Abstract
신규 해부 및 녹화 기술은 광 모니터링 염색 및 마우스 귓바퀴의 피부에 모낭을 둘러싼 피침 형 단말기의 탈 염색에 대해 설명한다. 준비는 안정적으로 광범위하게 소포 재활용의 연구에 사용 스티 릴 피리 디늄 염료의 흡수와 방출을 연구하는 신경 터미널 생활의 여러 레이블 단위의 광범위한 영역을 산출 간단하고 상대적으로 빠르다. 표시하기 전에 준비를 세분화하는 것은 한 개인에서 같은 귀에 제어 비교 비교 테스트를 할 수 있습니다. 유용한 정보는 제조, 라벨 및 촬영 파라미터의 품질을 개선하기 위해 주어진다. 이 새로운 시스템은 약리학 시금 및 흡수 이들 모두 야생형의 피침 형 단자에 중요한 염료 및 유전자 변형 동물의 방출을 기계적으로 유발에 적합하다. 라벨 강도의 조절 성 영향의 예는 제공됩니다.
Introduction
그들은 일반적으로 피부 또는 다른 주변 조직에 깊이 묻혀로 Mechanosensory 신경 종말은, 현장에 접근, 일반적으로 작은 확산 분산 어렵다. 이를 시각화, 따라서 일반적으로 녹색 또는 노란색 형광 단백질 (GFP / YFP) 1 형광 라벨의 유전자 발현에 마우스 라인을 얻는 연장 immunolabeling / 염색 시간, 또는 지연과 비용 다음 단면이 필요합니다. 여기서 우리는 편리 조직과 연구를위한 모낭의 구 심성의 많은 수에 액세스 할 수있는 빠르고 간단한 방법을 보여, 그들은 신속 단자 기능 2의 광학 모니터링에 표시 할 수있는 방법. 연습으로, 영상을 해부에서 전체 기술은 거의 2와 같은 시간에 완료 할 수 있습니다.
감각 축삭의 피침 형 단자는 각각, 포유 동물의 모낭은 모발 모낭의 상피 주위 펠리 세 이즈를 형성에 분포아교 / 슈반 세포 사이에 끼워 단말기는 2-4를 처리합니다. 단말의 목적은 서라운드 모발의 기계적 변위를 검출하는 것이다. 이들은 빠르고 느리게 적응 엔딩 혼합되어 있지만, 주로 머리의 움직임에 응답하여 활성의 짧은 버스트를 생성한다. 전형적으로, 소성에도 계속 변위의 존재 하에서 매우 빠르게 이동이 중단 될 때 정지한다.
광학 방법으로 피침 형 단자를 연구하는이 쥐의 날개 모델은 이러한 결말의 구조와 기능 연구를위한 많은 유리한 기능을 가지고 있습니다. 귓바퀴의 피부 주로 두 층 사이의 연골 조직의 소량, 백투백 나란히 놓이는 것이다. 피부 인해 신체의 다른 영역에 약하게 접착 결합 조직에 대하여 최소량의 매우 얇고 쉽게 해부. 쉽게 분리 피부 층 따라서, 모공 및 단자에 좋은 액세스 할 수 있습니다. 신경 분포쉽게 접근하고 식별 할 수 있습니다. 모낭은 더 드문 드문 여포의 개인 또는 소규모 그룹의 이미지를 용이하게, 다른 피부 지역에 비해 배포됩니다. 얇은 기본 진피층 때문에 추가 처리없이 형광 현미경으로 촬영에 이상적입니다, 염료 및 약리학 적 약물에 좋은 접근성을 제공합니다. 고정 또한 조직 학적 처리 후에, 정착 염료를 사용하는 경우, 아날로그 표지 단자의 영상은 살아있는 단말이거나 할 수 있습니다.
우리는 흡수 (세포 내 이입)와 스티 릴 피리 디늄 염료 (FM1 - 43의 릴리스 (엑소 사이토 시스)에 의해 입증 재활용은 피침 엔딩에서 발생하는 막, 표시하려면이 준비를 사용하고, N - (3 triethylammoniumpropyl를) -4- (4- (디 부틸) 스티 릴) 피리 디늄 브로마이드). 염료는 없습니다, 그러나 크게 투자 슈반 세포가 2를 처리 레이블을 보인다. 우리는이 염료의 흡수 / 릴리스되었습니다, 따라서 연구를 막ecycling, 비정형 (포스 포 리파제 D-결합) 대사성 글루타메이트 수용체를 통해 글루타메이트 변조에 따라 달라질 수 있습니다. 간단한 자극 및 분석 프로토콜의 결과를 설명하고, 공통 전위 분석 문제도 다룹니다.
Protocol
이러한 방법은이 마우스를 경추 탈구하여 인도적 euthanised 하였다 RW 등. 은행에보고 된 연구에 사용 하였다. 영국에서는, 이것은 동물 (과학적인 절차)에 나와 법적으로 승인 일정 1 방법 법, 1986 년 유럽 지침 63분의 2,010 / EU있다. 이 연방 법률은 모든 절차를 승인 한 동물 복지에 의해 애버딘 대학 윤리 심의위원회에서 로컬로 적용됩니다.
라벨 1. 준비 귀
- 이러한 Liley의 (1956) (5) 등의 표준 생리 식염수를 제조하고 90 % O 2 / 5 % CO 2 (carbogen)로 포화. (12)의 NaHCO3 (3)의 KCl (4), KH 2 PO 4 (1), 염화나트륨 (138.8)의 MgCl 2 (1), CaCl2를 (2), 글루코스 (11) Liley의 식염수 (㎜)이다. 참고 :이 원고의 나머지 부분 동안, '생리'는 완전히 carbogen와 포화 식염수를 참조합니다. dissectio 중20 분 - n은 준비의 모든 15을 덮고있는 식염수를 새로 고칩니다.
- 인도적 두개골에 손상을주지 않고 성인 마우스를 안락사. 참고 : 우리는 C57 / Bl6J 및 MF1 마우스를 사용했지만 어떤 마우스 변형을 사용할 수있다. 가장 중요한 점은 큰 성인 (> 25g)를 사용하는 것이 아니다. 큰 생쥐의 레이블은 덜 안정적인 자주 모낭의 작은 흩어져 그룹에 국한되고있다.
- (50mm 일반적으로 편리) 단지 밀도 헤어 라인 위 ~ 25cm의 가위베이스 근처의 외부 귀 (귓바퀴)을 제거하고 실리콘 고무 늘어선 문화 / 배양 접시에 식염수에 잠수함.
- 아래 날개 앞쪽 (오목) 측의 위치를 미세 곤충 핀 정기적으로 실리콘에 여백을 핀 (~ 6 - 귀 당 8 ~ 0.2 mm 직경 핀). 20 분, 또는 지속적으로 관류 목욕을 사용 - 식염수마다 15을 새로 고칩니다.
- 조심스럽게 초기에 귓바퀴의 절단 기본 각지에서 액세스, 무딘 절개에 의한 전방 피부의 후방 피부를 벗겨두꺼운 중앙 연골과 체계적으로 얇은 연골이없는 외부 여백으로 작동합니다.
- 이렇게하려면없이 한 쌍의 후방 부위의 단면의 중심을 잡아. 3 집게. 턱이 닫힌 후, 아니의 또 다른 세트의 점을 배치. 피부와 하부 연골 사이에는 3 집게.
- 부드럽게 후부 피부를 다시 박리 층을 분리하면서 조심 유착 느슨하게 필요한 최소의 힘을 이용하여, 좌우의 간격 내에서 폐쇄 된 포셉 포인트를 작동한다.
- 후방 피부가 제거로, 위치에 전방 피부를 둡니다. (위의 1.5에 따라) 앞쪽에 피부 옆에, 최대 후방 피부, 피부면을 고정.
- 다음에, 신중 완전히 1.6과 동일한 무딘 절개 기술에 의해 전방 피부 스킨 층 사이에 개재 한 귓바퀴 연골을 제거한다. 포셉으로 구멍 구멍을 피하십시오.
- 그런 다음, F또는 두 날개 피부 준비 부드럽게 껍질, 튕기 모낭 기지를 커버 발포 폴리스티렌 폼을 닮은, 결합 조직의 얇은 층을 멀리 문질러. 참고 : 최적의 청소를 취득하는 것은 약간의 연습을 할 수 있습니다; 너무 격렬 스크래핑하여 모낭의베이스에있는 신경망을 제거하는 동안 불충분 조직 제거, 색소 용액과 영상 모두에 대한 액세스를 방해한다.
- 식염수를 새로 고칩니다.
2. 피침 형 터미널 라벨
참고 : 다음 프로토콜 스티 릴 피리 디늄 염료에 최적화되어 있습니다. 기타, 화학적으로 유사한, 스티 릴 피리 디늄 염료는 아마도 농도 및 배양 시간에 약간의 조정 후, 작동합니다. 염료 솔루션을 취급 할 때는 장갑과 실험실 코트를 착용 할 것. 어느 제조 업체에서 직접 10 mM의 재고 염료 솔루션을 구입하거나 포도당없이 식염수에 염료 분말을 용해하여 재고를 준비합니다. 나누어지는 (10 μL 보통 편리하지만, 큰 SCA이를 조정제작 실험) 및 상점은 -80 ° C에서 -20 ° C에서 최대 6 개월 ~ 1 년 동안 동결. 파우더는 최소 2 년 동안 저장합니다. 반복 동결 / 염료 솔루션의 해동 사이클을 피; 이 급속 색소 변성. 일단 4 ° C에서 저장, 해동 1 주일 이내에 사용한다.
- 수면 아래 5mm - 플랫폼 ~ 3, 30 ° C로 수조를 예열.
- 갓 10 μM 스티 릴 피리 디늄 색소 용액 (10 ㎖ 염수 갓 해동 10mM의 스티 릴 피리 디늄 염료 10 μL)을 제조하고 수조에서 평형화.
- (일반적인 볼륨 ~ 2 ㎖) 생리 식염수 2mm - 핀은 실리콘 고무의 각 준비 1에 잠긴 35mm 문화 요리를 지어. 동물의 사용을 최소화하기 위해, - (15cm 길이 10) 작은 가위의 기반이 정점에서 반으로 잘라 경우 각 날개 피부 준비는 두 가지 준비를 얻을 것입니다.
- 30 ° C의 수조에 잠긴 플랫폼에서 식염수 덮인 날개 준비를 포함하는 35mm 요리를 놓습니다. 확인합니다물 깊이는 적절한 온난화에 충분하지만 오픈 접시에 식염수를 오염시키지 않습니다.
- 핀 미세 (0.5-1 mm 외경) 계속 준비를 가스에 각각의 접시의 실리콘베이스로 O 2 / CO 2를 흐르는 튜브. 또한 물을 욕조에 세척 / 접시 상쾌한 용 염료 무료 식염수 100 ㎖를 배치합니다. carbogen 채도를 유지하고 수질 오염을 방지하기 위해 단단히 마개 병을 사용.
- 다음 병 마개 100 ml의에서 날개 준비를 통해 식염수를 대체 30 분 동안 30 ℃에서 모든 평형. 추가로 30 분을 품어. 참고 :이 교체 식염수 증발 가스 라인 버블 링으로 인한 대량 볼륨 손실을 보상한다.
- 신속하고 신중 염료 용액의 희석 효과는 다음에 추가 될 최소화하는 티슈 종이 제조 주위에 남아있는 액체를 얻어시킨다, 100㎖의 비커에 폐 염료 무 식염수 얻어 붓는다. (건드리지 않도록주의 바랍니다
- 다음 30 ℃에서 40 분 동안 10 μM 스티 릴 피리 디늄 염료 3 ㎖ 절차의 나머지 부분에 대한 R / T로 돌아 - 2 날개의 준비를 품어.
- R / T에 솔루션을 사용하여, 세 단계에 비 내면화 염료를 제거합니다. 참고 :이 단계는 최고의 이미징 눈 어두운 적응을 시작하기 위해 최소한의 주변 광 (블랙 아웃 블라인드, 레드 / 오렌지 저 강도 조명)에서 수행된다.
- 폐기물 비커에 요리에서 라벨 솔루션을 멀리 붓고 빠르게 연속으로 빠르게 염료 무료 식염수의 세 가지 변화를 씻어. 이 준비 쉽게 노출 막으로부터 departitions 어떤 염료 잔류 스티 릴 피리 디늄 염료 용액의 부착을 제거합니다.
- 표면 막으로부터 즉 대부분 잔존 염료 departition하도록 추가로 30 분 동안 염색없는 염수의 최종 변화 부화 단자 내재화하지 염료.
- 영구 염료 붙어 t을 제거설 폰화 된 B-덱스트린 유도체 킬레이트에 의해 노출 된 막의 외부 전단 O (Advasep -7- 1 mm의 5 분 - 표 1 참조). 따라서, 나머지 모든 염료는 조직 내에서 될 것입니다.
- 이미징을위한 신선한 염료 무료 식염수에두고 철저하게 조직 종이 접시의 외부를 건조.
참고 : 터미널은 이제 이미징을위한 준비가되어 있습니다. 피침 엔딩 천천히 다시 endocytosed 스티 릴 피리 디늄 염료를 방출하므로, 살아있는 것을 인식하는 것이 중요하다. 이 R / T에서 느려집니다하지만, 이미징시 / 전에 지연을 최소화하는 것이 중요하다. 실험이 여러 준비의 표시를 필요로하는 경우, 처음에는 모두 30 ℃에서 레이블이 지정되지 않은 유지한다. 그들은 몇 시간 동안 가능한 것입니다. 첫 번째 이미징 동안 - 그럼 간격으로 순차적으로 레이블을, 두 번째 준비를 라벨로 (2.8.3 2.7 단계).
피침 엔딩 레이블 3. 이미지.
참고 : 관찰자해야 다음 이미징 단계에 대한 어두운 적응. 이 가르치시 증가 시력이 낮은 여기 광 레벨이 영상의 모낭을 찾을 필요 의미합니다. 이 광독성을 최소화하기보다는 광표백하는 불편 함을 줄이는 가장 중요하다. 전체 강도 조명에 의해 생성 된 활성 산소는 빠르게 (60 초 이내) 신경 터미널 (GS Bewick, S. Fadul 및 WJ 베츠, 게시되지 않은 관찰) 생활 죽일 수 있습니다.
- 촬영하기 전에 해부 실체 현미경에서 준비를 확인하고 조심스럽게 표면의 이물질을 제거합니다. 이 이미지를 오염 자동 형광을 방지 할 수 있습니다.
- 표준 형광 필터 세트와 수직 표면 형광 현미경의 무대에서 접시를 탑재 (480-488 nm의 여기, 500 - 스티 릴 피리 디늄 염료 520 nm의 방출).
- 편안 단말을 찾을 때까지 단지 충분한 감광 필터 여기 광 강도를 감쇠에스.
- 저와 함께 관찰하여 표시 모공을 찾습니다 - 다음, 점차 이상 (10 배와 20 배 침수 목적) 확대 목표 (3.5 건조 목표를 4 배).
- 저전력과 높은 배율 20 배 침수 목적의 10 배 건조 목적을 표시 피침 형 단자의 이미지를 캡처합니다. 광 강도 및 노출 시간을 최소화 (0.5 카메라 적분 시간 - 1 초 제안된다).
- 표준 디지털 카메라에서 이미지를 캡처 및 독점 소프트웨어를 사용하여 컴퓨터 하드 드라이브에 이미지를 저장합니다. 주의 : 전형적인 예는도 1에 도시되어있다.
- 이미지 ~ 각 준비 20 피침 엔딩. 이 여백 영상 차례로 각각의 모낭을 따라 날개의 피부와 작업의 기지에서 절단 가장자리에서 마진 멀리에서 시작합니다. 약간 같은 뿌리를 두 번 이미지 않도록주의하면서, 필드가 절단 가장자리에 평행 한 중복에 걸쳐 작업하고 분명하게 손상되는 어떤. 참고 :다시는 일반적으로 모두 유의 한 자연 드 염색이 발생하기 전에 이미지에 너무 많은 피침 형 단자입니다. 따라서, 우리는 체계적 다음 프로토콜을 이용하여 모집단 샘플링 제안한다.
- 한계 스트립을 완료 한 후, 귓바퀴의 밑면을 향해 하나의 필드 폭을 이동하고 반대 방향으로 처리를 반복한다.
- 이미지 모든 터미널 명확 매우 더 비스듬하게 광학 평면에 표준 환상 분석 ROI 내에 완전히 맞지 않을 지향 가끔 사람을 제외하고, 발생 (4 절 참조). 그들은 분명히 손상 또는 배경 강도가 현지화 된 조직 손상을 나타내는, 특히 높은 경우를 제외하고, 주변 단말기에 비해 비정상적으로 밝거나 어두워 피침 형을 제외하지 마십시오.
- 피부 영역의 10 % 이상은 / 단자 / 없게 손상된 경우 제조 폐기. 참고 : 피침 시간과 destain으로, 전체 영상 세척의 마지막 20 분 내의 각 준비.
- 나는F 강도 비교는 시간이 일치 준비하여 유효 확인 하나 이상의 준비를 사용하여. 이렇게하려면 드 얼룩 시간의 비교를 위해, 30 분 ~ 각 준비를 염색의 타이밍 오프셋.
- 5 또는 10 분 간격으로 역 염색 (엑소 사이토 시스), 화상 동일한 단말기를 모니터링한다. 실제로, 그것은 어느 하나에 대비하여 각 시점에서의 세 개별 단자 이미지 할 수있다.
피침 엔딩 레이블 4. 분석.
참고 : 다음 절차는 단말기 강도를 분석하는 빠른 방법이다.
- 이자 (ROI)의 환형 영역을 모낭의베이스 (도 2)에서 모발의 선단 중심. 분석 할 수있는 모낭 내의 모발 자동 형광을 방지하기에 충분히 큰 환형 ROI의 내주를 설정하지만 아직도 상기 단말기의 형광을 포함한다. 외주 최대 규모의 termin을 둘러싸 충분히 큰 있는지 확인알 가능성이 그 주요 광학 / 뿌리 축에 가까운 방향이 발생할 수 있습니다.
- 대상에 환형 영역의 배경에 ROI가 거의 동일한 확인 (사각형 또는 원 통상 ~ 400 ㎛의 2) 분석중인 단말의 부근에서의 로컬 염색 강도를 결정한다.
주 :이 두 개의 ROI의 크기 분석 초기에 설정하고 어느 한 실험에서 모든 제제에 걸쳐 모든 후속 모낭 / 피침 단자를 분석하는데 사용된다. 그래서, 처음에 치료 그들의 파라미터를 설정하는 것이 중요하다. - 단자, 모공 사이가 아닌 낮은 강도 피부의 기초가 피지선에서 지방의 배경을 표현하기 위해 뿌리에 충분히 가까이 배경 투자 수익 (ROI)을 놓고 있지만 터미널 영역을 포함하지 않도록주의.
- '측정'또는 스프레드 시트 소프트웨어 및 전송 데이터 '분석 투자 수익 (ROI)'기능을 사용하여 두 로아의 평균 강도를 기록한다.
- 스프레드 시트의 각 개별 모낭하는 순 강도를 제공하기 위해 고리에서 해당 지역에서의 평균 배경 강도를 뺀다. 현지화 된 배경이 조정은 크게 간 뿌리 변동성을 줄일 수 있습니다.
Representative Results
이 귓바퀴 제제의 모낭은 쉽게 제조의 웨이퍼 박막 특성과 이러한 mechanosensory 단자 수득 접근성의 상대적 용이성을 나타내는 형광 (도 1a)없이 아래 transillumination 보인다. 각각은 피지선의 어두운 초승달 피어싱 눈에 띄는 헤어 샤프트 기본으로 대표된다. 표면 형광에서 각 모낭 주위의 표시 피침 형 단자는 분명하게 볼과 일반적으로 강력한 자연 스티 릴 염료 흡수 (그림 1B)를 표시한다. 이 부과 움직임없이 발생합니다. 포위 정도 가변 6이더라도 피침 단자는 모발을 둘러싸 보인다. 라벨의 대부분은 점상 (점)보다는 예상 될 수있는 선형 배열이다. 점 모양의 패턴은 단말기가 단말기의 길이 방향으로 광학면에서 관찰되는 반사. 티의 준비는 단순히 현미경 스테이지로 전송하고 다시 준비의 단순함을 보여 현장에 이미지화하고, 표시 후 시각화를 위해 더 이상의 처리를 수신하지 않습니다.
이러한 신규 한 제제는도 3에 도시되는 실시 예에 적합한 실험.이 세포 내 이입 및 세포 외 유출 거실 단말기에서뿐만 아니라, 그들의 변조 모두를 연구하기 위해 사용될 수있다. 이러한 2 + 마그네슘 등의 리간드 또는 양이온과 칼슘을 2 + 채널을 차단하면서 따라서, 엔도 시토 시스를 들어, 글루타메이트 수용체 작용제는, 라벨의 강도를 증가시킬 수있다, 니켈 2 + 또는 CD 2+는이 감소합니다. 대안 적으로, 이러한 제제는 또한도 3c에 도시 된 바와 같이, 세포 외 유출의 동역학을 연구하기 위해 이용 될 수있다. 먼저, 레이블이 단말기는 자발적으로 탈 염색을 볼 수있다. 그러나,이 destain는 latrotoxin의 세포 외 유출의 자극에 의해 가속된다. 더 드실험 결과의 꼬리, RW 등.이 은행에서 볼 수있다.
그림 1. 강력한 스티 릴 염료 라벨은 마우스 피나에 기록. 모낭은 유륜 / 지방 조직을 덮는의 허가 지역에 표시되는 방법을 명확하게 보여주는 명 시야 조명에 레이블이없는 날개 준비의 (A) 부분. 어두운, 일반적으로 bilobed, 초승달 모양은 중앙 모발 주변의 피지선 있습니다. 약간 더 높은 배율 (B) 유사한 영역 및 스티 릴 색소로 표지 피침 엔딩을 보여주는 표면 형광 이미지화. 스케일 바 -. 40 μm의 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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스티 릴 염료 라벨링 강도 그림 2. 분석. 머리 샤프트 (이 이미지에 표시되지 않음)을 중심으로 (A) 스티 릴 염료와 모낭 라벨의 전형적인 원형 패턴. (B) 주요 분석 '관심 지역'(ROI)은 여포를 둘러싸는 피침 형의 신경 말단의 방어벽의 위치에 중첩 표준 고리에 의해 정의된다. 이 투자 수익 (ROI)은 라벨의 강도가 상당히 준비를 사이에 모든 치료를 통해 비교 될 수 있도록 단일 실험 형태와 영역에서 일정하게 유지된다. 각 ROI의 순 강도 인접한 정사각형 또는 원형 배경 영역 (~ 400 μm의 2)의 강도를 감산함으로써 계산된다. 다시 말하지만,이 사각형 배경 영역은 주어진 실험을하는 동안 모양과 지역에서 일정하게 유지된다.대상 = "_ 빈">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
헤어 난포 수입 성의 피침 엔딩 그림 3. 레이블 강도는 일반적으로 분산되지 않고, 엔도와 세포 외 유출 모두를 검사하는 데 사용 할 수 있습니다. 스티 릴 염료 강도 측정에서 일반 데이터를 상기 분석 방법을 사용하여 자발적으로 표시 피침 형 단자에. 제어 조건 (A) 레이블 강도 (54 포, 4 귀) 및 1 mM의 글루타메이트 (42 포, 4 귀). 개별 엔딩의 강도 값은 클러스터 도트 플롯으로 표시됩니다. 각 점은 모낭 주위에 하나의 단말 방어벽의 강도를 나타냅니다. 대부분은 낮은 강도에서 클러스터 동안도 제어 조건에서 몇 가지 데이터 포인트 (모공)이 매우 강렬합니다. 특정한 한 세기에서 제 도트성만이 중심 플롯과 동일한 강도의 후속 데이터 포인트 양쪽에 점차적 횡 그려진다. 따라서, 횡 방향 확산은 특정 라벨 강도 모낭의 빈도를 나타낸다. 수평 라인은 평균 ± 25 % 분위 범위를 나타냅니다. 1 mM의 글루타메이트와 배양은 50 % (*** P <0.001, 맨 - 휘트니) ~에 의해 중간 강도를 강화하지만, 라벨링 (200)에 의해 향상 될 수있다 - 일부 단말기에서 300 %. (B) 글루타메이트 매개 강화 된 염료 흡수 (엔도 시토 시스)를 보여주는 이미지. 증가 된 라벨 강도 같이 글루타메이트 (1 mM)을의 모낭 준비의 배양은 현저하게, 스티 릴 염료 흡수를 증가시킨다. 스케일 바 20 μm의. (C) 강화 염료 릴리스 (세포 외 유출). 0 분의 라벨은 60 분보다 명확하게 밝로 표시 한 후, 스티 릴 염료는 자발적으로 광표백에 대한 제어도 배경 공제 후, 다시 해제됩니다. 이 릴리스는 크게 포입니다latrotoxin에 의해 tentiated, 통제되지 않은 소포 세포 외 유출을 유발 검은 과부 거미 독 성분. 독소의 60 분 후, 단말 라벨링 거의 발견 할 수없는 것이다. 스티 릴 염료 라벨이 가역성 터미널 형광 시냅스 같은 소포의 지역 재활용하는 동안 내재화로 인한 가설을 지원합니다. 스케일 바 20 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
Bewick 및 베츠 원래 N- 피리 디늄 시냅스 소포 막 로컬 재생을 모니터링 스티 릴 피리 디늄 브로마이드 7-10 염료 관련 (3- triethylammoniumpropyl) -4- (4- (디 부틸 아미노) 스티 릴)를 개발 하였다. 염료를 흡수하고, 따라서 증가 된 형광 따라서 시냅스 소포 막 내면화 (이입)를 반영한다. 그 후,이 내면화 염료가 더 전기적 활동에 의해 다시 방출 될 수있다, 염료 손실을 보여주는 것은 소포 막 외부화 (세포 외 유출)를 모니터링합니다. 시냅스, 이는 신경 전달 물질 분비에 대한 프록시이다. 동시에, 우리는 이러한 염료 차 mechanosensory 신경 종말 (7) 레이블을 발견했다. 최근에 11 Bewick, 은행 및 동료는이 성숙, 차별화 된 mechanosensory 터미널 생체에 유사한 과정을 반영하는 것으로 나타났다. 여기서 다시, 염료는 글루타메이트를 해제 구조적으로 재활용 50 나노 미터 직경 '시냅스와 같은'소포 (SLV는)을 레이블을 붙입니다.mechanosensory 터미널에서, 자신의 시냅스 대응과는 달리,이 재활용은 주로 자연이다. 또한, 기계적, 단순히보다 전기 자극에 의해 조절된다.
문화 및 달팽이관의 유모 세포, 특히 일반 및 스티 릴 피리 디늄 염료의 스티 릴 염료의 감각 뉴런에 대한 mechanosensory 채널을 차단하고 비가 역적으로 내부 멤브레인 (12) 라벨의 mechanosensory 채널을 통해 전달하는 것으로 나타났다. 그러나, 근육 스핀들 (11)의 2 또는 IA 엔딩에서 피침 형 어미와 같이 여기 현장에서 차별화 된 mechanosensory 터미널에서 비교 스티 릴 염료 농도에서 기계적 (13), (14)을 자극하지 않는 유모 세포에, 라벨은 막 엔도 시토 시스입니다. mechanosensory 신경 말단에서, 예를 들어, 표지는 가역적이고, (2), 11 (1) 여기서 사용되는 농도에서 mechanosensory 반응을 차단하지이 엔딩에 채널을 투과하여 일부 염료 국제화 완전히 배제 할 수는 없지만 5., latrotoxin에 가까운 총 destain 성숙한 터미널에서 라벨의 대다수는 재활용 소포 막과 내재화로 나타냅니다. 그러므로 우리는 염료의 흡수 및 방출에 약물 효과를 검사하여, 가장 최근에, mechanosensory 구 심성 터미널에서 SLV 재활용의 약리학 (2) 활동 의존성 (11)을 연구하기 위해이 기술을 사용하고있다.
가장 실용적인 기술과 마찬가지로, 재현성 반복과 연습이 필요합니다. 신뢰성을 보장하기위한 핵심 사항 중 일부는 이제 논의 될 것이다. 어린 동물에서 피침 형 라벨은 더 신뢰할 수있다 - 우리가 사용했던 작은 동물은 15g의 체중이었다. 이 경우 이유는 완전히 명확하지 않지만 이하의 결합 조직의 절개 적은 기계적 외상 및 제작이 필요 때문일 수있다신경 분포 층 위에 놓인 조직을 제거 할 때 AVES 덜 잔류 잔존.
전반적으로, 조직의 준비는 나이가 생쥐에서 다음 떨어져 피부 층을 박리되는 기술적으로 가장 어려운 실용적인 측면과 함께, 매우 간단합니다. 이러한에서 해부가 시작되는 피부 층은 바닥에 강하게 함께 준수하지만, 심지어 여기 층의 분리는 여백으로 훨씬 쉬워진다. 일반적으로 전방 피부처럼 감사하게, 혹은 결과적으로,이 얇은 한계 피부 영역은 일반적으로 가장 만족스러운 라벨을 제공합니다. 따라서, 특히 여백의 매우 얇은 피부를 파악하지 마십시오. 손상의 위험을 최소화 직접 폐쇄 집게로 추진보다는 잡고 간접적으로 준비를 조작, 또는 가능성이 필수적인 이해에만 강하다는 조직을 표시하여야하는 경우합니다. 이 주 저와 같이 즉시 모공 위에 놓인 '시트 폴리스티렌'층을 제거에 철저이미징 및 의약품 접근에 기계적인 방해. 그러나, 그것은 바로 아래에 기본이 손상 등의 구조 (즉, 멀리 스트립) 신경 네트워크와 단말기와 신체 접촉을 최소화하는 것이 필수적이다. 주된 형광 피지선에서 노란색 / 흰색이면, 머리 샤프트 기지 및 황색 / 오렌지 피침 엔딩의 몇 초승달의 눈에 띄는 자동 형광,이 신경 얼기 층 및 관련 피침 형 단자 통관시 제거 된 나타냅니다. 이것은 나이 (> 30g) 마우스와 주요 문제가 나타납니다. 염색 절차 전반에 걸쳐 모든 30 ° C에 있고, 잘 산소 확인합니다. 표시된 단자 아직 살아 있음을 유의하십시오. 따라서, 염료 지속적인 자연 (제정) exocytic 출시 분비됩니다. 이는 R / T에서 느린 것이지만, 염료 손실을 최소화하기 위해 킬레이트 용액 촬상 제거 사이의 지연을 최소화하는 것이 좋다. 또한, 대한 간 그룹 비교의강도의 tudies,이 모든 그룹의 영상을 보장하기 위해 필수적인 것은 시간과 일치합니다. 촬상 전에 염료 킬레이트 제의 사용은 큰 이미지 콘트라스트를 개선한다. 그래서 비교적 비싼 반면, 킬레이트 단계는 양호한 이미지 품질을 확보하기위한 매우 중요하다. 사용하는 사이에 4 ° C에 저장하는 경우, 3 일 연속 - 킬레이트 사용은도 2의 해결책을 여러 번 재사용함으로써 최소화 될 수있다. 그것의 염료 격리가 포화 상태에 접근하고 도시, 눈에 띄게 핑크 진행되면 킬레이트 솔루션을 폐기하십시오.
촬상 중에, 강도 및 여기 광 노출 시간 모두의 누적 결과 이러한 살아있는 단자 광독성 손상에 대한 가능성을 인식. 이러한 고려 사항은 화상 품질이 주요 관심사이다 단일 이미지 평가시기, 덜 중요하다. 그러나, 최소로 여기 광에 노출을 감소 동력학 연구에서 반복 촬영 동안 중요하다. 이러한 염료를 개발하는 동안라벨 시냅스, 우리는 신경 말단에 극적이고 돌이킬 수없는 손상의 원인이됩니다 전체 전력 여기 조명에서> 1 분 동안 여기를 발견했다. 그들은 처음이어서 다음, 거대하게 확장 15 분 ~에 걸쳐 완전히 붕괴. 우리는 체계적으로 노출 시간과 강도의 상대적 기여도를 테스트하지 못했지만, 이러한 관찰은 원칙 모두를 최소화하는 것 좋습니다. 그래서, 여기 광 강도와 지속 시간이 좋은 이미지를 얻기에 상응하는 최소하고, 적절한 제어 이미지가 시간 코스 연구에서 촬영하는 것이 좋습니다. 각각의 시점에서, 데이터는 반복 된 촬상 조건에서 광독성 영향을받지 않는 것을 테스트하기 이전에 보지 않은 단말기의 추가적인 이미지를 촬영. 이 순진 터미널에서 라벨의 행동이 모공에 반복적으로 이미지화되는 것을 유사한 보장하는 것입니다.
다수의 인자 순 강도 (D)의 집단 내 가변성을 감소시킬 수있다ATA. 부적절한 염색에도 작은 면적을 크게 여포 간 데이터 변화에 영향을 미칠 수 있으므로 정확한 ROI를 배치, 특히 배경 ROI는 중요하다. 순 강도의 변화는 각각의 모낭이 엔딩의 방어벽에 의해 둘러 쌓여 방법을 완전히에 의해 영향을 받는다. 포위의 정도가 관련 매개 변수의 경우 예를 들어 비교, 그림 2에서 볼 수있는 거의 원형 패턴 그림 1B에있는 초승달 모양의 라벨 분배. 더 복잡한 분석, 아마도 자동화 된 소프트웨어 탐지 및 임계 값을 사용하여이 필요합니다. 심지어 가장 정확하게 분석 뿌리 그룹에 대한 강도 분포는 일반적으로 인구의 중간 값보다는 수단의 사이에 처리 비교를위한 비모수 통계의 사용을 필요로 (그림 3 참조) 분산되지 않도록주의하시기 바랍니다. 이러한 비율 오으로 강도를 표현하는 등 표준화 기술,또는 대조군 F 반대측 제어 여러 제제들, 상기 변동을 줄이기 위해 적용될 수있다했다. 마지막으로 고려해야 할 항목 기술은 약리 시험을위한 실험 설계이다. 약리학 적 연구 중에 염료 도장 전에 30 분 동안 약액의 제조를 사전 배양한다. 다음으로, 염료 용액 중의 약물 농도를 유지한다. 약물이 차량 식염수 플러스 비히클에 용해되는 경우 대조군, 어느 식염수를 사용하거나.
본 문서에서는이 새로운 날개 준비가 최소한의 준비와 피부에 mechanosensory 엔딩의 높은 품질의 이미지를 제공하는 방법을 보여줍니다. 우리는 또한 소포 재활용의 두 가지 중요한 측면의 약리학을 조사하는데 사용될 수있다 나타낸다. 우리는 글루타메이트 수용체 효능 색소 내재화 (엔도 시토 시스의 마커)를 증가 할 수 있으며, 둘째, 그 염료 latrotoxin (세포 외 유출의 자극제)로 다시 손실 첫 나타낸다. 이는 준비의 중요성이온 기술은 터미널 기능, 구조 및 상호 관계의 광학 모니터링을위한 독특한 기회를 수득 이미징 실험 현장에서 피부 mechanosenory 단자 생활에 우수한 액세스를 제공한다는 것입니다. 후자의 목적을 위해, 우리는 또한 결합 된 광학 / 전기 생리 연구 (자세한 내용은 자매 조브 문서를 참조)에 사용하기 위해 추가로 개발했다.
Disclosures
저자는 공개 아무것도 없어.
Acknowledgments
이 연구는 영국 의학 연구위원회 프로젝트 보조금 GSB에 G0601253와 RWB 및 GSB에 SULSA Bioskape 보조금에 의해 투자되었다
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PDMS - Sylgard 184 | Dow Corning | Flexible, inert, translucent solid silicone polymer. | |
| No. 3 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11231-20 | |
| Austerlitz Insect pins | Fine Science Tools | 26002-10 | Very fine pins to attach pinna preparation securely to the PDMS with minimal damage. |
| FM1-43/Synaptogreen C4 | Biotium/Cambridge Bioscience | BT70020 | Fluorescent membrane probe that reversibly partitions into the outer leaflet of cell membranes. Used predominantly for monitoring vesicle membrane endo-/exocytosis. |
| Advasep 7 | Biotium/Cambridge Bioscience | BT70029 | A sulfonated b-cyclodextrin derivative that chelates FM1-43 (& other styryl pyridinium dyes) out of the exposed membranes, leaving internalised dye to be seen more clearly by lowering the background labelling/fluorescence. |
| Retiga Exi Fast 1394 | Qimaging | Monochrome, cooled CCD camera - basic model | |
| Volocity 3D Image Analysis Software | Perkin Elmer | Volocity 6.3 | Image capture and analysis software. |
References
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