Abstract
Роман рассечение и записи методика описана для оптического окрашивания мониторинга и де-окрашиванием ланцетными терминалов, окружающих волосяные фолликулы в коже ушной раковины мыши. Препарат прост и относительно быстро, надежно уступая обширные участки множественных помеченных единиц живой нервных терминалов для изучения поглощения и высвобождения пиридиния красителей стириловых широко используются в исследованиях утилизации везикул. Разбиением препараты перед мечения позволяет тест по сравнению с контролем сравнения в том же ухе от одного индивидуума. Полезные советы приведены для повышения качества подготовки, маркировки и параметров формирования изображения. Эта новая система пригодна для опробования фармакологически и механически-индуцированное поглощение и высвобождение этих жизненно важных красителей в ланцетными терминалы в обоих дикого типа и генетически модифицированных животных. Примеры модуляторными воздействий на интенсивность маркировки приведены.
Introduction
Механосенсорных нервные окончания , как правило , малы, диффузно распределены и трудно получить доступ на месте, так как они, как правило , похоронены глубоко в кожу или другие окружающие ткани. Визуальное их, поэтому, как правило , требует секционирования с последующим длительным иммунноокрашивания / окрашивания периода или задержки и за счет получения линий мышей с генетической экспрессии флуоресцентных меток , таких как зеленый или желтый флуоресцентный белок (GFP / YFP) 1. Здесь мы показываем удобную ткань и быстрый и простой способ , чтобы получить доступ к большому количеству волосяного фолликула афферентов для исследования, и как они могут быть быстро маркировано для оптического мониторинга функции терминала 2. С практикой, вся техника от рассечения к визуализации может быть завершена в качестве лишь 2 часа.
В ланцетные терминалы сенсорных аксонов, иннервирующих фолликулы волос у млекопитающих образуют частоколы вокруг эпителия волос фолликула, с каждымТерминал зажатой между глиальных / Шванн клеточных процессов 2-4. Цель терминалов для обнаружения механического перемещения волосков они окружают. Они представляют собой смесь быстро и медленно адаптирующихся окончаний, но они в основном производят короткие всплески активности в ответ на движение волос. Как правило, стрельба останавливается очень быстро, когда движение прекращается, даже при наличии непрерывного перемещения.
Это мышиное Пина модель для изучения ланцетовидные терминалов оптическими методами имеет множество выгодных возможностей для изучения структуры и функции этих окончаний. Ушной раковины преимущественно два слоя кожи, соединенной спина к спине, только с небольшим количеством хрящевой ткани между ними. Кожа очень тонкая и легко рассекают за счет минимальных количеств слабо клеевой соединительной ткани по отношению к другим областям тела. Легко разлученных слои кожи, таким образом, дают хороший доступ к фолликулах и терминалов. иннервациилегко доступны и идентифицировать. Волосяные фолликулы более редко распределены, чем в других регионах кожи, облегчая визуализацию отдельных или небольших групп фолликулов. Тонкий основной дермальный слой обеспечивает хорошую доступность для красителей и фармакологических препаратов, поэтому идеально подходит для работы с изображениями с помощью флуоресцентной микроскопии без дальнейшей обработки. Изображений меченых терминалов могут быть либо живых терминалов или, если используется аналог поправимо красителя, после фиксации и последующей гистологической обработки.
Мы использовали этот препарат , чтобы показать , что мембрана рециркуляции происходит в ланцетными окончаний, о чем свидетельствует поглощение (эндоцитоз) и выпуска (экзоцитоза) от стирильная пиридиния красителя (FM1-43 N - (3-triethylammoniumpropyl) -4- (4- (дибутиламино) стирильная) пиридиний дибромид). Краситель не означает, однако, как представляется, значительно маркировать инвестирование Шванн клеточных процессов 2. Мы также показали, что поглощение этого красителя / выпуска, и, следовательно, мембраны гecycling, подлежит глутаматергической модуляции через нетипичное (фосфолипаза D-связанных) метаботропного рецептора глутамата. Результаты простых стимуляции и анализа протоколов проиллюстрированы и общие вопросы анализа потенциала также выделены.
Protocol
Эти методы были использованы в исследовании , опубликованном в банках, RW и др. 2 Мышей гуманно эвтаназии путем цервикальной дислокации. В Великобритании, это законодательно утвержденного Списка 1 метод перечислены в животных (научные процедуры) Закон, 1986 и Европейская Директива 2010/63 / ЕС. Это федеральное законодательство соблюдается на местном уровне в Университете Абердина по защите животных и Этического совета по рассмотрению действия, которые одобрили все процедуры.
1. Подготовка Уши для нанесения этикеток
- Подготовьте стандартный физиологический солевой раствор, такой как Liley ( в 1956) 5 и насыщают его с 90% O 2/5% CO 2 (карбогена). Солевой раствор Liley является (мМ): NaHCO 3 (12), KCl (4), КН 2 РО 4 (1), NaCl (138,8), MgCl 2 (1), CaCl 2 (2) и глюкоза (11). ПРИМЕЧАНИЕ: На протяжении оставшейся части этой рукописи, «физиологический раствор» будет относиться к солевой раствор, который полностью насыщен карбогена. Во время dissectioп, обновить физиологический раствор, покрывающий препарат через каждые 15 - 20 мин.
- Гуманно эвтаназии взрослой мыши без повреждения черепа. ПРИМЕЧАНИЕ: Мы использовали C57 / Bl6J и MF1 мышей, но любой штамм мыши можно использовать. Самым важным аспектом является то, чтобы не использовать большие взрослые (> 25 г). Этикетировочное в больших мышей является менее надежным, часто будучи ограничивается мелкими и разрозненными группами фолликулов.
- Удалите внешние уши (перья) вблизи основания с ~ 25 см ножницами, чуть выше линии волос густой, и погрузите в физиологическом растворе в силиконовой подкладкой культуры / чашку Петри (50 мм, как правило, удобно).
- Поместите PINNA переднюю (вогнутую) стороной вниз и прикрепить поля к силиконом через регулярные промежутки времени с булавками мелких насекомых (~ 6 - 8 за ухо, диаметром ~ штырьки 0,2 мм). Обновить солевой раствор каждые 15 - 20 мин, или использовать постоянно перфузированной ванну.
- Аккуратно отслаиваться заднюю кожу от передней кожи путем отслаивания, первоначально доступ из разреза основания ушной раковины надтолстый центральный хрящ и систематически работает над тонкими, хрящевых свободных внешних полей.
- Для этого, удерживая центр среза края задней кожи с парой нет. 3 щипцов. Затем, с закрытыми челюстями, поместите точки другого набора нет. 3 щипцов в зазоре между кожей и нижележащего хряща.
- Аккуратно работать пункты закрытых щипцов из стороны в сторону в зазоре, используя минимальное требуемое усилие, осторожно ослабьте спаек во время пилинга назад заднюю кожу, чтобы отделить слои.
- С задней снятой кожей, оставьте переднюю кожу в нужном положении. Закрепление заднюю кожи, кожную стороной вверх, рядом с передней кожи (как в 1,5 раза, выше).
- Затем тщательно и полностью удалить ушную хрящ, который был зажат между слоями кожи от передней кожи и тем же тупым методом рассечения, как в версии 1.6. Избегайте прокалывания отверстий с пинцетом.
- Тогда, фили оба Пина препараты кожи мягко кожуры, срывать и стирающие тонкий слой соединительной ткани, напоминающие Пенополистирол, который покрывает волосы фолликула основания. Примечание: Получение оптимальной клиринг может занять немного практики; удаление недостаточное ткани препятствует доступа, как для раствора красителя и для получения изображения, в то время как выскабливание слишком энергично удаляет нейронных сетей, которые в основе фолликулов.
- Обновить солевой раствор.
Этикетировочное 2. ланцетные терминал
Примечание: Следующий протокол оптимизирован для стирильная пиридиния красителя. Другие, химически подобные, стириловые пиридиния красители должны работать, возможно, после некоторой корректировки в концентрации и инкубационного времени. Надевайте перчатки и пальто лаборатории при работе на растворах красителей. Либо купить 10 раствор красителя запас мМ непосредственно от производителя или подготовить запас путем растворения порошка красителя в физиологическом растворе без глюкозы. Алиготе (10 мкл, как правило, удобно, но настроить это для больших АССле экспериментов) и хранить в замороженном виде до 6 месяцев при -20 ° C или ~ 1 год при температуре -80 ° С. Порошок будет хранить в течение не менее 2-х лет. Избегайте повторного замораживания / оттаивания циклов растворов красителей; это быстро денатурирует краситель. После того, как размораживать, хранят при температуре 4 ° C и использовать в течение 1 недели.
- Предварительно подогревают на водяной бане до 30 ° С, с платформой ~ 3 - 5 мм ниже поверхности воды.
- Свеже приготовить раствор стирильная пиридиний красителя 10 мкМ (10 мкл свежеприготовленного размороженной 10 мМ стирильная пиридиний краситель в 10 мл физиологического раствора) и уравновешивают в водяной бане.
- Штифт каждый препарат в силиконовую резину подкладкой 35 мм культуральные чашки, погруженной в 1 - 2 мм физиологического раствора (типичного объема, ~ 2 мл). Каждый препарат кожи ушной раковины даст два препарата, если разрезать пополам от вершины до основания с маленькими ножницами (10 - длина 15 см), чтобы свести к минимуму использование животных.
- Поместите посуду мм 35, содержащие солевые препараты, покрытые ушной раковины на затопленной платформе в 30 ° C на водяной бане. Убедитесь в том,глубина воды достаточна для адекватного потеплению, но не загрязняет физиологический раствор в открытой чашке.
- Pin штраф (0,5 - 1 мм наружный диаметр) трубки с распущенными O 2 / CO 2 в силиконовой основе каждого блюда непрерывно газа препараты. Также поместите в водяной бане 100 мл физиологического раствора красителя бесплатно для стиральной / посудомоечной освежает. Используйте плотно закрытых графин для поддержания карбогена насыщения и предотвращения загрязнения воды.
- Равновесие все при 30 ° С в течение 30 мин, а затем заменить физиологический раствор в течение препаратов Pinna из 100 мл закупоренных бутылки. Выдержите в течение еще 30 минут. Примечание: Эта замена компенсирует солевом испарения, и любые объемные потери в результате объемной газовой линии барботажа.
- Вылить физиологический раствор красителей в стакан отходов емкостью 100 мл, а затем быстро и осторожно промокните прочь любую жидкость, оставшуюся вокруг подготовки с папиросной бумагой, чтобы свести к минимуму воздействие на разведение раствора красителя, которые будут добавлены в следующем. Будьте осторожны, не трогать (
- Выдержите ушной раковины препараты в течение 2 - 3 мл 10 мкМ стирильная пиридиний красителем в течение 40 мин при 30 ° С, затем возвращают к R / T для остальной части процедуры.
- Удалить не-интернализированную краситель в три этапа, используя решения на R / T. Примечание: Эти шаги лучше всего выполнять в минимальном внешнем освещении (плотными жалюзи, красный / оранжевый освещения низкой интенсивности), чтобы начать глаза темно-приспособление для работы с изображениями.
- Вылить маркировочную раствор из посуды в стакан отходов и быстро промыть в три смены физиологического раствора красителей в быстрой последовательности. Это удаляет остаточный стирильная пиридиния раствор красителя, прилипшие к препаратам и любой краситель, который легко departitions из экзогенных мембран.
- Выдержите в окончательном изменении физиологического раствора красителей в течение еще 30 мин до departition наиболее остающийся краситель из поверхностных мембран, то есть, краситель не усвоены терминалами.
- Удалить стойкие краситель застрял то внешней листовке экспонированных мембран хелатирующими с сульфированного B-циклодекстрина (Advasep-7, 1 мМ, 5 мин - см таблицу 1). Таким образом, все остальные краситель будет находиться в пределах ткани.
- Место в физиологическом растворе свежей красителей для работы с изображениями и высушить наружную поверхность тарелки тщательно бумажной салфеткой.
Примечание: Терминалы теперь готовы для работы с изображениями. Важно иметь в виду, что ланцетовидные окончаний живы и, следовательно, медленно выпуская эндоцитированный стирильную пиридиния краситель снова. Несмотря на то, что это будет медленнее при R / T, важно, чтобы свести к минимуму задержки до / во время формирования изображения. Если эксперимент требует маркировки нескольких препаратов, первоначально поддерживать их все немеченого при 30 ° С. Они будут жизнеспособными в течение нескольких часов. Затем последовательно маркировать с интервалами, помечая второй препарат (шаги 2.7 - 2.8.3) при визуализации первого.
3. визуализации Маркированный ланцетные Окончания.
Примечание: Наблюдательдолжны быть темно-адаптирована для следующих этапов обработки изображений. Увеличение остроты зрения это означает, что дает уровень освещенности ниже возбуждения требуется найти фолликулы для визуализации. Это особенно важно для минимизации фототоксичности, а не уменьшения неудобств фотообесцвечивания. Свободные радикалы, генерируемые полной интенсивности освещения может быстро (в течение 60 секунд) убивать живых нервных терминалов (GS Bewick, S. Фадула и WJ Бец, неопубликованные наблюдения).
- Перед изображениями, проверьте препарат под рассечение стереомикроскопа и тщательно удалить любой поверхностный мусор. Это предотвращает автофлуоресценции загрязняя изображения.
- Установите блюдо на стадии вертикального эпифлуоресцентной микроскопа со стандартным флуоресцеина набор фильтров (480 - 488 нм возбуждение, 500 - 520 нм для эмиссии стирилового пиридиния красителя).
- не Ослабление интенсивности света возбуждения с помощью фильтров нейтральной плотности, пока только достаточно, чтобы комфортно найти терминалs.
- Расположить меченых фолликулы путем наблюдения с низким (3.5x - 4x сухой цели), то прогрессивно цели выше (объективные погружения 10x и 20x воды) увеличения.
- Захват изображений меченых терминалов ланцетными через 10х сухой цели для малой мощности и 20x целей погружением в воду большем увеличении. Минимизация интенсивности света и время облучения (время интеграции камеры 0,5 - 1 сек предложено).
- Захват изображений на стандартной цифровой камеры и сохранять изображения на жестком диске компьютера, используя программное обеспечение. Примечание: Типичный пример показан на рисунке 1.
- Изображение ~ 20 ланцетные окончаний от каждого препарата. Начало в маржинальной отдаленным от обрезной кромки у основания кожи ушной раковины и работы по этой разницы визуализации каждого фолликула, в свою очередь. Работа по всем в слегка перекрывая поля параллельно отреза, следя за тем, чтобы не изображением того же фолликула дважды, и любые, которые явно повреждены. Обратите вниманиеповторно, как правило, слишком много ланцетные терминалов к изображению их все перед значительным спонтанное де-окрашивание происходит. Таким образом, мы предлагаем систематически выборки населения, используя следующий протокол.
- После завершения маргинальную полосу, переместить одну полевую ширину к основанию ушной раковины, и повторить процесс в обратном направлении.
- Изображение все терминалы встречаются, за исключением случайных из них четко ориентированных гораздо более косо по отношению к оптической плоскости и вряд ли подойдет полностью в пределах стандартного кольцевого анализа ROI (смотри раздел 4). Не исключаю необычно увеличения или уменьшения lanceolates по сравнению с окружающими терминалами, если они не будут явно повреждены или интенсивность фона особенно высока, что указывает на локализованное повреждение тканей.
- Выбросьте препарат, если более 10% площади кожи / терминалов повреждены / непригодным для использования. Примечание: В качестве lanceolates destain со временем, полная визуализация каждый препарат в течение 20 мин после окончания стирки.
- яе с использованием более одного препарата, обеспечить сравнения интенсивности действительны по времени соответствующие препараты. Чтобы сделать это, офсет тайминги окрашивания каждого препарата по ~ 30 мин, чтобы обеспечить сопоставимость раз де-пятен.
- Для того, чтобы следить за де-пятно (экзоцитоз), изображение того же терминала с интервалом 5 или 10 мин. С практикой, можно изображению до 3 отдельных терминалов в каждый момент времени в любом одном препарате.
4. Анализ Маркированный ланцетные Окончания.
Примечание: Следующая процедура представляет собой быстрый метод анализа интенсивности терминала.
- Сделать кольцевую область интереса (ROI) в центре кончика стержня волоса у основания фолликула (рисунок 2). Установка внутренней окружности кольцевого ROI, достаточно большой, чтобы избежать Стержень волоса автофлуоресценции в любом фолликула анализируемый но по-прежнему охватывает все концевые флуоресценцию. Убедитесь в том, что внешняя окружность достаточно велик, чтобы вложить большой TerminAl вероятны, что ориентирована близко к главной оптической оси / фолликула.
- Сделать фон ROI примерно равную по площади мишени кольцевого пространства (квадрат или круг, как правило , ~ 400 мкм 2) для определения локальной интенсивности окрашивания в непосредственной близости от терминала при анализе.
Примечание: Размеры этих двух трансформирования установлены в начале анализа и используется для анализа всех последующих фолликулы / ланцетовидные терминалы во всех препаратах в одном эксперименте. Таким образом, важно установить их параметры с осторожностью в начале. - Поместите фона ROI достаточно близко к луковице, чтобы представлять местный фон в сальных желез, лежащих в основе выводов, а не нижнюю кожу интенсивности между фолликулами, но будьте осторожны, чтобы не включать в себя любые терминальные области.
- Запись средней интенсивности двух трансформирования с помощью 'меру' или 'анализа ROI' функции программного обеспечения и передачи данных в электронную таблицу.
- В таблице, для каждого отдельного фолликула вычесть среднюю локальную интенсивность фона от того, в кольцевом пространстве, чтобы дать чистую интенсивность. Эта корректировка для локального фона значительно снижает между фолликула изменчивость.
Representative Results
Фолликулы волос в этом препарате ушной раковины хорошо видны при просвечивании без флуоресценции (рис 1А), иллюстрирующий Тончайшая характер подготовки и относительную легкость доступности , которые она предоставляет для этих механосенсорных терминалов. Каждый символизирован видного основания стержня волоса пронизывающий темный полумесяц сальной железы. Под эпифлуоресцентной, меченые ланцетные терминалы , окружающие каждый волосяной фолликул , отчетливо видны и показывают поглощение , как правило , надежные спонтанное стирильная красителя (рис 1B). Это происходит без наложенного движения. Терминалы ланцетные замечены окружать стержень волоса, хотя степень окружения является переменной 6. Большая часть маркировки является пунктированные (пятна), а не линейное расположение, что можно было бы ожидать. Шаблон точечное отражает терминалы наблюдается в оптической плоскости по длине терминала. Тхиподготовка s не получил дальнейшей обработки для визуализации после маркировки, она была просто переносили на предметный столик микроскопа и отображаемого на месте, которое еще раз иллюстрирует простоту этого препарата.
Примеры экспериментов , к которым этот новый препарат подходит показаны на рисунке 3. Он может быть использован для изучения как эндоцитоза и экзоцитоза в живых терминалах, а также их модуляции. Таким образом, для эндоцитоза, агонисты рецептора глутамата может увеличить интенсивность маркировки, в то время как блокирование Ca 2+ каналы с лигандами или катионы , такие как Mg 2+, Ni 2+ или Cd 2+ уменьшает его 2. В качестве альтернативы, этот препарат может быть также использован для изучения кинетики экзоцитоза, как показано на фиг.3С. Во-первых, меченый терминал видно де-окрашивание спонтанно. Тем не менее, этот destain ускоряется экзоцитоза стимулятора, latrotoxin. Более дехвосты экспериментальных результатов можно увидеть в банках, RW и др. 2.
Рисунок 1. Прочные стирил Dye Этикетировочное Записано в Mouse Пина. (A) Часть немеченого подготовки ушной раковины при ярком освещении поля, показывая , как четко появляются волосяные фолликулы в областях , очищенных от вышележащих тканей ареолярная / из жировой ткани. Темные, как правило, двулопастные, серповидной формы являются сальные железы, окружающих центральный стержень волоса. (Б) Аналогичная область, при несколько большем увеличении и визуализируют с помощью эпифлуоресцентной, показывая ланцетовидные окончаний , меченные стирилового красителя. Шкала баров -. 40 мкм Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
"1"> 
Рисунок 2. Анализ стирил Dye обозначая интенсивности. (A) Типичный круговой схеме маркировки волосяного фолликула с стирилового красителя, сосредоточены на стержне волоса (не видно на этом снимке). (B) 'область интереса' основной анализ (ROI) определяется с помощью стандартного кольцевого пространства , наложенной на позиции частоколом ланцетные нервных окончаний , окружающих фолликул. Этот ROI поддерживается постоянным по форме и площади для любого одного эксперимента, чтобы обеспечить интенсивность маркировки может быть достаточно сравнить между препаратами и во всех процедур. Чистая интенсивность каждого ROI рассчитывается путем вычитания интенсивности соседнего квадратного или круглого фоновой области (~ 400 мкм 2). Опять же, этот квадрат фона области сохраняется постоянной по форме и площади в течение любого данного эксперимента.целевых = "_blank"> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3. Этикетировочное Интенсивность фолликула волос афферентных Lanceloate концовок не нормально распределенной, и может быть использован для изучения Оба эндо- и экзоцитоза. Типичные данные измерений интенсивности стирильная красителя в спонтанно меченых терминалы ланцетными с использованием метода анализа , описанного выше. (А) интенсивность Этикетировочное в контрольных условиях (54 фолликулы, 4 колоса) и 1 мМ глутамата (42 фолликулы, 4 ушей). Значения интенсивности отдельных окончаний отображаются в виде графиков кластера точек. Каждая точка представляет собой интенсивность одного терминала частокол вокруг фолликула. Обратите внимание, что даже в условиях управления несколько точек данных (фолликулы) являются чрезвычайно интенсивными, в то время как большинство из них сгруппированы по более низкой интенсивности. Первая точка в конкретной Intensности строится в центре и последующие точки данных одной и той же интенсивности нанесены все более в боковом направлении по обе стороны. Таким образом, боковой разброс представляет частоту фолликулах какой-либо конкретной интенсивности маркировки. Горизонтальные линии представляют медиану ± 25% межквартильный диапазон. Инкубация с 1 мМ глютамата повышает Медиана на ~ 50% (*** Р <0,001, Mann-Whitney), но маркировка может быть увеличена на 200 - 300%, в некоторых терминалах. (Б) изображения , демонстрирующие поглощение усиливается краситель глутамат-опосредованной (эндоцитоза). Инкубация препарата волосяной фолликул, в глутамат (1 мМ) заметно увеличивает поглощение красителя стирильную, как показано увеличенной интенсивности маркировки. Масштабная линейка 20 мкм. (C) Усиление высвобождения красителя (экзоцитоз). После того, как маркировка, стирильная краситель самопроизвольно выпущен снова, как маркировка при 0 мин явно ярче, чем через 60 мин, даже после вычитания фона для контроля за фотообесцвечиванию. Этот релиз значительно роtentiated по latrotoxin, черная вдова яда паука компонент, который вызывает неконтролируемый везикул экзоцитоза. Через 60 мин в токсина, терминал маркировки практически невозможно обнаружить. Эта обратимость маркировки стирильная красителя подтверждает гипотезу о том, что терминал флуоресценции обусловлено интернализации при локальной утилизации синаптических типа везикул. Масштабная линейка 20 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Discussion
Бьюик и Бец первоначально разработан N- (3-triethylammoniumpropyl) -4- (4- (дибутиламино) стирильную) пиридиний дибромид связанных стирильная пиридиния красителей 7-10 контролировать местную рециркуляцию синаптических мембран везикул. поглощение красителя, и, следовательно, увеличился флуоресценции, поэтому отражает синаптические везикулы мембраны интернализации (эндоцитоза). В дальнейшем эта усвоены краситель может быть переиздан дальнейшей электрической активности, показывающий потерю красителя контролирует везикул мембраны экстернализацию (экзоцитоз). В синапсах, это прокси-сервер для секреции нейромедиатора. В то же время, мы также обнаружили , эти красители первичной метки механосенсорных нервных окончаний 7. Совсем недавно 11, Бьюик, Банки и коллеги тогда показали , что это отражает аналогичный процесс в зрелых, дифференцированных механосенсорных терминалов бывших естественных условиях. Здесь снова, красители маркировать 50 Диаметр "синаптические типа" везикулы нм (КРН), которые перерабатывают конститутивно выпустить глутамат.В механосенсорных терминалах, в отличие от своих синаптических аналогов, эта переработка в первую очередь спонтанно. Он также модулируется с помощью механического, а не просто электрический, стимуляции.
Для сенсорных нейронов в культуре , так и в клетках волос улитке стириловых красителей в общем и стирилового пиридиния красителя , в частности , было показано , что проходят через механосенсорных каналы, блокируя механосенсорных каналы и необратимо маркировки внутренних мембран 12. Тем не менее, в сопоставимых концентрациях стирильная красителя в дифференцированных механосенсорных терминалов на месте, как и здесь , в ланцетовидными окончаний 2, или в Ia окончаний мышечных веретен 11, а также в клетках волос, которые не механически стимулированных 13, 14, маркировка с помощью мембранной эндоцитоза. В механосенсорных нервных окончаний, например, маркировка является обратимым и не блокирует механосенсорных ответов в концентрациях , используемых здесь , 2, 11, 15. В то время как некоторые интернализации красителя канала просачивания в этих окончаний не может быть полностью исключена, почти полное destain с latrotoxin указывает на значительное большинство маркировки в зрелых терминалах интернализации с рециркуляцией везикул мембраны. Мы, таким образом, использовал эту технику для изучения активности зависимость 11 и, совсем недавно, фармакологию 2 рециркуляции SLV в механосенсорных афферентных терминалов путем изучения эффектов препарата на поглощение и высвобождение красителей.
Как и в большинстве практических методов, воспроизводимости требует повторения и практики. Некоторые из ключевых моментов для обеспечения надежности теперь будет обсуждаться. Ланцетные маркировка у молодых животных является более надежным - самым маленьким животным мы использовали 15 г веса тела. Не совсем понятно, почему это так, но это может быть потому, что рассечение младшей соединительной ткани требует меньше механической травмы и ЛеAves менее оставшийся остаток при удалении ткани, прилежащие иннервации слой.
В целом, подготовка ткани довольно проста, с облупившейся слои кожи друг от друга, являющийся наиболее технически сложный практический аспект, а затем только в старых мышей. В эти слои кожи сильно прилипать друг с другом у основания, где начинается рассечение, но даже здесь разделение слоев становится гораздо легче в направлении периферии. К счастью, или, возможно, следовательно, эти тонкие краевые участки кожи, как правило, дают наиболее удовлетворительные маркировки, как это делает переднюю кожу в целом. Поэтому, в частности, избежать захвата очень тонкой кожи на полях. Чтобы свести к минимуму риск повреждения, манипулировать препаратов косвенно путем нажатия с закрытыми щипцами, а не хватать непосредственно, или если важно зажимают только жесткие ткани вряд ли подлежит обязательной маркировке. Будьте внимательны при удалении слой 'лист полистирола' немедленно вышележащих фолликулы, так как это основной мненическое препятствие к визуализации и доступа наркотиков. Тем не менее, важно , чтобы свести к минимуму физический контакт с базовыми структурами , так как это ущерб (то есть, отсекает) нейронных сетей и терминалов чуть ниже. Если преобладающий флуоресценции желтый / белый в сальных железах, видным автофлуоресценции оснований для волос вала и несколько полумесяцев оранжевого / желтого ланцетными окончаний, это указывает на то, нервное сплетение слой и связанные с ланцетовидными терминалы были удалены во время очистки. Это, как представляется, главная проблема со взрослыми (> 30 г) мышей. На протяжении процедуры окрашивания, обеспечивают все при температуре 30 ° C и хорошо насыщенной кислородом. Имейте в виду, что меченые терминалы все еще живы. Следовательно, краситель будет секретируется постоянной спонтанной (конститутивным) exocytic выпуска. Это будет медленнее при R / T, но это хорошая практика, чтобы свести к минимуму задержку между удалением раствора хелатор и обработки изображений, чтобы свести к минимуму потери красителя. Кроме того, для межгруппового сравнительные секtudies интенсивности, необходимо обеспечить визуализацию всех групп время соответствием. Использование агента красителя хелаты до визуализации значительно улучшает контрастность изображения. Таким образом, в то время как относительно дорогой, шаг комплексообразования является весьма важным для обеспечения хорошего качества изображения. Использование хелатор может быть сведено к минимуму за счет повторного Раствор несколько раз, и даже на 2 - 3 дня подряд, при хранении при 4 ° С между использованием. Отменить решение хелатор как только она идет заметно розовый, показывая его поглощение красителя приближается к насыщению.
Во время визуализации, быть в курсе потенциал для фототоксического повреждения этих живых терминалов, что является совокупным результатом как по интенсивности и времени экспозиции возбуждающего света. Это соображение является менее важным для одного временной точки изображения, где качество изображения является основной заботой. Тем не менее, это имеет решающее значение при повторном визуализации в кинетике исследований с целью уменьшения возбуждения освещенности до минимума. При разработке этих красителей вметка синапсы, мы обнаружили, возбуждение в течение> 1 мин при полной мощности освещения возбуждения вызовет резкое и непоправимый ущерб нервных окончаний. Сначала они впоследствии расширить огромно, а затем полностью разрушиться в течение ~ 15 мин. Мы не систематически проверять относительный вклад времени экспозиции и интенсивности, но эти наблюдения позволяют предположить, руководящим принципом должно быть, чтобы минимизировать оба. Таким образом, рекомендуется, чтобы интенсивность света возбуждения и продолжительность минимум соизмеримы с получением хороших изображений, а также соответствующие контрольные изображения принимаются в времени курса обучения. Для того, чтобы проверить, что данные не затрагиваются фототоксичности при повторных условиях формирования изображения, в каждый момент времени принимают дополнительное изображение ранее не открывавшейся терминала. Это должно гарантировать, поведение маркировки в наивных терминалах напоминает, что в фолликулах изображаемого неоднократно.
Ряд факторов может уменьшить изменчивость внутри группы чистой интенсивности дата. Точная размещение трансформирования, в частности, фон ROI, имеет важное значение, так как даже небольшие участки неприемлемом окрашивания может сильно повлиять на изменчивость данных между фолликула. Изменчивость чистой интенсивности также зависит от того, как полностью каждый волосяной фолликул окружен частоколом окончаний. Сравните, например, в форме полумесяца распределение маркировки на рисунке 1В с почти полностью круговой схеме видно на рисунке 2. Более сложный анализ, возможно , с использованием автоматизированного обнаружения программного обеспечения и пороговую, необходимы , если степень окружения является важным параметром. Обратите внимание , что распределение интенсивности даже наиболее точно проанализированных фолликула групп не являются нормально распределенными (смотри рисунок 3), что вызывает необходимость использования непараметрических статистических данных для последующей обработки между сравнения медианы населения , а не средств. Нормализация методы, такие как выразить силу света в процентах OF контралатеральной контроль, или контрольной группы из нескольких препаратов, могут быть применены для дальнейшего снижения изменчивости. Окончательный технический пункт будет рассмотрен экспериментальный дизайн для фармакологического тестирования. В ходе фармакологических исследований, предварительно инкубировать препарата в растворе лекарственного средства в течение 30 мин перед нанесением красителя. Затем, поддерживать концентрацию лекарственного средства в растворе красителя. В контрольной группе, используют либо соль, либо, если препарат растворяется в транспортном средстве, физиологический раствор плюс транспортное средство.
В данной статье показано, как этот новый препарат Пина предлагает высококачественные изображения механосенсорных окончаний в коже с минимальной подготовкой. Мы также покажем это может быть использован для изучения фармакологии двух важнейших аспектов утилизации везикул. Покажем сначала, что агонист рецептора глутамата может увеличить интернализации красителя (маркер эндоцитоза), а во-вторых, что краситель потерян снова с latrotoxin (стимулятором экзоцитоза). Значение этого подготовка трионов и методика является то , что он предлагает отличный доступ к живой кожи mechanosenory терминалов на месте для проведения экспериментов с изображениями, предоставляя уникальные возможности для оптического мониторинга терминальной функции, структуры и их взаимосвязей. Для этого последнего конца, мы также разработали его в дальнейшем для использования в комбинированных оптических / электрофизиологических исследований (см сестра Jove статью для более подробной информации).
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Работа финансировалась UK Medical Research Council грант проекта G0601253 к GSB и РБГ и грант SULSA Bioskape к GSB
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PDMS - Sylgard 184 | Dow Corning | Flexible, inert, translucent solid silicone polymer. | |
| No. 3 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11231-20 | |
| Austerlitz Insect pins | Fine Science Tools | 26002-10 | Very fine pins to attach pinna preparation securely to the PDMS with minimal damage. |
| FM1-43/Synaptogreen C4 | Biotium/Cambridge Bioscience | BT70020 | Fluorescent membrane probe that reversibly partitions into the outer leaflet of cell membranes. Used predominantly for monitoring vesicle membrane endo-/exocytosis. |
| Advasep 7 | Biotium/Cambridge Bioscience | BT70029 | A sulfonated b-cyclodextrin derivative that chelates FM1-43 (& other styryl pyridinium dyes) out of the exposed membranes, leaving internalised dye to be seen more clearly by lowering the background labelling/fluorescence. |
| Retiga Exi Fast 1394 | Qimaging | Monochrome, cooled CCD camera - basic model | |
| Volocity 3D Image Analysis Software | Perkin Elmer | Volocity 6.3 | Image capture and analysis software. |
References
- Li, L., et al. The functional organization of cutaneous low-threshold mechanosensory neurons. Cell. 147 (7), 1615-1627 (2011).
- Banks, R. W., et al. Glutamatergic modulation of synaptic-like vesicle recycling in mechanosensory lanceolate nerve terminals of mammalian hair follicles. J. Physiol. 591 (10), 2523-2540 (2013).
- Andres, K. H. On the microstructure of receptors on sinus hair. Z. Zellforsch. Mikrosk. Anat. 75, 339-365 (1966).
- Shenton, F., Bewick, G. S., Banks, R. W. A study of the expression of small conductance calcium-activated potassium channels (SK1-3) in sensory endings of muscle spindles and lanceolate endings of hair follicles in the rat. PLoS One. 9, e107073 (2014).
- Liley, A. W. An investigation of spontaneous activity at the neuromuscular junction of the rat. J. Physiol. 132 (3), 650-666 (1956).
- Suzuki, M., Ebara, S., Koike, T., Tonomura, S., Kumamoto, K. How many hair follicles are innervated by one afferent axon? A confocal microscopic analysis of palisade endings in the auricular skin of thy1-YFP transgenic mouse. Proc. Jpn. Acad. Ser. B. Phys. Biol. Sci. 88 (10), 583-595 (2012).
- Betz, W. J., Mao, F., Bewick, G. S. Activity-dependent fluorescent staining and destaining of living vertebrate motor nerve terminals. J. Neurosci. 12 (2), 363-375 (1992).
- Betz, W. J., Bewick, G. S., Ridge, R. M. Intracellular movements of fluorescently labeled synaptic vesicles in frog motor nerve terminals during nerve stimulation. Neuron. 9 (5), 805-813 (1992).
- Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. Science. 255 (5041), 200-203 (1992).
- Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical monitoring of transmitter release and synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. J. Physiol. 460 (1), 287-309 (1993).
- Bewick, G. S., Reid, B., Richardson, C., Banks, R. W. Autogenic modulation of mechanoreceptor excitability by glutamate release from synaptic-like vesicles: evidence from the rat muscle spindle primary sensory ending. J. Physiol. 562 (2), 381-394 (2005).
- Drew, L., Wood, J. FM1-43 is a permeant blocker of mechanosensitive ion channels in sensory neurons and inhibits behavioural responses to mechanical stimuli. Molecular Pain. 3, (2007).
- Griesinger, C. B., Richards, C. D., Ashmore, J. F. FM1-43 reveals membrane recycling in adult inner hair cells of the mammalian cochlea. J. Neurosci. 22 (10), 3939-3952 (2002).
- Griesinger, C. B., Richards, C. D., Ashmore, J. F. Apical endocytosis in outer hair cells of the mammalian cochlea. Eur. J. Neurosci. 20 (1), 41-50 (2004).
- Watson, S., Aryiku, C., Banks, R. W., Bewick, G. S. Comparison of gadolinium and FM1-43 as blockers of stretch-evoked firing of rat muscle spindle afferents. Proc. Physiol. Soc. 21, P22 (2010).
