Abstract
En roman dissektion och inspelning teknik beskrivs för optisk övervakning-färgning och de-färgning av lansettlika terminaler omgivande hårsäckar i huden på musen pinna. Preparatet är enkel och relativt snabb, tillförlitligt ger omfattande regioner av flera märkta enheter av levande nervändar för att studera upptag och utsläpp av styrylfärgämnen pyridinium färgämnen i stor utsträckning används i studier av vesikler återvinning. Uppdelning förberedelserna innan märkning tillåter testet kontra kontrolljämförelser i samma öra från en enskild individ. Användbara tips ges för att förbättra kvaliteten av preparatet, märkning och bildparametrar. Det nya systemet är lämpligt för analys av farmakologiskt och mekaniskt inducerat upptag och frisättning av dessa viktiga färgämnen i lansettlika terminaler i både vildtyp och genetiskt modifierade djur. Exempel på modulerande påverkan på märkning intensitet ges.
Introduction
Mechanosensory nervändar är vanligtvis små, diffust fördelat och svårtillgängligt på plats, eftersom de vanligen begravda djupt i huden eller andra omgivande vävnader. Visualisera dem därför vanligtvis kräver sektioneringen följt av en långvarig immunomärkning / färgnings period, eller fördröjningen och kostnaden för att erhålla mus linjer med genetiskt uttryck av fluorescerande märkningar, såsom grön eller gul fluorescerande protein (GFP / YFP) 1. Här visar vi en bekväm vävnad och en snabb och enkel metod för att få tillgång till ett stort antal hårsäckar afferenter för studier, och hur de kan snabbt märkas för optisk övervakning av terminalfunktionen 2. Med lite övning kan hela tekniken från dissektion avbildning fyllas i så lite som två timmar.
De lansettlika terminalerna av sensoriska axoner innerverar hårsäckar hos däggdjur bildar palisades runt epitelet av håret-follikelstimulerande, med varjeterminal inklämt mellan gliaceller / Schwann cellprocesser 2-4. Syftet av terminalerna är att detektera mekanisk förflyttning av de hårstrån som de omger. De är en blandning av snabbt och långsamt anpassa ändelser, men de främst producerar korta skurar av aktivitet som svar på håret rörelse. Typiskt stoppar bränning mycket snabbt när rörelsen upphör, även i närvaro av en fortsatt förskjutning.
Denna murina pinna modell för att studera lansettlika terminaler genom optiska metoder har många fördelaktiga särdrag för att studera strukturen och funktionen av dessa avslutningar. Ytterörat är huvudsakligen två lager av hud apposed back-to-back, med endast en liten mängd av broskvävnad mellan. Huden är mycket tunn och lätt dissekeras på grund av minimala mängder av svagt vidhäftande bindväv i förhållande till andra delar av kroppen. De lätt separeras hudlagren därför ge god tillgång till hårsäckarna och terminaler. innervationär lättillgängligt och identifierbar. Hårsäckarna glesare fördelade än i andra hudområden, vilket underlättar avbildning av enskilda eller små grupper av folliklar. Det tunna underliggande dermala skiktet ger god tillgänglighet till färgämnen och farmakologiska läkemedel, så är idealisk för avbildning av fluorescensmikroskopi utan vidare bearbetning. Avbildning av märkta terminaler kan antingen vara levande terminaler eller om du använder en fastställbara dye analog, efter fixering och ytterligare histologisk bearbetning.
Vi har använt denna beredning för att visa att membran återvinning sker i lansettlika ändelser, framgår av upptag (endocytos) och släpp (exocytos) av en styryl pyridinium färgämne (FM1-43 N - (3-triethylammoniumpropyl) -4- (4- (dibutylamino) styryl) pyridinium dibromid). Färgämnet dock inte tycks avsevärt märka investerar Schwann cellprocesser 2. Vi visade också att denna färgupptagning / release, och därmed membran reCycling, är föremål för glutamaterg modulering genom ett atypiskt (fosfolipas D-kopplad) metabotropiska glutamatreceptorn. Resultaten av enkla stimulerings och analysprotokoll illustreras, och gemensamma potentiella problem analys lyfts också fram.
Protocol
Dessa metoder användes i forskningen redovisas i Banks, RW et al. 2 Möss humant avlivas genom halsdislokation. I Storbritannien, är detta ett juridiskt godkänd schema en metod som anges i Djur (vetenskapliga förfaranden) Act, 1986 och EU-direktivet 2010/63 / EU. Detta federal lagstiftning verkställs lokalt vid University of Aberdeen genom djurskydds och etikprövningsnämnd som har godkänt alla förfaranden.
1. Förbereda öron för märkning
- Bered en standard fysiologisk saltlösning, såsom Liley s (1956) 5 och mätta den med 90% O2 / 5% CO2 (carbogen). Liley s saltlösning är (mM): NaHCOs 3 (12), KCl (4), KH 2 PO 4 (1), NaCl (138,8), MgCl2 (1), CaCl2 (2) och glukos (11). OBS: Under resten av detta manuskript, "saltlösning" kommer att hänvisa till saltlösning som är helt mättad med karbogen. under dissection, uppdatera saltlösning omfattar förberedelse var 15 - 20 min.
- Humant avliva en vuxen mus utan att skada skallen. OBS: Vi har använt C57 / BL6J och MF1-möss men någon musstam kan användas. Den viktigaste aspekten är att inte använda stora vuxna (> 25 g). Märkning större möss är mindre tillförlitliga, ofta är begränsad till små och spridda grupper av folliklar.
- Ta bort de yttre öron (pinnae) nära basen med ~ 25 cm sax, strax ovanför den täta håret linjen, och dränka i saltlösning i en silikongummi-fodrade kultur / petriskål (50 mm är vanligen lämpligt).
- Placera den främre (konkava) sida pinna ner och stift marginalerna till silikon med jämna mellanrum med fina insekt stift (~ 6 - 8 per öra, ~ stift 0,2 mm diameter). Uppdatera saltlösning var 15 - 20 min, eller använd en konstant perfusion bad.
- Dra försiktigt bort den bakre huden från den främre huden genom dissektion, initialt åtkomst från den skurna basen av pinna överden tjocka centrala brosk och systematiskt arbeta mot de tunna, brosk fritt yttre marginaler.
- För att göra detta, håll mitten av den skurna kanten av den bakre huden med ett par ingen. 3 pincett. Sedan, med käftarna stängda, placera punkter i en annan uppsättning av ingen. 3 pincett i gapet mellan huden och den underliggande brosket.
- arbeta försiktigt punkterna för de slutna pincett från sida till sida i gapet, med hjälp av det minimum som krävs kraft, lossa försiktigt sammanväxningar medan skalar tillbaka den bakre huden att separera skikten.
- Med den bakre hud bort, lämna den främre huden på plats. Nåla den bakre hud, dermala sidan uppåt, bredvid den främre huden (som per 1,5, ovan).
- Nästa, noggrant och fullständigt avlägsna ytterörat brosk som inklämt mellan ytskikten från den främre huden genom samma dissektion teknik som i 1.6. Undvik att göra punktering hål med pincett.
- Då, feller båda Pinna hudpreparat försiktigt skal, mod och gnugga bort det tunna lagret av bindväv, som liknar expanderad polystyren skum, som täcker hårsäcken baser. OBS: Att få optimal clearing kan ta lite övning; otillräcklig borttagande av vävnad hindrar tillgång, både för färglösningen och för avbildning, medan skrapa alltför kraftigt bort de neurala nätverk som är vid basen av hårsäckarna.
- Uppdatera saltlösning.
2. Lanceolate Terminal Labeling
OBSERVERA: Följande protokoll är optimerad för styryl pyridinium färgämne. Andra, kemiskt liknande, styrylfärgämnen pyridinium färgämnen ska fungera, kanske efter vissa justeringar i koncentration och inkubationstid. Använd handskar och en laboratorierock vid hantering av färglösningar. Antingen köpa 10 mM stamfärgämneslösning direkt från tillverkaren eller förbereda lager genom att lösa färgämnet pulver i saltlösning utan glukos. Alikvot (10 ^ är vanligen lämpligt, men justera detta för stora scale experiment) och lagra fryst i upp till 6 månader vid -20 ° C eller ~ 1 år vid -80 ° C. Pulver lagrar minst 2 år. Undvik upprepad frysning / upptiningscykler av färgämneslösningar; detta denaturerar snabbt färgämnet. När tinas, förvara vid 4 ° C och använd inom en vecka.
- Förvärm ett vattenbad till 30 ° C, med en plattform ~ 3-5 mm under ytan av vattnet.
- Färskt förbereda 10 iM styryl pyridinium färglösning (10 pl av nyligen tinas 10 mM styryl pyridinium färgämne i 10 ml saltlösning) och jämvikt i vattenbad.
- Sprint varje beredning i en silikongummibeläggning 35 mm odlingsskålar nedsänkta i 1 - 2 mm av saltlösning (normal volym, ~ 2 ml). Varje ytterörat hudpreparat kommer att ge två produkter, om halve från apex att basera med en liten sax (10-15 cm längd), för att minimera användningen av djur.
