Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

De ontwikkeling van gevriesdroogde Loop-gemedieerde Isotherme Amplification reagentia voor de detectie van Published: April 18, 2016 doi: 10.3791/53839
Automatic Translation
1, 1
1Viral and Rickettsial Diseases Department, Naval Medical Research Center

Abstract

Coxiella burnetii, de agent waardoor Q-koorts, is een obligaat intracellulaire bacterie. PCR gebaseerde diagnostische testen ontwikkeld voor het detecteren C. burnetii DNA in celculturen en klinische monsters. PCR vereist gespecialiseerde apparatuur en uitgebreide training van eindgebruikers, en daarom niet geschikt voor routinematige werken vooral in een gebied met beperkte hulpbronnen. We hebben a-loop gemedieerde isotherme amplificatie (LAMP) test om de aanwezigheid van C. detecteren ontwikkeld burnetii in monsters van patiënten. Deze werkwijze wordt uitgevoerd bij een temperatuur rond 60 ° C in een waterbad of verwarmingsblok. De gevoeligheid van deze assay LAMP is vergelijkbaar met PCR met een detectielimiet van ongeveer 25 kopieën per reactie. Dit rapport beschrijft de bereiding van het reactiemengsel middels gevriesdroogde reagentia en visualisatie van resultaten via Hydroxynaftolblauw blauw (HNB) of een UV-lamp met fluorescerende intercalerende kleurstof in het reactiemengsel. De LAMP reagentia waren lyophilized en bewaard bij kamertemperatuur (KT) gedurende één maand zonder verlies van detectiegevoeligheid. Dit LAMP test is bijzonder robuust omdat het reactiemengsel preparaat geen complexe stappen omvatten. Deze methode is ideaal voor gebruik in beperkte middelen waar de Q-koorts endemisch is.

Introduction

De kleine Gram-negatieve bacterie Coxiella burnetii is de verwekker van Q-koorts, die wereldwijd zoönose. Als gevolg van de wereldwijde distributie Q-koorts en de hoge infectiviteit van C. burnetii, de VS militair en civiel personeel in het buitenland ingezet lopen het risico van besmetting in de endemische gebieden.

Q-koorts manifesteert zich in twee vormen: acute en chronische infecties. Acute Q-koorts presenteert zich met griepachtige symptomen, hepatitis, of longontsteking, en is meestal een self-limiting ziekte met een lage sterfte. Chronische Q-koorts, terwijl minder gangbaar, resulteert vaak in endocarditis, die een veel hogere sterftecijfer heeft indien onbehandeld 1,2. Daarom, vroege diagnose te begeleiden een passende behandeling is van cruciaal belang voor de patiëntenzorg. Polymerase kettingreactie (PCR) en kwantitatieve real time PCR (qPCR) assays ontwikkeld voor het detecteren C. burnetii DNA in celculturen en klinische monsters 3-5 </ Sup>. Zowel PCR en qPCR zijn duur en vaak niet direct beschikbaar in resource-constrained gebieden voor routinewerk.

Oorspronkelijk beschreven door Notomi 6-loop gemedieerde isotherme amplificatie (LAMP) biedt een alternatieve DNA-amplificatie methode. LAMP gebruikt Bst DNA polymerase voor strengverplaatsing DNA-synthese met speciaal ontworpen primersets die ten minste zes onafhankelijke gebieden van het doelgen herkennen. Het belangrijkste voordeel van LAMP is dat amplificatie plaats onder isotherme omstandigheden. Daarom wordt slechts een waterbad, verwarming blok of een incubator vereist. Deze methode werd gebruikt om verschillende rickettsia ziekteverwekkers 7-9 detecteren. Visualisatie van geamplificeerde DNA-producten door gelelektroforese is de meest accurate methode die terecht positieve valse positieven kunnen differentiëren door niet-specifieke amplificatie. Maar de bij gelelektroforese procedures niet praktisch voor beperkte middelen arEAS. Verschillende alternatieve methoden ontwikkeld om de reactieproducten gedetecteerd. Deze alternatieve zoals troebelheid afgeleid van magnesiumpyrofosfaat formatie 10 of met een fluorescerende intercalerende kleurstof onder UV-licht 11,12 worden gevisualiseerd gunstiger dan het draaien van een gel. De LAMP reagentia waren een maand stabiel indien bewaard bij 25 ° C en 37 ° C, waarbij omgevingstemperatuur in tropische en subtropische landen waarin Q-koorts endemisch 13.

