Abstract
Eine neuartige Dissektion und Aufzeichnungstechnik wird zur optischen Überwachung Färbung und de-Färbung von lanceolate Terminals umgebenden Haarfollikel in der Haut der Ohrmuschel der Maus beschrieben. Die Herstellung ist einfach und relativ schnell, zuverlässig umfangreiche Regionen von mehreren markierten Einheiten von lebenden Nervenendigungen Nachgeben extensiv in Studien der Vesikelrecycling verwendet zu untersuchen Aufnahme und Abgabe von Styryl pyridinium-Farbstoffe. Unterteilen der Vorbereitungen vor der Markierung ermöglicht Test vs. Kontrolle Vergleiche im gleichen Ohr von einem einzelnen Individuum. Hilfreiche Tipps für die Verbesserung der Qualität der Zubereitung, die Kennzeichnung und die Abbildungsparameter gegeben. Dieses neue System ist geeignet für pharmakologisch Untersuchung und mechanisch induzierte Aufnahme und Freisetzung dieser Vitalfarbstoffe in lanceolate Terminals sowohl in Wildtyp und gentechnisch veränderte Tiere. Beispiele für modulierende Einflüsse auf die Markierungsintensität gegeben.
Introduction
Mechanosensorischen Nervenenden sind in der Regel klein, diffus verteilt und schwer zugänglichen in situ, da sie in der Regel tief in die Haut oder andere umgebende Gewebe eingebettet sind. Visualisieren sie daher durch eine verlängerte Immunmarkierung / Färbungszeit oder die Verzögerung und die Kosten des Erhaltens Mauslinien mit genetischen Expression von Fluoreszenzmarkierungen, wie grün oder gelb fluoreszierende Protein (GFP / YFP) 1 gefolgt erfordert in der Regel sectioning. Hier zeigen wir eine bequeme Gewebe und eine schnelle und einfache Methode , den Zugang zu einer großen Anzahl von Haarfollikel Afferenzen für das Studium zu gewinnen, und wie sie schnell zur optischen Überwachung von Terminal - Funktion 2 markiert werden. Mit etwas Übung kann die gesamte Technik von Dissektion Bildgebung in weniger als 2 Stunden abgeschlossen sein.
Die lanceolate Terminals sensorischer Axone innervieren Haarfollikel in Säugetieren Palisaden um das Epithel der Haarbalg bilden, mit jeweilsKlemme zwischen Glia / Schwann - Zellen sandwichartig verarbeitet 2-4. Der Zweck der Klemmen ist die mechanische Verschiebung der Haare zu erfassen, sie umgeben. Sie sind eine Mischung von schnell und langsam Anpassung Enden, aber sie produzieren überwiegend kurze Ausbrüche von Aktivität in Reaktion auf Haarbewegung. Typischerweise stoppt die Zündung sehr schnell, wenn die Bewegung aufhört, auch in Gegenwart von fort Verschiebung.
Dieses murine Ohrmuschel Modell für die Untersuchung lanceolate Terminals durch optische Verfahren hat viele vorteilhafte Merkmale für die Struktur und Funktion dieser Digungen studieren. Die Ohrmuschel ist vorwiegend zwei Schichten der Haut angelagert back-to-back, mit nur einer geringen Menge von Knorpelgewebe dazwischen. Die Haut ist sehr dünn und leicht durch minimale Mengen von Klebstoff schwach Bindegewebe relativ zu anderen Regionen des Körpers präpariert. Die leicht getrennt Hautschichten, daher geben einen guten Zugang zu den Follikeln und Terminals. Die Innervationleicht zugänglich und erkennbar ist. Die Haarfollikel mehr sind spärlich verteilt als in anderen Hautregionen, die Abbildung einzelner oder kleiner Gruppen von Follikeln zu erleichtern. Die dünne darunter liegende Hautschicht ergibt eine gute Zugänglichkeit zu Farbstoffe und pharmakologische Medikamente, so ist ideal für die Bildgebung mittels Fluoreszenzmikroskopie ohne weitere Verarbeitung. Die Darstellung von markierten Terminals können entweder von lebenden Terminals oder, wenn eine fixierbare Farbstoff analog unter Verwendung von nach dem Fixieren und weitere histologische Verarbeitung.
Wir haben dieses Präparat verwendet , dass die Membran zu zeigen , das Recycling in den lanceolate Endungen auftritt, belegt durch die Aufnahme (Endozytose) und Release (Exozytose) eines Styrylpyridinium- Farbstoff (FM1-43; N - (3-triethylammoniumpropyl) -4- (4- (Dibutylamino) styryl) pyridinium Dibromid). Der Farbstoff nicht tut, scheint jedoch deutlich die Investition Schwann Zelle 2 verarbeitet zu beschriften. Wir zeigten auch, dass dieser Farbstoff-Aufnahme / Freisetzung und damit r MembraneCycling, unterliegt glutamatergen Modulation durch eine atypische (Phospholipase D-gekoppelt) metabotropen Glutamatrezeptor. Die Ergebnisse der einfachen Stimulation und Analyseprotokolle dargestellt sind, und gemeinsame Potenzialanalyse Probleme werden ebenfalls hervorgehoben.