- Placera 35 mm skålar innehållande saltlösning täckta Pinna preparat på den nedsänkta plattformen i 30 ° C vattenbad. Se till attvattendjup är tillräcklig för adekvat uppvärmning men inte förorena saltlösning i den öppna skålen.
- Pin fina (0,5-1 mm ytterdiameter) rör med strömmande O 2 / CO 2 i silikon basen av varje maträtt att kontinuerligt gas förberedelserna. Också placera i vattenbad 100 ml färgämnesfritt saltlösning för tvättning / skål uppfriskande. Använd en väl försluten-flaska för att upprätthålla carbogen mättnad och förhindra vattenförorening.
- Jämvikt allt vid 30 ° C under 30 minuter sedan ersätta saltlösning över Pinna preparat från 100 ml flaska med propp. Inkubera ytterligare 30 min. OBS: Denna ersättning kompenserar för saltlösning avdunstning och eventuella bulkvolymförluster till följd av gasledningen bubblande.
- Häll bort färgämnesfria saltlösning i en 100 ml avfallsbägare, sedan snabbt och försiktigt blot bort all vätska som finns kvar runt preparatet med läskpapper för att minimera utspädningseffekter på färgämneslösningen som skall tillsättas nästa. Var noga med att inte röra (
- Inkubera Pinna beredningar i 2 - 3 ml 10 nM styryl pyridinium färgämne för 40 minuter vid 30 ° C sedan återgå till R / T för resten av förfarandet.
- Avlägsna icke-interna färgämne i tre steg, med hjälp av lösningar på R / T. OBS: Dessa steg utförs bäst i (röd / orange lågintensiv belysning blackout persienner,) minimal omgivande ljus för att börja öga mörk anpassning för avbildning.
- Häll bort märkningen lösning från disken i en avfallsbägare och snabbt skölja i tre byten av dye-fri saltlösning i snabb följd. Detta tar bort rest styryl pyridinium färglösning som vidhäftar till förberedelserna och någon färg som lätt departitions från exponerade membran.
- Inkubera i en slutlig förändring av färg fri saltlösning under ytterligare 30 minuter att departition mest återstående färg från ytmembran, det vill säga inte färgämne internaliseras av terminalerna.
- Avlägsna ihållande färgämne fastnat to den yttre bipacksedel av exponerade membran genom kelatering med sulfonerad b-cyklodextrin-derivatet (ADVASEP-7, 1 mM, 5 min - se tabell 1). Således kommer all kvarvarande färgämnet vara inom vävnaderna.
- Placera i färskt färg fri saltlösning för avbildning och torka utsidan av skålen noga med silkespapper.
OBS: Terminalerna är nu redo för avbildning. Det är viktigt att vara medveten om att lansettlika ändarna är vid liv och därför långsamt släppa endocytos styryl pyridinium färg igen. Även om detta kommer att vara långsammare vid R / T, är det viktigt att minimera förseningar före / under avbildning. Om försöket kräver märkning av flera preparat, initialt hålla dem alla omärkt vid 30 ° C. De kommer att vara livskraftiga under flera timmar. Sedan märka sekventiellt i intervaller, genom märkning av andra preparat (steg 2,7 - 2.8.3) medan avbildning av första.
3. Imaging Labeled Lanceolate avslutningar.
OBS: Observatörenbör vara mörk anpassad för följande avbildningssteg. Den ökade synskärpa detta ger innebär lägre exciteringsljusnivåer krävs för att hitta hårsäckarna för avbildning. Detta är mycket viktigt för att minimera fototoxicitet snarare än att minska olägenheter i samband med fotoblekning. Fria radikaler som genereras av full intensitet belysning kan snabbt (inom 60 sek) döda levande nervändar (GS Bewick, S. Fadul och WJ Betz, opublicerade observationer).
- Innan avbildning, ta preparatet under dissektion stereo och försiktigt bort alla ytor skräp. Detta förhindrar auto-fluorescens förorenar bilderna.
- Montera skålen på scenen av en upprätt epifluorescensmikroskop med en standard fluorescein filteruppsättning (480-488 nm excitation, 500-520 nm emission för styryl pyridinium färg).
- Dämpa exciteringsljusintensitet med neutrala täthetsfilter tills precis tillräcklig för att bekvämt lokalisera terminalens.
- Lokalisera märkta folliklar genom att observera med låg (3.5x - 4x torr mål), sedan successivt högre (10x och 20x nedsänkning i vatten mål) förstorings mål.
- Ta bilder av märkta lansettlika terminaler genom 10x torr mål för låg effekt och 20x nedsänkning i vatten mål för högre förstoring. Minimera ljusintensiteten och exponeringstiden (en kameraintegrationstiden för 0,5-1 sek föreslås).
- Ta bilder på en vanlig digitalkamera och spara bilder på datorns hårddisk med hjälp av egenutvecklad mjukvara. OBS: Ett typiskt exempel visas i Figur 1.
- Image ~ 20 lansettlika ändelser från varje preparat. Börja på marginalen längst bort från klippkanten på basen av ytterörat hud och arbete längs denna marginal imaging varje follikelstimulerande i tur och ordning. Arbeta över i något överlappande fält parallellt med den skurna kanten, noga med att inte avbilda samma follikelstimulerande två gånger och alla som uppenbarligen är skadade. OBS!re är typiskt för många lansettlika terminalerna till bild dem alla innan betydande spontan de-färgning inträffar. Därför föreslår vi systematiskt provtagning befolkningen med hjälp av följande protokoll.
- Efter avslutad kantremsan, flytta en fältbredd mot basen av ytterörat, och upprepa processen i den omvända riktningen.
- Bild alla terminaler stött utom enstaka som tydligt orienterade mycket mer snett till det optiska planet och det är osannolikt att passa helt i standardringformiga analys ROI (se avsnitt 4). Utesluter inte ovanligt starkare eller svagare lanceolates jämfört med de omgivande terminaler, såvida de inte är uppenbart skadad eller bakgrundsintensiteten är särskilt hög, vilket indikerar lokal vävnadsskada.
- Kasta beredningen om mer än 10% av det hudområde / terminaler skadade / oanvändbara. OBS: Som lanceolates avfärgning med tiden, komplett avbildning varje preparat inom 20 minuter från slutet av tvätten.
- jagf använda mer än ett preparat, se intensitet jämförelser är giltig genom tids matcha preparat. För att göra detta, offset tidpunkterna för färgning varje preparat vid ~ 30 min, för att säkerställa jämförbarhet av de fläck gånger.
- Att övervaka de-fläck (exocytos), bild samma terminal på 5 eller 10 minuters intervall. Med lite övning är det möjligt att bilden upp till 3 separata terminaler vid varje tidpunkt i något preparat.
4. Analysera Labeled Lanceolate avslutningar.
Obs: Följande procedur är en snabb metod för att analysera terminal intensitet.
- Göra ett ringformat område av intresse (ROI) centrerad på spetsen av hårstrået vid basen av follikeln (Figur 2). Ställ den inre omkretsen av den ringformiga ROI tillräckligt stor för att undvika hårstrået auto-fluorescens i varje follikel som skall analyseras men fortfarande omfatta alla terminal fluorescens. Säkerställa att den yttre omkretsen är tillräckligt stor för att innesluta den största terminal som kan förekomma som är orienterad nära den optiska huvud / follikelstimulerande axel.
- Göra en bakgrund ROI approximativt lika i area till målet ringen (fyrkant eller en cirkel, typiskt ~ 400 | j, m 2) för att bestämma den lokala färgningsintensitet i närheten av terminalen enligt analysen.
Obs: Storleken på dessa två ROI sätts i början av analysen och används för att analysera alla efterföljande folliklar / lansettlika terminaler över alla förberedelser i något experiment. Så, är det viktigt att sätta sina parametrar med omsorg i början. - Placera bakgrunden ROI tillräckligt nära follikeln att representera lokala bakgrund i talgkörtlarna som ligger bakom terminalerna, inte lägre intensitet hud mellan folliklar, men vara noga med att inte inkludera några terminala regionerna.
- Anteckna medelvärdet intensiteten av de två ROI med hjälp av "åtgärd" eller "analysera ROI" funktion av programvaran och överföra data till ett kalkylblad.
- I tabell för varje enskild follikelstimulerande subtrahera den genomsnittliga lokala bakgrundsintensiteten från den i ringen för att ge en netto intensitet. Denna justering för lokaliserad bakgrund minskar kraftigt mellan-follikelstimulerande variabilitet.
Representative Results
Hårsäckarna i denna pinna beredning är lätta att se under genomlysning utan fluorescens (Figur 1A), som visar mycket tunn karaktär av preparatet och den relativa lättillgänglighet det ger dessa mechanosensory terminaler. Varje kännetecknas av framstående hårstrået bas piercing mörka halvmåne av talgkörtelaktiviteten. Under epifluorescence är de märkta lansettlika terminaler som omger varje hårsäck tydligt och visar typiskt robust spontana styryl färgupptagning (Figur 1B). Detta sker utan införde rörelse. De lansettlika terminaler ses att omsluta hårstrået, även om omfattningen av inringning är variabel 6. En stor del av märkningen är punktuell (fläckar) i stället för det linjära arrangemanget som kan förväntas. Den punktat mönster återspeglar terminaler observeras i ett optiskt plan längs längden av terminalen. Thiförberedelser fick ingen ytterligare behandling för visualisering efter märkning, det var helt enkelt överfördes till ett mikroskop skede och avbildas in situ, vilket återigen visar enkelheten i denna beredning.
Exempel experiment som detta nya preparat är lämpat visas i figur 3. Den kan användas för att studera både endocytos och exocytos i levande terminaler, liksom deras modulering. Således, för endocytos, kan glutamat receptoragonister öka märkning intensitet, och blockerar Ca2 + kanaler med ligander eller katjoner, såsom Mg 2+, Ni 2+ eller Cd 2+ minskar det två. Alternativt kan detta preparat också användas för att studera kinetiken för exocytos, såsom visas i fig 3C. För det första är en märkt terminal sett de-färgning spontant. Emellertid är denna avfärgning påskyndas av exocytos stimulerande, latrotoxin. mer desvansar av de experimentella resultaten kan ses i Banks, RW et al. 2.
Figur 1. Robust styryl Dye Märkning Inspelad i mus Pinna. (A) En del av en omärkt pinna beredning i ljusa fält belysning, visar hur tydligt hårsäckar visas i områden rensas av liggande areolar / fettvävnad. De mörka, vanligen bilobed, växande former är talgkörtlar som omger den centrala hårstrået. (B) En liknande område, på en något högre förstoring och avbildas med epifluorescence, visar lansettlika ändelser märkta med styryl färg. Skala barer -. 40 pm klicka god här för att se en större version av denna siffra.
"1"> 
Figur 2. Analys av styryl Dye Labeling Intensitet. (A) Karaktäristisk cirkulär mönster av hårsäcken märkning med styryl färg, centrerad på hårstrået (inte synliga i denna bild). (B) Den huvudsakliga analysen 'regionen av intresse "(ROI) definieras av en standard annulus lagras på positionen för den palissad av lansettlika nervändar omger follikeln. Denna ROI hålls konstant i form och område för en enskild experiment för att säkerställa märkning intensitet kan rättvist jämföras mellan preparat och i alla behandlingar. Nettointensiteten för varje ROI beräknas genom att subtrahera intensiteten hos en intilliggande fyrkantig eller cirkulär bakgrundsområdet (~ 400 | j, m 2). Återigen, detta fyrkantig bakgrund region hållas konstant i form och yta vid varje givet experiment.target = "_ blank"> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Märkning intensitet Hårsäckarna Afferent Lanceloate Endings är inte normalfördelad, och kan användas för att undersöka både endo- och exocytos. Typiska data från styryl färgintensitetsmätningar i spontant märkta lansettlika terminaler med hjälp av analysmetod som beskrivs ovan. (A) Märkning intensitet under kontrollbetingelser (54 folliklar, 4 öron) och 1 mM glutamat (42 folliklar, 4 öron). Intensitetsvärdena för enskilda ändelser visas som kluster punktdiagram. Varje punkt representerar intensiteten hos en terminal palissad runt en follikel. Observera att även under kontrollbetingelser några datapunkter (folliklar) är extremt intensiv, medan de flesta är grupperade vid lägre intensiteter. Den första punkten på en viss intensheten är avsatt i centrum och efterföljande punkter av samma intensitetsdata ritas alltmer i sidled på vardera sidan. Således, lateral spridning representerar frekvensen av folliklar av någon särskild märkning intensitet. De horisontella linjerna representerar median ± 25% kvartilavståndet. Inkubation med 1 mM glutamat ökar medianintensiteten med ~ 50% (*** P <0,001, Mann-Whitney), men märkning kan förbättras genom 200-300% i vissa terminaler. (B) Images visar glutamat-medierad förstärkt färgämnesupptagning (endocytos). Inkubation av hårfollikeln beredningen i glutamat (1 mM) markant ökar styryl färgupptagning, vilket framgår av den ökade märkningsintensitet. Skala bar 20 ^ m. (C) Enhancing färgämne frisättning (exocytos). Efter märkning är styryl färg spontant släppt igen, eftersom märkningen vid 0 min är klart ljusare än på 60 minuter, även efter bakgrundssubtraktion att kontrollera för fotoblekning. Den här versionen är mycket potentiated av latrotoxin, en svart änka gift beståndsdel, som utlöser okontrollerad vesikler exocytos. Efter 60 minuter i toxin, är terminal märkning nästan omöjlig att upptäcka. Denna reversibilitet styryl färg märkning stöder hypotesen att terminal fluorescens beror på internalisering under lokal återvinning av synaptiska liknande vesiklar. Skala bar 20 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Bewick och Betz utvecklades ursprungligen N- (3-triethylammoniumpropyl) -4- (4- (dibutylamino) styryl) pyridinium dibromid relaterade styryl pyridinium färgämnen 7-10 för att övervaka lokala återvinning av synaptiska vesikler membran. Dye upptag, och därmed ökad fluorescens, avspeglar således synaptiska vesikler membran interna (endocytos). Därefter detta intern färgämnet kan återutsättas genom ytterligare elektrisk aktivitet, som visar färgförlust övervakar vesikelmembranet externalisering (exocytos). I synapser, är detta ett mått på signalsubstans sekretion. Samtidigt fann vi även dessa färgämnen märka primära mechanosensory nervändar 7. På senare tid 11, Bewick, banker och kollegor visade sedan att detta återspeglar en liknande process i mogna, differentierade mechanosensory terminaler ex vivo. Här igen, färgämnen märka 50 nm i diameter "synaptiska liknande" vesiklar (SLVS) som återvinner konstitutivt att frigöra glutamat.I mechanosensory terminaler, till skillnad från sina synaptiska motsvarigheter, är denna återvinning främst spontana. Det är också moduleras genom mekanisk, snarare än att bara elektriska, stimulering.
För sensoriska neuroner i kultur och i cochlea hårceller, styrylfärgämnen i allmänhet och styryl pyridinium färgämne i synnerhet har visat sig passera genom mechanosensory kanaler, blockera mechanosensory kanaler och irreversibelt märkning interna membran 12. Men vid jämförbara styryl färgämneskoncentrationer i differentierade mechanosensory terminaler in situ, som här i lansettlika ändelser 2, eller i Ia ändar i muskelspolar 11, och hårceller som inte är mekaniskt stimuleras 13, 14, är märkning av membran endocytos. I mechanosensory nervändar, till exempel, är reversibel märkning och inte blockerar mechanosensory svar på de koncentrationer som används här två, 11, en5. Medan vissa färgämnesinterna genom kanalträngning i dessa ändelser inte helt kan uteslutas, den nästan totala avfärgning med latrotoxin indikerar den stora majoriteten av märkningen i mogna terminaler är av internalisering med återvinning vesikelmembranet. Vi har därför använt denna teknik för att studera aktiviteten beroende 11 och senast farmakologi 2 av SLV återvinning i mechanosensory afferenta terminaler genom att undersöka läkemedelseffekter på upptag och frisättning av färgämnena.
Som med de flesta praktiska tekniker kräver reproducerbarhet upprepning och praktik. Några av de viktigaste punkterna för att säkerställa tillförlitligheten kommer nu att diskuteras. Lansettlika märkning hos yngre djur är mer tillförlitlig - den minsta djur som vi har använt var 15 g kroppsvikt. Det är inte helt klart varför detta är fallet, men det kan bero på dissekering av den yngre bindväv kräver mindre mekanisk trauma och leaves mindre kvarvarande återstoden när du tar bort vävnaderna liggande innervation skiktet.
Totalt sett är det vävnadspreparat ganska enkel, med skalar hudlagren isär är den mest tekniskt utmanande praktisk aspekt och sedan bara hos äldre möss. I dessa hudlagren kraftigt vidhäfta tillsammans vid basen där dissektion börjar, men även här separation av skikten blir mycket lättare mot marginalerna. Tack och lov, eller kanske därför dessa tunnare marginella hudområden brukar ge den mest tillfredsställande märkning, som gör den främre huden i allmänhet. Därför, i synnerhet undvika att ta tag i mycket tunn hud på marginalerna. För att minimera risken för skador, manipulera preparat indirekt genom att trycka med slutna pincett snarare än gripa direkt, eller om detta är viktigt grepp bara hårdare vävnader osannolikt att märkas. Var noggrann i att ta bort "blad polystyren" lagret omedelbart överliggande hårsäckarna, eftersom detta är den viktigaste migmekanisk hinder för bildbehandling och drog tillgång. Emellertid är det viktigt att minimera fysisk kontakt med underliggande strukturer såsom detta skadar (dvs., skalar bort) de neurala nätverk och terminaler bara nedan. Om den dominerande fluorescens är gul / vit i talgkörtlarna, framträdande auto-fluorescens av hårstrået baser och några halvmånar av orange / gul lansettlika ändelser, indikerar detta nervplexus skiktet och tillhörande lansettlika terminaler har avlägsnats under avslut. Detta verkar vara det största problemet med äldre (> 30 g) möss. Under hela färgningsprocedurer, se till att allt är vid 30 ° C och väl syresatt. Var medveten om att märkta terminaler är fortfarande vid liv. Följaktligen kommer färgämne utsöndras av pågående spontan (konstitutiv) exocytisk release. Detta kommer att vara långsammare vid R / T, men det är bra att minimera fördröjningen mellan avlägsnandet av kelator lösning och bildbehandling, för att minimera färgförlust. Dessutom för mellan-grupper jämförande studies intensitet, är det viktigt att se till avbildning av alla grupper är tidsmatchade. Användning av en färg kelatbildare innan avbildning avsevärt förbättrar bildkontrasten. Så medan relativt dyra, är mycket viktigt för att säkerställa god bildkvalitet kelateringen steget. Kelator användning kan minimeras genom att återanvända lösningen flera gånger, och till och med på 2 - 3 dagar i följd, om den förvaras vid 4 ° C mellan användningarna. Släng kelator lösning när det går märkbart rosa, visar dess färgämnesbindning närmar mättnad.
Under avbildning, vara medveten om risken för fototoxisk skada på dessa levande terminaler, som är ett kumulativt resultat av både intensiteten och exponeringstiden för excitationsljuset. Denna synpunkt är mindre viktigt för enstaka tidpunkt bilder, där bildkvaliteten är det primära målet. Det är dock viktigt under upprepad avbildning i kinetiska studier för att minska excitation ljusexponering till ett minimum. Samtidigt utveckla dessa färgämnen tilletikett synapser, fann vi excitation för> 1 min vid full effekt exciteringsbelysning kommer att orsaka dramatiska och irreparabel skada på nervterminaler. De först därefter expandera enormt, sedan kollapsa helt över en period av ~ 15 min. Vi har inte systematiskt testa de relativa bidragen från exponeringstid och intensitet, men dessa observationer tyder på den vägledande principen bör vara att minimera båda. Så, är det rekommenderat att excitationsljus intensitet och varaktighet är den minsta i proportion med att få bra bilder, och lämpliga kontroll bilder tas i tidsförloppet studier. För att testa att uppgifterna inte påverkas av fototoxicitet under upprepade avbildningsbetingelser, vid varje tidpunkt ta en extra bild av en tidigare inte visats terminal. Detta är att se till att beteendet hos märkning naiva terminaler liknar den i hårsäckarna som avbildas flera gånger.
Ett antal faktorer kan reducera variabiliteten av nettointensiteten d inomgruppsata. Exakt placering av ROI, särskilt bakgrunden ROI, är viktigt, eftersom även små områden av olämplig färgning i hög grad kan påverka mellan-follikelstimulerande uppgifter variabilitet. Variationen i netto intensitet påverkas också av hur fullständigt varje hårsäck är omgivet av palissad av ändelser. Jämför exempelvis halvmåneformade distributions märkning i figur 1B med nästan helt cirkulärt mönster ses i figur 2. Mer komplex analys, kanske med hjälp av automatiserade program upptäckt och tröskel är nödvändiga om graden av inringning är en viktig parameter. Observera att intensitetsfördelningarna för även de mest noggrant analyserade follikelstimulerande grupper som inte normalt fördelade (se figur 3), vilket nödvändiggör användningen av icke-parametrisk statistik för mellan-behandling jämförelser av befolknings medianer snarare än medel. Normaliseringstekniker, såsom att uttrycka intensiteter i procent of kontralaterala kontroll, eller hos en kontrollgrupp består av flera preparat, kan tillämpas för att ytterligare minska variabilitet. Den slutliga tekniska objekt som ska beaktas är den experimentella designen för farmakologisk testning. Under farmakologiska undersökningar, pre-inkubera preparatet i läkemedelslösningen under 30 minuter före färg ansökan. Då, bibehålla läkemedelskoncentrationen i färgämneslösningen. I kontroller, använda antingen saltlösning eller, om läkemedlet är upplöst i ett fordon, saltlösning plus fordon.
Denna artikel visar hur denna nya pinna förberedelse erbjuder högkvalitativa bilder av mechanosensory ändelser kvalitet i huden med minimal förberedelse. Vi visar också att det kan användas för att undersöka farmakologin av två kritiska aspekter av vesikler återvinning. Vi visar först att en glutamatreceptoragonist kan öka färginterna (en markör för endocytos), och andra, är att färgämnet förlorade igen med latrotoxin (ett stimulerande av exocytos). Betydelsen av denna Förberedelsejon och teknik är att det erbjuder utmärkt tillgång till levande hud mechanosenory terminaler på plats för avbildning experiment ger unika möjligheter för optisk övervakning av terminal funktion, struktur och deras inbördes relationer. För detta senare ändamål har vi också utvecklat den vidare för användning i kombinerade optiska / elektrofysiologiska studier (se syster JUPITER artikeln för detaljer).
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Arbetet har finansierats av brittiska Medical Research Council projektbidrag G0601253 till GSB och RWB och en SULSA Bioskape bidrag till GSB
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PDMS - Sylgard 184 | Dow Corning | Flexible, inert, translucent solid silicone polymer. | |
| No. 3 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11231-20 | |
| Austerlitz Insect pins | Fine Science Tools | 26002-10 | Very fine pins to attach pinna preparation securely to the PDMS with minimal damage. |
| FM1-43/Synaptogreen C4 | Biotium/Cambridge Bioscience | BT70020 | Fluorescent membrane probe that reversibly partitions into the outer leaflet of cell membranes. Used predominantly for monitoring vesicle membrane endo-/exocytosis. |
| Advasep 7 | Biotium/Cambridge Bioscience | BT70029 | A sulfonated b-cyclodextrin derivative that chelates FM1-43 (& other styryl pyridinium dyes) out of the exposed membranes, leaving internalised dye to be seen more clearly by lowering the background labelling/fluorescence. |
| Retiga Exi Fast 1394 | Qimaging | Monochrome, cooled CCD camera - basic model | |
| Volocity 3D Image Analysis Software | Perkin Elmer | Volocity 6.3 | Image capture and analysis software. |
References
- Li, L., et al. The functional organization of cutaneous low-threshold mechanosensory neurons. Cell. 147 (7), 1615-1627 (2011).
- Banks, R. W., et al. Glutamatergic modulation of synaptic-like vesicle recycling in mechanosensory lanceolate nerve terminals of mammalian hair follicles. J. Physiol. 591 (10), 2523-2540 (2013).
- Andres, K. H. On the microstructure of receptors on sinus hair. Z. Zellforsch. Mikrosk. Anat. 75, 339-365 (1966).
- Shenton, F., Bewick, G. S., Banks, R. W. A study of the expression of small conductance calcium-activated potassium channels (SK1-3) in sensory endings of muscle spindles and lanceolate endings of hair follicles in the rat. PLoS One. 9, e107073 (2014).
- Liley, A. W. An investigation of spontaneous activity at the neuromuscular junction of the rat. J. Physiol. 132 (3), 650-666 (1956).
- Suzuki, M., Ebara, S., Koike, T., Tonomura, S., Kumamoto, K. How many hair follicles are innervated by one afferent axon? A confocal microscopic analysis of palisade endings in the auricular skin of thy1-YFP transgenic mouse. Proc. Jpn. Acad. Ser. B. Phys. Biol. Sci. 88 (10), 583-595 (2012).
- Betz, W. J., Mao, F., Bewick, G. S. Activity-dependent fluorescent staining and destaining of living vertebrate motor nerve terminals. J. Neurosci. 12 (2), 363-375 (1992).
- Betz, W. J., Bewick, G. S., Ridge, R. M. Intracellular movements of fluorescently labeled synaptic vesicles in frog motor nerve terminals during nerve stimulation. Neuron. 9 (5), 805-813 (1992).
- Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. Science. 255 (5041), 200-203 (1992).
- Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical monitoring of transmitter release and synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. J. Physiol. 460 (1), 287-309 (1993).
- Bewick, G. S., Reid, B., Richardson, C., Banks, R. W. Autogenic modulation of mechanoreceptor excitability by glutamate release from synaptic-like vesicles: evidence from the rat muscle spindle primary sensory ending. J. Physiol. 562 (2), 381-394 (2005).
- Drew, L., Wood, J. FM1-43 is a permeant blocker of mechanosensitive ion channels in sensory neurons and inhibits behavioural responses to mechanical stimuli. Molecular Pain. 3, (2007).
- Griesinger, C. B., Richards, C. D., Ashmore, J. F. FM1-43 reveals membrane recycling in adult inner hair cells of the mammalian cochlea. J. Neurosci. 22 (10), 3939-3952 (2002).
- Griesinger, C. B., Richards, C. D., Ashmore, J. F. Apical endocytosis in outer hair cells of the mammalian cochlea. Eur. J. Neurosci. 20 (1), 41-50 (2004).
- Watson, S., Aryiku, C., Banks, R. W., Bewick, G. S. Comparison of gadolinium and FM1-43 as blockers of stretch-evoked firing of rat muscle spindle afferents. Proc. Physiol. Soc. 21, P22 (2010).