Een LAMP assay werd ontwikkeld in ons laboratorium om de aanwezigheid van sporen C. burnetii in 14 plasmamonsters. Hier beschrijven we een eenvoudig protocol voor de bereiding van de LAMP reactiemengsel uit de gevriesdroogde reagentia. De gevriesdroogde reagentia een maand stabiel indien bewaard bij kamertemperatuur. In combinatie met een eenvoudige visualisatiemethode is dit een ideale methode te gebruiken voor het detecteren C. burnetii in een beperkte middelen setting.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Bereid Plasmid DNA verdunningen als norm voor LAMP Reaction

  1. Gebruik een spectrofotometer om de optische dichtheid (OD) gemeten bij 260 nm aan het plasmide (bevattende doelwitgen IS1111a van C. burnetii RSA 493) DNA-concentratie te bepalen. Een OD 260 van 1 gelijk aan 50 ug / ul DNA.
  2. Zetten de hoeveelheid plasmide DNA in het kopieaantal. Aangezien de grootte van het plasmide 6330 bp, het molecuulgewicht van dit plasmide is 4,1 x 10 6 g (6330 bp x 649 g / bp). De DNA-concentratie van het plasmide 34,2 ng / pl (zoals bepaald uit stap 1.1). 1 pl van deze DNA-monster bevat 34,2 ng plasmide-DNA, hetgeen neerkomt op 5 x 10 9 kopieën (34,2 x 10 -9 g / 4,1 x 10 6 GX 6.02 x 10 23) van DNA.
  3. Voeg 10 ul van plasmide-DNA (5 x 10 9 kopieën / ul) aan 90 ul van water voor een 10-voudige verdunning van een DNA-monster van 5 x 10 8 kopieën / pl.
  4. Herhaal stap 1,3 tot DNA-monsters van 5 x 10 7 bereiden, 5 x 10 6, 5 x 10 5, 5 x 10 4, 5 x 10 3, 5 x 10 2, 5 x 10 1, en ​​5 x 10 0 kopieën / pl.

2. Bereid Template DNA van Monsters voor LAMP Reaction

  1. Voer DNA extractie uit humaan plasma onder toepassing van een commerciële DNA Mini Kit volgens het protocol van de fabrikant. Met in totaal 200 gl monster voor extractie en elueren geëxtraheerde DNA in een 20 ui volume.

3. Maak 2x LAMP Reaction Buffer

  1. Meng 200 pl 10x Pol buffer, 320 pl 5 M trimethylglycine, 12 gl 1 M MgSO4, 280 ui dNTP mengsel (10 mM elk) en 188 gl water tot 1 ml 2x LAMP buffer maken. Mix van pulse-vortexen gedurende 10 sec.

4. Voer Standard LAMP Reaction

  1. Meng 12,5 pi 2x LAMP buffer (zoals bereid in stap 3; 40 mM Tris-HCl (pH 8,8), 20 mM KCl, 16 mM MgSO4, 20 mM (NH 4) 2 SO 4, 0,2% Triton X-100, 1,6 M trimethylglycine, 1,4 mM dNTP mengsel), 1,2 pl primer mix, 1 ui Bst DNA polymerase (8 U / pl) en 5,3 pi water reactiemengsel (20 ui) in een 0,2 ml PCR buis maken.
  2. Voeg 5 pl DNA (van stap 1 en 2) naar de 20 pi reactiemengsel en meng goed.
  3. Afsluiten buis en incubeer bij 60 ° C gedurende 60 min in een waterbad of verwarmingsblok. Dit is de optimale reactietemperatuur vooraf bepaald.
  4. Voeg 5 ui 10X gelbeladingsbuffer om de reactie te beëindigen.
  5. Belasting 5 pi reactieproducten tot een 2% agarosegel gekleurd met intercalerende nucleïnezuur vlek.
  6. Run gel bij 100 V gedurende 35 minuten in 1 x TBE buffer.
  7. Visualiseer de resultaten door UV-licht.