Protocol
Diese Methoden wurden in der Forschung berichtet in Banken verwendet, RW et al. 2 Mäuse wurden auf humane Weise durch Genickbruch eingeschläfert. Im Vereinigten Königreich ist dies eine gesetzlich zugelassene Anlage 1 Verfahren in den genannten Tiere (Scientific Procedures) Act 1986 und der europäischen Richtlinie 2010/63 / EU. Dieses Bundesgesetz ist vor Ort an der University of Aberdeen durch den Tierschutz und ethische Review Board durchgesetzt, die alle Verfahren genehmigt haben.
1. Vorbereiten Ohren für Labeling
- Bereiten einer Standard physiologische Salzlösung, wie Liley der (1956) 5 und sättigt sie mit 90% O 2/5% CO 2 (Carbogen). Liley der Kochsalzlösung (mM): NaHCO 3 (12), KCl (4), KH 2 PO 4 (1), NaCl (138,8), MgCl 2 (1), CaCl 2 (2) und Glucose (11). HINWEIS: Für den Rest des Manuskripts "Saline" wird auf Kochsalzlösung beziehen, die vollständig mit Carbogen gesättigt ist. Während DISSECTIOn, aktualisieren Sie die Kochsalzlösung für den Zubereitung alle 15 - 20 min.
- Menschlich eine erwachsene Maus einschläfern, ohne den Schädel zu beschädigen. Anmerkung: Wir haben C57 / Bl6J und MF1-Mäuse verwendet, aber jede Mausstamm verwendet werden kann. Der wichtigste Aspekt ist nicht groß Erwachsene zu verwenden (> 25 g). Beschriften in größeren Mäuse weniger zuverlässig, oft zu kleinen und verstreuten Gruppen von Follikeln beschränkt werden.
- Entfernen Sie die äußeren Ohren (Ohrmuschel) in der Nähe der Basis mit ~ 25 cm Schere, gerade über dem dichten Haarlinie und versenken in Kochsalzlösung in einem Silikon-Gummi ausgekleidete Kultur / Petrischale (50 mm ist in der Regel bequem).
- Positionieren Sie die Ohrmuschel vorderen (konkaven) Seite nach unten und stecken Sie die Ränder auf dem Silikon in regelmäßigen Abständen mit feinen Insektenstifte (~ 6 - 8 pro Ohr, ~ 0,2 mm Durchmesser Pins). Aktualisieren Salz jede 15 bis 20 Minuten, oder verwenden Sie eine ständig durchbluteten Bad.
- schälen Sie vorsichtig die hintere Haut von der vorderen Haut durch stumpfe Dissektion entfernt, zunächst von der Schnitt Basis der Ohrmuschel Zugriff überdie dicken Mittel Knorpel und arbeiten systematisch an den dünnen, knorpelfreien Außenränder.
- Um dies zu tun, halten Sie die Mitte der Schnittkante der hinteren Haut mit einem Paar nicht. 3 Zange. Dann, mit geschlossenen Backen, legen Sie die Punkte von einem anderen Satz von Nr. 3 Zange in den Zwischenraum zwischen der Haut und dem darunterliegenden Knorpel.
- Vorsichtig arbeiten, die Punkte der geschlossenen Zange von Seite zu Seite innerhalb der Lücke, die minimal erforderliche Kraft verwenden, sorgfältig Verwachsungen zu lösen, während Peeling die hintere Haut zurück, um die Schichten zu trennen.
- Mit der hintere Haut entfernt, lassen Sie die vordere Haut in Position. Pin der posterioren Haut, Hautseite nach oben, neben der vorderen Haut (nach 1,5, oben).
- Als nächstes sorgfältig und vollständig die Ohrmuschel Knorpel entfernen, die zwischen den Hautschichten von der vorderen Haut durch die gleiche stumpfe Dissektionstechnik wie in 1.6 eingeklemmt wurde. Vermeiden Sie Einstichlöcher mit der Zange.
- Dann foder beide Ohrmuschel Hautpräparate sanft schälen, zupfen und reiben Sie die dünne Schicht aus Bindegewebe, ähnlich expandiertem Polystyrolschaum, die die Haarfollikel Basen deckt weg. HINWEIS: Um eine optimale Clearing Beschaffung ein wenig Übung nehmen können; unzureichende Gewebeentfernung behindert den Zugang sowohl für die Farbstofflösung und für die Bildgebung, während zu stark Abschaben der neuronalen Netze entfernt, die an der Basis der Follikel sind.
- Aktualisieren Sie die Kochsalzlösung.
2. Lanceolate Klemmenbeschriftung
HINWEIS: Das folgende Protokoll für Styrylpyridinium- Farbstoff optimiert ist. Andere, chemisch ähnlich, Styrylpyridinium- Farbstoffe sollten arbeiten, vielleicht nach einer gewissen Einstellung der Konzentration und Inkubationszeit. Tragen Sie Handschuhe und einen Laborkittel, wenn Farbstofflösungen Handhabung. Entweder kaufen 10 mM Stammfarbstofflösung direkt vom Hersteller oder Lager herzustellen, indem man die Farbstoffpulver in Kochsalzlösung auflöst, ohne Glukose. Aliquot (10 & mgr; l ist in der Regel bequem, aber passen diese für große scale Experimente) und Lagerung tiefgefroren für bis zu 6 Monate bei -20 ° C oder ~ 1 Jahr bei -80 ° C. Pulver wird für mindestens 2 Jahre gespeichert werden. Vermeiden Sie wiederholte Frost / Tau-Zyklen von Farbstofflösungen; Diese denaturiert schnell den Farbstoff. Einmal aufgetaute lagern bei 4 ° C und innerhalb von 1 Woche.
- einem Wasserbad auf 30 ° C vorgewärmt, mit einer Plattform ~ 3 bis 5 mm unterhalb der Oberfläche des Wassers.
- Frisch herstellen 10 uM Styrylpyridinium- Farbstofflösung (10 ul frisch aufgetaut 10 mM Styrylpyridinium- Farbstoff in 10 ml Kochsalzlösung) und äquilibrieren in einem Wasserbad.
- Pin jeder Zubereitung in einem Silikon-Gummi ausgekleidet 35 mm Kulturschalen untergetaucht in 1 bis 2 mm von Salzlösung (typisches Volumen, ~ 2 ml). Jede Ohrmuschel Vorbereitung der Haut wird zwei Präparate ergeben, wenn in der Hälfte von der Spitze schneiden mit einer kleinen Schere zu stützen (10 bis 15 cm Länge), Tierversuche zu minimieren.
- Legen Sie die 35-mm-Schalen, die mit Kochsalzlösung bedeckt Ohrmuschel Präparate auf dem Untersee-Plattform im 30 ° C Wasserbad enthält. Sicherstellen, dass dieWassertiefe für eine ausreichende Erwärmung ausreichend, aber nicht die Kochsalzlösung in der offenen Schale verunreinigen.
- Pin fein (0,5-1 mm Außendurchmesser) Schläuche mit O 2 / CO 2 in die Silikon - Basis jeder Schale fließt , um kontinuierlich die Vorbereitungen Gas. Auch legen in das Wasserbad 100 ml farbstofffreie Kochsalzlösung zum Waschen / Schale erfrischend. Verwenden Sie einen gut verschlossenen Flasche Carbogen der Sättigung zu halten und Wasserverschmutzung zu verhindern.
- Äquilibrieren alles bei 30 ° C für 30 min, dann ersetzen Sie die Kochsalzlösung über die Ohrmuschel Präparate aus den 100 ml verschlossenen Flasche. Inkubieren weitere 30 min. HINWEIS: Diese Reserve kompensiert Salzverdampfung und alle Schüttvolumen Verluste aus Gas-line sprudelnden.
- Abgießen farbstofffreien Kochsalzlösung in einem 100 ml Becherglas Abfall, dann schnell und sorgfältig jede Flüssigkeit blot entfernt verbleibenden um die Zubereitung mit Seidenpapier Verdünnungseffekte auf der Farbstofflösung zu minimieren, um als nächstes zugegeben werden. Achten Sie darauf, nicht zu berühren (
- Inkubieren Ohrmuschel Präparationen in 2 - 3 ml von 10 uM Styryl pyridinium Farbstoff für 40 min bei 30 ° C dann zurück zu R / T für den Rest des Verfahrens.
- Entfernen Sie nicht internalisierte Farbstoff in drei Stufen unter Verwendung von Lösungen bei R / T. Hinweis: Diese Schritte werden am besten durchgeführt, in minimalen Umgebungslicht (Verdunkelung, rot / orange mit niedriger Intensität Beleuchtung) Auge dunkel-Anpassung für die Bildgebung zu beginnen.
- Gießen Sie die Markierungslösung aus den Schalen in einen Abfallbecher weg und spülen Sie schnell in drei Änderungen von farbstofffreie Kochsalzlösung in schneller Folge. Dies beseitigt die Rest Styrylpyridinium- Farbstofflösung haftend auf die Vorbereitungen und jeder Farbstoff, der aus exponierten Membranen leicht departitions.
- Inkubieren in einem letzten Änderung der farbstofffreien Kochsalzlösung für weitere 30 min die meisten verbleibenden Farbstoffes von Oberflächenmembranen departition, dh Farbstoff durch die Klemmen nicht internalisiert.
- Entfernen Sie hartnäckigen Farbstoff stecken to der externen Faltblatt der exponierten Membranen mit sulfonierten b-Cyclodextrin - Derivat Chela (Advasep-7, 1 mM, 5 min - siehe Tabelle 1). Somit werden alle verbleibenden Farbstoffes innerhalb der Gewebe ist.
- Legen Sie in frischen farbstofffreie Kochsalzlösung für die Bildgebung und trocknen Sie die Außenseite der Schale gründlich mit Seidenpapier.
HINWEIS: Die Anschlüsse sind nun bereit für die Bildgebung. Es ist wichtig, sich bewusst zu sein, dass die lanceolate Endungen sind lebendig und daher langsam wieder die Endozytose Styrylpyridinium- Farbstoff freigesetzt wird. Obwohl dies bei R / T langsamer sein, ist es wichtig, Verzögerungen vor / während der Bilderzeugung zu minimieren. Wenn das Experiment Kennzeichnung von mehreren Zubereitungen erfordert zunächst beibehalten sie alle bei 30 ° C nicht markiert. Sie werden für mehrere Stunden lebensfähig sein. Dann beschriften nacheinander in Abständen, durch die zweite Zubereitung Kennzeichnung (Schritte 2.7 - 2.8.3), während die erste Bildgebung.
3. Imaging Beschriftete Lanceolate Endings.
HINWEIS: Der Beobachtersollte für die folgenden Bilderzeugungsstufen sein dunkel angepasst. Die erhöhte Sehschärfe dies ergibt bedeutet geringere Anregungslicht Ebenen die Follikel für die Bildgebung zu finden sind erforderlich. Dies ist besonders wichtig für die Phototoxizität zu minimieren, anstatt die Unannehmlichkeit des Photobleaching reduzieren. Freie Radikale durch volle Intensität Beleuchtung erzeugt schnell kann (innerhalb von 60 sec) töten Nerven lebenden Terminals (GS Bewick, S. Fadul und WJ Betz, nicht veröffentlichte Beobachtungen).
- Vor Bildgebung, überprüfen Sie die Vorbereitung unter einer Dissektion Stereomikroskop und sorgfältig jede Oberfläche Schmutz zu entfernen. Dies verhindert, dass Autofluoreszenz die Bilder zu kontaminieren.
- Montieren Sie die Schüssel auf der Bühne eines aufrechten Epifluoreszenz-Mikroskop mit einem Standard-Fluorescein-Filtersatz (480-488 nm Anregung, 500 - 520 nm Emission für Styrylpyridinium- Farbstoff).
- Dämpfen Sie den Anregungslichtintensität mit Neutraldichtefilter, bis ausreichend nur bequem, das Terminal zu lokalisierens.
- Suchen Sie markierten Follikel durch mit niedrigen Beobachtung (3.5x - 4x trocken Ziel), dann progressiv höher (10x und 20x Wasserimmersionsobjektiv) vergrößernden Objektiven.
- Zum Aufzeichnen von Bildern von markierten lanceolate Terminals durch 10x Trockenobjektiv für Low-Power und 20x Wassertauchziele für höhere Vergrößerung. Minimierung der Lichtintensität und der Belichtungszeit (eine Kameraintegrationszeit von 0,5-1 sec wird vorgeschlagen).
- Zum Aufzeichnen von Bildern auf einem Standard-Digitalkamera und Speichern von Bildern auf Computer-Festplatte proprietäre Software. HINWEIS: Ein typisches Beispiel ist in Abbildung 1 dargestellt.
- Bild ~ 20 lanceolate Endungen von jeder Zubereitung. Beginnen Sie am Rand am weitesten von der Schnittkante an der Basis der Ohrmuschel Haut und Arbeit entlang dieser Marge Bildgebung jeder Follikel in der Reihe. Die Arbeiten über in leicht überlappenden Bereichen der Schnittkante parallel, dabei nicht die gleiche Follikel zweimal und jeder zu Bild, das offensichtlich beschädigt sind. Beachten Sie dasRe sind in der Regel zu viele lanceolate Terminals Bild sie alle, bevor eine signifikante spontane de-Färbung auftritt. Daher empfiehlt Abtasten wir systematisch die Bevölkerung das folgende Protokoll.
- Nach dem Randstreifen Abschluss einer Feldbreite in Richtung der Basis der Ohrmuschel, bewegen und den Prozess in umgekehrter Richtung wiederholen.
- Bild alle Terminals angetroffen werden, außer gelegentlichen diejenigen klar orientiert sehr viel mehr schräg zur optischen Ebene und unwahrscheinlich ganz zu passen innerhalb der Standard-Ringanalyse ROI (siehe Abschnitt 4). nicht ausschließen, ungewöhnlich heller oder dunkler lanceolates zu den umliegenden Terminals verglichen, es sei denn, sie offensichtlich beschädigt sind oder Hintergrundintensität besonders hoch ist, was anzeigt, lokalisierte Gewebeschäden.
- Entsorgen Sie die Vorbereitung, wenn mehr als 10% der Hautbereich / Klemmen beschädigt / unbrauchbar. HINWEIS: lanceolates mit der Zeit entfärben, vollständige Abbildung jedes Präparat innerhalb von 20 Minuten nach Ende des Wasch.
- ichf unter Verwendung von mehr als einer Vorbereitung, gewährleisten Intensität Vergleiche gültig sind durch zeitlich passende Präparate. Um dies zu tun, Offset-Timings jeder Präparation von ~ 30 min Färbung, um sicherzustellen, Vergleichbarkeit der de-Beize Zeiten.
- Zur Überwachung de-Färbung (Exozytose), Bild das gleiche Endgerät bei 5 oder 10-Minuten-Intervallen. Mit etwas Übung ist es möglich, Bild bis zu 3 getrennte Anschlüsse zu jedem Zeitpunkt in einem Präparat.
4. Analysieren Beschriftete Lanceolate Endings.
Hinweis: Das folgende Verfahren eine schnelle Methode zur Analyse von Terminal Intensität ist.
- Machen Sie einen ringförmigen Bereich von Interesse (ROI) zentriert auf der Spitze der Haarschaft an der Basis des Haarfollikels (Abbildung 2). Stellen Sie den Innenumfang des ringförmigen ROI groß genug, um den Haarschaft Autofluoreszenz in jedem Follikel zu vermeiden analysiert werden, aber immer noch umfassen alle terminalen Fluoreszenz. Stellen Sie sicher, dass der Außenumfang groß genug ist, den größten termin zu umschließenal wahrscheinlich angetroffen werden, dass zur optischen Haupt / Follikel-Achse orientiert schließen wird.
- Bilden einen Hintergrund ROI etwa gleich in Bereich in den Ziel Anulus (Quadrat oder einem Kreis, typischerweise ~ 400 & mgr; m 2) , um die lokale Färbungsintensität in der Nähe des Terminals zu analysiere zu bestimmen.
Hinweis: Die Größen dieser zwei ROIs werden zu Beginn der Analyse festgelegt und verwendet, um alle nachfolgenden Follikel / lanceolate Terminals über alle Präparationen in einem Experiment analysiert. So ist es wichtig, ihre Parameter mit Sorgfalt am Anfang zu setzen. - Platzieren Sie den Hintergrund ROI nahe genug an der Follikel lokalen Hintergrund in den Talgdrüsen zu repräsentieren, um die Anschlüsse zu Grunde liegen, nicht auf die geringere Intensität der Haut zwischen den Follikeln, aber sein nicht vorsichtig alle Anschlussbereiche aufzunehmen.
- Notieren Sie sich die mittlere Intensität der beiden ROIs mit der "Maßnahme" oder "analysieren ROI 'Funktion der Software und Übertragen von Daten in eine Tabelle.
- In der Tabelle, Subtrahieren für jeden einzelnen Follikel die mittlere lokale Hintergrundintensität aus, dass in dem Ringraum einen Nettointensität zu geben. Diese Einstellung für lokalisierte Hintergrund stark reduziert zwischen-Follikel Variabilität.
Representative Results
Die Haarfollikel in dieser Ohrmuschel Herstellung sind unter Durchleuchtung ohne Fluoreszenz (Abbildung 1A) leicht zu erkennen ist , welche die hauchdünne Art der Zubereitung und der relativen Leichtigkeit der Zugänglichkeit es um diese mechanosensorischen Terminals bietet. Jeder wird durch die prominente Haarschaft Basisdurchdringen der dunklen Mondsichel der Talgdrüse typisiert. Unter Epifluoreszenz- werden die markierten lanceolate Terminals jedes Haarfollikel umgebenden deutlich zu sehen und zeigen die typisch robust spontane Styrylfarbstoffs Aufnahme (1B). Dies geschieht ohne auferlegte Bewegung. Die lanceolate Klemmen sind zu sehen in den Haarschaft zu umgeben, obwohl der Umfang der Umfassung ist variabel 6. Ein Großteil der Markierung ist punctata (spots) eher als die lineare Anordnung, die erwartet werden könnte. Die punktierte Muster reflektiert Terminals in einer optischen Ebene entlang der Länge des Anschlusses beobachtet wird. This Präparat erhielten keine weitere Verarbeitung zur Visualisierung nach der Markierung, wurde es einfach zu einem Mikroskoptisch überführt und in situ abgebildet werden , was wiederum die Einfachheit dieser Herstellung veranschaulicht.
Beispiel Versuche diese neue Zubereitung , an die geeignet sind , in Figur 3 gezeigt. Es kann verwendet werden , um sowohl die Endozytose und Exozytose in lebenden Terminals zu studieren, sowie deren Modulation. So kann Endozytose, Glutamat - Rezeptor - Agonisten die Markierungsintensität zu erhöhen, während Ca 2+ -Kanäle Blockierung mit Liganden oder Kationen wie Mg 2+, Ni 2+ oder Cd 2+ verringert sie 2. Alternativ kann diese Zubereitung auch die Kinetik der Exozytose zu studieren verwendet werden, wie in 3C gezeigt. Zuerst wird ein markierter terminal de Färbung spontan gesehen. Jedoch ist diese entfärben durch die Exozytose Stimulans beschleunigt Latrotoxin. Mehr details der Versuchsergebnisse können in Banks, RW et al. 2 ersichtlich ist.
Abbildung 1. Robuste Styrylfarbstoffs Labeling Aufgenommen in der Maus Pinna. (A) Teil einer unmarkierten Ohrmuschel Vorbereitung in Hellfeldbeleuchtung, die zeigt , wie deutlich Haarfollikel in Bereichen erscheinen geräumt areolar / Fettgewebe liegt. Die dunklen, in der Regel zweilappig sind Sichelformen Talgdrüsen die zentrale Haarschaft umgibt. (B) Ein ähnliches Bereich bei einer etwas höheren Vergrößerung und mit Epifluoreszenz abgebildet, zeigt lanceolate Digungen mit Styryl - Farbstoff markiert. Maßstabsbalken -. 40 & mgr; m Bitte klicken Sie hier um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Abbildung 2. Analyse der Styrylfarbstoffs Markierungsintensität. (A) Typische Kreismuster des Haarfollikels Markierung mit Styrylfarbstoffs, zentriert auf dem Haarschaft (nicht im Bild sichtbar). (B) Die "Region of Interest" Hauptanalyse (ROI) wird durch einen Standard Anulus auf die Position der Palisade von lanceolate Nervenenden rings um die Follikel lagert definiert. Dieser ROI konstant gehalten wird, in Form und Fläche für jedes einzelne Experiment Markierungsintensität zu gewährleisten, kann ziemlich zwischen Zubereitungen und über alle Behandlungen verglichen werden. Nettointensität jedes ROI wird durch Subtrahieren der Intensität eines benachbarten quadratischen oder kreisförmigen Hintergrundbereich (~ 400 & mgr; m 2) berechnet. Auch dieser quadratischen Hintergrund Bereich konstant in Form und Fläche in ganz einem bestimmten Experiment gehalten.target = "_ blank"> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Markierungsintensität des Haarfollikels Afferent Lanceloate Endings nicht normalverteilt und kann verwendet werden , um zu untersuchen Sowohl Endo- und Exocytose. Typische Daten aus Styrylfarbstoffs Intensitätsmessungen in spontan markierten lanceolate Terminals die Analyse oben beschriebenen Methode. (A) Labeling Intensität unter Kontrollbedingungen (54 Follikel, 4 Ohren) und 1 mM Glutamat (42 Follikel, 4 Ohren). Die Intensitätswerte der einzelnen Endungen werden als Cluster-Dot-Plots angezeigt. Jeder Punkt repräsentiert die Intensität eines Anschlusses Palisaden um einen Follikel. Beachten Sie, dass auch unter Kontrollbedingungen wenige Datenpunkte (Follikel) sind extrem intensiv, während die meisten bei geringeren Intensitäten gruppiert sind. Der erste Punkt bei einer bestimmten intenskeit wird in der Mitte und nachfolgende Datenpunkte der gleichen Intensität aufgetragen progressiv seitlich auf beiden Seiten aufgetragen. Somit stellt seitliche Ausbreitung der Häufigkeit der Follikel eines bestimmten Markierungsintensität. Die horizontalen Linien stellen Median ± 25% Quartilsabstand. Inkubation mit 1 mM Glutamat erhöht die mittlere Intensität von ~ 50% (*** P <0,001, Mann-Whitney), aber Markierung kann um 200 erhöht werden - 300% in einigen Terminals. (B) Bilder Glutamat-vermittelte verbesserte Farbstoffaufnahme demonstriert (Endozytose). Inkubation des Haarfollikels Zubereitung in Glutamat (1 mM) deutlich erhöht styryl Farbstoffaufnahme, wie durch die erhöhte Markierungsintensität dargestellt. Maßstabsbalken 20 um. (C) Enhancing Farbstofffreisetzung (Exozytose). Nach der Markierung wird Styrylfarbstoffs wieder spontan freigesetzt, wie die Kennzeichnung bei 0 min deutlich heller als bei 60 min ist, auch nach Abzug des Hintergrunds für Photobleaching zu steuern. Diese Version ist stark potentiated von Latrotoxin, Bestandteil eine schwarze Witwe Spinnengift, die Exozytose unkontrollierte Vesikel auslöst. Nach 60 min in Toxin ist terminale Markierung fast nicht nachweisbar. Diese Reversibilität der Styrylfarbstoffs Kennzeichnung unterstützt die Hypothese, dass Terminal Fluoreszenz Internalisierung während der lokalen Recycling synaptischer Vesikel-ähnlichen zurückzuführen ist. Maßstabsbalken 20 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Discussion
Bewick und Betz diejenigen entwickelt , die N- (3-triethylammoniumpropyl) -4- (4- (Dibutylamino) styryl) pyridinium Dibromid bezogenen Styrylpyridinium- Farbstoffe 7-10 lokale Recycling synaptischer Vesikel Membran zu überwachen. Die Farbstoffaufnahme und damit eine erhöhte Fluoreszenz spiegelt daher synaptischen Vesikelmembran Internalisierung (Endozytose). Anschließend kann diese internalisiert Farbstoff durch weitere elektrische Aktivität wieder freigegeben werden, überwacht die Vesikelmembran Externalisierung Farbstoffverlust zeigt (Exozytose). In Synapsen, dies ist ein Proxy für Neurotransmitter-Ausschüttung. Zur gleichen Zeit fanden wir auch diese Farbstoffe 7 primäre mechanosensorischen Nervenendigungen beschriften. In jüngerer Zeit 11, zeigte Bewick, Banken und Kollegen dann , dass dies in den reifen, differenzierten mechanosensorischen Terminals ex vivo einen ähnlichen Prozess widerspiegelt. Auch hier bezeichnen die Farbstoffe 50 nm Durchmesser 'synaptic-like' Vesikel (SLVs), die konstitutiv recyceln Glutamat freisetzen.In mechanosensorischen-Terminals, im Gegensatz zu ihren synaptischen Kollegen ist dies in erster Linie Recycling spontan. Es wird auch durch mechanische, anstatt einfach elektrische Stimulation moduliert.
Für sensorischen Neuronen in der Kultur und in Cochlea Haarzellen, Styrylfarbstoffe im Allgemeinen und Styrylpyridinium- Farbstoff insbesondere wurde gezeigt , durch die mechanosensorischen Kanäle passieren, die mechanosensorischen Kanäle blockiert und Kennzeichnung irreversibel inneren Membranen 12. Jedoch bei vergleichbaren Styrylfarbstoffs Konzentrationen in differenzierten mechanosensorischen Terminals in situ, wie hier in lanceolate Endungen 2 oder in Ia Endungen in Muskelspindeln 11, und in Haarzellen, die nicht mechanisch 13 angeregt, 14, Kennzeichnung ist durch Membran Endozytose. In mechanosensorischen Nervenendigungen, zum Beispiel, die Kennzeichnung ist reversibel und blockiert nicht die mechanosensorischen Antworten bei den Konzentrationen hier 2 verwendet, 11, 15. Während einige Farbstoff Internalisierung durch Kanal Permeation in diesen Endungen kann nicht vollständig ausgeschlossen werden, die in der Nähe von insgesamt destain mit Latrotoxin zeigt die große Mehrheit der Etikettierung in reifen Terminals ist durch Internalisierung mit Recycling Vesikelmembran. Wir haben, verwendet daher diese Technik 11 die Aktivität Abhängigkeit zu studieren und, in jüngster Zeit, die Pharmakologie 2 von SLV Recycling in mechanosensorischen afferenten Terminals von Arzneimittelwirkungen auf die Aufnahme und Freisetzung der Farbstoffe zu untersuchen.
Wie bei den meisten praktischen Techniken erfordert Reproduzierbarkeit Wiederholung und Praxis. Einige der wichtigsten Punkte für die Zuverlässigkeit sichergestellt wird nun diskutiert. Lanceolate Kennzeichnung bei jüngeren Tieren ist zuverlässiger - das kleinste Tier, das wir verwendet haben, betrug 15 g Körpergewicht. Es ist nicht ganz klar, warum dies der Fall ist, aber es kann sein, weil Dissektion der jüngeren Binde- erfordert Gewebe weniger mechanisches Trauma und leAves weniger verbleibende Rückstand, wenn das Gewebe Entfernen der Innervation Schicht liegt.
Insgesamt ist die Gewebepräparation ganz einfach, mit den Hautschichten auseinander Abziehen der technisch anspruchsvollsten praktischen Aspekt zu sein und dann nur bei älteren Mäusen. In diesen haften die Hautschichten an der Basis stark zusammen, wo die Dissektion beginnt, aber auch hier eine Trennung der Schichten wird viel einfacher gegenüber den Rändern. Zum Glück, oder vielleicht damit diese dünneren Randhautbereiche geben in der Regel die meisten zufrieden stellende Kennzeichnung, wie die vordere Haut tut im Allgemeinen. Deshalb, vor allem vermeiden, an den Rändern der sehr dünnen Haut zu erfassen. Um das Risiko von Schäden zu minimieren, zu manipulieren Vorbereitungen indirekt mit geschlossenen Zange drückt, anstatt Greifen direkt oder wenn wesentliche Griff nur härtere Gewebe kaum markiert werden. Seien Sie gründlich bei der Entfernung der 'Schicht- Polystyrol' Schicht sofort die Follikel liegt, da dies die Haupt michmechanische Behinderung Bildgebung und Drogen-Zugang. Allerdings ist es wichtig , physischen Kontakt mit den zugrunde liegenden Strukturen wie diese Schäden möglichst gering zu halten (dh Streifen weg) die neuronalen Netze und Endgeräte direkt unterhalb. Wenn die vorherrschende Fluoreszenz gelb / weiß in den Talgdrüsen ist, prominente Autofluoreszenz der Haarschaft Basen und einige Sicheln von orange / gelb lanceolate Endungen, deutet dies auf die Nervengeflechte Schicht und die damit verbundenen lanceolate Terminals während Clearance entfernt worden ist. Dies scheint das Hauptproblem bei älteren (> 30 g) Mäusen zu sein. Während der Färbeverfahren, sicherzustellen, alles bei 30 ° C ist und gut mit Sauerstoff angereichert. Beachten Sie, dass markierte Terminals noch am Leben sind. Folglich wird Farbstoff durch laufende spontane (konstitutiv) Exozytose-Freisetzung sezerniert werden. Dies wird bei R / T langsamer sein, aber es ist eine gute Praxis, die Verzögerung zwischen der Entfernung von Chelator-Lösung und Bildgebung zu minimieren, Farbstoffverlust zu minimieren. Außerdem wird für zwischen den Gruppen Vergleichs sTUDIEN der Intensität, ist es wesentlich, Abbilden aller Gruppen zu gewährleisten ist zeit abgestimmt. Verwendung eines Farbstoff-Chelatbildner vor der Bebilderung deutlich verbessert Bildkontrast. Während also relativ teuer ist, ist die Chelat-Schritt sehr wichtig für die Gewährleistung einer guten Bildqualität. Chelator Verwendung kann durch Wiederverwendung der Lösung mehrmals minimiert werden, und sogar auf 2 bis 3 aufeinanderfolgenden Tagen, gelagert bei 4 ° C zwischen den Anwendungen. Entsorgen Sie die Chelator-Lösung, sobald es merklich rosa geht, zeigt seine Farbstoff-Sequestrierung Sättigung nähert.
Während der Bilderzeugung beachten des Potenzials für phototoxische Schädigung dieser lebenden Terminals, die eine kumulative Ergebnis sowohl die Intensität und die Bestrahlungszeit des Anregungslichtes. Diese Überlegung ist weniger wichtig für einzelne Bilder Zeitpunkt, wo die Bildqualität das Hauptanliegen ist. Jedoch ist es während wiederholter Bildgebung in kinetische Studien entscheidend Anregungslichtexposition auf ein Minimum zu reduzieren. Während der Entwicklung dieser FarbstoffeLabel Synapsen, fanden wir Anregung für> 1 min bei voller Leistung Anregungsbeleuchtung wird dramatisch und irreparable Schäden an den Nervenenden führen. Sie erweitern zuerst anschließend enorm, dann kollabiert vollständig über einen Zeitraum von ca. 15 min. Wir prüften nicht systematisch die relativen Beiträge von Belichtungszeit und Intensität, aber diese Beobachtungen legen nahe, das Leitprinzip sowohl zu minimieren sollte. So empfiehlt es sich, Anregungslichtintensität und Dauer sind das Minimum angemessen mit guten Bildern bekommen, und geeignete Kontrollbilder werden in Zeitverlaufsstudien gemacht. Um zu testen, dass die Daten nicht von Phototoxizität bei wiederholter Bildgebungsbedingungen betroffen sind, zu jedem Zeitpunkt nehmen ein zusätzliches Bild eines zuvor ungesehenen Terminal. Dies ist das Verhalten der Markierung in naive Klemmen zu gewährleisten ähnelt in Follikel wiederholt abgebildet wird.
Eine Reihe von Faktoren können die innerhalb der Gruppe Variabilität der Nettointensität d reduzierenata. Genaue Platzierung der ROIs, insbesondere die Hintergrund ROI, ist wichtig, da sogar kleine Bereiche ungeeigneter Färbung stark zwischen Follikel-Datenvariabilität beeinflussen können. Die Variabilität der Nettointensität wird auch durch, wie vollständig jedes Haar beeinflusst Follikel durch die Palisade aus Endungen umgeben. Vergleichen Sie zum Beispiel die sichelförmige Verteilung Kennzeichnung in 1B mit dem nahezu vollständig kreisförmigen Muster in Abbildung 2 zu sehen ist . Komplexere Analyse, vielleicht mit automatisierten Software - Erkennung und Schwellwertbildung, sind notwendig , wenn der Grad der Einkreisung ein relevanter Parameter ist. Bitte beachten Sie, dass die Intensitätsverteilungen selbst für die genau analysiert Follikel Gruppen nicht normalverteilt sind (siehe Abbildung 3), was die Verwendung von nicht-parametrischer Statistiken für zwischen-Behandlung Vergleiche der Bevölkerung Mediane eher als Mittel. Normalisierungstechniken wie Intensitäten als Prozentsatz o exprimierendenf kontralaterale Kontrolle oder einer Kontrollgruppe aus mehreren Zubereitungen können Variabilität weiter zu reduzieren, angewandt werden. Die endgültige technische Artikel zu betrachten, ist die experimentelle Design für pharmakologische Tests. Während pharmakologische Untersuchungen vorge inkubieren die Herstellung der Arzneimittellösung 30 min vor dem Farbauftrag. Dann halten die Arzneimittelkonzentration in der Farbstofflösung. In der Kontrollgruppe, verwenden entweder Kochsalzlösung oder, wenn das Medikament in einem Fahrzeug, Kochsalzlösung und Träger gelöst wird.
Der vorliegende Beitrag zeigt, wie diese neue Ohrmuschel Vorbereitung qualitativ hochwertige Bilder von mechanosensorischen Digungen in der Haut mit minimaler Vorbereitung bietet. Wir zeigen auch, kann es die Pharmakologie von zwei kritische Aspekte der Vesikelrecycling zu untersuchen verwendet werden. Wir zeigen zunächst, dass ein Glutamat-Rezeptor-Agonist Farbstoff Internalisierung erhöhen kann (ein Marker der Endozytose) und zweitens, dass Farbstoff verloren wieder mit Latrotoxin (ein Stimulans der Exozytose). Die Bedeutung dieser preparatIon und Technik ist , dass es auf lebende Haut mechanosenory Terminals in situ für die Bildgebung Experimente Man erhält einzigartige Möglichkeiten für die optische Überwachung von Terminal - Funktion, Struktur und deren Beziehungen untereinander einen ausgezeichneten Zugang bietet. Zu diesem letzteren Zweck haben wir entwickelt es auch weiter für den Einsatz in kombinierten optischen / elektrophysiologische Untersuchungen (siehe Schwester JoVE Artikel für weitere Details).
Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Die Arbeit wurde von der britischen Medical Research Council Projektförderung G0601253 GSB und RWB und einem SULSA Bioskape Zuschuss an GSB finanziert
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PDMS - Sylgard 184 | Dow Corning | Flexible, inert, translucent solid silicone polymer. | |
| No. 3 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11231-20 | |
| Austerlitz Insect pins | Fine Science Tools | 26002-10 | Very fine pins to attach pinna preparation securely to the PDMS with minimal damage. |
| FM1-43/Synaptogreen C4 | Biotium/Cambridge Bioscience | BT70020 | Fluorescent membrane probe that reversibly partitions into the outer leaflet of cell membranes. Used predominantly for monitoring vesicle membrane endo-/exocytosis. |
| Advasep 7 | Biotium/Cambridge Bioscience | BT70029 | A sulfonated b-cyclodextrin derivative that chelates FM1-43 (& other styryl pyridinium dyes) out of the exposed membranes, leaving internalised dye to be seen more clearly by lowering the background labelling/fluorescence. |
| Retiga Exi Fast 1394 | Qimaging | Monochrome, cooled CCD camera - basic model | |
| Volocity 3D Image Analysis Software | Perkin Elmer | Volocity 6.3 | Image capture and analysis software. |
References
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