Abstract
En hidtil ukendt dissektion og optagelse teknik er beskrevet for optisk overvågning farvning og de-farvning af lancetformede terminaler omkring hårsækkene i huden af mus pinna. Præparatet er enkel og relativt hurtigt, pålideligt giver omfattende regioner af flere mærkede enheder af levende nerve terminaler til at studere optagelse og frigivelse af styryl pyridinium farvestoffer udstrakt grad anvendes i studier af vesikel genbrug. Inddele forberedelserne før mærkning tillader test vs. kontrol sammenligninger i samme øre fra et enkelt individ. Nyttige tips er givet for at forbedre kvaliteten af forberedelsen, mærkningen og de billeddannende parametre. Det nye system er velegnet til analyse farmakologisk og mekanisk induceret optagelse og frigivelse af disse vitale farvestoffer i lancetformede terminaler i både vildtype og genetisk modificerede dyr. Eksempler på modulatoriske indflydelse på mærkning intensitet er givet.
Introduction
Mechanosensory nerveender er typisk små, fordelt diffust og vanskeligt tilgængelige in situ, da de normalt er begravet dybt i huden eller andre omgivende væv. Visualisere dem derfor sædvanligvis kræver sektionering efterfulgt af en langvarig immunolabeling / farvning periode, eller forsinkelsen og dyrt at opnå muselinjer med genetisk ekspression af fluorescerende mærker såsom grøn eller gul fluorescerende protein (GFP / YFP) 1. Her viser vi en bekvem væv og en hurtig og enkel metode til at få adgang til et stort antal hårsækken afferenter for at studere, og hvordan de kan hurtigt mærkes til optisk overvågning af terminal funktion 2. Med praksis, kan hele teknik fra dissektion til billedbehandling være afsluttet i så lidt som 2 timer.
De lancetformede terminaler af sensoriske axoner innerverer hårsækkene i pattedyr danne palisader omkring epitelet af hår-follicle, med hverterminal indlagt mellem glial / Schwann celleprocesser 2-4. Formålet med terminalerne er at påvise mekanisk forskydning af hårene de omgiver. De er en blanding af hurtigt og langsomt tilpasning endelser, men de overvejende producerer korte byger af aktivitet som respons på håret bevægelse. Typisk brændingen stopper meget hurtigt, når bevægelse ophører, selv i nærvær af en fortsat forskydning.
Denne murine pinna model til undersøgelse lancetformede terminaler ved optiske metoder har mange fordelagtige træk til undersøgelse af strukturen og funktionen af disse endelser. Pinna er overvejende to lag af huden apposed back-to-back, med kun en lille mængde af bruskvæv mellem. Huden er meget tynd og let dissekeret grund af minimale mængder af svagt klæbende bindevæv i forhold til andre områder af kroppen. De let adskilte hudlag derfor giver god adgang til de hårsække og terminaler. Den innervationer let tilgængelig og kan identificeres. Hårsækkene mere tyndt fordelt end i andre hudområder, lette billeddannelse af individuelle eller små grupper af follikler. Den tynde underliggende hudlag giver god tilgængelighed til farvestoffer og farmakologiske stoffer, så er ideel til billeddannelse ved fluorescens mikroskopi uden yderligere forarbejdning. Den billeddannelse af mærkede terminaler kan enten være af levende terminaler eller, hvis du bruger en fixable farvestof analog, efter fiksering og yderligere histologisk behandling.
Vi har brugt dette præparat at vise, at membranen genbrug opstår i lancetformede slutninger, fremgår af optagelse (endocytose) og frigivelse (exocytose) af en styryl pyridinium farvestof (FM1-43, N - (3-triethylammoniumpropyl) -4- (4- (dibutylamino) styryl) pyridinium dibromid). Farvestoffet dog ikke, synes i væsentlig grad at mærke investerer Schwann celle processer 2. Vi viste også, at denne farvestofoptagelse / release og dermed membran recycling, er underlagt glutamaterge modulation gennem en atypisk (phospholipase D-koblede) metabotrop glutamat receptor. Resultaterne af enkle stimulation og analyse protokoller er illustreret, og fælles potentielle analyse spørgsmål er også fremhævet.
Protocol
Disse metoder blev anvendt i forskning rapporteret i Banks, RW et al. 2 Mus blev humant aflivet ved cervikal dislokation. I Storbritannien, er det en juridisk godkendt Skema 1 metode anført i Dyr (videnskabelige procedurer) Act, 1986 og europæisk direktiv 2010/63 / EU. Denne føderale lovgivning håndhæves lokalt på University of Aberdeen i dyrevelfærd og Etisk Review Board, der har godkendt alle procedurer.
1. Forberedelse Ører til mærkning
- Forbered en standard fysiologisk saltopløsning, såsom Liley s (1956) 5 og mætte den med 90% O2 / 5% CO 2 (carbogen). Liley s saltopløsning er (mM): NaHCO3 (12), KCI (4), KH 2 PO 4 (1), NaCl (138,8), MgCI2 (1), CaCl2 (2) og glucose (11). BEMÆRK: I hele den resterende del af dette håndskrift, "saltvand" vil henvise til saltvand, der er fuldt mættet med carbogen. Under dissection, opdatere saltvand som omfatter forberedelse hver 15 - 20 min.
- Humant aflive en voksen mus uden at beskadige kraniet. BEMÆRK: Vi har anvendt C57 / BL6J og MF1 mus, men enhver musestamme kan anvendes. Det vigtigste aspekt er ikke at bruge store voksne (> 25 g). Mærkning i større mus er mindre pålidelige, ofte er begrænset til små og spredte grupper af hårsække.
- Fjern de ydre ører (pinnae) nær basen med ~ 25 cm saks, lige over den tætte hår linje, og nedsænkes i saltvand i et siliconegummi-foret kultur / petriskål (50 mm er sædvanligvis praktisk).
- Placer pinna anterior (konkave) nedad og pin margenerne til silikone med jævne mellemrum med fine insekt stifter (~ 6 - 8 pr øre, ~ mm diameter 0,2 pins). Opdater saltvand hver 15-20 minutter, eller bruge en konstant perfunderet bad.
- Træk forsigtigt væk posterior huden fra den forreste huden ved stump dissektion, først adgang fra de afskårne bunden af pinna i løbetden tykke centrale brusk og systematisk arbejder hen imod de tynde, brusk-fri eksterne marginer.
- For at gøre dette, hold på midten af den afskårne kant af den bageste huden med et par no. 3 pincet. Derefter, med kæberne lukket, placere de punkter i et andet sæt nr. 3 pincet i kløften mellem huden og det underliggende brusk.
- arbejde forsigtigt de punkter i de lukkede pincet fra side til side inden for åbning ved hjælp af den minimale krævede kraft, omhyggeligt løsne sammenvoksninger mens skrælning tilbage den bageste huden for at adskille lagene.
- Med den bageste hud fjernes, efterlader den forreste hud i position. Pin posteriore huden, dermal opad, ved siden af den forreste hud (som pr 1.5, ovenfor).
- Dernæst omhyggeligt og fuldstændigt fjerne pinna brusk, der blev indlagt mellem overfladelagene fra det forreste hud ved den samme stump dissektion teknik som i 1.6. Undgå at punktere huller med pincet.
- Derefter, feller begge Pinna præparater hud blidt skræl, plukke og gnid væk det tynde lag af bindevæv, der ligner ekspanderet polystyren skum, der dækker hårsækken baser. BEMÆRK: Indhentning optimal clearing kan tage lidt øvelse; utilstrækkelig fjernelse væv hindrer adgang, både for farveopløsning og til billeddannelse, mens skrabning for voldsomt fjerner de neurale net, som i bunden af folliklerne.
- Opdater saltvand.
2. lancetformede Terminal Mærkning
BEMÆRK: Følgende protokol er optimeret til styryl pyridinium farvestof. Andre, kemisk lignende, styryl pyridinium- farvestoffer bør arbejde, måske efter nogle justeringer i koncentration og inkubationstid. Brug handsker og en kittel ved håndtering farvestof løsninger. Enten købe 10 mM lager farveopløsning direkte fra producenten eller forberede lager ved at opløse farvestoffet pulver i saltvand uden glukose. Prøve (10 pi er sædvanligvis praktisk, men justere denne til store scale eksperimenter) og butik frosne i op til 6 måneder ved -20 ° C eller ~ 1 år ved -80 ° C. Pulver gemmer i mindst 2 år. Undgå gentagne fryse / tø cyklusser af farvestofopløsninger; denne hurtigt denaturerer farvestoffet. Når optøet, opbevares ved 4 ° C og anvendes inden for en uge.
- Forvarm et vandbad til 30 ° C, med en platform ~ 3 - 5 mm under vandoverfladen.
- Frisk forberede 10 uM styryl pyridinium farveopløsning (10 pi frisk optøet 10 mM styryl pyridinium farvestof i 10 ml saltvand) og tempereres i vandbad.
- Pin hvert præparat i en silicone-gummi foret 35 mm dyrkningsskåle nedsænket i 1 - 2 mm af saltvand (typisk volumen, ~ 2 ml). Hver pinna forberedelse hud vil give to præparater, hvis halveret fra apex at basere med en lille saks (10 - 15 cm længde), for at minimere anvendelsen af dyr.
- Placer mm skåle 35 indeholdende saltvand-dækket Pinna præparater på nedsænket platform i 30 ° C vandbad. Sørg for,vanddybde er tilstrækkelig til en passende opvarmning, men ikke forurener saltvand i den åbne skål.
- Pin fint (0,5-1 mm ydre diameter) rør med strømmende O 2 / CO 2 ind i silikone bunden af hver skål til løbende gas forberedelserne. Også anbringes i vandbadet 100 ml farvestof-frit saltvand til vask / skål forfriskende. Brug en tæt tilproppet-flaske til at opretholde carbogen mætning og forhindre forurening vand.
- Ækvilibrere alt på 30 ° C i 30 min og derefter erstatte saltvand over Pinna præparater fra de 100 ml tilproppet flaske. Inkuber i yderligere 30 minutter. BEMÆRK: Denne udskiftning kompenserer for saltvand fordampning og eventuelle tab bulk-volumen som følge af gas-line boblende.
- Hæld væk dye-fri saltvand i et 100 ml affald bægerglas, derefter hurtigt og omhyggeligt skamplet væk enhver væske tilbage omkring forberedelse med silkepapir at minimere udvandingseffekt på farvestoffet løsning tilføjes næste. Pas på ikke at røre ved (
- Inkuber Pinna præparater i 2 - 3 ml 10 pM styryl pyridinium farvestof i 40 min ved 30 ° C derefter vende tilbage til R / T for resten af proceduren.
- Fjerne ikke-internaliseret farvestof i tre faser, under anvendelse af opløsninger på R / T. BEMÆRK: Disse trin udføres bedst i minimal omgivende lys (mørklægningsgardiner, rød / orange lav intensitet belysning) for at begynde øjet mørk-tilpasning til billeddannelse.
- Hæld væk mærkningen løsning fra servicet i et spild bægerglas og hurtigt skylles i tre hold af farvestof-fri saltvand hurtigt efter hinanden. Dette fjerner den resterende styryl pyridinium farveopløsning fastholdelsen af forberedelserne og enhver farvestof, der let departitions fra udsatte membraner.
- Inkuber i en endelig ændring af farvestof-frit saltvand i yderligere 30 min til departition mest resterende farvestof fra overflademembraner, dvs. farvestof ikke internaliseret af terminalerne.
- Fjern vedholdende farvestof fast to den eksterne indlægsseddel eksponerede membraner ved chelatering med sulfoneret b-cyclodextrinderivat (Advasep-7, 1 mM, 5 min - se tabel 1). Således vil alle resterende farvestof være inden vævene.
- Anbring i frisk farvestof-frit saltvand til billeddannelse og tørre ydersiden af skålen grundigt med filtrerpapir.
BEMÆRK: Terminalerne er nu klar til billeddannelse. Det er vigtigt at være opmærksom på, at lancetformede endelser er i live, og derfor langsomt frigive endocytose styryl pyridinium farvestof igen. Selv om dette vil være langsommere ved R / T, er det vigtigt at minimere forsinkelser før / under billedbehandling. Hvis forsøget kræver mærkning af flere præparater i begyndelsen opretholde dem alle umærket ved 30 ° C. De vil være levedygtige i flere timer. Så mærke sekventielt med mellemrum, ved mærkning af anden forberedelse (trin 2.7 - 2.8.3), mens billeddannelse den første.
3. Imaging mærket lancetformede Endings.
BEMÆRK: Observatørenbør være mørk-tilpasset til følgende billeddannende trin. Den øgede synsstyrke dette giver betyder lavere magnetisering lysniveauer er forpligtet til at finde de hårsække til billeddannelse. Dette er meget vigtigt for at minimere fototoksicitet stedet for at reducere ulemperne ved fotoblegning. Frie radikaler genereret af fuld belysning intensitet kan hurtigt (inden for 60 sek) dræbe levende nerveender (GS pibesvaner, S. Fadul og WJ Betz, upublicerede observationer).
- Før billedbehandling, kontrollere forberedelse under en dissektion stereomikroskop og fjern forsigtigt enhver overflade snavs. Dette forhindrer autofluorescens kontaminerende billederne.
- Monter fadet på scenen af en opretstående epifluorescensmikroskop med et standard fluorescein filter sæt (480-488 nm excitation, 500 - 520 nm emission for styryl pyridinium farvestof).
- Dæmpe ekscitationslysintensiteten med neutralfiltre indtil lige tilstrækkelig til komfortabelt placere terminalens.
- Find mærkede hårsække ved at observere med lav (3,5x - 4x tør mål), derefter gradvist højere (10x og 20x vand nedsænkning objektive) forstørrelsesobjektiver.
- Tag billeder af mærket lancetformede terminaler gennem 10x tørt mål for lavt strømforbrug og 20x nedsænkning i vand mål for højere forstørrelse. Minimer lysintensiteten og eksponeringstid (et kamera integration tid på 0,5 - foreslås 1 sek).
- Tag billeder på en standard digital kamera og gemme billeder på computerens harddisk ved hjælp af proprietær software. BEMÆRK: Et typisk eksempel er vist i figur 1.
- Billede ~ 20 lancetformede endelser fra hvert præparat. Start på en mindre del længst væk fra den afskårne kant i bunden af det ydre øre hud og arbejde langs denne margen imaging hver follikel efter tur. Arbejde på tværs i let overlappende områder parallelt med den afskårne kant, pas på ikke at billedet det samme follicle to gange, og enhver, der er tydeligt beskadiget. BEMÆRK:re er typisk for mange lancetformede terminaler til billedet dem alle før betydelig spontan de-farvning sker. Således foreslår vi systematisk prøveudtagning af befolkningen ved hjælp af følgende protokol.
- Efter endt marginale strimmel, flytte et felt bredde mod bunden af det ydre øre, og gentage processen i modsat retning.
- Billede alle terminaler stødt, undtagen lejlighedsvise dem klart orienteret meget mere skråt til den optiske fly og næppe at passe helt inden for standard ringformede analyse ROI (se afsnit 4). Må ikke udelukke usædvanligt kraftigere eller svagere lanceolates forhold til de omkringliggende terminaler, medmindre de selvfølgelig er beskadiget eller baggrund intensitet er særlig høj, hvilket indikerer lokaliseret vævsskade.
- Kassér præparat, hvis mere end 10% af det hudområde / terminaler er beskadiget / ubrugelige. BEMÆRK: Som lanceolates affarves med tiden, komplet imaging hvert præparat inden for 20 min af slutningen af vask.
- jegf ved hjælp af mere end en forberedelse, sikre sammenligninger intensitet er gyldige ved tid-matchende præparater. For at gøre dette, offset tider af farvning hvert præparat ved ~ 30 min, for at sikre sammenligneligheden af de-pletten gange.
- For at overvåge de-farvning (exocytose), billede samme terminal på 5 eller 10 min intervaller. Med praksis, er det muligt at billedet op til 3 separate klemmer på hvert tidspunkt i et præparat.
4. Analyse mærket lancetformede Endings.
Bemærk: Følgende procedure er en hurtig metode til at analysere terminal intensitet.
- Afgiv et ringformet område af interesse (ROI) centreret på spidsen af håret ved basis af folliklen (figur 2). Indstil den indre omkreds af den ringformede ROI stort nok til at undgå håret auto-fluorescens i enhver follikel, der skal analyseres, men stadig omfatter alle terminalen fluorescens. Sikre, at den ydre omkreds er stor nok til at omslutte det største terminal, der kan forekomme, der er orienteret tæt på de vigtigste optiske / follikel akse.
- Foretag en baggrund ROI omtrent lig i området til målet annulus (offentlig cirkel, typisk ~ 400 um 2) for at bestemme den lokale farvningsintensitet i nærheden af terminalen under analysen.
Bemærk: Størrelsen af disse to ROI'er er sat i begyndelsen af analysen og bruges til at analysere alle efterfølgende follikler / lancetformede terminaler på tværs af alle forberedelserne i et eksperiment. Så er det vigtigt at indstille deres parametre med omhu i begyndelsen. - Placer baggrund ROI tæt nok på hårsækken til at repræsentere lokale baggrund i talgkirtlerne, der ligger til grund for terminaler, ikke den lavere intensitet huden mellem hårsække, men pas på ikke at inkludere terminale regioner.
- Gennemsnitsværdien intensiteten af de to ROI'er ved hjælp af »foranstaltning« eller »analysere ROI 'funktion af data software og overføre til et regneark.
- I regnearket, for hver enkelt follikel trække den gennemsnitlige lokale baggrund intensitet fra den i det ringformede rum for at give en netto intensitet. Denne justering for lokaliseret baggrund reducerer mellem-follikel variabilitet.
Representative Results
De hårsækkene i denne pinna forberedelse er lette at se under gennemlysning uden fluorescens (figur 1A), der illustrerer wafer-tynde karakter af forberedelsen og relativt lette tilgængelighed det giver til disse mechanosensory terminaler. Hver af dem er præget af den fremtrædende håret basen piercing mørke halvmåne af sebaceous kirtel. Under epifluorescens de mærkede lancetformede terminaler omgiver hver hårsækken tydeligt ses og vise typisk robust spontane styrylfarvestofoptagelse (figur 1B). Dette sker uden pålagt bevægelse. De lancetformede terminaler ses at omringe håret, selv om omfanget af omringning er variabel 6. Meget af mærkningen er punktformig (pletter) snarere end den lineære arrangement, som man kunne forvente. Den punktformige mønster afspejler terminaler bliver observeret i et optisk plan langs længden af terminalen. This forberedelse modtog ingen yderligere behandling til visualisering efter mærkning blev det simpelthen overført til et mikroskop scenen og afbildes in situ, hvilket igen illustrerer enkelhed af dette præparat.
Eksempel eksperimenter, som denne hidtil ukendte præparat er egnet, er vist i figur 3. Det kan bruges til at studere både endocytose og exocytose i levende terminaler, samt deres modulation. Således for endocytose, kan glutamatreceptoragonister øge intensiteten mærkning, samtidig med at blokere Ca2 + kanaler med ligander eller kationer såsom Mg2 +, Ni2 + eller Cd2 + formindsker det 2. Alternativt kan dette præparat også anvendes til at undersøge kinetikken af exocytose, som vist i figur 3C. Først en mærket terminal set de-farvning spontant. Men denne affarvning accelereres ved exocytose stimulerende, latrotoxin. Mere dehaler af de eksperimentelle resultater kan ses i Banks, RW et al. 2.
Figur 1. Robust styrylfarvestof Mærkning Optaget i Mouse Pinna. (A) En del af en umærket pinna forberedelse i lyse belysning felt, der viser, hvordan klart hårsækkene vises i områder ryddet af overliggende areolar / fedtvæv. De mørke, som regel bilobed, halvmåne figurer er talgkirtler omgiver den centrale hårstrået. (B) En lignende område, på et lidt højere forstørrelse og filmede med epifluorescens, viser lancetformede endelser mærket med styrylfarvestof. Scale barer -. 40 um Klik her for at se en større version af dette tal.
"1"> 
Figur 2. Analyse af styrylfarvestof Mærkning Intensitet. (A) Typisk cirkulært mønster af hårsækken mærkning med styrylfarvestof, centreret på hårskaftet (ikke synlig i dette billede). (B) Den vigtigste analyse 'region of interest' (ROI) er defineret ved en standard annulus overlejret på placeringen af palisaden af lancetformede nerveender omkranser hårsækken. Denne ROI holdes konstant i form og område til et enkelt eksperiment for at sikre mærkning intensitet kan nogenlunde sammenlignes mellem præparater og på tværs af alle behandlinger. Nettointensitet af hver ROI beregnes ved at subtrahere intensiteten af en tilstødende offentlig cirkulær baggrund region (~ 400 um 2). Også denne firkant baggrund region holdt konstant i form og areal under enhver given eksperiment.target = "_ blank"> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Mærkning Intensitet af hårsækken Afferent Lanceloate Endings er ikke normalfordelt, og kan bruges til at undersøge både endo- og exocytose. Typiske data fra målinger styrylfarvestof intensitet i spontant mærkede lancetformede terminaler ved hjælp af analysemetoden beskrevet ovenfor. (A) Mærkning intensitet under kontrolbetingelser (54 follikler, 4 ører) og 1 mM glutamat (42 follikler, 4 ører). Intensitetsværdierne enkelte endelser vises som klynge dot plots. Hvert punkt repræsenterer intensiteten af en terminal palisade omkring en follikel. Bemærk, at selv under kontrolbetingelser et par datapunkter (follikler) er ekstremt intens, mens de fleste er grupperet ved lavere intensiteter. Den første prik på en bestemt intenstet er plottet i midten og efterfølgende datapunkter af samme intensitet er plottet gradvist mere sideværts på begge sider. Således lateral spredning repræsenterer frekvensen af hårsække af en bestemt mærkning intensitet. De vandrette linjer repræsenterer median ± 25% interkvartile område. Inkubation med 1 mM glutamat forbedrer median intensitet med ~ 50% (*** P <0,001, Mann-Whitney), men mærkning kan forbedres med 200 - 300% i nogle terminaler. (B) billeder demonstrerer glutamat-medieret forøget farvestofoptagelse (endocytose). Inkubation af hårsækken præparat i glutamat (1 mM) markant øger styrylfarvestofoptagelse, som vist ved den forøgede intensitet mærkning. Scale bar 20 pm. (C) Forbedring farvestof release (exocytose). Efter mærkning, er styrylfarvestof spontant frigivet igen, som mærkningen ved 0 min er klart lysere end ved 60 min, selv efter baggrunden subtraktion at styre for fotoblegning. Denne udgivelse er stærkt potentiated ved latrotoxin, en sort enke edderkop gift bestanddel, der udløser ukontrolleret vesikel exocytose. Efter 60 min i toksin, terminal mærkning er næsten upåviselig. Denne reversibilitet mærkning styrylfarvestof understøtter den hypotese, at terminale fluorescens skyldes internalisering under lokal genanvendelse af synaptiske-lignende vesikler. Scale bar 20 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Bewick og Betz oprindeligt udviklet N- (3-triethylammoniumpropyl) -4- (4- (dibutylamino) styryl) pyridinium dibromide-relateret styryl pyridinium farvestoffer 7-10 at overvåge lokal genanvendelse af synaptisk vesikel membran. Farvestofoptagelse og dermed forøget fluorescens, afspejler derfor synaptisk vesikel membran internalisering (endocytose). Efterfølgende dette internaliserede farvestof kan genudgivet ved yderligere elektrisk aktivitet, viser tab farvestof overvåger vesikel membran eksternalisering (exocytose). I synapser, dette er en proxy for neurotransmitter sekretion. Samtidig, vi også fundet disse farvestoffer mærke primære mechanosensory nerveender 7. For nylig 11, Bewick, Banker og kolleger derefter viste, at dette afspejler en lignende proces i modne, differentierede mechanosensory terminaler ex vivo. Også her farvestofferne mærke 50 nm diameter 'synaptiske-lignende' vesikler (Slvs), der genbruger konstitutivt at frigive glutamat.I mechanosensory terminaler, i modsætning til deres synaptiske kolleger, dette genbrug er primært spontan. Det er også moduleres ved mekanisk, snarere end blot elektrisk stimulering.
For sensoriske neuroner i kultur og i cochlea hårceller, styrylfarvestoffer i almindelighed og styryl pyridinium farvestof i særdeleshed har vist sig at passere gennem mechanosensory kanaler, blokerer mechanosensory kanaler og irreversibelt mærkning interne membraner 12. Men ved sammenlignelige koncentrationer styrylfarvestof i differentierede mechanosensory terminaler i stedet, som her i lancetformede endelser 2, eller i Ia slutninger i muskel spindler 11, og i hårceller, der ikke er mekanisk stimuleres 13, 14, mærkning, er ved membran endocytose. I mechanosensory nerveender, f.eks mærkning er reversibel og ikke blokerer mechanosensory responser ved de anvendte koncentrationer her 2, 11, 1Fem. Mens nogle farvestof internalisering af kanal gennemsivning i disse endelser ikke helt kan udelukkes, at næsten total affarvning med latrotoxin indikerer det store flertal af mærkningen i modne terminaler, er ved internalisering med genbrug vesikel membran. Vi har derfor anvendt denne teknik til at studere aktiviteten afhængighed 11 og senest farmakologien 2 af SLV genbrug i mechanosensory afferente terminaler ved at undersøge narkotika effekter på optagelse og frigivelse af farvestoffer.
Som med de fleste praktiske teknikker, reproducerbarhed kræver gentagelse og praksis. Nogle af de vigtigste punkter for at sikre pålidelighed vil nu blive diskuteret. Lancetformede mærkning hos yngre dyr er mere pålidelige - den mindste dyr, vi har brugt var 15 g kropsvægt. Det er ikke helt klart, hvorfor dette er tilfældet, men det kan skyldes, dissektion af den yngre bindevæv kræver mindre mekanisk traume og leaves mindre tilbageværende remanens ved fjernelse vævene ligger over innervation lag.
Samlet set præparatets væv er ganske enkel, med peeling huden lag fra hinanden er den mest teknisk udfordrende praktiske aspekt, og da kun i ældre mus. I disse hudlagene klæber kraftigt sammen ved bunden, hvor dissektion starter, men selv her adskillelse af lagene bliver meget lettere mod kanten. Heldigvis, eller måske følgelig disse tyndere marginale hudområder normalt giver den mest tilfredsstillende mærkning, som gør den forreste huden generelt. Derfor især undgå at tage fat i meget tynde hud på marginerne. For at minimere risikoen for skader, manipulere forberedelserne indirekte ved at skubbe med lukkede pincet i stedet gribe direkte, eller hvis det er væsentligt fatte kun skrappere væv som ikke vil kunne mærkes. Være grundig med at fjerne 'ark polystyren »lag ligger umiddelbart over folliklerne, da dette er den vigtigste migniske obstruktion til billeddannelse og adgang lægemiddel. Imidlertid er det vigtigt at minimere fysisk kontakt med underliggende strukturer, da dette skader (dvs. strimler væk) de neurale net og terminaler lige nedenfor. Hvis den dominerende fluorescens er gul / hvid i talgkirtlerne, fremtrædende auto-fluorescens af håret baser og få halvmåner af appelsin / gul lancetformede slutninger, indikerer dette nerve plexus lag og tilhørende lancetformede terminaler er fjernet under clearance. Dette synes at være det største problem med ældre (> 30 g) mus. Gennem farvningsprocedurer, sikre, at alt er på 30 ° C og godt iltet. Vær opmærksom på, at mærkede terminaler er stadig i live. Følgelig vil farvestof udskilles af igangværende spontan (konstitutiv) exocytisk frigivelse. Dette vil være langsommere på R / T, men det er god praksis at minimere forsinkelsen mellem fjernelsen af chelator løsning og billedbehandling, for at minimere tab farvestof. Desuden for mellem-grupper komparative studies af intensitet, er det vigtigt at sikre billeddannelse af alle grupper er tid-matchet. Anvendelse af et farvestof-chelatdanner før billedbehandling forbedrer kontrasten. Så mens relativt dyre, chelatering trin er ganske vigtigt for at sikre en god billedkvalitet. Chelator brug kan minimeres ved at genbruge opløsningen flere gange, og endda på 2 - 3 på hinanden følgende dage, hvis de opbevares ved 4 ° C mellem anvendelser. Kassér chelator løsning, når det går mærkbart pink, viser sin farvestof beslaglæggelse nærmer mætning.
Under billedbehandling, være klar over potentialet for fototoksisk beskadigelse disse levende terminaler, som er en kumulativ resultat af både intensiteten og behandlingstid af excitationslyset. Denne overvejelse er mindre vigtigt for enkelt tidspunkterne billeder, hvor billedkvaliteten er den primære bekymring. er imidlertid afgørende under gentagen billeddannelse i kinetikundersøgelser at reducere excitationslys eksponering til et minimum. Mens udviklingen af disse farvestoffer tillabel synapser, fandt vi excitation for> 1 min ved fuld effekt excitation belysning vil medføre dramatiske og uoprettelige skader på nerveender. De først efterfølgende ekspandere enormt, så kollapsede fuldstændigt over et tidsrum på ~ 15 min. Vi har ikke systematisk teste de relative bidrag eksponeringstid og intensitet, men disse observationer tyder det ledende princip bør være at minimere begge. Så anbefales det, at excitationslyset intensitet og varighed er minimum står mål med at få gode billeder, og passende billeder kontrol er taget i tide-kursus undersøgelser. For at teste, at oplysningerne ikke er påvirket af fototoksicitet under gentagne imaging betingelser, på hvert tidspunkt tage en ekstra billede af en tidligere ikke set terminal. Dette er for at sikre adfærd mærkningen i naive terminaler ligner i hårsække, der afbildes gentagne gange.
En række faktorer kan reducere inden-gruppen variabilitet af nettointensitet data. Præcis placering af ROI'er, især baggrunden ROI, er vigtig, da selv små områder af uhensigtsmæssig farvning i høj grad kan påvirke mellem-follikel data variabilitet. Variabiliteten af nettointensitet er også påvirket af, hvordan helt hver hårsæk er omgivet af palisaden af slutninger. Sammenlign for eksempel halvmåneformede fordeling mærkning i figur 1B med næsten fuldstændig cirkulært mønster ses i figur 2. Mere kompleks analyse, måske ved hjælp af automatiseret software påvisning og tærskelværdier, er nødvendige, hvis graden af omringning er en relevant parameter. Bemærk venligst, at intensitet distributioner for selv de mest præcist analyserede follicle grupper ikke normalt fordelt (se figur 3), hvilket nødvendiggør brugen af ikke-parametrisk statistik for mellem-behandling sammenligninger af befolkningens medianer snarere end hjælp. Normalisering teknikker, såsom ekspression intensiteter i procent of kontralateral kontrol eller for en kontrolgruppe bestående af flere præparater, kan anvendes til yderligere at reducere variabilitet. Den endelige tekniske element, der skal overvejes, er den eksperimentelle design for farmakologisk testning. Under farmakologiske undersøgelser, præinkuberes præparatet i lægemiddelopløsningen i 30 min før farvestof ansøgning. Derefter opretholde lægemiddelkoncentrationen i farveopløsningen. I kontroller anvendes enten saltvand eller, hvis lægemidlet er opløst i et køretøj, saltvand plus køretøj.
Denne artikel viser, hvordan denne nye pinna forberedelse tilbyder kvalitet billeder af mechanosensory slutninger højt huden med minimal forberedelse. Vi viser også, at det kan anvendes til at undersøge farmakologien af to kritiske aspekter af vesikel genanvendelse. Vi viser først, at en glutamat-receptor-agonist kan øge farvestof internalisering (en markør for endocytose), og for det andet, er det farvestof tabt igen med latrotoxin (en stimulans af exocytose). Betydningen af denne forberedelse;ion og teknik er, at det giver fremragende adgang til levende hud mechanosenory terminaler på stedet for billeddannelse eksperimenter, der giver unikke muligheder for optisk overvågning af terminal funktion, struktur og deres indbyrdes relationer. Til det sidstnævnte formål har vi også udviklet det videre til brug i kombinerede optiske / elektrofysiologiske undersøgelser (se søster JOVE artikel for detaljer).
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Arbejdet blev finansieret af UK Medical Research Council projekttilskud G0601253 til GSB og RWB og en SULSA Bioskape tilskud til GSB
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PDMS - Sylgard 184 | Dow Corning | Flexible, inert, translucent solid silicone polymer. | |
| No. 3 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11231-20 | |
| Austerlitz Insect pins | Fine Science Tools | 26002-10 | Very fine pins to attach pinna preparation securely to the PDMS with minimal damage. |
| FM1-43/Synaptogreen C4 | Biotium/Cambridge Bioscience | BT70020 | Fluorescent membrane probe that reversibly partitions into the outer leaflet of cell membranes. Used predominantly for monitoring vesicle membrane endo-/exocytosis. |
| Advasep 7 | Biotium/Cambridge Bioscience | BT70029 | A sulfonated b-cyclodextrin derivative that chelates FM1-43 (& other styryl pyridinium dyes) out of the exposed membranes, leaving internalised dye to be seen more clearly by lowering the background labelling/fluorescence. |
| Retiga Exi Fast 1394 | Qimaging | Monochrome, cooled CCD camera - basic model | |
| Volocity 3D Image Analysis Software | Perkin Elmer | Volocity 6.3 | Image capture and analysis software. |
References
- Li, L., et al. The functional organization of cutaneous low-threshold mechanosensory neurons. Cell. 147 (7), 1615-1627 (2011).
- Banks, R. W., et al. Glutamatergic modulation of synaptic-like vesicle recycling in mechanosensory lanceolate nerve terminals of mammalian hair follicles. J. Physiol. 591 (10), 2523-2540 (2013).
- Andres, K. H. On the microstructure of receptors on sinus hair. Z. Zellforsch. Mikrosk. Anat. 75, 339-365 (1966).
- Shenton, F., Bewick, G. S., Banks, R. W. A study of the expression of small conductance calcium-activated potassium channels (SK1-3) in sensory endings of muscle spindles and lanceolate endings of hair follicles in the rat. PLoS One. 9, e107073 (2014).
- Liley, A. W. An investigation of spontaneous activity at the neuromuscular junction of the rat. J. Physiol. 132 (3), 650-666 (1956).
- Suzuki, M., Ebara, S., Koike, T., Tonomura, S., Kumamoto, K. How many hair follicles are innervated by one afferent axon? A confocal microscopic analysis of palisade endings in the auricular skin of thy1-YFP transgenic mouse. Proc. Jpn. Acad. Ser. B. Phys. Biol. Sci. 88 (10), 583-595 (2012).
- Betz, W. J., Mao, F., Bewick, G. S. Activity-dependent fluorescent staining and destaining of living vertebrate motor nerve terminals. J. Neurosci. 12 (2), 363-375 (1992).
- Betz, W. J., Bewick, G. S., Ridge, R. M. Intracellular movements of fluorescently labeled synaptic vesicles in frog motor nerve terminals during nerve stimulation. Neuron. 9 (5), 805-813 (1992).
- Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. Science. 255 (5041), 200-203 (1992).
- Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical monitoring of transmitter release and synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. J. Physiol. 460 (1), 287-309 (1993).
- Bewick, G. S., Reid, B., Richardson, C., Banks, R. W. Autogenic modulation of mechanoreceptor excitability by glutamate release from synaptic-like vesicles: evidence from the rat muscle spindle primary sensory ending. J. Physiol. 562 (2), 381-394 (2005).
- Drew, L., Wood, J. FM1-43 is a permeant blocker of mechanosensitive ion channels in sensory neurons and inhibits behavioural responses to mechanical stimuli. Molecular Pain. 3, (2007).
- Griesinger, C. B., Richards, C. D., Ashmore, J. F. FM1-43 reveals membrane recycling in adult inner hair cells of the mammalian cochlea. J. Neurosci. 22 (10), 3939-3952 (2002).
- Griesinger, C. B., Richards, C. D., Ashmore, J. F. Apical endocytosis in outer hair cells of the mammalian cochlea. Eur. J. Neurosci. 20 (1), 41-50 (2004).
- Watson, S., Aryiku, C., Banks, R. W., Bewick, G. S. Comparison of gadolinium and FM1-43 as blockers of stretch-evoked firing of rat muscle spindle afferents. Proc. Physiol. Soc. 21, P22 (2010).