5. Voer LAMP Reactie met Gereconstitueerdreagentia

  1. Meng 125 gl 10x Pol buffer, 200 pl 5 M trimethylglycine, 7,5 gl 1 M MgSO4, 667,5 ui water 1 ml buffer reconstitutie maken. Mix van pulse-vortexen gedurende 10 sec.
  2. Verwijder buizen die gevriesdroogde reagentia uit de verzegelde aluminiumfoliezak bevatten. Laat de buizen als de aluminiumfolie zak niet is afgedicht gebruikt of als het beschadigd is.
  3. Voeg 20 ul van reconstitutie buffer in elke buis opnieuw te suspenderen gevriesdroogde reagentia.
  4. Meng door pipetteren buffer op en neer 5 keer. Neem een ​​kijkje om te controleren of de gevriesdroogde reagentia volledig opnieuw opgeschort. Het witte poeder moet verdwijnen in de buis.
  5. Voeg 5 ui DNA-matrijs (van stap 1 en 2) om het opgeloste reagentia en meng goed.
  6. Afsluiten buis en incubeer bij 60 ° C gedurende 60 min in een waterbad of verwarmingsblok.
  7. Voeg 5 ui 10X gelbeladingsbuffer om de reactie te beëindigen.
  8. Belasting 5 gl reactiemengselproducten om een ​​2% agarosegel gekleurd met intercalerende nucleïnezuur vlek.
  9. Run gel bij 100 V gedurende 35 minuten in 1 x TBE buffer.
  10. Visualiseer de resultaten door UV-licht.

6. Voer LAMP Reactie met Reconstitution Buffer bevattende HNB of Fluorescent intercalerende Dye

  1. Meng 125 gl 10x Pol buffer, 200 pl 5 M trimethylglycine, 7,5 gl 1 M MgSO4, 7,5 ui 20 mM HNB (of 12,5 pl 100x fluorescerende intercalerende kleurstof) en 660 gl (of 655 pl) van water maak 1 ml reconstitutie buffer. Mix van pulse-vortexen gedurende 10 sec.
  2. Gebruik de bereide buffer bereid in hoofdstuk 6 om de stappen te herhalen 5.2 - 5.6.
  3. Visualiseren van de resultaten met het blote oog (reactie die HNB) of UV licht (reactie die intercalerende fluorescente kleurstof).

7. Voer Real-time LAMP Reactie met Tube Scanner

  1. Voeg 5 ul DNA de reconstituted reagentia met fluorescerende intercalerende kleurstof, dicht buis en voeg deze aan de buis scanner.
  2. Stel incubatietemperatuur bij 60 ° C. Meet de fluorescentie bij 520 nm gedurende 60 min.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Het gevriesdroogde LAMP reagentia in de 0,2 ml buisje bevat Bst DNA polymerase, primers en dNTP's. 20 ui buffer reconstitutie wordt gebruikt om resuspendeer de gevriesdroogde reagentia. Figuur 1 toont de resultaten LAMP reactie op agarosegels met vers bereide reagentia en reagentia gevriesdroogd. Het gevriesdroogde reagens heeft geen activiteit te verminderen. LAMP reacties bereid door beide reagentia kan 25 kopieën van DNA-matrijs. Figuur 2 toont detecteren het detecteren van de reactieproducten met HNB of fluorescerende intercalerende kleurstof aanwezig in het reactiemengsel. Toevoeging van HNB de reactie produceert een visuele kleurverandering van paars naar blauw met 25, 50 en 100 kopieën van DNA-matrijs in de reacties. De opname van fluorescerende intercalerende kleurstof in het reactiemengsel geeft een sterk fluorescentiesignaal met UV licht wanneer 25, 50 en 100 kopieën van DNA-matrijzen aanwezig zijn. Een buis scanner werd gebruiktin deze studie voor real-time detectie. Deze machine kan 8 reacties tegelijkertijd uit te voeren. Figuur 3 toont met de buis scanner om de fluorescentie signalen in real-time met fluorescerende intercalerende kleurstof aanwezigheid volgen. De fluorescentiesignalen boven de basislijn na 14, 18, ​​21, en ​​23 min met 10 6, 10 4, 10 3 en 100 kopieën van DNA-matrijs in de reacties.

Figuur 1
Figuur 1. LAMP Resultaten agarosegel met vers bereide reagentia (A) en gelyofiliseerd Reagentia (B). De reactiemengsels werden geïncubeerd bij 60 ° C gedurende 60 minuten. (A) Laan 1, 100 bp ladder; Laan 2-3, 4-5, 6-7 en 8-9 zijn reacties met 2,5 x 10 3, 2,5 x 10 2, 2,5 x 10 en geen kopieën van plasmide-DNA. (B) Lane 10-11, 12-13, 14-15 en 16-17 zijn reaCTIES met 2,5 x 10 3, 2,5 x 10 2, 2,5 x 10 en 0 kopieën van plasmide-DNA. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2. Methoden om detecteren LAMP Products. HNB (A) of intercalerende fluorescente kleurstof (B) werden gebruikt voor LAMP producten te detecteren. Reacties werden uitgevoerd bij 60 ° C gedurende 60 min uitgevoerd. Lane 1-5, reacties met 0, 10, 25, 50 en 100 exemplaren van het plasmide. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 3
Figuur 3. Real-time detectie van LAMP producten. Reacties werden uitgevoerd bij 60 ° C gedurende 60 min uitgevoerd. Reacties met 10 6 (zwart), 10 4 (rood), 10 3 (groen), 100 (geel), 10 (blauw), 1 (oranje) en 0 (bruin en lichtbruin) kopieën van plasmide. Drie detecties werden onafhankelijk uitgevoerd. Ze waren zeer reproduceerbaar. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Eerder hebben we een gevoelige en specifieke test gericht op de LAMP inbrengorgaan IS1111a 14. De IS1111 element werd gekozen omdat het sterk geconserveerd onder de verschillende stammen van C. burnetii en het hoge aantal kopieën (7-110) in de bacteriën (Klee 2006). Onze resultaten toonden dat LAMP ongeveer 25 kopieën van IS1111 element, die correleren met slechts een chromosomale kopie van Coxiella DNA kan detecteren. In deze studie, Bst DNA polymerase, LAMP primers en dNTP's werden gevriesdroogd en verpakt in een zip aluminiumfolie zak. De gevoeligheid van deze gevriesdroogde reagentia blijft op 25 exemplaren; vergelijkbaar met de vers bereide reagentia ten minste een maand bij opslag bij kamertemperatuur. Het is zeer belangrijk om ervoor te zorgen dat de aluminiumfolie zak wordt goed afgesloten voordat u deze opent. Laat de buizen als de aluminiumfolie zak niet is afgedicht gebruikt of als het beschadigd is. Dit kan de rehydratie o veroorzakenf de gevriesdroogde reagentia die leidt tot het verlies van de reactiviteit. De andere belangrijke stap is het opnieuw schorsing van de gevriesdroogde reagentia met reconstitutie buffer. De LAMP reactie zal niet goed werken met reagentia die niet volledig opnieuw opgeschort. Vanwege de hoge zoutconcentraties van de reactiebuffer en hoge viscositeit van de oplossing trimethylglycine, ze kunnen niet succesvol gevriesdroogd met Bst DNA polymerase, LAMP primers en dNTP's. Een speciale stap is nodig om de reconstitutie buffer met die componenten te bereiden. Potentieel de LAMP reactie kan worden getest bij lage zoutconcentraties met weinig of geen trimethylglycine. Als er een reactie vaststelling van dezelfde detectiegevoeligheid maar met laag zoutgehalte en lage trimethylglycine concentratie, het gevriesdroogde reagens hoeft alleen te worden gereconstitueerd met water. Dit zal de reactiestappen verder te vereenvoudigen.

