量に変換します。プラスミドのサイズは6,330 bpであることから、このプラスミドの分子量は4.1×10 6グラム（6,330 bpのX 649グラム/ BP）です。プラスミドDNAの濃度は、34.2 ngの/μL（ステップ1.1で決定される）です。このDNA試料の1μlのDNAの5×10 9コピー（34.2×10 -9グラム/ 4.1×10 6 GX 6.02×10 23）に等しくする、プラスミドDNAの34.2 ngのが含まれています。
- 5×10 8コピー/μlにDNAサンプルを作るために10倍希釈するための水90μlにプラスミドDNAを10μl（5×10 9コピー/μl）を追加します。。
- 繰り返しステップ1.3は、5×10 7のDNAサンプルを調製した5×10 6、5×10 5、5×10 4、5×10 3、5×10 2、5×10 1、および5×10 0コピー/ μlの。
2. LAMP反応のための試料からDNAテンプレートを準備します
- 製造業者のプロトコルに従って市販のDNAミニキットを使用して、ヒト血漿試料からのDNAの抽出を行います。抽出のための200μlのサンプルの合計を使用して、20μl容量で抽出したDNAを溶出します。
3. 2倍LAMP反応緩衝液を準備します
- 2倍LAMP緩衝液1mlを作るために10倍ポル・バッファ、5 Mトリメチルグリシン、1MのMgSO 4、のdNTP混合物（各10mM）の280μlの水188μlに12μlの320μlの200μlのを混ぜます。 10秒間パルスボルテックスして混和します。
4.標準LAMP反応を行います
- 2倍LA12.5μlのミックスMPバッファ（ステップ3で調製した、40mMのトリス-HCl（pHは8.8）、20 mMの塩化カリウム、16mMのMgSO 4を、20mMの（NH 4）2 SO 4、0.2％トリトンX-100、1.6 Mトリメチルグリシン、1.4 mMののdNTP混合物）、プライマーミックスの1.2μlを、 のBst DNAポリメラーゼ（8 U /μl）を1μlの、水5.3μlを0.2ミリリットルのPCRチューブ内で反応混合物（20μl）を作ります。
- （ステップ1または2から）20μlの反応混合物にDNAの5μl加え、よく混ぜます。
- 近い管および水浴または加熱ブロック中で60分間60℃でインキュベートします。これは、以前に決定され、最適な反応温度です。
- 反応を停止し、10倍ゲルローディング緩衝液5μLを加えます。
- 核酸染色を挿入で染色した2％アガロースゲルに負荷反応生成物5μLを。
- 1×TBE緩衝液中で35分間、100Vでゲルを実行します。
- UV光によって結果を可視化します。
前記再構成でLAMP反応を行います試薬
- 再構成緩衝液1mlを作るために10倍ポル・バッファ、5 Mトリメチルグリシン、1 M MgSO 4を、水の667.5μlに7.5μlの200μlを125μlのを混ぜます。 10秒間パルスボルテックスして混和します。
- 密封されたアルミホイル袋から凍結乾燥試薬を含むチューブを外します。それが破損している場合アルミ箔袋が密閉されているかどうかのチューブを使用しないでください。
- 凍結乾燥試薬を再懸濁するために、各チューブに再構成緩衝液20μlを追加します。
- バッファ上下に5回ピペッティングして混ぜます。凍結乾燥試薬が完全に再懸濁されていることを確認するために見てみましょう。白色粉末をチューブに消えるはずです。
- （ステップ1または2からの）再構成試薬にDNAテンプレートの5μl加え、よく混ぜます。
- 近い管および水浴または加熱ブロック中で60分間60℃でインキュベートします。
- 反応を停止し、10倍ゲルローディング緩衝液5μLを加えます。
- 負荷反応液5μl核酸染色を挿入で染色した2％アガロースゲルに製品。
- 1×TBE緩衝液中で35分間、100Vでゲルを実行します。
- UV光によって結果を可視化します。
6. HNBまたは蛍光インターカレート色素を含む再構成緩衝液でLAMP反応を行います
- への水の10倍ポルBufferを125μlの、5 Mトリメチルグリシン、1MのMgSO 4、20mMのHNB（または100倍の蛍光挿入色素の12.5μl）を7.5μlに7.5μlの660μlの（または655マイクロリットル）の200μLをミックス再構成緩衝液1mlを作ります。 10秒間パルスボルテックスして混和します。
- 5.6 - 手順5.2を繰り返すセクション6で調製した再構成されたバッファを使用してください。
- 肉眼での結果（HNBを含む反応）またはUV光（蛍光挿入色素を含む反応）を視覚化します。
7.チューブスキャナによるリアルタイムLAMP反応を行います
- reconstitutに5μlのDNAを追加します。ED試薬は、蛍光挿入色素、近いチューブを含む、チューブスキャナにそれを挿入します。
- 60℃に設定したインキュベーション温度。 60分間の520nmでの蛍光を測定します。
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Representative Results
0.2ミリリットル管内の凍結乾燥LAMP試薬はのBst DNAポリメラーゼ、プライマー、およびdNTPが含まれています。再構成用緩衝液20μlを、凍結乾燥された試薬を再懸濁するために使用される。 図1は、新たに調製した試薬および凍結乾燥試薬を用いて、アガロースゲル上でLAMP反応結果を示します。凍結乾燥試薬は、その活性を低下させません。両方の試薬 によって調製LAMP反応は、DNA鋳型の25コピーを検出することができる。 図2は、HNBまたは反応中に存在する蛍光インターカレート染料との反応生成物の検出を示します。反応にHNBの添加は、反応中に存在するDNAテンプレートの25、50および100コピーと青紫から視覚的な色の変化を生じます。反応中の蛍光インターカレート色素を含めることは、DNAテンプレートの25、50、及び100のコピーが存在するUV光で強い蛍光シグナルを示しています。チューブスキャナを使用しましたリアルタイム検出のために本研究です。このマシンは、同時に8反応を行うことができます。蛍光挿入色素の存在と、リアルタイムで蛍光シグナルを監視するために、チューブスキャナを使用して、図3に示す図 。蛍光シグナルは、反応中、14の後にベースラインを超えている18、21、及び10 6と23分、10 4、10 3、及びDNA鋳型の100コピー。
新たに調製された試薬（A）及び凍結乾燥試薬（B）とのアガロースゲル上で 図1 LAMP結果。反応混合物を60分間60℃でインキュベートしました。 （A）レーン1、100bpラダー。レーン2から3、4から7と8 - - 5、6〜9は、2.5×10 3との反応は、ある2.5×10×10 2、2.5、およびプラスミドDNAのコピーなし。 （B）レーン10から11まで、12から13まで、14から15、および16から17はレアです2.5×10 3でctions、2.5×10 2、×10 2.5、およびプラスミドDNAの0コピー。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2 の方法は、LAMP産物を検出する。HNB（A）または蛍光インターカレート染料（B）は、LAMP産物を検出するために使用しました。反応を60分間60℃で行いました。 5レーン1、0、10、25、50、およびプラスミドの100コピーとの反応。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3。 LAMP産物の強い> リアルタイム検出。反応を60分間60℃で行いました。 10 6（黒）、10 4（赤）、10 3（緑）、100（黄色）、10（青）、1（オレンジ）と0（ブラウンとライトブラウン）プラスミドのコピーとの反応。三つの検出は、独立して行きました。彼らは非常に再現性があった。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
以前、我々は、挿入要素IS1111a 14をターゲットに高感度で特異的なLAMPアッセイを開発しました。それは非常にC.の異なる株の間で保存されているため、IS1111要素が選択されましたバーネッティと細菌中のコピーのその高い番号（110から7）（クレー2006）。我々の結果は、LAMPはコクシエラ DNAのわずか1染色体コピーに相関し得るIS1111要素の約25コピーを検出することができることを示しました。本研究では、 のBst DNAポリメラーゼ、LAMPプライマー、およびdNTPを凍結乾燥し、圧縮さアルミ箔袋に包装されます。これらの凍結乾燥試薬の感度は25コピーのまま。室温で保存された少なくとも1ヶ月間、新たに調製した試薬に似ています。アルミ箔袋が適切にそれを開く前に、密閉されていることを確認してくださいすることが非常に重要です。それが破損している場合アルミ箔袋が密閉されているかどうかのチューブを使用しないでください。これは、再水和Oを引き起こす可能性がありますその反応性の喪失をもたらす凍結乾燥試薬F。他の重要なステップは、再構成緩衝液を用いて凍結乾燥試薬の再懸濁液です。 LAMP反応は、完全に再懸濁されていない試薬で正しく動作しません。なぜなら、反応緩衝液およびトリメチルグリシン溶液の高粘度の高い塩濃度で、それらは正常のBst DNAポリメラーゼ、LAMPプライマー、およびdNTPを用いて凍結乾燥することができません。特別なステップは、これらのコンポーネントを用いて再構成バッファを用意する必要があります。潜在的LAMP反応は、低または無トリメチルグリシンとの低塩濃度で試験することができます。同一の検出感度を有するが、低塩および低トリメチルグリシン濃度の反応条件が存在する場合、凍結乾燥された試薬は、水で再構成する必要があります。これにより、反応工程を簡素化します。
最近、Wangら 15は、内12を比較しました市販等温マスターミックスキットでLAMPアッセイ - ハウスや社内アッセイは、偽陽性の結果を持っているが見つかりました。当研究室では、我々は異なる細菌の検出のためのいくつかのLAMPアッセイを開発しており、これらの社内アッセイにおいて偽陽性の結果を発見したことがありません。また、LAMP法の開発の初期段階において、アッセイは、社内で調製したマスターミックスと商品化マスターミックスの両方で試験し、有意差がアッセイ」感度および特異性は観察されませんでした。
我々の研究はまた、実験室でのクロスコンタミネーションの可能性を減少させるために反応チューブを開けることなく、LAMP産物を検出するだけでなく、結果は、ゲル電気泳動法と比較読み取る短い処理時間を持つことができるだけでなく、いくつかの方法を提示します。これらの検出方法を使用する利点は、非常に迅速にアッセイを実施し、Cと個体を診断する能力を強化しますバーネッティ
サーモサイクラーが必要とされるPCRベースの方法とは異なり、60℃付近の一定温度を維持する加熱ブロック、水浴またはインキュベータは、LAMPアッセイのために必要とされるすべてです。これは、リソースが制限された設定でのアッセイは、特に適しています。オリジナルのLAMPアッセイとは異なり、 のBst DNAポリメラーゼ、LAMPプライマー、およびdNTPは、-20℃で保存する必要があります。これらの凍結乾燥された試薬は、Q熱が流行しているリソースが制限された設定のそれがさらに便利になり、室温で保存することができます。 4°C、25°C、37°Cで凍結乾燥された試薬の長期安定性研究は現在進行中です。将来的には、凍結乾燥された試薬を用いて、このLAMPアッセイはCを検出できることを証明したいと思い同様の感度でバーネッティPCRのリモート設定インチ
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Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Acknowledgments
この研究は、米海軍医学研究センター、研究作業単位6000.RAD1.J.A0310によってサポートされていました。この記事で表明された見解は執筆者のものであり、必ずしも海軍省、国防省、または米国政府の公式な政策や位置を反映するものではありません。魏メイチンは、米国政府の従業員です。この作品は彼女の公務の一部として用意しました。タイトル17 USC§105」このタイトルの下に著作権保護は、米国政府のいずれかの作業には使用できません。」ことを提供しますタイトル17 USC§101は、その人の公務の一環として、米国政府の兵役のメンバーや従業員によって調製作品として米国政府の仕事を定義します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LAMP primers | Eurofins MWG operon | 10 nmol, salt free | Sequence designed by customer |
| Bst DNA polymerase | New England Biolabs | M0275L | 8 units/ml |
| 10x Thermo pol buffer | New England Biolabs | B9004S | |
| dNTP mixture | New England Biolabs | N0447L | 10 mM each |
| Betaine | Sigma-Aldrich | B0300 | 5 M, Trimethylglycine |
| Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | M3409-1ML | 1 M |
| 10x Bluejuice | Invitrogen | 10816-015 | gel loading buffer |
| SYBR green | Invitrogen | S7585 | 10,000x, visualize products in tubes |
| GelRed | Phenix Research Products | RGB-4103 | 10,000x, visualize products in gels |
| Lyophilized reagents | Gene Reach | ||
| Hydroxynaphthol blue | Fluka | 33936-10G | |
| ESEQuant tube scanner | Qiagen | real-time detection |
References
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