Abstract
Una nueva técnica de disección y grabación se describe para la tinción de control óptico y de-tinción de terminales lanceoladas que rodean los folículos pilosos en la piel del pabellón de la oreja del ratón. La preparación es simple y relativamente rápido, produciendo de forma fiable extensas regiones de múltiples unidades marcadas de terminales nerviosas vivas para estudiar la absorción y liberación de colorantes de piridinio estirilo se utilizan ampliamente en los estudios de reciclaje de vesículas. La subdivisión de las preparaciones antes de su etiquetado permite prueba vs. comparaciones de control en el mismo oído de un solo individuo. consejos útiles se dan para mejorar la calidad de la preparación, el etiquetado y los parámetros de imagen. Este nuevo sistema es adecuado para ensayar farmacológicamente y la absorción y liberación de estos colorantes vitales en terminales lanceoladas en tanto de tipo salvaje y los animales modificados genéticamente inducida mecánicamente. Se dan ejemplos de influencias moduladores sobre la intensidad de etiquetado.
Introduction
Terminaciones nerviosas mecanosensorial son típicamente pequeños, difusamente distribuida y de difícil acceso in situ, ya que suelen ser enterrados profundamente en la piel u otros tejidos circundantes. Visualizarlas, por lo tanto, por lo general requiere de seccionamiento seguido de un prolongado immunolabeling / período de tinción, o la demora y el costo de la obtención de líneas de ratones con la expresión genética de los marcadores fluorescentes como la proteína fluorescente verde o amarillo (GFP / YFP) 1. Aquí mostramos un tejido cómodo y un método rápido y sencillo para acceder a un gran número de fibras aferentes del folículo piloso para el estudio, y la forma en que se pueden etiquetar de forma rápida para la supervisión óptica de la función del terminal 2. Con la práctica, toda la técnica de disección para formación de imágenes se puede completar en tan sólo 2 horas.
Los terminales lanceoladas de los axones sensoriales que inervan los folículos del pelo en los mamíferos forman empalizadas de todo el epitelio del folículo piloso, con cadaterminal de intercalado entre células / Schwann glial procesa 2-4. El propósito de los terminales es para detectar el desplazamiento mecánico de los pelos que rodean. Son una mezcla de terminaciones de adaptación rápida y poco a poco, pero predominantemente producen pequeños momentos de actividad en respuesta al movimiento del cabello. Típicamente, el disparo se detiene muy rápidamente cuando el movimiento cesa, incluso en presencia de desplazamiento continuo.
Este modelo murino para el estudio de pinna terminales lanceoladas por métodos ópticos tiene muchas características ventajosas para el estudio de la estructura y función de estas terminaciones. El pabellón auricular es predominantemente dos capas de la piel yuxtapuestas espalda con espalda, con sólo una pequeña cantidad de tejido de cartílago entre. La piel es muy delgada y fácilmente diseccionado debido a cantidades mínimas de tejido conectivo débilmente adhesiva con relación a otras regiones del cuerpo. Las capas de la piel fácilmente separados, por lo tanto, dan un buen acceso a los folículos y terminales. La inervaciónes fácilmente accesible e identificable. Los folículos pilosos se distribuyen de manera más dispersa que en otras regiones de la piel, lo que facilita la obtención de imágenes de individuos o pequeños grupos de folículos. La delgada capa dérmica subyacente da una buena accesibilidad a los tintes y drogas farmacológicas, lo que es ideal para la formación de imágenes por microscopía de fluorescencia sin procesamiento adicional. La proyección de imagen de los terminales etiquetados puede ser o bien de los terminales que viven o, si se utiliza un análogo de tinte corregible, después de la fijación y posterior procesamiento histológico.
Hemos utilizado esta preparación de membrana para demostrar que el reciclaje se produce en las terminaciones lanceoladas, evidenciado por absorción (endocitosis) y liberación (exocitosis) de un colorante de estirilo piridinio (FM1-43; N - (3-triethylammoniumpropyl) -4- (4- (dibutilamino) estiril) piridinio dibromuro). El colorante no significa, sin embargo, parece que la etiqueta significativamente los procesos de la célula de Schwann invertir 2. También puso de manifiesto que esta absorción de colorante / liberación, y por lo tanto de membrana reCycling, está sujeto a la modulación glutamatérgica a través de una atípica (fosfolipasa D acoplados a) receptor de glutamato metabotrópico. Los resultados de los protocolos de estimulación y análisis simples se ilustran, y también se reseñan los problemas comunes de análisis posibles.
Protocol
Estos métodos fueron utilizados en la investigación publicada en Banks, RW et al. 2 Los ratones fueron sacrificados humanitariamente por dislocación cervical. En el Reino Unido, este es un método legalmente aprobado la Lista 1 que figuran en los Animales (Procedimientos Científicos), de 1986, y la Directiva Europea 2010/63 / UE. Esta legislación federal se aplica localmente en la Universidad de Aberdeen por el Bienestar Animal y Ética Junta de Revisión que han aprobado todos los procedimientos.
1. Las orejas se preparan para el etiquetado
- Preparar una solución salina fisiológica estándar, tal como de Liley (1956) 5 y saturar con 90% O2 / 5% de CO 2 (carbógeno). Solución salina de Liley es (mM): NaHCO 3 (12), KCl (4), KH 2 PO 4 (1), NaCl (138,8), MgCl 2 (1), CaCl 2 (2) y glucosa (11). NOTA: Durante todo el resto de este manuscrito, "solución salina" se referirá a la solución salina que está totalmente saturado de Carbógeno. durante dissection, actualizar la solución salina que cubre la preparación cada 15 - 20 min.
- Humanitariamente la eutanasia a un ratón adulto sin dañar el cráneo. NOTA: Hemos utilizado ratones C57 / BL6J y MF1 pero cualquier cepa de ratón puede ser utilizado. El aspecto más importante es no usar adultos de gran tamaño (> 25 g). Etiquetado en ratones más grandes es menos fiable, a menudo se limitan a grupos pequeños y dispersos de los folículos.
- Retire los oídos externos (pinnas) cerca de la base con unas tijeras ~ 25 cm, justo por encima de la línea del pelo denso, y sumergir en una solución salina en una silicona cultura / placa de Petri revestido de caucho (50 mm es generalmente conveniente).
- Coloque el lado anterior del pabellón auricular (cóncava) hacia abajo y fijar los márgenes a la silicona a intervalos regulares con alfileres finos de insectos (~ 6 - 8 por oído, alfileres ~ 0,2 mm de diámetro). Refrescar solución salina cada 15 - 20 minutos, o usar un baño constantemente perfundida.
- Con cuidado, retire la piel posterior de la piel anterior mediante disección roma, acceder inicialmente a partir de la base de corte del pabellón auricular duranteel cartílago central gruesa y sistemática de trabajo hacia los márgenes exteriores delgadas, libres de cartílago.
- Para ello, mantenga el centro del borde de corte de la piel posterior con un par de ninguna. 3 fórceps. Luego, con las mandíbulas cerradas, colocar los puntos de otro conjunto de ninguna. 3 fórceps en la brecha entre la piel y el cartílago subyacente.
- trabajar suavemente los puntos de las pinzas cerradas de lado a lado dentro de la separación, utilizando la fuerza mínima necesaria, afloje con cuidado adherencias, mientras que pelar la piel posterior para separar las capas.
- Con la piel posterior retira, dejar la piel en la posición anterior. Pin de la piel posterior, lado dérmico arriba, al lado de la piel anterior (según 1.5, más arriba).
- A continuación, retirar cuidadosamente y completamente el cartílago pabellón auricular que se intercala entre las capas de la piel de la piel anterior por la misma técnica de disección roma como en 1.6. Evitar hacer perforaciones con las pinzas.
- Entonces, fo las dos preparaciones de la piel del pabellón auricular con cuidado la cáscara, desplume y frotar lejos la capa delgada de tejido conectivo, que se asemeja espuma de poliestireno expandido, que cubre las bases del folículo piloso. NOTA: La obtención de compensación óptima puede tomar un poco de práctica; eliminación de tejido insuficiente obstruya el acceso, tanto para la solución de colorante y para formación de imágenes, mientras que el raspado demasiado vigorosamente elimina las redes neuronales que se encuentran en la base de los folículos.
- Actualizar la solución salina.
Etiquetado 2. Terminal Lanceolado
NOTA: El siguiente protocolo está optimizado para el tinte estirilo piridinio. Otros, colorantes de piridinio, estirilo químicamente similares deben trabajar, tal vez después de algunos ajustes en el tiempo de incubación y la concentración. Use guantes y una bata de laboratorio al manipular soluciones de colorante. O bien comprar mM solución de 10 stock de tinte directamente desde el fabricante o preparar de stock de disolver el colorante en polvo en solución salina sin glucosa. Alícuota (10 l suele ser conveniente, pero esto para ajustar gran scaLe experimentos) que se mantienen congelados durante un máximo de 6 meses a -20 ° C o ~ 1 año a -80 ° C. Polvo almacenará durante al menos 2 años. Evitar repetidos de congelación / descongelación de soluciones de tinte; este desnaturaliza rápidamente el tinte. Una vez descongelado, se almacena a 4 ° C y utilizar dentro de 1 semana.
- Pre-calentar un baño de agua a 30 ° C, con una plataforma de ~ 3-5 mm por debajo de la superficie del agua.
- Recién preparar la solución de tinte estirilo piridinio 10 M (10 l de recién descongelado tinte estirilo piridinio 10 mM en 10 ml de solución salina) y equilibrar en baño de agua.
- Pin cada preparación en una silicona-caucho forrado placas de 35 mm de cultivo sumergido en 1 - 2 mm de solución salina (volumen típico, ~ 2 ml). Cada preparación de la piel del pabellón auricular producirá dos preparaciones si se corta por la mitad desde el vértice a la base con unas tijeras pequeñas (10 - 15 cm de longitud), para reducir al mínimo el uso de animales.
- Colocar las cápsulas 35 mm que contienen las preparaciones salinas pabellón de la oreja cubierta de la plataforma sumergida en el baño de agua a 30 ° C. Asegurar lala profundidad del agua es suficiente para el calentamiento adecuado pero no contamine la solución salina en el recipiente abierto.
- Pin fina (0,5 - 1 mm de diámetro exterior) de tubos con un chorro de O2 / CO2 en la base de silicona de cada plato al gas de forma continua los preparativos. También colocar en el baño de agua 100 ml de solución salina libre de tinte para el lavado refrescante / plato. Utilice una botella tapada herméticamente para mantener la saturación Carbógeno y prevenir la contaminación del agua.
- Equilibrar todo a 30 ° C durante 30 minutos y luego reemplazar la solución salina durante los preparativos del pabellón auricular de los 100 ml con tapón de botella. Incubar 30 minutos más. NOTA: Este reemplazo compensa la evaporación de solución salina y las pérdidas de volumen mayor que resultan de burbujeo línea de gas.
- Que sequen solución salina libre de colorante en un vaso de precipitados de 100 ml de residuos, a continuación, de forma rápida y cuidadosamente seque el líquido sobrante alrededor de la preparación con papel de seda para minimizar los efectos de dilución en la solución de colorante que se añade a continuación. Tome el cuidado no tocar (
- Incubar preparaciones pabellón de la oreja en 2 - 3 ml de 10 mM de colorante estiril de piridinio durante 40 minutos a 30 ° C luego regresar a R / T para el resto del procedimiento.
- Eliminar tinte no internalizado en tres etapas, el uso de soluciones en R / T. NOTA: Estos pasos se realizan mejor en un mínimo de luz ambiente (persianas, iluminación de color rojo / naranja de baja intensidad) para comenzar ojo oscuro-adaptación para la imagen.
- Verter la solución de etiquetado de distancia de los platos en un vaso de residuos y enjuague rápido en tres cambios de solución salina libre de tinte en una sucesión rápida. Esto elimina el residuo estirilo piridinio solución de colorante se adhiere a los preparativos y cualquier tinte que departitions fácilmente de las membranas expuestas.
- Incubar en un cambio final de solución salina libre de colorante durante 30 min a departition tinte más restante de membranas de la superficie, es decir, no tinte internalizado por los terminales.
- Remover tinte persistente t atascadoo la hoja externa de las membranas expuestas por quelantes con el derivado sulfonado b-ciclodextrina (Advasep-7, 1 mM, 5 min - ver Tabla 1). Por lo tanto, todos colorante restante estará dentro de los tejidos.
- Colocar en solución salina libre de colorante fresco para formación de imágenes y secar el exterior de la placa de fondo con papel de seda.
NOTA: Los terminales están ahora listos para la imagen. Es importante ser consciente de que las terminaciones lanceoladas están vivos y, por lo tanto, liberando lentamente el colorante de piridinio estirilo endocitosis de nuevo. Aunque esto será más lenta a R / T, es importante para minimizar los retrasos antes / durante la exploración. Si el experimento requiere etiquetado de múltiples preparaciones, mantendrá inicialmente a todos ellos sin marcar a los 30 ° C. Ellos serán viables durante varias horas. A continuación, la etiqueta secuencialmente a intervalos, marcando el segundo preparado (pasos 2.7 - 2.8.3), mientras que imágenes de la primera.
3. Imaging Etiquetada Lanceolado Endings.
NOTA: El observadordeben ser adaptados a la oscuridad de las siguientes etapas de formación de imágenes. El aumento de la agudeza visual esto proporciona significa que se requieren menores niveles de luz de excitación para encontrar los folículos para la formación de imágenes. Esto es más importante para minimizar la fototoxicidad en lugar de reducir el inconveniente de photobleaching. Los radicales libres generados por la iluminación plena intensidad pueden rápidamente (dentro de 60 seg) matar a los terminales nerviosas (GS Bewick, S. Fadul y WJ Betz, observaciones no publicadas) que viven.
- Antes de imágenes, comprobar la preparación en un estereomicroscopio de disección y retirar con cuidado cualquier resto de la superficie. Esto evita auto-fluorescencia contaminar las imágenes.
- Montar el plato en el escenario de un microscopio de epifluorescencia vertical con un conjunto de filtro de fluoresceína estándar (480 - 488 nm de excitación, 500 - 520 nm de emisión para el tinte de piridinio estiril).
- Atenuar la intensidad de la luz de excitación con filtros de densidad neutra hasta justo suficiente para localizar el terminal cómodamentes.
- Localiza folículos marcados mediante la observación con baja (3.5 x - 4x objetivo seco), y luego progresivamente objetivos más alta (objetivo de inmersión 10x y 20x agua) de aumento.
- Capturar imágenes de los terminales etiquetados lanceoladas a través objetivo de 10x en seco de baja potencia y 20x objetivos de inmersión en agua para mayor aumento. Minimizar la intensidad y tiempo de exposición de luz (un tiempo de integración de la cámara de 0,5 - 1 segundo se sugiere).
- Capturar imágenes en una cámara digital estándar y guardar las imágenes en el disco duro de un ordenador utilizando el software propietario. NOTA: Un ejemplo típico se muestra en la Figura 1.
- Image ~ 20 terminaciones lanceoladas de cada preparación. Inicio en la parte más alejada del margen desde el borde de corte en la base de la piel del pabellón auricular y el trabajo a lo largo de este margen de imagen cada folículo a su vez. Trabajar a través de un poco por encima campos paralelos al borde de corte, teniendo cuidado de no imagen del mismo folículo dos veces y cualquiera que esté deteriorada. NOTA: Lare suelen ser demasiados terminales lanceoladas a la imagen a todos ellos antes de que ocurra espontánea significativa de-tinción. Por lo tanto, sugerimos que el muestreo sistemático de la población que utiliza el siguiente protocolo.
- Después de completar la tira marginal, mover un campo de anchura hacia la base de la oreja, y repetir el proceso en la dirección inversa.
- Imagen todos los terminales encontrados, salvo los ocasionales claramente orientados mucho más oblicuamente con respecto al plano óptico y es improbable que esté dentro de los análisis ROI anular estándar (ver sección 4). No excluya lanceolates inusualmente fuerte o más débil en comparación con los terminales de los alrededores, a menos que estén dañados o, evidentemente, la intensidad de fondo es particularmente alta, lo que indica daño tisular localizado.
- Desechar la preparación si más de 10% de la superficie de la piel / terminales están dañados / inutilizable. NOTA: Como lanceolates destain con el tiempo, la imagen completa cada preparación a menos de 20 minutos del final del lavado.
- yof usando más de una preparación, aseguran comparaciones de intensidad son válidos por las preparaciones de tiempo de coincidencia. Para ello, los tiempos de desplazamiento de la tinción de cada preparación por ~ 30 minutos, para asegurar la comparabilidad de los tiempos de-la mancha.
- Para supervisar de-la mancha (exocitosis), la imagen de la misma terminal en intervalos de 5 o 10 min. Con la práctica, es posible que la imagen hasta 3 terminales independientes en cada punto de tiempo en cualquier preparación.
4. Analizar Etiquetada Lanceolado Endings.
Nota: El siguiente procedimiento es un método rápido para el análisis de la intensidad de la terminal.
- Hacer una región anular de interés (ROI) centrado en la punta del eje del cabello en la base del folículo (Figura 2). Establecer la circunferencia interior de la ROI anular lo suficientemente grande para evitar el tallo del cabello auto-fluorescencia en cualquier folículo para ser analizada, pero todavía abarcar toda la fluorescencia terminal. Asegúrese de que la circunferencia exterior es lo suficientemente grande para encerrar el mayor terminal que es probable encontrar que está orientado cerca del eje principal óptico / folículo.
- Hacer un ROI fondo aproximadamente igual en área a la corona circular de destino (cuadrado o un círculo, típicamente ~ 400 micras 2) para determinar la intensidad de la tinción local en el entorno de la terminal bajo análisis.
Nota: Los tamaños de estas dos regiones de interés se fijan en el comienzo del análisis y se utilizan para analizar todos los folículos / terminales lanceoladas posteriores a través de todas las preparaciones en cualquier experimento. Por lo tanto, es importante establecer sus parámetros con cuidado al principio. - Coloque el retorno de la inversión de fondo lo suficientemente cerca del folículo para representar el fondo local en las glándulas sebáceas que subyacen a los terminales, no la piel de menor intensidad entre los folículos, pero tenga cuidado de no incluir ningún terminal regiones.
- Registrar la intensidad media de las dos regiones de interés utilizando la "medida" o "análisis de retorno de la inversión 'en función de los datos de software y transferencia a una hoja de cálculo.
- En la hoja de cálculo, para cada folículo del individuo restar la intensidad de fondo media local de que en el espacio anular para dar una intensidad neta. Este ajuste para el fondo localizada reduce en gran medida la variabilidad entre folículo.
Representative Results
Los folículos pilosos en esta preparación pabellón auricular se ven fácilmente con transiluminación sin fluorescencia (Figura 1A), que ilustra la naturaleza de oblea delgada de la preparación y la relativa facilidad de la accesibilidad que permite a estos terminales mechanosensory. Cada uno se caracteriza por la destacada base de tallo del pelo perforación de la media luna oscura de la glándula sebácea. Bajo epifluorescencia, los terminales lanceoladas marcados que rodean a cada folículo del pelo se hacen claramente visibles y muestran el típicamente robusto absorción de colorante estiril espontánea (Figura 1B). Esto ocurre sin circulación impuestas. Los terminales lanceoladas son vistas para rodear el eje del pelo, aunque el alcance de cerco es variable 6. Gran parte de la etiqueta es puntiforme (manchas) en lugar de la disposición lineal que se podría esperar. El patrón puntiforme refleja terminales se observaron en un plano óptico a lo largo de la longitud de la terminal. This preparación recibido ningún proceso adicional para la visualización después del marcaje, se transfiere simplemente a una platina del microscopio y la imagen in situ, que ilustra una vez más la simplicidad de esta preparación.
Ejemplo experimentos a que esta nueva preparación es adecuado se muestra en la Figura 3. Se puede usar para estudiar tanto la endocitosis y exocitosis en las terminales de vida, así como su modulación. Por lo tanto, para la endocitosis, agonistas de los receptores de glutamato pueden aumentar la intensidad de marcado, mientras que el bloqueo de canales de Ca2 + con ligandos o cationes tales como Mg2 +, Ni2 + o Cd2 + 2 disminuye. Alternativamente, esta preparación también se puede utilizar para estudiar la cinética de la exocitosis, como se muestra en la Figura 3C. En primer lugar, un terminal de marcado se ve de-tinción de forma espontánea. Sin embargo, este destain es acelerado por el estimulante exocitosis, latrotoxina. más decolas de los resultados experimentales se pueden ver en los bancos, RW et al. 2.
Figura 1. robusta estiril tinte de etiquetado Grabado en el ratón Pinna. (A) Parte de una preparación pabellón auricular sin marcar en la iluminación de campo claro, que muestra claramente cómo aparecen los folículos pilosos en las zonas despejadas de tejidos que recubre areolar / adiposas. Los bilobulado, por lo general, en forma de semicírculos oscuros son glándulas sebáceas que rodean el tallo del pelo central. (B) un área similar, con un aumento ligeramente más alto y fotografiado con epifluorescencia, mostrando terminaciones lanceoladas marcados con colorante estiril. - Las barras de escala. 40 micras Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Figura 2. Análisis de estiril tinte de etiquetado intensidad. (A) patrón circular típica de etiquetado folículo del pelo con el tinte de estirilo, centrada en el eje del pelo (no visible en esta imagen). (B) 'región de interés' El análisis principal (ROI) se define por un anillo estándar superpuesta a la posición de la empalizada de las terminaciones nerviosas lanceoladas que rodean el folículo. Este retorno de la inversión se mantiene constante en la forma y el área para cualquier solo experimento para asegurar intensidad de marcado puede compararse de manera justa entre las preparaciones y en todos los tratamientos. Intensidad neta de cada retorno de la inversión se calcula restando la intensidad de una región de fondo cuadrada o circular adyacente (~ 400 m 2). Una vez más, esta región fondo cuadrado se mantiene constante en la forma y el área a través de cualquier experimento dado.target = "_ blank"> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. La intensidad de Etiquetado del folículo del pelo aferente Lanceloate Endings no se distribuyen normalmente, y puede ser utilizado para examinar Tanto endo y exocitosis. Los datos típicos de mediciones de la intensidad del tinte estirilo en terminales lanceoladas etiquetados de forma espontánea utilizando el método de análisis descrito anteriormente. (A) Intensidad Etiquetado en condiciones de control (54 folículos, 4 orejas) y glutamato 1 mM (42 folículos, 4 orejas). Los valores de intensidad de terminaciones individuales se muestran como gráficos de puntos clúster. Cada punto representa la intensidad de una empalizada terminal de alrededor de un folículo. Tenga en cuenta que, incluso bajo condiciones de control de unos pocos puntos de datos (folículos) son extremadamente intenso, mientras que la mayoría se agrupan a menor intensidad. El primer punto a la intens particularesdad se representa en el centro y los puntos de datos subsiguientes de la misma intensidad se representan progresivamente más lateralmente a cada lado. Por lo tanto, la propagación lateral representa la frecuencia de los folículos de cualquier intensidad etiquetado particular. Las líneas horizontales representan rango intercuartil mediana ± 25%. La incubación con glutamato 1 mM aumenta la mediana de intensidad de ~ 50% (*** P <0,001, Mann-Whitney), pero el etiquetado puede ser mejorada por 200 a 300% en algunos terminales. (B) Las imágenes que demuestran la absorción mejorada de colorante mediada por glutamato (endocitosis). La incubación de la preparación del folículo del pelo en glutamato (1 mM) aumenta notablemente la absorción de colorante estirilo, como se muestra por el aumento de la intensidad de etiquetado. La barra de escala 20 micras. (C) mejorar la liberación de colorante (exocitosis). Después del marcaje, tinte estirilo se libera espontáneamente de nuevo, como el etiquetado a 0 min es claramente más brillante que a los 60 minutos, incluso después de la sustracción del fondo para el control de photobleaching. Este lanzamiento es en gran medida potentiated por latrotoxina, una viuda negro constituyente veneno de la araña, lo que desencadena la exocitosis de vesículas incontrolada. Después de 60 min en la toxina, el etiquetado terminal es casi indetectable. Esta reversibilidad de tinte de etiquetado estirilo apoya la hipótesis de que la fluorescencia terminal es debido a la internalización durante el reciclaje local de las vesículas sinápticas similares. La barra de escala 20 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
Bewick y Betz desarrolló originalmente la N- (3-triethylammoniumpropyl) -4- (4- (dibutilamino) estiril) relacionado dibromuro-piridinio colorantes estirilo piridinio 7-10 para supervisar local de reciclaje de membrana de la vesícula sináptica. la absorción de colorante, y por lo tanto el aumento de la fluorescencia, por lo tanto, refleja la internalización de la membrana de las vesículas sinápticas (endocitosis). Posteriormente, este colorante internalizado puede ser re-lanzado por una mayor actividad eléctrica, que muestra la pérdida de tinte supervisa externalización membrana de la vesícula (exocitosis). En la sinapsis, esto es un indicador de la secreción de neurotransmisores. Al mismo tiempo, también encontramos estos colorantes etiquetan terminaciones nerviosas primarias mechanosensory 7. 11 Más recientemente, Bewick, Banks y sus colegas mostraron entonces que esto refleja un proceso similar en terminales mechanosensory maduras y diferenciadas ex vivo. Una vez más, los tintes etiquetan 50 de diámetro vesículas sinápticas 'similar' nm (SLV) que reciclan de forma constitutiva de la liberación de glutamato.En terminales mechanosensory, a diferencia de sus homólogos sinápticas, este reciclaje es principalmente espontánea. También es modulada por mecánica, en lugar de simplemente eléctrica, la estimulación.
Para neuronas sensoriales en la cultura y en las células ciliadas cocleares, tintes de estirilo en tinte general y estirilo piridinio, en particular, se ha demostrado que pasar a través de los canales mechanosensory, el bloqueo de los canales mechanosensory e irreversiblemente el etiquetado de las membranas internas 12. Sin embargo, en concentraciones de colorante estiril comparables en terminales mechanosensory diferenciados en situ, como aquí en terminaciones lanceoladas 2, o en las terminaciones Ia en los husos musculares 11, y en células de pelo que no son estimuladas mecánicamente 13, 14, el etiquetado es por endocitosis membrana. En las terminales nerviosas mechanosensory, por ejemplo, el etiquetado es reversible y no bloquea las respuestas mechanosensory en las concentraciones utilizadas aquí 2, 11, 15. Si bien algunos internalización de tinte a la permeabilidad del canal en estas terminaciones no se puede descartar por completo, el destain casi total con latrotoxina indica la gran mayoría del etiquetado en los terminales maduros es por la internalización de la membrana reciclaje de vesículas. Tenemos, por lo tanto, se utiliza esta técnica para estudiar la dependencia de la actividad 11 y, más recientemente, la farmacología 2 de SLV reciclaje en los terminales aferentes mechanosensory mediante el examen de efectos del fármaco sobre la absorción y liberación de los colorantes.
Al igual que con la mayoría de las técnicas prácticas, reproducibilidad requiere repetición y la práctica. Algunos de los puntos clave para garantizar la fiabilidad se discutirá ahora. lanceoladas etiquetado en los animales más jóvenes es más fiable - el animal más pequeño que hemos usado fue 15 g de peso corporal. No está del todo claro por qué este es el caso, pero puede ser debido a la disección del tejido conectivo más joven requiere menos trauma mecánico y leaves menos residuo que queda cuando la eliminación de los tejidos que recubren la capa de inervación.
En general, la preparación del tejido es bastante simple, con peeling las capas de piel, aparte de ser el aspecto práctico más técnicamente difícil y sólo en los ratones más viejos. En estos, las capas de piel se adhieren fuertemente entre sí en la base donde se inicia la disección, pero incluso en este caso la separación de las capas se vuelve mucho más fácil hacia los márgenes. Afortunadamente, o tal vez en consecuencia, estas áreas de la piel marginales más delgadas suelen dar el etiquetado más satisfactoria, como lo hace la piel anterior generalmente. Por lo tanto, sobre todo evitar agarrar la piel muy delgada en los márgenes. Para reducir al mínimo el riesgo de daños, manipular preparados indirectamente, empujando con pinzas cerradas en vez de agarrar directamente, o si GRASP esencial tejidos más resistentes solamente con pocas probabilidades de ser etiquetados. Sea cuidadoso en la eliminación de la capa de 'hoja de poliestireno' que cubre inmediatamente los folículos, ya que es la principal meobstrucción mecá- de formación de imágenes y acceso a los medicamentos. Sin embargo, es esencial para minimizar el contacto físico con las estructuras subyacentes como esto daña (es decir, las tiras de distancia) las redes neuronales y terminales justo debajo. Si la fluorescencia predominante es el amarillo / blanco en las glándulas sebáceas, prominente autofluorescencia de las bases del tallo piloso y unos crecientes de las terminaciones lanceoladas de color naranja / amarillo, esto indica que la capa plexo nervioso y terminales lanceoladas asociados se han eliminado durante el despacho. Este parece ser el principal problema con el (> 30 g) los ratones más viejos. A lo largo de los procedimientos de tinción, asegurarse de que todo esté a 30 ° C y bien oxigenada. Tenga en cuenta que los terminales etiquetados todavía están vivos. En consecuencia, el tinte será secretada por la liberación espontánea exocytic en curso (constitutivo). Esto será más lento a R / T, pero es una buena práctica para reducir al mínimo el retraso entre la eliminación de la solución de agente quelante y de formación de imágenes, para minimizar la pérdida de tinte. Por otra parte, para entre-grupos comparativos sos estudios de intensidad, es esencial para asegurar la formación de imágenes de todos los grupos es el tiempo combinado. El uso de un agente colorante quelante antes de la imagen mejora en gran medida el contraste de imagen. Así, mientras que relativamente caro, la etapa de quelación es muy importante para garantizar una buena calidad de imagen. uso quelante puede ser minimizado mediante la reutilización de la solución varias veces, e incluso en 2 - 3 días consecutivos, si se almacena a 4 ° C entre usos. Desechar la solución quelante una vez que se va notablemente rosa, mostrando su secuestro de tinte se aproxima saturación.
Durante una imagen, tenga en cuenta el potencial de daño fototóxico a estos terminales que viven, que es el resultado acumulativo de la intensidad y el tiempo de exposición de la luz de excitación. Esta consideración es menos importante para las imágenes solo punto de tiempo, donde la calidad de imagen es la principal preocupación. Sin embargo, es crucial durante la exposición repetida en estudios de cinética para reducir la exposición a la luz de excitación a un mínimo. Durante el desarrollo de estos colorantes asinapsis de la etiqueta, que encontraron la excitación durante> 1 min a plena potencia luminosa de excitación provocará daños dramática e irreparable a los terminales nerviosas. Se primera posteriormente se expanden enormemente, a continuación, se colapsan por completo durante un periodo de ~ 15 min. No hemos probado de forma sistemática las contribuciones relativas de tiempo de exposición y la intensidad, pero estas observaciones sugieren el principio rector debe ser reducir al mínimo tanto. Por lo tanto, se recomienda que la intensidad de la luz de excitación y la duración son el mínimo proporcional a obtener buenas imágenes, y las imágenes apropiadas de control se toman en los estudios de tiempo-por supuesto. Para probar que los datos no se ven afectados por la fototoxicidad en condiciones de formación de imágenes repetidas, en cada punto de tiempo de tomar una imagen adicional de un terminal previamente no visto. Esto es para asegurar el comportamiento de la etiqueta en terminales ingenuos se asemeja a la de los folículos está formando la imagen de forma repetida.
Una serie de factores puede reducir la variabilidad dentro del grupo de la intensidad neta dATA. La colocación precisa de las regiones de interés, en particular la ROI fondo, es importante, ya que incluso pequeñas áreas de tinción apropiado pueden afectar en gran medida la variabilidad de datos entre-folículo. La variabilidad de la intensidad neta también se ve influida por la forma completamente cada folículo piloso está rodeado por la empalizada de terminaciones. Compárese, por ejemplo, la forma de media luna de distribución de etiquetado en la figura 1B con el patrón casi completamente circular visto en la Figura 2. Un análisis más complejo, tal vez mediante la detección de software automatizado y de umbral, son necesarios si el grado de cerco es un parámetro relevante. Tenga en cuenta que las distribuciones de intensidad, incluso para los grupos analizados con precisión la mayoría de los folículos no se distribuyen normalmente (ver Figura 3), haciendo necesario el uso de las estadísticas no paramétricas para las comparaciones entre los tratamientos de las medianas de población que en los medios. técnicas de normalización, tales como expresar intensidades como porcentaje of de control contralateral, o de un grupo de control formado por varias preparaciones, se puede aplicar para reducir aún más la variabilidad. El elemento técnico final a considerar es el diseño experimental para los ensayos farmacológicos. Durante las investigaciones farmacológicas, pre-incubar la preparación en solución de fármaco durante 30 min antes de la aplicación del tinte. A continuación, mantener la concentración de fármaco en la solución de colorante. En los controles, usar solución salina o, si el fármaco se disuelve en un vehículo, solución salina más vehículo.
El presente artículo muestra cómo esta nueva preparación pabellón auricular ofrece imágenes de alta calidad de las terminaciones mecanosensoriales en la piel con un mínimo de preparación. También mostramos que puede ser utilizado para examinar la farmacología de los dos aspectos críticos de reciclaje de vesículas. Se demuestra en primer lugar que un agonista del receptor de glutamato puede aumentar la internalización de colorante (un marcador de la endocitosis), y en segundo lugar, que el tinte se pierde de nuevo con latrotoxina (un estimulante de la exocitosis). La importancia de este preparationes y la técnica es que ofrece un excelente acceso a los terminales mechanosenory vivas de la piel sobre el terreno durante los experimentos de imagen, ofreciendo oportunidades únicas para la supervisión óptica de la función del terminal, la estructura y las relaciones entre ellos. Para este último fin, también hemos desarrollado aún más para su uso en estudios combinados ópticos / electrofisiológicos (véase el artículo de la hermana JoVe para más detalles).
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
El trabajo fue financiado por el Consejo de Investigación Médica del Reino Unido G0601253 subvención para el proyecto de GSB y RSF y una subvención sulsa Bioskape de GSB
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PDMS - Sylgard 184 | Dow Corning | Flexible, inert, translucent solid silicone polymer. | |
| No. 3 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11231-20 | |
| Austerlitz Insect pins | Fine Science Tools | 26002-10 | Very fine pins to attach pinna preparation securely to the PDMS with minimal damage. |
| FM1-43/Synaptogreen C4 | Biotium/Cambridge Bioscience | BT70020 | Fluorescent membrane probe that reversibly partitions into the outer leaflet of cell membranes. Used predominantly for monitoring vesicle membrane endo-/exocytosis. |
| Advasep 7 | Biotium/Cambridge Bioscience | BT70029 | A sulfonated b-cyclodextrin derivative that chelates FM1-43 (& other styryl pyridinium dyes) out of the exposed membranes, leaving internalised dye to be seen more clearly by lowering the background labelling/fluorescence. |
| Retiga Exi Fast 1394 | Qimaging | Monochrome, cooled CCD camera - basic model | |
| Volocity 3D Image Analysis Software | Perkin Elmer | Volocity 6.3 | Image capture and analysis software. |
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