Onlangs, Wang et al. 15 vergeleken twaalf-Huis LAMP assays met de gecommercialiseerde isotherme Master Mix kit en vond het in-house testen hebben vals-positieve resultaten. In ons laboratorium hebben wij een aantal LAMP assays ontwikkeld voor de detectie van verschillende bacteriën en nooit gevonden vals-positieve resultaten in deze in-house assays. Verder in de beginfase van de ontwikkeling van de LAMP methode werden de assays getest met zowel intern bereid master mix en gecommercialiseerd master mix en geen verschil werd waargenomen in gevoeligheid en specificiteit van de assays.

Onze studie toont ook een aantal methoden die niet alleen de LAMP producten kunnen detecteren zonder de reageerbuisjes om de kans op kruisbesmetting te verminderen laboratorium maar hebben ook een kortere procestijd te lezen resultaten vergelijken gelelektroforese methode. Het voordeel van deze detectiemethoden sterk zal ons vermogen om de test snel uit te voeren en te diagnosticeren individu met C. burnetii

In tegenstelling tot PCR-gebaseerde werkwijzen waarbij een thermocycler nodig, een verwarmingsblok, waterbad of broedstoof handhaven van een constante temperatuur van ongeveer 60 ° C is alles wat nodig is voor de LAMP assay. Dit maakt de bepaling bijzonder geschikt beperkte middelen setting. In tegenstelling tot de oorspronkelijke LAMP assay Bst DNA polymerase, LAMP primers en dNTP's moeten worden opgeslagen bij -20 ° C. Deze gelyofiliseerde reagentia kunnen worden bewaard bij kamertemperatuur waardoor het nog nuttig voor een bron-beperkte omgeving waar Q-koorts endemisch maakt. De lange termijn stabiliteitsonderzoek van de gevriesdroogde reagentia bij 4 ° C, 25 ° C en 37 ° C is momenteel gaande. In de toekomst willen we laten zien dat deze lamp test met behulp van gevriesdroogde reagentia kan C. detecteren burnetii met gevoeligheid vergelijkbaar met diePCR in een afgelegen locatie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Dit onderzoek werd gesteund door het Naval Medical Research Center, onderzoek werkeenheid 6000.RAD1.J.A0310. De standpunten in dit artikel zijn die van de auteurs en geven niet noodzakelijkerwijs het officiële beleid of de positie van het Ministerie van de Marine, Ministerie van Defensie, of de Amerikaanse regering. Wei-Mei Ching is een werknemer van de Amerikaanse overheid. Dit werk werd opgesteld in het kader van haar officiële taken. Titel 17 USC §105 bepaalt dat "bescherming van het auteursrecht in het kader van deze titel is niet beschikbaar voor een werk van de Amerikaanse regering." Titel 17 USC §101 definieert een Amerikaanse regering werk als werk bereid door militaire dienst lid of werknemer van de Amerikaanse overheid in het kader van officiële taken van die persoon.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LAMP primers Eurofins MWG operon 10 nmol, salt free Sequence designed by customer
Bst DNA polymerase New England Biolabs M0275L 8 units/ml
10x Thermo pol buffer New England Biolabs B9004S
dNTP mixture New England Biolabs N0447L 10 mM each
Betaine Sigma-Aldrich B0300 5 M, Trimethylglycine
Magnesium Sulfate Sigma-Aldrich M3409-1ML 1 M
10x Bluejuice Invitrogen 10816-015 gel loading buffer
SYBR green Invitrogen S7585 10,000x, visualize products in tubes
GelRed Phenix Research Products RGB-4103 10,000x, visualize products in gels
Lyophilized reagents Gene Reach
Hydroxynaphthol blue Fluka 33936-10G
ESEQuant tube scanner Qiagen real-time detection

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Anderson, A., et al. Diagnosis and management of Q fever United States, 2013: recommendations from CDC and the Q Fever Working Group. MMWR Recomm. Rep. 62 (3), 1-30 (2013).
  2. Rolain, J. M., Boulos, A., Mallet, M. N., Raoult, D. Correlation between ratio of serum doxycycline concentration to MIC and rapid decline of antibody levels during treatment of Q fever endocarditis. Antimicrob. Agents and Chemother. 49 (7), 2673-2676 (2005).
  3. Fournier, P. E., Raoult, D. Comparison of PCR and serology assays for early diagnosis of acute Q fever. J. Clin. Microbiol. 41 (11), 5094-5098 (2003).
  4. Schneeberger, P. M., et al. Real-time PCR with serum samples is indispensable for early diagnosis of acute Q fever. Clin. Vaccine Immunol. 17 (2), 286-290 (2010).
  5. Turra, M., Chang, G., Whybrow, D., Higgins, G., Qiao, M. Diagnosis of acute Q fever by PCR on sera during a recent outbreak in rural South Australia. Ann. N Y Acad. Sci. 1078, 566-569 (2006).
  6. Notomi, T., et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 28 (12), (2000).
  7. Paris, D. H., Blacksell, S. D., Newton, P. N., Day, N. P. Simple, rapid and sensitive detection of Orientia tsutsugamushi. by loo-isothermal DNA amplification. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 102 (12), 1239-1246 (2008).
  8. Huber, E., et al. Loop-mediated isothermal amplification assay targeting the 47-kDa gene of Orientia tsutsugamushi.: A rapid and sensitive alternative to real-time PCR. J. Med. Microb. Diagn. 1 (112), (2012).
  9. Pan, L., Zhang, L., Wang, G., Liu, Q. Rapid, sensitive detection of the ompB gene of spotted fever group rickettsiae by loop-mediated isothermal amplification. BMC Infect. Dis. 12 (254), (2012).
  10. Mori, Y., Nagamine, K., Tomita, N., Notomi, T. Detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation. Biochem. Biophys. Res. Commun. 289 (1), 150-154 (2001).
  11. Qiao, Y. M., et al. Loop-mediated isothermal amplification for rapid detection of Bacillus anthracis.spores. Biotechnol. Lett. 29 (12), 1939-1946 (2007).
  12. Tomita, N., Mori, Y., Kanda, H., Notomi, T. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of gene sequences and simple visual detection of products. Nat. Protoc. 3 (5), 877-882 (2008).
  13. Thekisoe, O. M., et al. Stability of Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) reagents and its amplification efficiency on crude trypanosome DNA templates. J. Vet. Med. Sci. 71 (4), 471-475 (2009).
  14. Chen, H. W., Ching, W. M. Development of loop-mediated isothermal amplification assays for rapid and easy detection of Coxiella Burnetii. J. Microbiol Methods. 107, 176-181 (2014).
  15. Wang, D., et al. A Comparison of In-House Real-Time LAMP Assays with a Commercial Assay for the Detection of Pathogenic Bacteria. Molecules. 20 (6), 9487-9495 (2015).

Tags

Infectie vriesdrogen LAMP Isotherme, Q-koorts DNA detectie
De ontwikkeling van gevriesdroogde Loop-gemedieerde Isotherme Amplification reagentia voor de detectie van<em&gt; Coxiella burnetii</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, H. W., Ching, W. M. The… More

Chen, H. W., Ching, W. M. The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii. J. Vis. Exp. (110), e53839, doi:10.3791/53839 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter