Abstract
Coxiella burnetii, der Agent Q - Fieber verursacht, ist ein obligat intrazelluläres Bakterium. PCR - basierten diagnostischen Assays wurden zum Nachweis von C. entwickelt burnetii DNA in Zellkulturen und klinischen Proben. PCR erfordert spezielle Ausrüstung und umfassende Schulung von Endanwendern, und daher ist es für Routinearbeiten vor allem in einem ressourcenbeschränkte Bereich nicht geeignet. Wir haben eine loop-vermittelte isothermische Amplifikation (LAMP) Assay entwickelt , um die Anwesenheit von C. nachzuweisen burnetii in Patientenproben. Dieses Verfahren wird bei einer einzigen Temperatur etwa 60 ° C in einem Wasserbad oder Heizblock durchgeführt. Die Empfindlichkeit dieses LAMP-Test ist sehr ähnlich wie PCR mit einer Nachweisgrenze von etwa 25 Kopien pro Reaktion. Dieser Bericht beschreibt die Herstellung der Reaktion lyophilisierten Reagenzien und Visualisierung der Ergebnisse mit hydroxynaphthol blau (HNB) oder einer UV-Lampe mit fluoreszierenden interkalierenden Farbstoff in der Reaktion verwendet wird. Die LAMP-Reagenzien waren lyophilized und bei Raumtemperatur (RT) einen Monat lang ohne Verlust der Detektionsempfindlichkeit gespeichert. Diese LAMP-Test ist besonders robust, da die Reaktionsgemischaufbereitung nicht komplexe Schritte beinhaltet. Diese Methode ist ideal für den Einsatz in begrenzten Ressource-Einstellungen, wo Q-Fieber endemisch ist.
Introduction
Die kleine Gram-negative Bakterium Coxiella burnetii ist der Erreger des Q - Fiebers, das ein weltweit Zoonose ist. Durch den weltweiten Vertrieb von Q - Fieber und die hohe Infektiosität von C. burnetii, US - Militär- und Zivilpersonal im Ausland im Einsatz sind in Gefahr, in den Endemiegebieten infiziert.
Q-Fieber manifestiert sich in zwei Formen: akute und chronische Infektionen. Akute Q-Fieber präsentiert sich mit grippeähnlichen Symptomen, Hepatitis oder Pneumonie, und ist in der Regel eine selbstlimitierend Krankheit mit einer niedrigen Sterblichkeit. Chronische Q-Fieber, während weniger verbreitet, führt oft zu Endokarditis, die eine viel höhere Mortalitätsrate hat , wenn 1,2 unbehandelt. Daher ist eine frühzeitige Diagnose führen eine geeignete Behandlung für die Patientenversorgung kritisch ist. Polymerase - Kettenreaktion (PCR) und quantitative Echtzeit - PCR (qPCR) Assays wurden zum Nachweis von C. entwickelt burnetii DNA in Zellkulturen und klinische Proben 3-5 </ Sup>. Beide PCR und qPCR sind teuer und oft nicht ohne weiteres verfügbar in ressourcenbeschränkte Bereiche für die Routinearbeit.
Ursprünglich von Notomi 6 beschrieben, Loop-vermittelte isothermen Amplifikation (LAMP) bietet eine alternative DNA - Verstärkungsverfahren. LAMP verwendet Bst DNA - Polymerase zusammen mit speziell entwickelten Primer - Sets Verschiebung DNA Synthese Strang, der mindestens sechs unabhängigen Regionen des Zielgens zu erkennen. Der signifikanteste Vorteil ist, dass LAMP-Amplifikation unter isothermischen Bedingungen auftritt. Daher ist nur ein Wasserbad, Heizblock oder ein Inkubator ist nicht erforderlich. Dieses Verfahren wurde verwendet 7-9 verschiedene rickettsial Pathogene zu erkennen. Visualisierung von amplifizierte DNA-Produkte durch Gelelektrophorese ist die genaueste Methode, die wahren Positiven von Fehlalarme aufgrund unspezifischer Amplifikation unterscheiden kann. Jedoch sind die in der Gelelektrophorese angewandten Verfahren nicht praktikabel für begrenzten Ressource-areas. Es wurden verschiedene alternative Verfahren entwickelt, um die Reaktionsprodukte zu detektieren. Diese alternativen, wie Trübung , abgeleitet von Magnesiumpyrophosphat Formation 10 oder unter Verwendung eines fluoreszierenden interkalierenden Farbstoff unter UV - Licht visualisiert werden 11,12 sind günstiger als ein Gel läuft. Die LAMP - Reagenzien waren einen Monat lang stabil , wenn sie bei 25 ° C und 37 ° C gelagert, die sind Umgebungstemperaturen in tropischen und subtropischen Ländern , in denen Q - Fieber endemisch 13 ist.
Ein LAMP - Assay wurde in unserem Labor entwickelt , um das Vorhandensein von C. zu erkennen burnetii in Plasmaproben 14. Hier beschreiben wir ein einfaches Protokoll für die Herstellung der LAMP Reaktionsmischung aus dem lyophilisierten Reagenzien. Die lyophilisierten Reagenzien sind stabil für einen Monat, wenn bei RT gelagert. Wenn sie mit einem einfachen Visualisierungsverfahren kombiniert werden , ist dies eine ideale Methode zum Nachweis C. verwenden burnetii in einer begrenzten Ressource-Einstellung.
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Protocol
1. Bereiten Sie Plasmid-DNA Verdünnungen als Standard für den LAMP-Reaktion
- Verwenden eines Spektrophotometers die optische Dichte (OD) bei 260 nm zu messen , um das Plasmid (enthaltend Zielgen IS1111a von C. burnetii RSA 493) DNA - Konzentration zu bestimmen. Eine OD 260 von 1 entspricht 50 ug / ul DNA.
- Konvertieren Sie die Menge von Plasmid-DNA in die Kopienzahl. Da die Größe des Plasmids 6330 bp ist, ist das Molekulargewicht dieses Plasmids 4,1 x 10 6 g (6.330 bp x 649 g / bp). Die DNA-Konzentration des Plasmids ist 34,2 ng / & mgr; l (wie in Schritt bestimmt 1.1). 1 & mgr; l dieser DNA - Probe enthält 34,2 ng Plasmid - DNA, zu gleich 5 x 10 9 Kopien (34,2 x 10 -9 g / 4,1 x 10 6 6,02 x 10 gx 23) von DNA.
- Zugabe von 10 & mgr; l Plasmid - DNA (5 x 10 9 Kopien / ul) und 90 ul Wasser für eine 10-fache Verdünnung einer DNA - Probe von 5 x 10 8 Kopien zu erstellen / ul.
- Wiederholen Sie Schritt 1.3 zur Herstellung von DNA - Proben von 5 x 10 7, 5 x 10 6, 5 x 10 5, 5 x 10 4, 5 × 10 3, 5 x 10 2, 5 x 10 1 und 5 x 10 0 Kopien / ul.
2. Bereiten Sie DNA-Vorlage von Proben für die LAMP-Reaktion
- Führen DNA Extraktion aus Humanplasmaproben Kommerzielle DNA Mini Kit nach Herstellerprotokoll. Verwenden Sie eine Gesamtmenge von 200 ul Probe für die Extraktion und Elution extrahierten DNA in einem 20 & mgr; l Volumen.
3. Bereiten Sie 2x LAMP-Reaktionspuffer
- Mischen Sie 200 ul 10x Pol Buffer, 320 ul 5 M Trimethylglycin, 12 ul 1 M MgSO 4, 280 & mgr; l dNTP - Gemisch (jeweils 10 mM) und 188 ul Wasser zur Herstellung von 1 ml 2x LAMP - Puffer. Mix von Puls-Verwirbelung für 10 Sekunden.
4. Führen Sie Standard-LAMP-Reaktion
- Mix 12,5 ul 2x LAMP - Puffer (wie in Schritt 3 hergestellt; 40 mM Tris-HCl (pH 8,8), 20 mM KCl, 16 mM MgSO 4, 20 mM (NH 4) 2 SO 4, 0,2% Triton X-100, 1,6 M Trimethylglycin, 1.4 mM dNTP - Gemisch), 1,2 & mgr; l Primer - Mix, 1 & mgr; l Bst DNA - Polymerase (8 U / ul) und 5,3 ul Wasser Reaktionsmischung (20 ul) in einem 0,2 ml PCR - Röhrchen zu bilden.
- Zugabe von 5 & mgr; l DNA (aus Schritt 1 oder 2) in die 20 & mgr; l Reaktionsgemisch und gut mischen.
- Schließen Rohr und für 60 min in einem Wasserbad oder Heizblock bei 60 ° C inkubiert. Dies ist die optimale Reaktionstemperatur zuvor bestimmt.
- In 5 ul 10x Gelladepuffer, um die Reaktion zu beenden.
- Last 5 & mgr; l Reaktionsprodukte zu einem 2% Agarosegel, gefärbt mit stain Nukleinsäure interkalierende.
- Führen Gel bei 100 V für 35 min in 1x TBE-Puffer.
- Visualisieren Sie die Ergebnisse durch UV-Licht.
5. Führen Sie LAMP Reaktion mit RekonstituiertesReagenzien
- Mischen Sie 125 ul von 10x Pol Puffer, 200 & mgr; l von 5 M Trimethylglycin, 7,5 ul 1 M MgSO 4, 667,5 ul Wasser zur Herstellung von 1 ml Rekonstitution Puffer. Mix von Puls-Verwirbelung für 10 Sekunden.
- Entfernen Sie Rohre, die die lyophilisierten Reagenzien aus dem versiegelten Aluminiumfolienbeutel enthalten. Sie nicht die Rohre verwenden, wenn die Aluminiumfolienbeutel nicht abgedichtet ist, oder wenn es beschädigt ist.
- In 20 ul Rekonstitution Puffer in jedes Röhrchen lyophilisierten Reagenzien erneut zu suspendieren.
- Mischen durch Pipettieren Puffer nach oben und unten 5-mal. Werfen Sie einen Blick um sicherzustellen, dass die lyophilisierten Reagenzien komplett neu aufgehängt sind. Das weiße Pulver sollte in der Röhre verschwinden.
- In 5 ul DNA-Template (aus Schritt 1 oder 2) zu den rekonstituierten Reagenzien und gut mischen.
- Schließen Rohr und für 60 min in einem Wasserbad oder Heizblock bei 60 ° C inkubiert.
- In 5 ul 10x Gelladepuffer, um die Reaktion zu beenden.
- Last 5 ul ReaktionsProdukte einem 2% Agarosegel, gefärbt mit Nukleinsäure interkalierende stain.
- Führen Gel bei 100 V für 35 min in 1x TBE-Puffer.
- Visualisieren Sie die Ergebnisse durch UV-Licht.
6. Führen Sie LAMP Reaktion mit Rekonstitution Puffer, der HNB oder Fluorescent interkalierende Farbstoff
- Mischungs 125 ul 10fach Pol Puffer, 200 & mgr; l von 5 M Trimethylglycin, 7,5 ul 1 M MgSO 4, 7,5 ul 20 mM HNB (oder 12,5 & mgr; l 100x fluoreszierenden interkalierenden Farbstoff) und 660 ul (oder 655 & mgr; l) Wasser machen 1 ml Rekonstitution Puffer. Mix von Puls-Verwirbelung für 10 Sekunden.
- Verwenden Sie das aufgelöste Puffer in Abschnitt 6 hergestellt, die Schritte 5.2 zu wiederholen - 5.6.
- Visualisieren Sie die Ergebnisse mit dem bloßen Auge (Reaktion, die HNB) oder einem UV-Licht (Reaktion fluoreszierenden interkalierenden Farbstoff enthält).
Führen 7. Echtzeit-LAMP-Reaktion mit Rohr Scanner
- In 5 ul DNA an die reconstituted Reagenzien fluoreszierenden interkalierenden Farbstoff, in der Nähe Rohr und legen Sie es auf das Rohr Scanner enthält.
- Eingestellt Inkubationstemperatur auf 60 ° C. Messen der Fluoreszenz bei 520 nm für 60 min.
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Representative Results
Die lyophilisierten LAMP Reagenzien innerhalb der 0,2 - ml - Röhrchen enthält Bst DNA - Polymerase, Primer und dNTPs. 20 ul Rekonstitution Puffer wird verwendet , die lyophilisierten Reagenzien erneut zu suspendieren. Abbildung 1 zeigt die LAMP Reaktion führt auf Agarosegelen mit frisch zubereiteten Reagenzien und gefriergetrocknet Reagenzien. Das gefriergetrocknete Reagenz verringert nicht seine Aktivität. LAMP Reaktionen von beiden Reagenzien hergestellt werden , können 25 Kopien der DNA - Matrize zu erkennen. 2 zeigt den Nachweis der Reaktionsprodukte mit HNB oder fluoreszierenden interkalierenden Farbstoff in der Reaktion. Zugabe von HNB zur Reaktion erzeugt eine visuelle Farbveränderung von violett nach blau mit 25, 50 und 100 Kopien der DNA-Matrize, die in den Reaktionen. Die Aufnahme von fluoreszierenden interkalierenden Farbstoffs in der Reaktions zeigt eine starke Fluoreszenzsignal mit UV-Licht bei 25, 50 und 100 Kopien von DNA-Matrizen vorhanden sind. Ein Rohr Scanner wurde verwendet,in dieser Studie für die Echtzeit-Detektion. Diese Maschine kann 8 Reaktionen gleichzeitig durchführen. Abbildung 3 zeigt die Röhre Scanner mit Hilfe der Fluoreszenzsignale in Echtzeit mit fluoreszierenden interkalierenden Farbstoff Präsenz zu überwachen. Die Fluoreszenzsignale werden über der Grundlinie nach 14, 18, 21 und 23 min mit 10 6, 10 4, 10 3 und 100 Kopien der DNA - Matrize in den Reaktionen.
Abbildung 1. LAMP Ergebnisse auf Agarose - Gel mit frisch hergestelltem Reagenzien (A) und gefriergetrocknet Reagenzien (B). Die Reaktionsmischungen wurden 60 min bei 60 ° C inkubiert. (A) Spur 1, 100 bp - Leiter; Spur 2 - 3, 4 - 5, 6 - 7 und 8 - 9 sind Umsetzungen mit 2,5 × 10 3, 2,5 × 10 2, 2,5 x 10 und keine Kopien der Plasmid - DNA. (B) Lane 10 - 11, 12 - 13, 14 - 15 und 16 - 17 sind reactions mit 2,5 × 10 3, 2,5 × 10 2, 2,5 x 10 und 0 Kopien von Plasmid - DNA. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Methoden zur LAMP Produkte erkennen. HNB (A) oder fluoreszierenden interkalierenden Farbstoff (B) wurden verwendet , LAMP Produkte zu erkennen. Die Reaktionen wurden für 60 min bei 60 ° C durchgeführt. Bahn 1 bis 5, Reaktionen mit 0, 10, 25, 50 und 100 Kopien von Plasmid. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Echtzeit - Erkennung von LAMP - Produkte. Die Reaktionen wurden für 60 min bei 60 ° C durchgeführt. Reaktionen mit 10 6 (schwarz), 10 4 (rot), 10 3 (grün), 100 (gelb), 10 (blau), 1 (orange) und 0 (braun und hellbraun) Kopien von Plasmid. Drei Erfassungen wurden unabhängig voneinander durchgeführt. Sie waren sehr gut reproduzierbar. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Bisher haben wir eine empfindliche und spezifische LAMP - Targeting - Assay das Einsatzelement IS1111a 14. Das IS1111 Element wurde ausgewählt , weil es stark unter den verschiedenen Stämmen von C. konserviert burnetii und die hohe Anzahl der Kopien (7-110) in den Bakterien (Klee 2006). Unsere Ergebnisse zeigten , dass LAMP können etwa 25 Kopien des IS1111 Element erkennen, die so wenig wie eine chromosomale Kopie von Coxiella DNA korrelieren. In dieser Studie, Bst - DNA - Polymerase, LAMP Primer und dNTPs wurden in einem Reißverschlussaluminiumfolienbeutel gefriergetrocknet und verpackt. Die Empfindlichkeit dieser lyophilisierten Reagenzien bleibt bei 25 Kopien; ähnlich wie die frisch mindestens einem Monat hergestellten Reagenzien zur wenn bei RT gelagert. Es ist sehr wichtig, die Aluminiumfolie Tasche, um sicherzustellen, ordnungsgemäß vor dem Öffnen verschlossen ist. Sie nicht die Rohre verwenden, wenn die Aluminiumfolienbeutel nicht abgedichtet ist, oder wenn es beschädigt ist. Dies kann die Rehydrierung o verursachenf die lyophilisierte Reagenzien, die zum Verlust seiner Reaktivität führt. Der andere kritische Schritt ist die Resuspension der lyophilisierten Reagenzien mit Rekonstitutionspuffer. Die LAMP-Reaktion wird nicht richtig mit Reagenzien arbeiten, die nicht vollständig wieder suspendiert. Wegen der hohen Salzkonzentration des Reaktionspuffers und eine hohe Viskosität der Lösung , Trimethylglycin, können sie nicht erfolgreich mit Bst DNA - Polymerase, LAMP - Primer, dNTPs und lyophilisiert werden. Ein besonderer Schritt ist erforderlich, um die Rekonstitution Puffer mit diesen Komponenten herzustellen. Potenziell kann die LAMP-Reaktion bei niedrigen Salzkonzentrationen mit geringer oder keiner Trimethylglycin getestet werden. Wenn es eine Reaktionsbedingung ist, die die gleiche Nachweisempfindlichkeit, aber mit niedrigen Salz und niedrige Trimethylglycin Konzentration hat, muss das gefriergetrocknete Reagenz nur mit Wasser anrühren werden. Dies wird die Reaktionsschritte zu vereinfachen.
Vor kurzem al Wang et. 15 verglichen zwölf in-Haus LAMP-Assays mit der kommerzialisierten isothermen Master Mix Kit und fand die in-house-Tests haben falsch-positive Ergebnisse. In unserem Labor haben wir mehrere LAMP-Assays für den Nachweis verschiedener Bakterien entwickelt und nie falsch-positiven Ergebnissen in diesen in-house-Assays gefunden. Ferner wird in der Anfangsphase der Entwicklung des LAMP-Verfahren wurden die Tests getestet mit sowohl im Haus vorbereitet Master-Mix und kommerzialisiert Master-Mix und es wurde kein Unterschied in den Tests "Sensitivität und Spezifität beobachtet.
Unsere Studie zeigt auch mehrere Methoden, die nicht nur die LAMP Produkte ohne Öffnen der Reaktionsgefäße erkennen kann, die Wahrscheinlichkeit von Laborkreuzkontamination zu verringern, sondern haben auch eine kürzere Prozesszeit führt zu Gelelektrophorese Methode vergleichen, um zu lesen. Der Vorteil dieser Nachweismethoden verwendet , wird unsere Fähigkeit , erheblich verbessern , um schnell den Assay durchzuführen , und eine Person mit C. diagnostizieren burnetii
Im Gegensatz zu PCR-basierten Verfahren, bei denen ein Thermocycler erforderlich ist, einem Heizblock, Wasserbad oder Inkubator eine konstante Temperatur von etwa 60 ° C gehalten ist alles, was für das LAMP-Assay erforderlich ist. Dies macht den Test besonders geeignet in begrenzten Ressource-Einstellung. Im Gegensatz zum ursprünglichen LAMP - Assay, Bst DNA - Polymerase, LAMP - Primer, dNTPs und müssen bei -20 ° C gelagert werden. Diese lyophilisierten Reagenzien können bei Raumtemperatur gelagert werden, die es noch nützlicher für einen begrenzten Ressource-Einstellung macht, wo Q-Fieber endemisch ist. Die Langzeit-Stabilitätsstudie der lyophilisierten Reagenzien bei 4 ° C, 25 ° C und 37 ° C ist derzeit im Gange. In Zukunft möchten wir zeigen, dass dieser LAMP - Test gefriergetrocknet unter Verwendung von Reagenzien C. erkennen kann burnetii mit Empfindlichkeit ähnlich dervon PCR in einer Remote-Umgebung.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Diese Forschung wurde von Naval Medical Research Center, Forschung Arbeitseinheit 6000.RAD1.J.A0310 unterstützt. Die in diesem Artikel sind die der Autoren und geben nicht unbedingt die offizielle Politik oder Position des Department of the Navy, Department of Defense, oder der US-Regierung widerspiegeln. Wei-Mei Ching ist ein Mitarbeiter der US-Regierung. Diese Arbeit wurde im Rahmen ihrer offiziellen Aufgaben vorbereitet. Titel 17 USC § 105 heißt es: "Der Urheberrechtsschutz unter diesem Titel für jede Arbeit der Regierung der Vereinigten Staaten nicht zur Verfügung steht." Titel 17 USC §101 definiert eine US-Regierung Arbeit als Arbeit, die durch Militärdienst Mitglied oder Mitarbeiter der US-Regierung als Teil der Person durch Amtspflichten.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LAMP primers | Eurofins MWG operon | 10 nmol, salt free | Sequence designed by customer |
| Bst DNA polymerase | New England Biolabs | M0275L | 8 units/ml |
| 10x Thermo pol buffer | New England Biolabs | B9004S | |
| dNTP mixture | New England Biolabs | N0447L | 10 mM each |
| Betaine | Sigma-Aldrich | B0300 | 5 M, Trimethylglycine |
| Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | M3409-1ML | 1 M |
| 10x Bluejuice | Invitrogen | 10816-015 | gel loading buffer |
| SYBR green | Invitrogen | S7585 | 10,000x, visualize products in tubes |
| GelRed | Phenix Research Products | RGB-4103 | 10,000x, visualize products in gels |
| Lyophilized reagents | Gene Reach | ||
| Hydroxynaphthol blue | Fluka | 33936-10G | |
| ESEQuant tube scanner | Qiagen | real-time detection |
References
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