Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Udviklingen af ​​Frysetørret Loop-medierede Isotermiske Amplification reagenser til påvisning af Published: April 18, 2016 doi: 10.3791/53839
Automatic Translation
1, 1
1Viral and Rickettsial Diseases Department, Naval Medical Research Center

Abstract

Coxiella burnetii midlet forårsager Q-feber, er en obligat intracellulær bakterie. PCR diagnostiske assays er blevet udviklet til påvisning af C. burnetii DNA i cellekulturer og kliniske prøver. PCR kræver specialiseret udstyr og omfattende uddannelse af slutbrugere, og derfor er det ikke egnet til rutinearbejde især i en ressource-begrænset område. Vi har udviklet en løkke-medieret isotermisk amplifikation (LAMP) assay til påvisning af tilstedeværelsen af C. burnetii i patientprøver. Denne fremgangsmåde udføres ved en enkelt temperatur omkring 60 ° C i et vandbad eller varmeblok. Følsomheden af ​​denne LAMP assay er meget lig PCR med en detektionsgrænse på ca. 25 kopier pr reaktion. Denne rapport beskriver fremstillingen af ​​reaktionen ved hjælp frysetørrede reagenser og visualisering af resultater ved hjælp hydroxynaphthol blå (HNB) eller en UV-lampe med fluorescerende interkalerende farvestof i reaktionen. Lampen reagenser var lyophilized og opbevaret ved stuetemperatur (RT) i en måned uden tab af detekteringsfølsomhed. Denne LAMP assay er særdeles robust, fordi reaktionsblandingen forberedelse ikke indebærer komplekse trin. Denne metode er ideel til brug i ressource-begrænsede indstillinger, hvor Q-feber er endemisk.

Introduction

Den lille gram-negativ bakterie Coxiella burnetii er det forårsagende agens for Q-feber, som er en verdensomspændende zoonose. På grund af Q-feber verdensomspændende distribution og den høje infektivitet af C. burnetii, amerikanske militært og civilt personel, der er udstationeret i udlandet er i fare for at blive smittet i endemiske områder.

Q-feber manifesterer sig i to former: akutte og kroniske infektioner. Akut Q-feber præsenterer sig med influenzalignende symptomer, hepatitis eller pneumoni og er sædvanligvis en selvbegrænsende sygdom med en lav dødelighed. Kronisk Q-feber, mens mindre udbredt, resulterer ofte i endocarditis, som har en meget højere dødelighed hvis venstre ubehandlet 1,2. Derfor er tidlig diagnose guide en passende behandling er afgørende for patientpleje. Polymerasekædereaktion (PCR) og kvantitativ real time PCR (qPCR) assays er blevet udviklet til påvisning af C. burnetii DNA i cellekulturer og kliniske prøver 3-5 </ Sup>. Både PCR og qPCR er dyre og ofte ikke let tilgængelige i ressource-begrænset områder for rutinearbejde.

Oprindeligt beskrevet af Notomi 6, loop-medieret isotermiske forstærkning (LAMP) tilbyder et alternativ DNA-forstærkning metode. LAMP bruger Bst DNA-polymerase for strengdeplacering DNA-syntese sammen med specielt konstruerede primersæt, der genkender mindst seks uafhængige regioner af målgenet. Den væsentligste fordel ved LAMP er, at forstærkning sker under isotermiske betingelser. Derfor udgør kun et vandbad, varmeblok eller en inkubator påkrævet. Denne metode er blevet anvendt til at detektere flere rickettsial patogener 7-9. Visualisering af amplificerede DNA-produkter ved gelelektroforese er den mest nøjagtige metode, som kan differentiere ægte positive fra falske positiver grundet ikke-specifik amplifikation. Men de er involveret i gelelektroforese procedurer er ikke praktisk for ressource-begrænset areas. Flere alternative metoder blev udviklet for at detektere reaktionsprodukterne. Disse alternative, såsom turbiditet afledt af magnesiumpyrophosphat formationen 10 eller ved anvendelse af et fluorescerende interkalerende farvestof, der skal visualiseres under UV-lys 11,12 er gunstigere end køre en gel. Lampen reagenser var stabile i en måned, når den opbevares ved 25 ° C og 37 ° C, som er omgivelsestemperaturer i tropiske og subtropiske lande, hvor Q-feber er endemisk 13.

En LAMP-assay blev udviklet i vores laboratorium til påvisning af tilstedeværelsen af C. burnetii i plasmaprøver 14. Her beskriver vi en enkel protokol til udarbejdelse af LAMP reaktionsblandingen fra de frysetørrede reagenser. De lyofiliserede reagenser er stabil i en måned ved opbevaring ved stuetemperatur. Når det kombineres med en let visualisering metode, er dette en ideel metode til at bruge til påvisning C. burnetii i en ressource-begrænset indstilling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Forbered plasmid-DNA Fortyndinger som standard for LAMP Reaction

  1. Brug et spektrofotometer til at måle den optiske densitet (OD) ved 260 nm for at bestemme plasmid (indeholdende målgen IS1111a af C. burnetii RSA 493) DNA-koncentration. En OD 260 på 1 svarer til 50 pg / pl DNA.
  2. Omregner plasmid DNA i kopital. Da størrelsen af plasmidet er 6330 bp, molekylvægten af dette plasmid er 4,1 x 10 6 g (6.330 bp x 649 g / bp). DNA-koncentrationen af ​​plasmidet er 34,2 ng / pl (som bestemt fra trin 1.1). 1 pi af denne DNA-prøve indeholder 34,2 ng plasmid-DNA, svarende til 5 x 10 9 eksemplarer (34.2 x 10 -9 g / 4,1 x 10 6 gx 6,02 x 10 23) af DNA.
  3. Tilsæt 10 pi plasmid-DNA (5 x 10 9 kopier / pi) til 90 pi vand til en 10 ganges fortynding for at gøre en DNA-prøve på 5 x 10 8 kopier / pl.
  4. Gentag trin 1.3 til fremstilling DNA-prøver af 5 x 10 7, 5 x 10 6, 5 x 10 5, 5 x 10 4, 5 x 10 3, 5 x 10 2, 5 x 10 1, og 5 x 10 0 kopier / pi.

2. Forbered DNA Skabelon fra Prøver til LAMP Reaction

  1. Udføre DNA-ekstraktion fra humane plasmaprøver ved anvendelse af et kommercielt DNA mini kit ifølge producentens protokol. Anvende i alt 200 pi prøve til ekstraktion og eluere ekstraherede DNA i et 20 pi volumen.

3. Forbered 2x LAMP Reaction Buffer

  1. Bland 200 pi 10x Pol Buffer, 320 pi 5 M trimethylglycin, 12 pi 1 M MgSO4, 280 pi dNTP-blanding (10 mM hver) og 188 pi vand til at gøre 1 ml 2x LAMP puffer. Bland ved puls-vortex-behandling i 10 sek.

4. Udfør Standard LAMP Reaction

  1. Bland 12,5 pi 2x LAMP-puffer (som fremstillet i trin 3; 40 mM Tris-HCI (pH 8,8), 20 mM KCI, 16 mM MgSO4, 20 mM (NH4) 2 SO4, 0,2% Triton X-100, 1,6 M trimethylglycin, 1,4 mM dNTP-blanding), 1,2 pi primerblanding, 1 pi Bst DNA-polymerase (8 U / pl) og 5,3 pi vand til at gøre reaktionsblandingen (20 pi) i et 0,2 ml PCR-rør.
  2. Der tilsættes 5 pi DNA (fra trin 1 eller 2) til reaktionsblandingen 20 pi og bland godt.
  3. Luk rør og inkuberes ved 60 ° C i 60 minutter i et vandbad eller varmeblok. Dette er den optimale reaktionstemperatur bestemt tidligere.
  4. Tilsæt 5 pi 10x gelloadningspuffer at afslutte reaktionen.
  5. Belastning 5 pi reaktionsprodukter til en 2% agarosegel farvet med interkalaterende nukleinsyre pletten.
  6. Køre gel ved 100 V i 35 min i 1 x TBE-buffer.
  7. Visualiser resultaterne ved UV-lys.

5. Udfør LAMP Reaktion med RekonstitueretReagenser

  1. Bland 125 pi 10x Pol Buffer, 200 pi 5 M trimethylglycin, 7,5 pi 1 M MgSO4, til 667.5 pi vand til 1 ml rekonstitution puffer. Bland ved puls-vortex-behandling i 10 sek.
  2. Fjern rør, som indeholder de lyofiliserede reagenser fra den forseglede aluminiumsfolie pose. Brug ikke rørene hvis aluminiumsfolie posen ikke er forseglet, eller hvis den er beskadiget.
  3. Tilsæt 20 pi rekonstituering buffer i hvert rør til at re-suspendere frysetørrede reagenser.
  4. Bland ved pipettering buffer op og ned 5 gange. Tag et kig for at sikre de frysetørrede reagenser fuldstændig re-suspenderet. Det hvide pulver bør forsvinde i røret.
  5. Der tilsættes 5 pi DNA template (fra trin 1 eller 2) til de rekonstituerede reagenser og bland godt.
  6. Luk rør og inkuberes ved 60 ° C i 60 minutter i et vandbad eller varmeblok.
  7. Tilsæt 5 pi 10x gelloadningspuffer at afslutte reaktionen.
  8. Belastning 5 pi reaktionprodukter til en 2% agarosegel farvet med interkalaterende nukleinsyre pletten.
  9. Køre gel ved 100 V i 35 min i 1 x TBE-buffer.
  10. Visualiser resultaterne ved UV-lys.

6. Udfør LAMP Reaktion med rekonstitutionsbuffer indeholdende HNB eller Fluorescent indlejringsfarvestof

  1. Bland 125 pi 10x Pol Buffer, 200 pi 5 M trimethylglycin, 7,5 pi 1 M MgSO4, 7,5 pi 20 mM HNB (eller 12,5 pi 100x fluorescerende interkalerende farvestof) og 660 pi (eller 655 pi) af vand til gøre 1 ml opløsning buffer. Bland ved puls-vortex-behandling i 10 sek.
  2. Brug det rekonstituerede buffer udarbejdet i § 6 til at gentage trin 5.2 - 5.6.
  3. Visualiser resultaterne med det blotte øje (reaktion indeholder HNB) eller en UV-lys (reaktion indeholder fluorescerende interkalerende farvestof).

7. Udfør realtid LAMP Reaktion med Tube Scanner

  1. Tilsæt 5 pi DNA til reconstituted reagenser indeholdende fluorescerende indlejringsfarvestof tæt rør og indsætte det til røret scanneren.
  2. Indstil inkubationstemperatur ved 60 ° C. Mål fluorescensen ved 520 nm i 60 min.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De frysetørrede LAMP reagenser inde i 0,2 ml rør indeholder Bst DNA-polymerase, primere, og dNTP'er. 20 pi rekonstituering buffer anvendes til at re-suspendere de frysetørrede reagenser. Figur 1 viser LAMP reaktion resulterer på agarosegeler med frisklavet reagenser og frysetørrede reagenser. Det frysetørrede reagens reducerer ikke dets aktivitet. LAMP-reaktioner fremstillet ved begge reagenser kan detektere 25 kopier af DNA-skabelon. Figur 2 viser påvisningen af reaktionsprodukterne med HNB eller fluorescerende interkalerende farvestof til stede i reaktionen. Tilsætning af HNB til reaktionen frembringer en visuel farveændring fra violet til blå med 25, 50 og 100 kopier af DNA-template er til stede i reaktionerne. Inklusionen af ​​fluorescerende interkalerende farvestof i reaktionen viser et stærkt fluorescenssignal med UV lys, når 25, 50 og 100 kopier af DNA skabeloner er til stede. Et rør scanner blev anvendti denne undersøgelse for påvisning i realtid. Denne maskine kan udføre 8 reaktioner samtidig. Figur 3 viser ved hjælp af røret scanneren til at overvåge fluorescenssignaler i realtid med fluorescerende indlejringsfarvestof tilstedeværelse. Fluorescenssignalerne er over baseline efter 14, 18, ​​21, og 23 min med 10 6, 10 4, 10 3, og 100 kopier af DNA-template i reaktionerne.

figur 1
Figur 1. LAMP Resultater på agarosegel med frisklavet Reagenser (A) og lyofiliseres Reagenser (B). Reaktionsblandinger blev inkuberet ved 60 ° C i 60 minutter. (A) Bane 1, 100 bp stigen; Bane 2 - 3, med 4. - 5. 6 - 7 og 8 - 9 kan reaktioner med 2,5 x 10 3, 2,5 x 10 2, 2,5 x 10, og ingen kopier af plasmid-DNA. (B) Lane 10 - 11 12. - 13, 14 - 15 og 16. - de 17 reaKTIONER med 2,5 x 10 3, 2,5 x 10 2, 2,5 x 10, og 0 kopier af plasmid-DNA. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2. Metoder til Detect LAMP Products. HNB (A) eller fluorescerende interkalerende farvestof (B) blev anvendt til at detektere LAMP produkter. Reaktioner blev udført ved 60 ° C i 60 min. Bane 1 til 5, reaktioner med 0, 10, 25, 50, og 100 kopier af plasmidet. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3. Real-time Påvisning af LAMP Products. Reaktioner blev udført ved 60 ° C i 60 minutter. Reaktioner med 10 6 (sort), 10 4 (rød), 10 3 (grøn), 100 (gul), 10 (blå), 1 (orange) og 0 (brun og lys brun) kopier af plasmidet. Tre fund blev udført uafhængigt af hinanden. De var meget reproducerbar. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Tidligere udviklede vi en følsom og specifik LAMP assay rettet mod indsættelsen element IS1111a 14. Den IS1111 element blev valgt, fordi det er højt konserveret blandt forskellige stammer af C. burnetii og dets høje antal kopier (7. 110) i bakterier (Klee 2006). Vores resultater viste, at lampen kan detektere ca. 25 kopier af IS1111 element, som kan korrelere med så lidt som en kromosomal kopi af Coxiella DNA. I denne undersøgelse blev Bst DNA-polymerase, LAMP-primere, og dNTP'er lyofiliseret og pakket i en zip aluminiumsfolie taske. Følsomheden af ​​disse frysetørrede reagenser forbliver på 25 eksemplarer; svarende til de frisk fremstillede reagenser til mindst en måned, når den opbevares ved stuetemperatur. Det er meget vigtigt at sørge for aluminiumsfolie posen er forseglet korrekt, før du åbner den. Brug ikke rørene hvis aluminiumsfolie posen ikke er forseglet, eller hvis den er beskadiget. Dette kan medføre, at rehydrering of de lyofiliserede reagenser, der fører til tab af dets reaktivitet. Den anden kritiske trin er resuspension af de frysetørrede reagenser med rekonstituering buffer. Den LAMP reaktion vil ikke fungere korrekt med reagenser, der ikke er fuldt re-suspenderet. På grund af de høje koncentrationer af reaktionsbufferen og høj viskositet af trimethylglycin opløsning salt, kan de ikke med held lyofiliseret med Bst DNA-polymerase, LAMP-primere, og dNTP'er. En særlig trin er nødvendigt at forberede rekonstituering buffer med disse komponenter. Potentielt LAMP reaktionen kan testes ved lave saltkoncentrationer med lav eller ingen trimethylglycin. Hvis der er en reaktion tilstand, der har den samme detektionsfølsomhed men med lavt saltindhold og koncentration lav trimethylglycin, det frysetørrede reagens skal kun rekonstitueres med vand. Dette vil yderligere forenkle reaktionstrin.

For nylig, Wang et al. 15 sammenlignet tolv i-House LAMP analyser med kommercialiseret isotermiske Master Mix kit og fundet de interne analyser har falsk-positive resultater. I vores laboratorium har vi udviklet flere LAMP assays til påvisning af forskellige bakterier og har aldrig fundet falsk positive resultater i disse in-house assays. Endvidere i begyndelsen faser af udviklingen af ​​den LAMP metode blev assayene testet med både internt fremstillet mastermix og kommercialiseret mastermix og ingen forskel blev observeret i assays følsomhed og specificitet.

Vores undersøgelse præsenterer også adskillige fremgangsmåder, der ikke kun kan detektere LAMP produkter uden at åbne reaktionsrørene at mindske sandsynligheden for forurening laboratorium indlæg men også har en kortere proces tid til at læse resultaterne sammenlign gelelektroforese metode. Fordelen ved at anvende disse detektionsmetoder vil øge vores evne til hurtigt at udføre assayet og diagnosticere et individ med C. burnetii

I modsætning PCR-baserede metoder, hvor der kræves en thermocycler, en varmeblok, vandbad eller varmeskab opretholdelse af en konstant temperatur omkring 60 ° C er alt hvad der kræves for LAMP-assayet. Dette gør analysen særligt velegnet i ressource-begrænset indstilling. I modsætning til den oprindelige LAMP assay Bst DNA-polymerase, LAMP-primere, og dNTP'er skal opbevares ved -20 ° C. Disse lyofiliserede reagenser kan opbevares ved stuetemperatur, hvilket gør det endnu mere nyttigt for en ressource-begrænset indstilling, hvor Q-feber er endemisk. Langtidsstabiliteten undersøgelse af de frysetørrede reagenser ved 4 ° C, 25 ° C, og 37 ° C er i gang. I fremtiden vil vi gerne vise, at denne LAMP under anvendelse frysetørrede reagenser kan detektere C. burnetii med følsomhed svarende til denaf PCR i en remote indstilling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Denne forskning blev støttet af Naval Medical Research Center, forskningsarbejde enhed 6000.RAD1.J.A0310. Synspunkterne i denne artikel er forfatternes og afspejler ikke nødvendigvis den officielle politik eller placeringen af ​​Institut for søværnet, Department of Defense, eller den amerikanske regering. Wei Mei Ching er ansat af den amerikanske regering. Dette arbejde blev fremstillet som en del af hendes officielle pligter. Afsnit 17 USC § 105. at »Ophavsretlig beskyttelse efter denne titel er ikke tilgængelig for noget arbejde af den amerikanske regering.« Afsnit 17 USC §101 definerer en amerikanske regering arbejde som arbejde, udarbejdet af værnepligt medlem eller ansat af den amerikanske regering som en del af denne persons officielle pligter.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LAMP primers Eurofins MWG operon 10 nmol, salt free Sequence designed by customer
Bst DNA polymerase New England Biolabs M0275L 8 units/ml
10x Thermo pol buffer New England Biolabs B9004S
dNTP mixture New England Biolabs N0447L 10 mM each
Betaine Sigma-Aldrich B0300 5 M, Trimethylglycine
Magnesium Sulfate Sigma-Aldrich M3409-1ML 1 M
10x Bluejuice Invitrogen 10816-015 gel loading buffer
SYBR green Invitrogen S7585 10,000x, visualize products in tubes
GelRed Phenix Research Products RGB-4103 10,000x, visualize products in gels
Lyophilized reagents Gene Reach
Hydroxynaphthol blue Fluka 33936-10G
ESEQuant tube scanner Qiagen real-time detection

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Anderson, A., et al. Diagnosis and management of Q fever United States, 2013: recommendations from CDC and the Q Fever Working Group. MMWR Recomm. Rep. 62 (3), 1-30 (2013).
  2. Rolain, J. M., Boulos, A., Mallet, M. N., Raoult, D. Correlation between ratio of serum doxycycline concentration to MIC and rapid decline of antibody levels during treatment of Q fever endocarditis. Antimicrob. Agents and Chemother. 49 (7), 2673-2676 (2005).
  3. Fournier, P. E., Raoult, D. Comparison of PCR and serology assays for early diagnosis of acute Q fever. J. Clin. Microbiol. 41 (11), 5094-5098 (2003).
  4. Schneeberger, P. M., et al. Real-time PCR with serum samples is indispensable for early diagnosis of acute Q fever. Clin. Vaccine Immunol. 17 (2), 286-290 (2010).
  5. Turra, M., Chang, G., Whybrow, D., Higgins, G., Qiao, M. Diagnosis of acute Q fever by PCR on sera during a recent outbreak in rural South Australia. Ann. N Y Acad. Sci. 1078, 566-569 (2006).
  6. Notomi, T., et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 28 (12), (2000).
  7. Paris, D. H., Blacksell, S. D., Newton, P. N., Day, N. P. Simple, rapid and sensitive detection of Orientia tsutsugamushi. by loo-isothermal DNA amplification. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 102 (12), 1239-1246 (2008).
  8. Huber, E., et al. Loop-mediated isothermal amplification assay targeting the 47-kDa gene of Orientia tsutsugamushi.: A rapid and sensitive alternative to real-time PCR. J. Med. Microb. Diagn. 1 (112), (2012).
  9. Pan, L., Zhang, L., Wang, G., Liu, Q. Rapid, sensitive detection of the ompB gene of spotted fever group rickettsiae by loop-mediated isothermal amplification. BMC Infect. Dis. 12 (254), (2012).
  10. Mori, Y., Nagamine, K., Tomita, N., Notomi, T. Detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation. Biochem. Biophys. Res. Commun. 289 (1), 150-154 (2001).
  11. Qiao, Y. M., et al. Loop-mediated isothermal amplification for rapid detection of Bacillus anthracis.spores. Biotechnol. Lett. 29 (12), 1939-1946 (2007).
  12. Tomita, N., Mori, Y., Kanda, H., Notomi, T. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of gene sequences and simple visual detection of products. Nat. Protoc. 3 (5), 877-882 (2008).
  13. Thekisoe, O. M., et al. Stability of Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) reagents and its amplification efficiency on crude trypanosome DNA templates. J. Vet. Med. Sci. 71 (4), 471-475 (2009).
  14. Chen, H. W., Ching, W. M. Development of loop-mediated isothermal amplification assays for rapid and easy detection of Coxiella Burnetii. J. Microbiol Methods. 107, 176-181 (2014).
  15. Wang, D., et al. A Comparison of In-House Real-Time LAMP Assays with a Commercial Assay for the Detection of Pathogenic Bacteria. Molecules. 20 (6), 9487-9495 (2015).

Tags

Infektion frysetørring LAMP Isotermisk, Q-feber DNA afsløring
Udviklingen af ​​Frysetørret Loop-medierede Isotermiske Amplification reagenser til påvisning af<em&gt; Coxiella burnetii</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, H. W., Ching, W. M. The… More

Chen, H. W., Ching, W. M. The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii. J. Vis. Exp. (110), e53839, doi:10.3791/53839 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter