Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Utvikling av lyofilisert Loop-mediert Isotermiske amplifiseringsreagenser for deteksjon av Published: April 18, 2016 doi: 10.3791/53839
Automatic Translation
1, 1
1Viral and Rickettsial Diseases Department, Naval Medical Research Center

Abstract

Coxiella burnetii, agenten forårsaker Q-feber er en obligat intracellulær bakterie. PCR-baserte diagnostiske analyser er blitt utviklet for påvisning av C. burnetii DNA i cellekulturer og kliniske prøver. PCR krever spesialisert utstyr og omfattende opplæring av sluttbruker, og derfor er det ikke egnet for rutinearbeid, spesielt i en ressurs med begrenset område. Vi har utviklet en sløyfe-mediert isoterm amplifisering (lampe) assay for å påvise nærværet av C. burnetii i pasientprøver. Denne fremgangsmåten utføres ved en enkelt temperatur rundt 60 ° C i et vannbad eller varmeblokk. Følsomheten av denne lampen analysen er svært lik PCR med en deteksjonsgrense på ca. 25 kopier pr reaksjon. Denne rapporten beskriver fremstillingen av reaksjonen ved bruk av lyofiliserte reagenser og visualisering av resultater ved hjelp av hydroxynaphthol blå (HNB) eller en UV-lampe med fluorescerende interkalerende fargestoff i reaksjonen. LAMP reagenser var lyophilized og lagret ved romtemperatur (RT) i en måned uten tap av følsomhet. Dette LAMP analysen er spesielt robust fordi reaksjonsblandingen preparatet ikke involverer kompliserte trinn. Denne metoden er ideell for bruk i ressursbegrensede miljøer hvor Q-feber er endemisk.

Introduction

Den lille Gram-negative bakterien Coxiella burnetii er den utløsende agent for Q-feber, som er et verdensomspennende zoonose. På grunn av Q-feber verdensomspennende distribusjon og høy smittsomhet av C. burnetii, amerikanske militære og sivilt personell utplassert i utlandet står i fare for å bli smittet i endemiske områder.

Q-feber manifesterer seg i to former: akutte og kroniske infeksjoner. Akutt Q-feber presenterer seg med influensalignende symptomer, hepatitt eller lungebetennelse, og er vanligvis en selvbegrensende sykdom med lav dødelighet. Kronisk Q-feber, mens mindre utbredt, ofte resulterer i endokarditt, som har en mye høyere dødelighet hvis venstre ubehandlet 1,2. Derfor, for å tidlig diagnose lede en passende behandling er avgjørende for pasientbehandlingen. Polymerase kjedereaksjon (PCR) og kvantitativ sanntid PCR (qPCR) analyser er blitt utviklet for påvisning av C. burnetii DNA i cellekulturer og kliniske prøver 3-5 </ Sup>. Både PCR og qPCR er kostbare og ofte ikke lett tilgjengelig i ressursbegrensede områder for rutinearbeid.

Sløyfe-mediert isotermisk forsterkning (LAMP) opprinnelig beskrevet av Notomi 6, og tilbyr en alternativ DNA forsterkning metoden. LAMP bruker Bst DNA polymerase for tråd forskyvning DNA-syntese sammen med spesialdesignede primersett som gjenkjenner minst seks selvstendige regioner av målet genet. Den største fordelen av LAMP er at forsterkningen skjer under isotermiske forhold. Derfor er bare et vannbad, varmeblokk eller en inkubator nødvendig. Denne metoden har blitt anvendt for å detektere flere rickettsial patogener 7-9. Visualisering av amplifiserte DNA-produkter ved gelelektroforese er den mest nøyaktige metode som kan skille sanne positive fra falske positive på grunn av ikke-spesifikk amplifikasjon. Men de prosedyrer involvert i gel elektroforese er ikke praktisk for ressursbegrenset arEAS. Flere alternative fremgangsmåter ble utviklet for å detektere reaksjonsproduktene. Disse alternative, for eksempel turbiditet avledet fra magnesium pyrofosfat formasjonen 10 eller ved hjelp av en fluorescerende interkalerende fargestoff for å bli visualisert under UV-lys 11,12 er mer gunstig enn å kjøre en gel. LAMP- reagensene var stabile i en måned når det lagres ved 25 ° C og 37 ° C, som er omgivelsestemperaturer i tropiske og subtropiske land hvor Q-feber er endemisk 13.

En lampe assay ble utviklet i vårt laboratorium for å påvise nærvær av C. burnetii i plasmaprøver 14. Her beskriver vi en enkel protokoll for fremstilling av lampen reaksjonsblandingen fra de lyofiliserte reagenser. De lyofiliserte reagenser er stabile i en måned når det lagres ved romtemperatur. Når det kombineres med en enkel visualisering metode, er dette en ideell metode å bruke for å påvise C. burnetii i en ressursbegrenset setting.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Forbered plasmid DNA fortynninger som standard for LAMP Reaction

  1. Bruke et spektrofotometer for å måle den optiske tetthet (OD) ved 260 nm for å bestemme plasmidet (inneholdende target-genet IS1111a av C. burnetii RSA 493) DNA-konsentrasjon. En OD 260 på 1 tilsvarer 50 ug / ul av DNA.
  2. Konverter mengden av plasmid-DNA inn i kopiantall. Siden størrelsen på plasmidet er 6330 bp, molekylvekten av dette plasmid er 4,1 x 10 6 g (6330 bp x 649 g / bp). DNA-konsentrasjonen av plasmidet er 34,2 ng / mL (som bestemt fra trinn 1.1). 1 pl av denne DNA-prøve inneholder 34,2 ng av plasmid-DNA, noe som tilsvarer 5 x 10 ni kopier (34,2 x 10 -9 g / 4,1 x 10 6 gx 6.02 x 10 23) av DNA.
  3. Tilsett 10 pl av plasmid-DNA (5 x 10 ni kopier / il) til 90 ul vann i et 10 gangers fortynning for å lage en DNA-prøve av 5 x 10 8 kopier / ul.
  4. Gjenta trinn 1.3 for å fremstille DNA-prøver av 5 x 10 7, 5 x 10 6, 5 x 10 5, 5 x 10 4, 5 x 10 3, 5 x 10 2, 5 x 10 1, og 5 x 10 0 kopier / ul.

2. Forbered DNA mal fra Prøver for LAMP Reaction

  1. Utføre DNA-ekstraksjon fra humane plasmaprøver ved å bruke et kommersielt DNA mini-sett i overensstemmelse med fabrikantens protokoll. Bruke en total på 200 ul prøve for utvinning og elueres ekstraherte DNA i et 20 ul volum.

3. Forbered 2x LAMP reaksjonsbuffer

  1. Bland 200 ul 10 x Pol buffer, 320 ul av 5 M trimethylglycine, 12 pl av 1 M MgSO4, 280 ul dNTP-blanding (10 mM hver) og 188 mL vann for å lage 1 ml 2 x LAMPE buffer. Bland ved puls-virvling i 10 sek.

4. Utfør Standard LAMP Reaction

  1. Bland 12,5 mL av 2x LAMP-buffer (som fremstilt i trinn 3; 40 mM Tris-HCl (pH 8,8), 20 mM KCl, 16 mM MgSO4, 20 mM (NH4) 2 SO 4, 0,2% Triton X-100, 1,6 M trimethylglycine, 1.4 mM dNTP-blanding), 1,2 ul primer blanding, 1 ul Bst-DNA-polymerase (8 U / pl) og 5,3 pl vann til å gjøre reaksjonsblandingen (20 pl) i et 0,2 ml PCR-rør.
  2. Tilsett 5 ul DNA (fra trinn 1 eller 2) til 20 ul reaksjonsblandingen og bland godt.
  3. Tett rør og inkuberes ved 60 ° C i 60 min i et vannbad eller varmeblokk. Dette er den optimale reaksjonstemperaturen bestemt tidligere.
  4. Tilsett 5 ul 10 x gel lastebuffer for å avslutte reaksjonen.
  5. Belastning 5 ul av reaksjonsprodukter til en 2% agarosegel farget med interkalerende nukleinsyre flekken.
  6. Kjør gelen ved 100 V i 35 minutter i 1 x TBE-buffer.
  7. Visualisere resultatene av UV-lys.

5. Utfør LAMP Reaksjon med Rekonstituertreagenser

  1. Bland 125 mL 10x Pol buffer, 200 ul 5 M trimethylglycine, 7,5 mL av en M MgSO4, til 667,5 mL vann gjør 1 ml oppløsning buffer. Bland ved puls-virvling i 10 sek.
  2. Fjerne rør som inneholder de lyofiliserte reagenser fra den forseglede aluminiumsfolieposen. Ikke bruk rørene dersom aluminiumsfolie, posen er forseglet, eller hvis den er skadet.
  3. Tilsett 20 ul buffer rekonstituering i hvert rør for å resuspendere lyofiliserte reagenser.
  4. Bland ved pipettering buffer opp og ned 5 ganger. Ta en titt for å sørge for at de frysetørrede reagenser er helt re-suspendert. Det hvite pulveret skal forsvinne i røret.
  5. Tilsett 5 ul av DNA-templatet (fra trinn 1 eller 2) til de rekonstituerte reagensene og bland godt.
  6. Tett rør og inkuberes ved 60 ° C i 60 min i et vannbad eller varmeblokk.
  7. Tilsett 5 ul 10 x gel lastebuffer for å avslutte reaksjonen.
  8. Load 5 mL av reaksjonsprodukter til en 2% agarosegel farget med interkalerende nukleinsyre flekk.
  9. Kjør gelen ved 100 V i 35 minutter i 1 x TBE-buffer.
  10. Visualisere resultatene av UV-lys.

6. Utfør LAMP Reaksjon med rekonstitusjonsbuffer Inneholder HNB eller Fluorescent interkalere Dye

  1. Bland 125 ul av 10 x Pol buffer, 200 ul av 5 M trimethylglycine, 7,5 pl 1 M MgSO4, 7,5 pl 20 mM HNB (eller 12,5 ul 100x fluorescerende interkalerende fargestoff) og 660 ul (eller 655 pl) av vann til lage 1 ml oppløsning buffer. Bland ved puls-virvling i 10 sek.
  2. Bruk den rekonstituerte buffer utarbeidet i § 6 til å gjenta trinnene 5.2 - 5.6.
  3. Visualisere resultatene med det blotte øye (reaksjons-inneholdende HNB) eller et UV-lys (reaksjonsinneholdende fluorescerende interkalerende fargestoff).

7. Utfør sanntid LAMP Reaksjon med Tube Scanner

  1. Tilsett 5 ul DNA til reconstituted reagenser som inneholder fluorescerende interkalerende fargestoff, nær tube og sett det inn i røret skanner.
  2. Innstilt temperatur inkubasjon ved 60 ° C. Måle fluorescens ved 520 nm i 60 min.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De frysetørrede LAMP reagenser inne i 0,2 ml tube inneholder Bst DNA polymerase, primere, og dNTP. 20 ul rekonstitusjonsbuffer brukes til å re-suspendere de lyofiliserte reagenser. Figur 1 viser LAMP reaksjons resultatene på agarosegel med nylagde reagenser og lyofiliserte reagenser. Det lyofiliserte reagens ikke redusere sin aktivitet. LAMPE reaksjoner fremstilt av begge reagenser kan detektere 25 kopier av DNA-templat. Figur 2 viser påvisningen av reaksjonsproduktene med HNB eller fluorescerende interkalerende fargestoff til stede i reaksjonen. Tilsetning av HNB til reaksjonsbringer en visuell fargeforandring fra purpur til blå med 25, 50 og 100 kopier av DNA-templatet er tilstede i reaksjonene. Inkludering av fluorescerende interkalerende fargestoff i reaksjons viser en sterk fluorescens signal med UV-lys ved 25, 50 og 100 kopier av DNA-templater er til stede. En tube skanner ble brukti denne studien for sporing i sanntid. Denne maskinen kan utføre 8 reaksjoner samtidig. Figur 3 viser ved hjelp av røret skanneren til å overvåke fluorescens signaler i sanntid med fluorescerende interkalerende fargestoff tilstedeværelse. Fluorescens-signalene er over utgangsverdien etter 14, 18, ​​21, og 23 min med 10 6, 10 4, 10 3, og 100 kopier av DNA-templatet i reaksjonene.

Figur 1
Figur 1. LAMP Resultater på agarosegel med nylagde Reagenser (A) og frysetørket Reagenser (b). Reaksjonsblandingene ble inkubert ved 60 ° C i 60 min. (A) Felt 1, 100 bp stige; Felt 2 - 3 4 - 5, 6 - 7 og 8 - 9 er reaksjoner med 2,5 x 10 3, 2,5 x 10 2, 2,5 x 10, og ingen kopier av plasmid-DNA. (B) Felt 10 - 11, 12 - 13 og 14 - 15, og 16 - 17 er reactions med 2,5 x 10 3, 2,5 x 10 2, 2,5 x 10, og 0 kopier av plasmid DNA. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2. Fremgangsmåter for å oppdage LAMPE produkter. HNB (A) eller fluorescerende interkalerende fargestoff (B) ble brukt til å påvise LAMPE produkter. Reaksjoner ble utført ved 60 ° C i 60 min. Lane 1-5, reaksjoner med 0, 10, 25, 50 og 100 kopier av plasmidet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3. sporing i sanntid av LAMPE produkter. Reaksjoner ble utført ved 60 ° C i 60 min. Reaksjoner med 10 6 (svart), 10 4 (rød), 10 3 (grønn), 100 (gul), 10 (blå), 1 (oransje) og 0 (brun og lys brun) kopier av plasmidet. Tre påvisninger ble utført uavhengig. De var svært reproduserbare. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Tidligere har vi utviklet en sensitiv og spesifikk LAMP analyse rettet mot innsetting element IS1111a 14. Den IS1111 element ble valgt fordi det er sterkt konservert blant de ulike stammer av C. burnetii og sitt høye antall kopier (7-110) i bakterier (Klee 2006). Våre resultater viste at lampen kan detektere omtrent 25 kopier av IS1111 element, som kan relateres til så lite som en kromosomal kopi av Coxiella DNA. I denne studien ble Bst DNA polymerase, LAMP primere, og dNTP frysetørket og pakket i en zippet aluminiumsfolie bag. Sensitiviteten til disse lyofiliserte reagenser forblir ved 25 kopier; lik den ferskt tilberedte reagenser for minst én måned når de lagres ved romtemperatur. Det er svært viktig å sørge for at aluminiumsfolien bag er ordentlig lukket før du åpner den. Ikke bruk rørene dersom aluminiumsfolie, posen er forseglet, eller hvis den er skadet. Dette kan føre til at rehydrering of de lyofiliserte reagenser som fører til tap av dets reaktivitet. Den andre kritiske trinn er re-suspensjon av de lyofiliserte reagenser med tilberedning buffer. LAMP reaksjonen vil ikke fungere ordentlig med reagenser som ikke er fullt re-suspendert. På grunn av den høye saltkonsentrasjoner i reaksjonsbuffer og høye viskositet trimethylglycine oppløsning, kan de ikke være vellykket frysetørket med Bst-DNA-polymerase, lampe primere, og dNTP. En spesiell trinn er nødvendig for å fremstille rekonstitusjon buffer med disse komponentene. Potensielt LAMP reaksjon kan testes ved lave saltkonsentrasjoner med lav eller ingen trimethylglycine. Hvis det er en reaksjon tilstand som har samme følsomhet, men med lavt saltinnhold og lav trimethylglycine konsentrasjon, bare trenger lyofilisert reagens som skal rekonstitueres med vann. Dette vil ytterligere forenkle reaksjonstrinn.

Nylig har Wang et al., 15 sammenlignet med tolv i-house LAMP analyser med den kommersialiserte isotermisk Master Mix kit og fant interne analyser har falske positive resultater. I vårt laboratorium har vi utviklet flere LAMPE assays for påvisning av forskjellige bakterier og har aldri funnet falske positive resultater i disse in-house analyser. Videre i begynnelsen stadier av utviklingen av LAMP-metoden, ble analysene testet med både in-house forberedt mester mix og kommersialisert mester mix og ingen forskjell ble observert i analysene 'sensitivitet og spesifisitet.

Vår studie presenterer også flere metoder som ikke bare kan påvise lampens produkter uten å åpne reaksjonsrørene for å redusere sannsynligheten for laboratorie krysskontaminering, men har også en kortere prosess tid til å lese resultatene kan sammenliknes gelelektroforese metode. Fordelen med å bruke disse påvisningsmetoder vil i stor grad øke vår evne til raskt å utføre analysen og diagnostisere et individ med C. burnetii

I motsetning til PCR-baserte metoder hvor en termosykler er nødvendig, for en varmeblokk, vannbad eller inkubator opprettholde en konstant temperatur rundt 60 ° C er alt som er nødvendig for lampen analysen. Dette gjør analysen spesielt egnet i ressursbegrenset miljø. I motsetning til den opprinnelige LAMP-analysen, Bst DNA polymerase, LAMP primere, og dNTP må lagres ved -20 ° C. Disse lyofiliserte reagenser kan oppbevares i romtemperatur som gjør det enda mer nyttig for en ressurs-begrenset setting der Q-feber er endemisk. Den langtidsstabilitetsstudium av de lyofiliserte reagenser ved 4 ° C, 25 ° C, og 37 ° C er tiden pågår. I fremtiden ønsker vi å vise at dette LAMP analysen bruker lyofiliserte reagenser kan oppdage C. burnetii med følsomhet lik somav PCR i en ekstern innstilling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noe å avsløre.

Acknowledgments

Denne forskningen ble støttet av Naval Medical Research Center, forskningsarbeid enhet 6000.RAD1.J.A0310. Synspunktene i denne artikkelen er de av forfatterne, og reflekterer ikke nødvendigvis den offisielle politikk eller plasseringen av Department of the Navy, Department of Defense, eller den amerikanske regjeringen. Wei-Mei Ching er en ansatt av den amerikanske regjeringen. Dette arbeidet ble utarbeidet som en del av hennes offisielle plikter. Tittel 17 USC §105 fastsetter at "Copyright beskyttelse under denne tittelen er ikke tilgjengelig for noe arbeid av myndighetene i USA. Tittel 17 USC §101 definerer en amerikansk regjering arbeid som arbeid utarbeidet av militærtjeneste medlem eller ansatt av den amerikanske regjeringen som en del av vedkommendes tjenesteplikter.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LAMP primers Eurofins MWG operon 10 nmol, salt free Sequence designed by customer
Bst DNA polymerase New England Biolabs M0275L 8 units/ml
10x Thermo pol buffer New England Biolabs B9004S
dNTP mixture New England Biolabs N0447L 10 mM each
Betaine Sigma-Aldrich B0300 5 M, Trimethylglycine
Magnesium Sulfate Sigma-Aldrich M3409-1ML 1 M
10x Bluejuice Invitrogen 10816-015 gel loading buffer
SYBR green Invitrogen S7585 10,000x, visualize products in tubes
GelRed Phenix Research Products RGB-4103 10,000x, visualize products in gels
Lyophilized reagents Gene Reach
Hydroxynaphthol blue Fluka 33936-10G
ESEQuant tube scanner Qiagen real-time detection

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Anderson, A., et al. Diagnosis and management of Q fever United States, 2013: recommendations from CDC and the Q Fever Working Group. MMWR Recomm. Rep. 62 (3), 1-30 (2013).
  2. Rolain, J. M., Boulos, A., Mallet, M. N., Raoult, D. Correlation between ratio of serum doxycycline concentration to MIC and rapid decline of antibody levels during treatment of Q fever endocarditis. Antimicrob. Agents and Chemother. 49 (7), 2673-2676 (2005).
  3. Fournier, P. E., Raoult, D. Comparison of PCR and serology assays for early diagnosis of acute Q fever. J. Clin. Microbiol. 41 (11), 5094-5098 (2003).
  4. Schneeberger, P. M., et al. Real-time PCR with serum samples is indispensable for early diagnosis of acute Q fever. Clin. Vaccine Immunol. 17 (2), 286-290 (2010).
  5. Turra, M., Chang, G., Whybrow, D., Higgins, G., Qiao, M. Diagnosis of acute Q fever by PCR on sera during a recent outbreak in rural South Australia. Ann. N Y Acad. Sci. 1078, 566-569 (2006).
  6. Notomi, T., et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 28 (12), (2000).
  7. Paris, D. H., Blacksell, S. D., Newton, P. N., Day, N. P. Simple, rapid and sensitive detection of Orientia tsutsugamushi. by loo-isothermal DNA amplification. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 102 (12), 1239-1246 (2008).
  8. Huber, E., et al. Loop-mediated isothermal amplification assay targeting the 47-kDa gene of Orientia tsutsugamushi.: A rapid and sensitive alternative to real-time PCR. J. Med. Microb. Diagn. 1 (112), (2012).
  9. Pan, L., Zhang, L., Wang, G., Liu, Q. Rapid, sensitive detection of the ompB gene of spotted fever group rickettsiae by loop-mediated isothermal amplification. BMC Infect. Dis. 12 (254), (2012).
  10. Mori, Y., Nagamine, K., Tomita, N., Notomi, T. Detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation. Biochem. Biophys. Res. Commun. 289 (1), 150-154 (2001).
  11. Qiao, Y. M., et al. Loop-mediated isothermal amplification for rapid detection of Bacillus anthracis.spores. Biotechnol. Lett. 29 (12), 1939-1946 (2007).
  12. Tomita, N., Mori, Y., Kanda, H., Notomi, T. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of gene sequences and simple visual detection of products. Nat. Protoc. 3 (5), 877-882 (2008).
  13. Thekisoe, O. M., et al. Stability of Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) reagents and its amplification efficiency on crude trypanosome DNA templates. J. Vet. Med. Sci. 71 (4), 471-475 (2009).
  14. Chen, H. W., Ching, W. M. Development of loop-mediated isothermal amplification assays for rapid and easy detection of Coxiella Burnetii. J. Microbiol Methods. 107, 176-181 (2014).
  15. Wang, D., et al. A Comparison of In-House Real-Time LAMP Assays with a Commercial Assay for the Detection of Pathogenic Bacteria. Molecules. 20 (6), 9487-9495 (2015).

Tags

Infeksjon Lvofilisering LAMP Isoterm, Q-feber DNA deteksjon
Utvikling av lyofilisert Loop-mediert Isotermiske amplifiseringsreagenser for deteksjon av<em&gt; Coxiella burnetii</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, H. W., Ching, W. M. The… More

Chen, H. W., Ching, W. M. The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii. J. Vis. Exp. (110), e53839, doi:10.3791/53839 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter