Abstract
En ny disseksjon og registreringsteknikk er beskrevet for optisk overvåkning farging og de-farging av lansettformete klemmene som omgir hårsekker i huden på mus ytre øret. Preparatet er enkel og relativt rask, pålitelig som gir omfattende regioner i flere merkede enheter av levende nerveterminaler for å studere opptak og frigjøring av styryl pyridinium fargestoffer som benyttes mye i studier av vesikkel resirkulering. Oppdeling av forberedelsene før merking tillater test kontra kontroll sammenligninger i det samme øret fra en enkeltperson. Nyttige tips er gitt for å forbedre kvaliteten på forberedelse, merking og imaging parametere. Dette nye systemet er egnet for analyse av farmakologisk og mekanisk-indusert opptak og utslipp av disse viktige fargestoffer i lansettformede terminaler i både villtype og genmodifiserte dyr. Eksempler på regulerende innflytelse på produktet og intensitet er gitt.
Introduction
Mechanosensory nerveendene er vanligvis små, diffust utbredt og vanskelig tilgjengelig på stedet, som de vanligvis er begravd dypt i huden eller andre omkringliggende vev. Visualisere dem, derfor vanligvis krever seksjonering etterfulgt av en langvarig immunolabeling / flekker periode, eller forsinkelsen og utgiftene med å skaffe mus linjer med genetiske uttrykket av fluorescerende etiketter som grønn eller gul fluoriserende protein (GFP / YFP) 1. Her viser vi en praktisk vev og en rask og enkel metode for å få tilgang til et stort antall hårsekken afferente for å studere, og hvordan de kan raskt merket for optisk overvåkning av terminalfunksjon 2. Med praksis, kan hele teknikken fra disseksjon til bildebehandling være ferdig i så lite som to timer.
De lansettformede terminalene på sensoriske aksoner innervating hårsekkene hos pattedyr danner palisader rundt epitel av hår-follicle, med hverterminal klemt mellom glial / Schwann celle behandler 2-4. Hensikten med terminalene er å detektere mekanisk forskyvning av hårene de omgir. De er en blanding av hurtig og sakte tilpasning avslutninger, men de hovedsakelig produserer små pakker med aktivitetsnivået til håret bevegelse. Vanligvis stopper avfyring meget raskt når bevegelsen opphører, selv i nærvær av fortsatt forskyvning.
Denne murine pinna modell for å studere lansettformete terminaler ved hjelp av optiske fremgangsmåter har mange fordelaktige trekk for å studere strukturen og funksjonen til disse avslutninger. Øremuslingen er hovedsakelig to lag av huden apposed rygg mot rygg, med bare en liten mengde av mellom bruskvev. Huden er meget tynn og lett dissekert på grunn av minimale mengder av svakt lim bindevev i forhold til andre deler av kroppen. De lett skilles hudlagene, derfor gir god tilgang til follikler og terminaler. den innervasjoner lett tilgjengelig og identifiserbare. Hårsekkene blir mer spredt fordelt enn i andre hud regioner, legge til rette for avbildning av enkeltpersoner eller små grupper av follikler. Den tynne underliggende dermal lag gir god tilgjengelighet til fargestoffer og farmakologiske stoffer, så er ideell for avbildning av fluorescens mikroskopi uten videre behandling. Den avbildning av merket terminaler kan enten være av levende terminaler eller, hvis du bruker en fikses fargestoff analog, etter fiksering og videre histologisk behandling.
Vi har brukt dette preparatet for å vise at membranen resirkulering oppstår i lansettformede avslutninger, dokumentert av opptak (endocytose) og slipp (eksocytose) av en styryl pyridinium fargestoff (FM1-43 N - (3-triethylammoniumpropyl) -4- (4- (dibutylamino) styryl) pyridinium dibromide). Fargestoffet ikke, men synes å betydelig merke investere Schwann cellulære prosessene to. Vi har også vist at dette farveopptaks / frigjøring, og følgelig membran reCycling, er underlagt glutamatergic modulering gjennom en atypisk (fosfolipase D-koblet) metabotrope glutamatreseptoren. Resultatene av enkle stimulering og analyseprotokoller er illustrert, og vanlige potensielle analyse problemer er også markert.
Protocol
Disse metoder ble anvendt i forskning rapportert i Banks, RW et al. 2. Mus ble humant avlivet ved cervikal dislokasjon. I Storbritannia er dette en lovlig Schedule en metode oppført i Dyr (Scientific Procedures) Act, 1986 og EU-direktiv 2010/63 / EU. Dette føderal lovgivning håndheves lokalt ved Universitetet i Aberdeen ved dyrevelferd og etisk Review Board som har godkjent alle prosedyrer.
1. Klar Ears for merking
- Utarbeide en standard fysiologisk saltvann, for eksempel Liley-tallet (1956) 5 og mette den med 90% O 2/5% CO 2 (carbogen). Liley 's saltoppløsning er (mM): NaHCO3 (12), KCl (4), KH 2PO 4 (1), NaCl (138,8), MgCl2 (1), CaCl2 (2) og glukose (11). MERK: Gjennom resten av dette manuskriptet, "saltvann" vil referere til saltvann som er fullt mettet med carbogen. under dissection, oppdatere saltvann som dekker utarbeidelsen hvert 15 - 20 min.
- Humant avlive en voksen mus uten å skade skallen. MERK: Vi har brukt C57 / Bl6J og MF1 mus, men noen musestamme kan brukes. Det viktigste er ikke å bruke store voksne (> 25 g). Merking i større mus er mindre pålitelige, ofte være begrenset til små og spredte grupper av follikler.
- Fjern de ytre ører (pinnae) i nærheten av basen med ~ 25 cm saks, like over den tette hår linje, og senk i saltvann i en silikongummi-lined kultur / petriskål (50 mm er vanligvis praktisk).
- Plasser pinna anterior (konkav) siden ned og pin marginene til silikon med jevne mellomrom med fin insekt pins (~ 6 - 8 per øre, ~ 0,2 mm diameter pins). Oppdater saltvann hvert 15 - 20 min, eller bruke en konstant dynket bad.
- Nøye skrelle bort bakre huden fra anterior huden ved stump disseksjon, i første omgang å få tilgang fra kuttet bunnen av pinna løpettykke sentrale brusk og systematisk arbeide mot de tynne, brusk frie eksterne marginer.
- For å gjøre dette, hold midten av klippekanten av bakre huden med et par nei. 3 tang. Deretter, med kjevene lukket, plasserer avreise et annet sett med no. 3 tang i mellomrommet mellom huden og det underliggende brusk.
- Forsiktig arbeide punktene for de lukkede tang fra side-til-side innenfor åpningen, ved hjelp av minste nødvendige kraft, omhyggelig løsne sammenvoksninger mens peeling tilbake den bakre huden for å skille lagene.
- Med bakre hud fjernes, la anterior huden i posisjon. Fest bakre hud, dermal siden opp, ved siden av anterior huden (som per 1.5 ovenfor).
- Neste, nøye og fjerne det ytre øret brusk som ble klemt mellom hudlagene fra fremre huden ved samme stump disseksjon teknikk som i 1.6. Unngå å lage punktering hull med pinsett.
- Deretter feller begge pinna hud preparater forsiktig skrelle, innmat og gni bort det tynne laget av bindevev, ligner ekspandert polystyren skum, som dekker hårsekken baser. MERK: Innhenting optimal clearing kan ta litt øvelse; utilstrekkelig vev fjerning hindrer tilgang, både for fargeløsning og for avbildning, mens skrap for kraftig fjerner de nevrale nettverk som er i bunnen av follikler.
- Oppdater saltvann.
2. lansettformede Terminal Merking
MERK: Følgende protokoll er optimalisert for styryl pyridinium fargestoff. Andre, kjemisk lignende, styryl pyridinium fargestoffer skal fungere, kanskje etter litt justering i konsentrasjon og inkubasjonstid. Bruk hansker og laboratoriefrakk ved håndtering dye løsninger. Enten kjøpe 10 mM stamløsning fargestoff direkte fra produsenten eller tilberede lager ved oppløsning av fargestoffet i pulver saltvann uten glukose. Delmengde (10 pl er vanligvis praktisk, men justere denne for stor SCAle eksperimenter) og butikken frosset i opptil 6 måneder ved -20 ° C eller ~ 1 år ved -80 ° C. Powder vil lagre i minst 2 år. Unngå gjentatte fryse / tine sykluser av dye løsninger; dette raskt denatures fargestoff. Når tint, oppbevar ved 4 ° C og bruk innen en uke.
- Forvarmer et vannbad til 30 ° C, med en plattform ~ 3 - 5 mm under overflaten av vannet.
- Tilbereder 10 uM styryl pyridinium-fargeløsning (10 ul friskt tinet 10 mM styryl pyridinium-fargestoff i 10 ml saltvann) og ekvilibreres i vannbad.
- Pin hvert preparat i en silikon-gummi foret 35 mm kulturskåler nedsenket i 1 - 2 mm saltløsning (typisk volum, ~ 2 ml). Hver pinna huden forberedelse vil gi to preparatene hvis halvert fra apex å basere med liten saks (10 - 15 cm lengde), for å minimere bruk av dyr.
- Plasser 35 mm retter som inneholder saltvann dekket pinna forberedelser på nedsenket plattform i 30 ° C vannbad. Sørg for atvanndybden er tilstrekkelig for tilstrekkelig oppvarming, men ikke forurense salt i åpen skål.
- Pin fine (0,5 til 1 mm ytre diameter) rør med rennende O 2 / CO 2 inn i silikon bunnen av hver rett til kontinuerlig gass forberedelsene. legger også inn i vannbadet 100 ml farvestoff-fri saltoppløsning for vasking / skål forfriskende. Bruk en tett propp-flasken for å opprettholde carbogen metning og hindre vann forurensning.
- Ekvilibrere alt ved 30 ° C i 30 min og deretter bytter saltvann over pinna preparater fra de 100 ml proppet flaske. Inkuber i ytterligere 30 min. MERK: Denne erstatning kompenserer for saltvann fordampning og eventuelle tap bulk volum som følge av gass-linje bobler.
- Hell bort farvestoff-fri saltoppløsning inn i et 100 ml begerglass avfall, og deretter raskt og omhyggelig blot bort eventuell væske igjen rundt preparat med silkepapir for å minimalisere utvanningseffekter på fargeoppløsning som skal tilsettes neste. Pass på å ikke røre (
- Inkuber pinna preparater i 2 - 3 ml av 10 uM styryl pyridinium-fargestoff i 40 min ved 30 ° C og deretter gå tilbake til R / T for resten av prosedyren.
- Fjern ikke-internalisert fargestoff i tre trinn, ved hjelp av løsninger på R / T. MERK: Disse trinnene utføres best i minimal omgivelseslyset (rullegardiner, rød / orange lav intensitet belysning) for å starte øye mørk-tilpasning for bildebehandling.
- Hell bort merkingen løsningen fra retter i en avfalls beger og raskt skylle i tre endringer av dye-fri saltvann i rask rekkefølge. Dette fjerner rest styryl pyridinium fargeløsning følger til forberedelser og noen fargestoff som lett departitions fra utsatte membraner.
- Inkuber i en endelig endring av farvestoff-frie saltoppløsning i ytterligere 30 min for å departition de gjenværende farvestoff fra overflatemembraner, dvs. fargestoff ikke internalisert av terminalene.
- Fjern vedvarende fargestoff fast to den ytre paknings av eksponerte membraner ved chelatering med sulfonerte b-cyklodekstrin-derivat (Advasep-7, 1 mM, 5 min - se Tabell 1). Dermed vil all gjenværende farvestoff være i vev.
- Sett i frisk dye-fri saltvann for bildebehandling og tørke utsiden av fatet grundig med silkepapir.
MERK: Terminalene er nå klar for bildebehandling. Det er viktig å være klar over at de lansettformede avslutninger er i live, og derfor langsomt slippe gjennom endocytose styryl pyridinium fargestoff igjen. Selv om dette vil være tregere på R / T, er det viktig å minimere forsinkelser før / under bildebehandling. Hvis forsøket krever merking av flere preparater, i første omgang holde dem alle umerket ved 30 ° C. De vil være levedyktig i flere timer. Deretter merke sekvensielt med intervaller, ved å merke den andre forberedelser (trinn 2.7 - 2.8.3) mens bildebehandling først.
3. Imaging Merket lansettformede Endings.
MERK: Observatørenbør være mørkt tilpasset for følgende bilde trinn. Den økte synsskarphet dette gir betyr lavere eksitasjon lysnivåer er nødvendig for å finne follikler for bildebehandling. Dette er viktigst for å minimere fototoksisitet snarere enn å redusere ulempene ved fotobleking. Frie radikaler som genereres av full intensitet belysning kan raskt (innen 60 sek) drepe levende nerveterminaler (GS dvergs, S. Fadul og WJ Betz, upubliserte observasjoner).
- Før bildebehandling, sjekk preparatet under en disseksjon stereo og fjerne enhver overflate rusk nøye. Dette hindrer automatisk fluorescens forurensende bildene.
- Monter parabolen på scenen av en oppreist epifluorescence mikroskop med en standard fluorescein filtersett (480-488 nm eksitasjon, 500-520 nm emisjon for styryl pyridinium fargestoff).
- Dempe eksitasjon lysintensitet med filtre nøytral tetthet til akkurat tilstrekkelig til å komfortabelt finne terminalens.
- Lokal merket follikler ved å observere med lav (3.5x - 4x tørr objektiv), deretter gradvis høyere (10x og 20x vann nedsenking objektiv) forstørring.
- Ta bilder av merket lansettformede terminaler gjennom 10x tørr objektiv for lavt strømforbruk og 20x vann nedsenking mål for høyere forstørrelse. Minimal lysintensiteten og eksponeringstid (et kamera integrasjonstiden av 0,5 til 1 sek er foreslått).
- Ta bilder på en standard digitalt kamera og lagre bilder på datamaskinen harddisk ved hjelp av proprietær programvare. NB: Et typisk eksempel er vist i figur 1.
- Bilde ~ 20 lansettformede avslutninger fra hvert preparat. Start på marginen lengst fra skjærekant ved undersiden av det ytre øret huden og arbeid langs denne marginen avbildning hver follicle etter tur. Arbeid på tvers i litt overlappende felt parallelt med klippekanten, tar seg ikke å avbilde den samme hårsekken to ganger, og noen som er åpenbart skadet. MERK:re er typisk for mange lansettformede terminaler til bilde dem alle før betydelig spontan de-flekker oppstår. Derfor foreslår vi systematisk prøvetaking befolkningen ved hjelp av følgende protokoll.
- Etter endt marginal strip, flytte ett felt-bredde mot bunnen av det ytre øret, og gjenta prosessen i motsatt retning.
- Bilde alle terminaler oppstått, bortsett fra sporadisk de klart orienterte veldig mye mer på skrå til den optiske plan og neppe å passe helt innenfor standard ring analyse ROI (se kapittel 4). Utelukker ikke uvanlig sterkere eller svakere lanceolates forhold til de omkringliggende terminaler, med mindre de er åpenbart skadet eller bakgrunn intensitet er spesielt høy, noe som indikerer lokalisert vevsskade.
- Kast fremstillingen dersom mer enn 10% av hudområdet / terminalene er skadet / ubrukelig. MERK: Som lanceolates destain med tiden, komplett bilde hvert preparat innen 20 min på slutten av vask.
- jegf å bruke mer enn en forberedelse, sikre intensitet sammenligninger er gyldig ved tids matchende forberedelser. For å gjøre dette, offset timing av flekker hvert preparat av ~ 30 min, for å sikre sammenlignbarhet av de-beis ganger.
- For å overvåke de-flekk (eksocytose), bilde samme terminal på 5 eller 10 min intervaller. I praksis er det mulig å avbilde opp til 3 separate terminaler på hvert tidspunkt i hvilket som helst preparat.
4. Analysere Merket lansettformede Endings.
Merk: Følgende prosedyre er en rask metode for å analysere terminal intensitet.
- Lage et ringformet område av interesse (ROI) sentrert på spissen av håret på basis av follikkelen (figur 2). Angi den indre omkrets av det ringformede ROI stor nok til å unngå hårskaftet auto-fluorescens i en hvilken som helst follikkel som skal analyseres, men likevel omfatte alle terminalen fluorescens. Sørg for at den ytre omkrets er stor nok til å omslutte den største terminal sannsynlig å bli møtt som er orientert nær hoved optisk / hårsekken aksen.
- Foreta en bakgrunn ROI tilnærmet lik i området til målet ringrommet (kvadrat eller en sirkel, typisk ~ 400 mikrometer 2) for å bestemme den lokale fargeintensitet i nærheten av terminalen som analyseres.
Merk: Størrelsene på disse to ROIs er satt ved begynnelsen av analysen og som brukes til å analysere alle etterfølgende follikler / lansettformete klemmene på tvers av alle preparatene i ett eksperiment. Så, er det viktig å sette sine parametere med omhu i begynnelsen. - Plasser bakgrunn ROI nær nok til hårsekken til å representere lokal bakgrunn i talgkjertlene som ligger til grunn terminalene, ikke lavere intensitet huden mellom folliklene, men vær forsiktig så du ikke inkludere noen terminal regioner.
- Spill middelverdien intensiteten av de to Rois ved hjelp av "tiltaket" eller "analysere ROI 'funksjon av programvare og overføre data til et regneark.
- I regnearket for hver enkelt follicle subtrahere den midlere lokale bakgrunnsintensitet fra den i ringrommet for å gi en netto intensitet. Denne justeringen for lokaliserte bakgrunn reduserer mellom-hårsekken variabilitet.
Representative Results
Hårsekkene i denne pinna forberedelse er lett ses under gjennomlysnings uten fluorescens (figur 1A), illustrerer wafer-tynn natur av kjemikaliet og relativ enkel tilgjengelighet den gir til disse mechanosensory terminaler. Hver er preget av den prominente håret basen piercing mørke halvmåne av talgkjertel. Under epifluorescence, blir de merkede lansettformede terminaler rundt hver hårsekken tydelig sett og vis vanligvis robust spontan styryl fargestoff opptak (figur 1B). Dette skjer uten pålagt bevegelse. De lansettformede terminaler er sett til å omringe håret, selv om omfanget av omringing er variabel 6. Mye av merkingen er punktformet (flekker) i stedet for den lineære ordning som kan forventes. Den punktformet mønster reflekterer terminaler som observeres i en optisk plan langs lengden av terminalen. This fremstilling mottok ingen ytterligere behandling for visualisering etter merking, det bare ble overført til et objektbord og avbildes in situ, hvilket igjen illustrerer enkelheten av dette preparat.
Eksempel eksperimenter som denne nye preparatet er egnet, er vist i figur 3. Den kan brukes til å studere både endocytose og exocytose i levende terminaler, samt deres modulasjon. Således, for endocytose, kan glutamat-reseptor-agonister øker merking intensitet, mens den blokkerer Ca 2 + kanaler med ligander eller kationer så som Mg2 +, Ni2 + eller Cd2 + minsker den to. Alternativt kan dette preparat også brukes til å studere kinetikken til exocytose, som vist i figur 3C. Først blir et merket terminal sett de-farging spontant. Imidlertid er denne destain akselereres ved exocytose stimulerende, latrotoxin. mer dehaler av de eksperimentelle resultatene kan sees i Banker, RW et al. to.
Figur 1. Robust Styryl Dye Merking Innspilt i Mouse Pinna. (A) En del av en umerket pinna forberedelse i lyse felt belysning, viser hvor tydelig hårsekker vises i områder ryddet av overliggende areolar / fettvev. De mørke, vanligvis bilobed, halvmåne former er talgkjertler rundt sentrale håret. (B) En tilsvarende område, til en litt høyere forstørrelse og avbildes med epifluorescence, viser lansettformede avslutninger merket med styryl fargestoff. Skala barer -. 40 mikrometer Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
"1"> 
Figur 2. Analyse av Styryl Dye Merking Intensitet. (A) Typisk sirkulært mønster av hårsekken merking med styryl fargestoff, sentrert på håret (ikke synlig på bildet). (B) Hovedanalyse 'region av interesse "(ROI) er definert av en standard ringrom lagt over plasseringen av palisade av lansettformede nerveender omkranser hårsekken. Denne avkastningen holdes konstant i form og område for en enkelt eksperiment for å sikre merking intensitet kan ganske sammenlignes mellom forberedelser og på tvers av alle behandlinger. Netto intensitet av hver ROI beregnes ved å trekke intensiteten av en tilstøtende kvadratisk eller sirkulært bakgrunn region (~ 400 mikrometer 2). Igjen, dette er firkantet bakgrunn regionen holdes konstant i form og området gjennom noen gitt eksperiment.target = "_ blank"> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Merking Intensitet av hårsekken afferente Lanceloate Endings er ikke normalfordelt, og kan brukes til å undersøke både endo- og eksocytose. Typiske data fra styryl fargestoff intensitetsmålinger i spontant merket lansettformede inngangene med analysemetoden beskrevet ovenfor. (A) Merking intensitet etter kontroll forhold (54 follikler, 4 ører) og 1 mM glutamat (42 follikler, 4 ører). Intensitetsverdiene av de enkelte avslutninger er vist som klynge dot plots. Hvert punkt representerer intensiteten av en terminal Palisade rundt en follikkel. Legg merke til at selv under kontroll forhold noen datapunkter (follikler) er svært intense, mens de fleste er samlet ved lavere intensiteter. Den første punktum på en bestemt intensligheten er plottet på midten og etterfølgende datapunkter av samme intensitet er plottet progressivt mer sideveis på hver side. Således representerer lateral spredning hyppigheten av follikler på en hvilken som helst spesiell merking intensitet. De horisontale linjene representerer median ± 25% interkvartile området. Inkubasjon med 1 mM glutamat forbedrer median intensitet med ~ 50% (*** P <0,001, Mann-Whitney), men merking kan bli styrket ved 200-300% i enkelte terminaler. (B) som viser glutamat-mediert forbedret fargeopptak (endocytose). Inkubasjon av hårsekken preparat i glutamat (1 mM) øker markert styryl farveopptaks, som vist ved den økte merking intensitet. Scale bar 20 mikrometer. (C) Styrking fargestoff utgivelsen (eksocytose). Etter merking, er styryl fargestoff spontant løslatt igjen, som merking på 0 min er helt klart lysere enn på 60 min, selv etter bakgrunn subtraksjon å kontrollere for fotobleking. Denne utgivelsen er sterkt potentiated av latrotoxin, en sort enke edderkoppen gift bestanddel, som utløser ukontrollert vesikkel eksocytose. Etter 60 min i toxin, er terminal merking nesten umulig å oppdage. Dette er reversibel styryl fargestoff merking støtter hypotesen om at terminalen fluorescens skyldes intern under lokal resirkulering av synaptiske lignende blemmer. Scale bar 20 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Bewick og Betz opprinnelig utviklet N- (3-triethylammoniumpropyl) -4- (4- (dibutylamino) styryl) pyridinium-dibromid-relaterte styryl pyridinium fargestoffer 7-10 for å overvåke lokal gjenvinning av synaptisk vesikkelmembranen. Dye opptak, og dermed økt fluorescens, gjenspeiler derfor synaptisk vesikkelmembranen intern (endocytose). Senere denne internalisert fargestoff kan bli re-utgitt av ytterligere elektrisk aktivitet, viser fargestoff tap overvåker vesikkelmembranen eksternalisering (eksocytose). I synapser, er dette en proxy for nevrotransmitter sekresjon. Samtidig, også fant vi disse fargestoffer merke primære mechanosensory nerveender 7. Mer nylig 11, Bewick, banker og kolleger viste at dette gjenspeiler en tilsvarende prosess i modne, differensierte mechanosensory terminaler ex vivo. Her igjen, fargestoffer merke 50 nm diameter 'synaptiske lignende' vesikler (Leverandører av ett språk) som resirkulerer konstitutivt å frigjøre glutamat.I mechanosensory terminaler, i motsetning til sine synaptiske kolleger, dette er resirkulering primært spontan. Det er også modulert ved hjelp av mekanisk, snarere enn bare elektrisk, stimulering.
For sensoriske nevroner i kultur og i cochlea hårceller, styryl fargestoffer generelt og styryl pyridinium fargestoff spesielt har vist seg å passere gjennom mechanosensory kanalene, blokkerer mechanosensory kanaler og irreversibelt merking interne membraner 12. Men på sammenlign styryl fargestoff konsentrasjoner i differensierte mechanosensory terminaler i situ, som her i lansettformede avslutninger 2, eller i Ia avslutninger i muskel spindler 11, og i hårcellene som ikke er mekanisk stimuleres 13, 14, er merking av membran endocytose. I mechanosensory nerveterminaler, for eksempel, er merking reversible og ikke blokkere mechanosensory responser ved de konsentrasjoner som er brukt her 2, 11, 15. Mens noen fargestoff intern etter kanal gjennomtrengning i disse avslutninger ikke kan utelukkes helt, nær total destain med latrotoxin indikerer det store flertallet av merkingen i modne terminaler er av intern med resirkulering vesikkel membran. Vi har derfor brukt denne teknikken til å studere aktiviteten avhengighet 11 og, sist, farmakologi 2 av SLV gjenvinning i mechanosensory afferente terminaler ved å undersøke virkninger av rusmidler på opptak og utslipp av fargestoffer.
Som med de fleste praktiske teknikker krever reproduserbarhet repetisjon og praksis. Noen av de viktigste punktene for å sikre pålitelighet vil nå bli diskutert. Lansettformede merking i yngre dyr er mer pålitelig - den minste dyr vi har brukt var 15 g kroppsvekt. Det er ikke helt klart hvorfor dette er tilfelle, men det kan være på grunn disseksjon av den yngre bindevev krever mindre mekanisk trauma og leaves mindre gjenværende rester når du fjerner vev overliggende innervasjon laget.
Totalt sett er vevet forberedelse ganske enkelt, med peeling huden lagene fra hverandre er den mest teknisk utfordrende praktiske aspektet og da bare i eldre mus. I disse, hudlagene holder seg sterkt sammen ved bunnen hvor disseksjon starter, men selv her separering av lagene blir mye enklere mot margen. Heldigvis, eller kanskje derfor disse tynnere marginale hudområder vanligvis gi den mest tilfredsstillende merking, som gjør anterior huden generelt. Derfor spesielt unngå å ta tak i meget tynne huden på marginene. For å minimalisere risikoen for skade, manipulere preparater indirekte ved å presse med lukkede tang i stedet for å gripe direkte, eller hvis vesentlig gripe bare seigt bindevev lite egnet til å bli merket. Være grundig i å fjerne den "arket polystyren" lag umiddelbart liggende follikler, da dette er hoved megmekaniske hindring for bildebehandling og narkotika tilgang. Det er imidlertid viktig å minimalisere fysisk kontakt med underliggende strukturer som dette skader (dvs. strimler bort) nevrale nettverk og terminaler like nedenfor. Dersom den dominerende fluorescens er gul / hvit i talgkjertlene, fremtredende auto-fluorescens av håret baser og noen halvmåner av oransje / gul lansettformede avslutninger, indikerer dette nerve plexus laget og forbundet lansettformede terminalene har blitt fjernet i løpet av klaring. Dette ser ut til å være hovedproblemet med eldre (> 30 g) mus. Gjennom flekker prosedyrer, sikre at alt er ved 30 ° C og oksygenrikt. Vær oppmerksom på at merkede terminaler er fortsatt i live. Følgelig vil fargestoff bli utskilt av pågående spontan (konstituerende) exocytic utgivelse. Dette vil være tregere på R / T, men det er god praksis å minimalisere forsinkelsen mellom fjerning av kelator løsning og bildebehandling, for å minimere farge tap. Videre, for mellom-grupper sammenlignings studies av intensitet, er det viktig å sikre avbildning av alle grupper er tids matchet. Anvendelse av et fargestoff-chelateringsmiddel før avbilding i stor grad forbedrer bildekontrast. Så, mens relativt dyrt, er chelation trinnet ganske viktig for å sikre god bildekvalitet. Chelator anvendelse kan minimaliseres ved å gjenbruke oppløsningen flere ganger, og til og med på 2 - 3 påfølgende dager, når den lagres ved 4 ° C mellom hver bruk. Kast chelator løsning når det går merkbart rosa, viser sin fargestoff lagring nærmer seg metning.
Under avbildning, være klar over potensialet for fototoksisk skade på disse levende klemmene, som er en kumulativ resultat av både intensiteten og eksponeringstiden av eksitasjonslyset. Dette hensynet er mindre viktig for enkeltendepunktet bilder, der bildekvalitet er den primære bekymring. Imidlertid er det avgjørende ved gjentatt avbildning i kinetikkstudier for å redusere eksitasjonslys eksponering til et minimum. Mens utvikle disse fargestoffer tillabel synapser, fant vi eksitasjon for> 1 min på full effekt eksitasjon belysning vil føre til dramatisk og uopprettelig skade på nerveender. De først deretter utvide enormt, og deretter bryte helt sammen over en periode på ~ 15 min. Vi har ikke systematisk teste de relative bidrag fra eksponeringstid og intensitet, men disse observasjonene tyder på det styrende prinsippet bør være å redusere begge. Så er det anbefalt at eksitasjonslys intensitet og varighet er minimum i samsvar med å få gode bilder, og egnede kontroll bilder blir tatt i tidskurs studier. For å teste at dataene ikke er påvirket av fototoksisitet etter gjentatte bildeforhold på hvert tidspunkt ta et ekstra bilde av en tidligere usett terminal. Dette for å sikre oppførselen til merking i naive terminaler ligner den i follikler som avbildes gjentatte ganger.
En rekke faktorer kan redusere innen-gruppe variasjonen av netto intensitet data. Nøyaktig plassering av Rois, spesielt bakgrunnen ROI, er viktig, som selv små områder av upassende flekker i stor grad kan påvirke mellom-hårsekken data variabilitet. Variasjonen i netto intensitet er også påvirket av hvor fullstendig hver hårsekken er omkranset av palisade av avslutninger. Sammenlign for eksempel den halvmåneformede merking fordeling i figur 1B med nesten sirkelformet mønster vist på figur 2. Mer kompleks analyse, kanskje ved hjelp av automatisert programvare deteksjon og terskelverdier, er nødvendig hvis graden av omring er en aktuell parameter. Vær oppmerksom på at intensitetsfordelingene for selv de mest presist analyserte hårsekken gruppene ikke er normalfordelt (se figur 3), nødvendiggjør bruk av ikke-parametrisk statistikk for mellom-behandling sammenligninger av befolknings median i stedet for midler. Normaliserings teknikker, slik som uttrykker intensiteter som en prosentandel of kontralaterale kontroll, eller av en kontrollgruppe består av flere preparater, kan anvendes for ytterligere å redusere variabilitet. Den endelige tekniske elementet som skal vurderes er eksperimentell design for farmakologisk testing. I løpet av farmakologiske undersøkelser, pre-inkuberes ved fremstillingen i medikamentløsningen i 30 minutter før påføring fargestoff. Deretter opprettmedikamentkonsentrasjonen i fargestoffoppløsningen. I kontroller, bruke enten saltvann eller, hvis stoffet er oppløst i et kjøretøy, saltløsning pluss kjøretøy.
Denne artikkelen viser hvordan denne nye pinna forberedelse tilbyr kvalitet bilder av mechanosensory avslutninger høy i huden med minimal forberedelse. Vi viser også at den kan brukes til å undersøke farmakologi av to viktige aspekter av vesikkel resirkulering. Vi viser først at en glutamat reseptor agonist kan øke fargestoff intern (en markør for endocytose), og andre, er at fargestoff tapte igjen med latrotoxin (et sentralstimulerende av eksocytose). Betydningen av denne forberedelse;ion og teknikken er at den tilbyr utmerket tilgang til levende hud mechanosenory terminaler in situ for bildebehandling eksperimenter, affording unike muligheter for optisk overvåkning av terminal funksjon, struktur og deres relasjonene. Til dette siste slutt, har vi også utviklet den videre til bruk i kombinert optisk / elektrofysiologiske studier (se søster Jove artikkelen for detaljer).
Disclosures
Forfatterne har ikke noe å avsløre.
Acknowledgments
Arbeidet ble finansiert av britiske Medical Research Council prosjektstøtte G0601253 til GSB og RWB og en SULSA Bioskape tilskudd til GSB
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PDMS - Sylgard 184 | Dow Corning | Flexible, inert, translucent solid silicone polymer. | |
| No. 3 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11231-20 | |
| Austerlitz Insect pins | Fine Science Tools | 26002-10 | Very fine pins to attach pinna preparation securely to the PDMS with minimal damage. |
| FM1-43/Synaptogreen C4 | Biotium/Cambridge Bioscience | BT70020 | Fluorescent membrane probe that reversibly partitions into the outer leaflet of cell membranes. Used predominantly for monitoring vesicle membrane endo-/exocytosis. |
| Advasep 7 | Biotium/Cambridge Bioscience | BT70029 | A sulfonated b-cyclodextrin derivative that chelates FM1-43 (& other styryl pyridinium dyes) out of the exposed membranes, leaving internalised dye to be seen more clearly by lowering the background labelling/fluorescence. |
| Retiga Exi Fast 1394 | Qimaging | Monochrome, cooled CCD camera - basic model | |
| Volocity 3D Image Analysis Software | Perkin Elmer | Volocity 6.3 | Image capture and analysis software. |
References
- Li, L., et al. The functional organization of cutaneous low-threshold mechanosensory neurons. Cell. 147 (7), 1615-1627 (2011).
- Banks, R. W., et al. Glutamatergic modulation of synaptic-like vesicle recycling in mechanosensory lanceolate nerve terminals of mammalian hair follicles. J. Physiol. 591 (10), 2523-2540 (2013).
- Andres, K. H. On the microstructure of receptors on sinus hair. Z. Zellforsch. Mikrosk. Anat. 75, 339-365 (1966).
- Shenton, F., Bewick, G. S., Banks, R. W. A study of the expression of small conductance calcium-activated potassium channels (SK1-3) in sensory endings of muscle spindles and lanceolate endings of hair follicles in the rat. PLoS One. 9, e107073 (2014).
- Liley, A. W. An investigation of spontaneous activity at the neuromuscular junction of the rat. J. Physiol. 132 (3), 650-666 (1956).
- Suzuki, M., Ebara, S., Koike, T., Tonomura, S., Kumamoto, K. How many hair follicles are innervated by one afferent axon? A confocal microscopic analysis of palisade endings in the auricular skin of thy1-YFP transgenic mouse. Proc. Jpn. Acad. Ser. B. Phys. Biol. Sci. 88 (10), 583-595 (2012).
- Betz, W. J., Mao, F., Bewick, G. S. Activity-dependent fluorescent staining and destaining of living vertebrate motor nerve terminals. J. Neurosci. 12 (2), 363-375 (1992).
- Betz, W. J., Bewick, G. S., Ridge, R. M. Intracellular movements of fluorescently labeled synaptic vesicles in frog motor nerve terminals during nerve stimulation. Neuron. 9 (5), 805-813 (1992).
- Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. Science. 255 (5041), 200-203 (1992).
- Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical monitoring of transmitter release and synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. J. Physiol. 460 (1), 287-309 (1993).
- Bewick, G. S., Reid, B., Richardson, C., Banks, R. W. Autogenic modulation of mechanoreceptor excitability by glutamate release from synaptic-like vesicles: evidence from the rat muscle spindle primary sensory ending. J. Physiol. 562 (2), 381-394 (2005).
- Drew, L., Wood, J. FM1-43 is a permeant blocker of mechanosensitive ion channels in sensory neurons and inhibits behavioural responses to mechanical stimuli. Molecular Pain. 3, (2007).
- Griesinger, C. B., Richards, C. D., Ashmore, J. F. FM1-43 reveals membrane recycling in adult inner hair cells of the mammalian cochlea. J. Neurosci. 22 (10), 3939-3952 (2002).
- Griesinger, C. B., Richards, C. D., Ashmore, J. F. Apical endocytosis in outer hair cells of the mammalian cochlea. Eur. J. Neurosci. 20 (1), 41-50 (2004).
- Watson, S., Aryiku, C., Banks, R. W., Bewick, G. S. Comparison of gadolinium and FM1-43 as blockers of stretch-evoked firing of rat muscle spindle afferents. Proc. Physiol. Soc. 21, P22 (2010).
