Abstract
Aqui, demonstramos um método simples para a produção rápida de, monodispersas, microgotículas de E / S de tamanho controlável W usando um dispositivo de microfluidos centrífuga à base de capilar. microgotículas W / S foram recentemente utilizados em métodos eficientes que permitem miniaturizados experiências químicas. Por conseguinte, o desenvolvimento de um método versátil para produzir monodispersa W / O microgotículas é necessária. Desenvolvemos um método para gerar monodispersa microgotículas W / O com base em um dispositivo axissimétrico centrífuga à base de capilar co-corrente de microfluidos. Tivemos sucesso no controlo do tamanho das microgotículas ajustando o orifício capilar. O nosso método requer equipamento que é mais fácil de usar do que com outras técnicas de microfluidos, requer apenas um pequeno volume (0,1-1 pi) da solução de amostra para o encapsulamento, e permite a produção de centenas de milhares número de microgotículas W / O por segundo . Esperamos que este método ajudará estudos biológicos que requerem precioso s biológicaplos de conservação do volume de amostra, para uma rápida bioquímica análise quantitativa e estudos biológicos.
Introduction
W / O microgotículas 1-5 têm muitas aplicações importantes para o estudo da bioquímica e da tecnologia biológica, incluindo a síntese de proteínas 6, 7 cristalização de proteínas, emulsão de PCR 8,9, encapsulamento de células 10, e construção de sistemas semelhantes a células artificiais 5,6. Para produzir microgotículas W / O para estas aplicações, são importantes critérios de controlo de tamanho e monodispersibility das microgotículas W / O. Microcanais para fazer monodispersa, tamanho controlável W / O microgotículas 11 baseiam-se no método de co-corrente 12,13, método de focagem de fluxo de 14,15, e o método T-junção 16 em microcanais. Embora estes métodos produzem microgotículas / O w altamente monodispersas, o processo de microfabricação requer um tratamento complicado e técnicas especializadas para a preparação de microcanais, e requer também uma grande quantidade de solução de amostra (pelo menos, várias centenas81; l) por causa do volume morto inevitável nas bombas de seringa e tubos que conduzem a solução de exemplo para os microcanais. Assim, um método fácil de usar e de baixo volume morto para gerar monodisperso W / O microgotas é necessário.
Este papel, juntamente com vídeos de procedimentos experimentais, descreve um dispositivo de centrifugação com base em capilar axissimétrico co-fluir microfluidos 17 para a geração de tamanho de célula, monodispersa W / O microgotículas (Figura 1). Este método simples alcança monodispersity tamanho e controlabilidade tamanho. Ela exige apenas uma mesa mini-centrífuga e um dispositivo de co-fluindo axissimétrico baseada capilar microfluídico fixo em um microtubo de amostragem. Nosso método necessita apenas de um volume muito pequeno (0,1 ul), e não desperdiçar qualquer volume significativo da amostra.
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Protocol
1. Fabrico de um dispositivo micro-capilar baseada
- Configurar dos titulares
Nota: O desenho titular é apresentada na Figura 2A.- Recorte cada um dos quatro discos de os suportes (figura 2A (i) - (iv)) a partir de chapa de plástico poliacetal 2 mm de espessura utilizando uma máquina de moagem. Use as seguintes dimensões para cada um dos quatro discos do titular: (i) o disco 1 de diâmetro 8,5 milímetros, furo capilar (CH) de diâmetro 1,3 mm parafuso furo (SH) de diâmetro 1,8 mm; (Ii) o disco 2 de diâmetro 8,7 mm, diâmetro CH 2,0 mm, diâmetro SH 1,8 mm; (Iii) do disco 3 de diâmetro 8,7 mm, diâmetro CH 0,5 mm, diâmetro SH 1,8 mm; e (iv) do disco 4 9,1 milímetros de diâmetro, CH diâmetro 1,0 mm de diâmetro SH 1,8 milímetros.
- Monte os suportes usando M2 × 40 parafusos (Figura 2B). Uma parte inferior do suporte (Figura 2B) é constituído por um disco e o disco 2 na figura 2A (i), (ii) e uma parte superior (Figure 2B) do suporte consiste em o disco 3 e o disco 4 na Figura 2A (III), (IV).
- Para construir a parte inferior do suporte, insira o parafuso em cada três SH de cada disco 1 e 2. Encurtar os parafusos por beliscar fora de uma parte da porção de discussão. Manter o comprimento de parafuso em 0,9 cm (o mesmo comprimento que a parte inferior do suporte).
- Para construir a parte superior do suporte, inserir os parafusos para os dois SH de cada disco 3 e 4. Encurtar os parafusos beliscando fora de uma parte da porção de rosca. Manter o comprimento de parafuso com 0,7 cm (o mesmo comprimento que a parte superior do suporte).
- Para montar o suporte, se juntar as partes inferior e superior do suporte utilizando um parafuso comprido.
Nota: Mantenha o comprimento da cada parte do titular exata: a parte inferior é de 0,9 cm; a parte superior é de 0,7 cm (Figura 2B).
- Fabricação dos capilares de vidro
- Usar dois tipos de capilares de vidro com um capilar de vidro interior (diâmetro externo (OD) / diâmetro interno (ID): 1,0 / 0,6 mm) e um capilar de vidro exterior (OD / ID: 2,0 / 1,12 milímetros).
- Use um cortador de vidro para dividir o capilar de vidro exterior em três partes iguais, e depois usar o cortador de vidro para dividir o capilar de vidro interna em duas partes iguais.
- Afiar cada um dividido capilares de vidro interior e exterior, utilizando um extractor de capilar de vidro (Figura 3A). Defina o peso do extrator no máximo. Defina o nível de calor do extrator a 60 graus para o capilar de vidro exterior e 70 graus para o capilar interior. Cuidadosamente aguçar o capilar de vidro.
- Manter o comprimento da ponta no interior da parte de constrição do tubo capilar de vidro: o capilar interna é 1,5-1,8 cm; o capilar externa é 0,8-1,0 cm (Figura 3C). Se este comprimento é mais curto ou mais longo do que o comprimento descritos, por favor, ajustar o nível de calor do puxador.
- FIX os capilares de vidro interior ou exterior para o microforge suporte utilizando fita (Figura 3B).
- Cortar a ponta do capilar em vidro usando o microforge em três etapas (Figura 3B): (i) toque na ponta do capilar de vidro para as pérolas de vidro sobre um fio de platina, (ii) aquecer o fio de platina por pisar um pé alternar para 1-2 segundos, e (iii) após 1-2 seg, cortou a ponta do capilar em vidro pelo arrefecimento do fio de platina.
- Ajustar o diâmetro do interior (d i) e exterior (d o) orifícios capilares, respectivamente. O diâmetro do orifício do capilar de vidro interior é de 5, 10, e 20 um (d i = 5,10, 20 mm) e o exterior capilar de vidro (d o) é de 60 um (d o = 60 uM) nesta experiência.
Nota: O capilar de vidro, é descartável. Repetir a fabricação do vidro capilars.
- Ajustar o diâmetro do interior (d i) e exterior (d o) orifícios capilares, respectivamente. O diâmetro do orifício do capilar de vidro interior é de 5, 10, e 20 um (d i = 5,10, 20 mm) e o exterior capilar de vidro (d o) é de 60 um (d o = 60 uM) nesta experiência.
2. Procedimento para microgotas Geração W / S
- Preencher um capilar de vidro exterior com surfactante óleo contendo. A mistura de óleo e agente tensioactivo é hexadecano contendo 2% (w / w) monooleato de sorbitano nesta experiência (Figura 4A).
Nota: Não há muitas combinações de óleos e agentes tensioactivos (por exemplo, os óleos podem ser fluorado ou carbonatada; surfactantes pode ser iónico, não iónico, ou produto químico fluorado).- Introduzir 10 ml de hexadecano contendo mono-oleato de sorbitano em um capilar de vidro exterior. Na Figura 4A, o diâmetro do orifício do capilar de vidro exterior (d o) é de 60 um (d o = 60 uM). Para ajustar o orifício do capilar de vidro, voltar a passos 1.2.4-1.2.5.
- Definir o capilar exterior na parte inferior do suporte (Figura 4B).
- DraW cerca de 0,1 ul de uma solução aquosa para um capilar de vidro interior (Figura 4C), por acção capilar. Na Figura 4C, o diâmetro do orifício do capilar de vidro interno (d i) é de 10 um (d i = 10 uM). Para ajustar o orifício do capilar de vidro, de regresso aos passos 1.2.4-1.2.5.
- Jogo do capilar interno na parte superior do suporte (Figura 4D-a). Inserir o capilar interno para dentro do capilar exterior (Figura 4D-a). Olhando para o círculo branco de ponto, como na Figura 4D-um, observar a posição do capilar interno no interior do capilar exterior (diâmetro interno do tubo capilar externo (w) = 130 um) (Figura 4D-b, c) usando um microscópio digital . A posição do capilar interno no capilar exterior deve ser definido para W = 100-150? M.
Nota: Para alterar a posição do interiorcapilar capilar no exterior, por favor rode o parafuso na parte superior do suporte. Desse modo, a distância W pode ser controlada com precisão. - Introduzir 100 ul de hexadecano contendo mono-oleato de sorbitano (2% w / w) na parte inferior de um microtubo de 1.5 ml de amostra. Instalar o suporte, com os capilares interior e exterior, na amostra microtubo (Figura 4E-A). Certifique-se de verificar o capilar externa para mantê-lo longe da interface ar-óleo (Figura 4E-b).
- Centrífuga microtubo amostra usando uma mesa-out do tipo de balanço mini-centrifugar a uma gravidade de 1.600 xg por 1-2 seg para gerar microgotas (Figura 4F). Realizar todos os experimentos em temperatura ambiente.
Nota: Use a-out do tipo oscilante centrífuga. Uma gotícula pode colidir com uma parede lateral do microtubo amostra e se desintegram quando um ângulo de tipo fixo centrífuga é usado. - Lentamente elaborar a W / O gotículas com uma pipeta, e, em seguida, colocá-los em um s de vidrolide.
- Capturar imagens de microgotículas gerado usando um microscópio digital (ampliação, 200X).
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Representative Results
Neste estudo, são apresentados um método simples para a geração de microgotículas W / O de tamanho de células usando um dispositivo de microfluidos centrífuga à base de capilar (Figura 1). O dispositivo de microfluidos foi composto por um suporte de capilar (Figura 2B), dois capilares de vidro (capilares de vidro interior e exterior na Figura 3C), e um microtubo contendo um óleo incluindo surfactante. Nós injectado 0,1 mL de solução de amostra no capilar de vidro interior e colocado o tubo capilar de vidro interior para o capilar de vidro exterior (Figura 4D). Microgotículas W / O de tamanho de células foram gerados por planalto-Rayleigh instabilidade de um jacto de fluxo da solução de amostra 17 (Figura 1B) e mantiveram-se estáveis durante pelo menos 2 h 17.
Exemplos típicos dos diferentes tamanhos de W / microgotículas S gerada a partir da ba-capilarDispositivo de microfluidos centrífuga SED são mostrados na Figura 5. A Figura 5A-F mostra as imagens de microscopia digital e histogramas de distribuição de tamanho (n = 200) das microgotículas W / O. As microgotículas W / O foram gerados utilizando um capilar interno com um d i = 5 (A, B), 10 (C, D), ou 20 | iM (E, F) diâmetro do orifício, mantendo d e O constante W a 60 uM e 115 uM, respectivamente. As medições do tamanho das microgotículas de E / S W gerados foram adquiridos por análise da imagem de microscópio obtido. Para o d i = 5, 10, e 20 uM de orifícios, os diâmetros médios das microgotículas era 8,3 m (desvio padrão (DP) 0,9 um, o coeficiente de variação (CV) de 10,8%), 12,7 uM (SD 1,1 uM, CV 8,6%), e 17,9 uM (SD 1,4 uM, CV 7,8%), respectivamente. Estes resultados indicam que obtivemos êxito monodispersa microdrople S / Wts pelo método proposto. Além disso, os diâmetros em microgotículas W / O foram quase o mesmo que o orifício capilar interna (Figura 5G). Assim, o tamanho médio das microgotículas W / O podem facilmente ser ajustados sobre uma ampla gama, geralmente de 5 a 20 um, usando o micro-dispositivo.
Figura 1. Visão geral de co-fluindo dispositivo micro e formação de microgotículas W / O usando o dispositivo. (A) Ilustração axissimétrico baseada capilar centrífuga do centrífuga baseada capilar axissimétrico co-fluindo dispositivo micro e gerando processo W / O microgotas ( dentro do círculo), (B) W microgotículas / S gerada pelo planalto-Rayleigh instabilidade de um fluxo de jacto da solução aquosa 17, d é o diâmetro do orifício de i de capilar de vidro interior, d óé diâmetro do orifício do capilar de vidro interior, w é o diâmetro interno do capilar exterior, (C) Fotografia de dispositivo fabricado. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Configuração do suporte capilar (A) projeto do titular da capilar feita de plástico de poliacetal:. A unidade de diâmetros na titular é mm. (B) Fotografias do titular consistem em uma parte superior e uma parte inferior. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Diagrama de fluxo do dispositivo de microfluidos com a configuração e geração de microgotículas W / O. (A) Preparação do capilar exterior. Óleo com surfactantes introduzidos no capilar exterior, (B) capilar exterior definido para a parte inferior do suporte, (C) Preparação do capilar interno: solução aquosa de drAWN num capilar interior por capilaridade, capilar (D) interno definido dentro da parte superior do suporte (a). Verificando que o capilar interna era no capilar exterior usando um microscópio digital (b, c), (e) O titular com capilares internas e externas instaladas no tubo de ensaio (a). Verificando que o capilar exterior foi mantido longe da interface ar-óleo, (F) Finalmente, microtubo amostra foi centrifugada por uma mesa-out do tipo de balanço mini-centrífuga. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. A formação de microgotículas W / S-sized celulares monodispersas. Imagens microscópio digital e distribuição de tamanho de histogramas (n = 200) de microgotas gerados usando capilares de diversos diametros, d i = 5 (A, B), 10 (C, D), e 20 uM de (E, F), (G) A correlação entre o diâmetro do orifício do capilar de vidro e o diâmetro das microgotículas gerado W / O . As barras de erro mostram os desvios-padrão do diâmetro das microgotas W / S gerados. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Usando este dispositivo, o monodispersa W / O foram gerados por microgotículas planalto-Rayleigh instabilidade de um jacto de fluxo 17. O exame microscópico não revelou a presença de gotículas de satélite. Na fabricação do dispositivo, três passos críticos são essenciais para gerar sucesso microgotículas / O w monodispersas. Em primeiro lugar, a fornecer um fluxo linear de tensioactivo contendo óleo e uma solução aquosa, os furos capilares de quatro discos devem ser dispostas num padrão concêntrico. Em segundo lugar, o capilar interna foi cuidadosamente inserido no exterior capilar porque a ponta do capilar de quebra facilmente se entrar em contacto o suporte superior. Esta operação pode ser difícil, por isso recomendamos a utilização de uma lupa. Finalmente, a fim de tornar um jacto de fluxo da solução aquosa 17, a posição do capilar interno para dentro do capilar exterior deve ser definido para W = 100-150? M. Se a distribuição de tamanho das microgotículas W / S gerado pelo microfone centrífugarofluidic dispositivo não é monodispersa, verificar a posição do capilar interno no capilar exterior. Para alterar a posição do capilar interno no capilar exterior, por favor rode o parafuso na parte superior do suporte. Desse modo, a distância W pode ser controlada com precisão.
Para fazer microgotas / S W monodispersas, existem limitações atuais. Existe dificuldade em aumentar a taxa de centrífuga (se necessário), porque todas as experiências no estudo foram realizados a uma taxa máxima de centrífuga de mesa a centrífuga. Além disso, a geração de gotículas é difícil a partir de uma variedade de diferentes soluções de amostra, sendo a limitação dependente do desenho da centrífuga. Capilares múltiplos de cano como o capilar interno pode fornecer as microgotículas encapsuladas a partir de várias combinações de materiais e soluções 18.
O dispositivo micro tem duas principais vantagens em relação aos métodos convencionais de microcanais: i) eASY fabricação e robusta, e ii) o requisito de apenas um pequeno volume (0,1 ul) da solução de amostra. Em primeiro lugar, o fabrico do dispositivo axissimétrico centrífuga à base de capilar co-corrente de microfluidos é simples e robusto. Apenas capilares finos, um suporte de capilar, e um microtubo amostra são necessários. O tempo de fabrico é 5-10 min para o dispositivo. Fabricação do dispositivo leva menos tempo em comparação com a fabricação de outro dispositivo de microfluidos. Além disso, o suporte do capilar é robusto e pode ser reutilizado. Portanto, os únicos materiais de consumo estão os capilares de vidro e microtubo amostra no dispositivo, o que o torna menos dispendioso do que outros sistemas de microfluidos. Finalmente, uma vez que os fluxos de óleo e aquosas foram produzidos pela força centrífuga, não houve volume de desperdício. Para 2/1 seg, o dispositivo gera um grande número de microgotas.
Microgotículas são candidatos ideais para a realização de experimentos de alto rendimento que envolvem pequenas quantidades de amostra solution. Com este dispositivo, é teoricamente possível gerar centenas de milhares de microgotículas 10 mícrons de tamanho por segundo de 0,1 ul da solução da amostra. Assim, o dispositivo acomoda trabalhar com amostras biológicas preciosos, minimizando o volume de amostra necessário para a análise quantitativa rápida. Este dispositivo pode ser utilizado para analisar reacções bioquímicas 6-9 e reacções enzimáticas de células individuais 10.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-mm-thick polyacetal plastic plate | Tool | Nikkyo Technos, Co., Ltd. (Japan) | 244-6432-08 |
| Milling machine | Tool | Roland DG Co., Ltd. (Japan) | MDX-40A |
| End Mill RSE230-0.5*2.5 | Tool | NS Tool Co., Ltd. (Japan) | 01-00644-00501 |
| M2*40 screws | Tool | Jujo Synthetic Chemistry Labo. (Japan) | 0001-024 |
| Glass Capillry Puller | Tool | Narishige (Japan) | PC-10 |
| Microforge | Tool | Narishige (Japan) | MF-900 |
| Inner Glass Capillary | Tool | Narishige (Japan) | G-1 |
| Outer Glass Capillary | Tool | World Precision Instruments Inc. (USA) | 1B200-6 |
| 1.5 ml Sample tube | Tool | INA OPTIKA CO.,LTD (Japan) | ST-0150F |
| Hexadecane | Reagent | Wako Pure Chemical Industries Ltd. (Japan) | 080-03685 |
| Sorbitan monooleate (Span 80) | Reagent | Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. (Japan) | S0060 |
| Milli Q system | Reagent | Merck Millipore Corporation (Germany) | ZRQSVP030 |
| Swinging-out-type Mini-centrifuge | Tool | Hitech Co., Ltd. (Japan) | ATT101 |
| Digital Microscope | Tool | KEYENCE Corporation (Japan) | VHX-2001 |
References
- Song, H., Chen, D. L., Ismagilov, R. F.
- Huebner, A., et al.
- Taly, V., Kelly, B. T., Griffiths, A. D. Droplets as microreactors for highthroughput biology. ChemBioChem. 8 (3), 263-272 (2007).
- Teh, S. Y., Lin, R., Hung, L. H., Lee, A. P.
- Takinoue, M., Takeuchi, S. Droplet microfluidics for the study of artificial cells. Anal. Bioanal. Chem. 400 (6), 1705-1716 (2011).
- Hase, M., Yamada, A., Hamada, T., Baigl, D., Yoshikawa, K. Manipulation of cell-sized phospholipid-coated microdroplets and their use as biochemical microreactors. Langmuir. 23 (2), 348-352 (2007).
- Zheng, B., Tice, J. D., Roach, L. S., Ismagilov, R. F. A Droplet-Based, Composite PDMS/Glass Capillary Microfluidic System for Evaluating Protein Crystallization Conditions by Microbatch and Vapor-Diffusion Methods with On-Chip X-Ray Diffraction. Angew. Chem., Int. Ed. 43 (19), 2508-2511 (2004).
- Nakano, M., et al. Single-molecule PCR using water-in-oil emulsion. J. Biotechnol. 102 (2), 117-124 (2003).
- Diehl, F., et al. BEAMing: single-molecule PCR on microparticles in water-in-oil emulsions. Nat. Methods. 3, 551-559 (2006).
- He, M., et al. Selective encapsulation of single cells and subcellular organelles into picoliter- and femtoliter-volume droplets. Anal. Chem. 77 (6), 1539-1544 (2005).
- Baroud, C., Gallaire, F., Dangla, R.
- Utada, A. S., Nieves, A. F., Stone, H. A., Weitz, D. A. Dripping to jetting transitions in coflowing liquid streams. Phys. Rev. Lett. 99 (9), 094502 (2007).
- Cramer, C., Fischer, P., Windhab, E. J. Drop formation in a co-flowing ambient fluid. Chem. Eng. Sci. 59 (15), 3045-3058 (2004).
- Anna, S. L., Bontoux, N., Stone, H. A. Formation of dispersions using "flow-focusing" in microchannels. Appl. Phys. Lett. 82, 364-366 (2003).
- Takeuchi, S., Garstecki, P., Weibel, D. B., Whitesides, G. M. An axisymmetric flow-focusing microfluidic device. Adv. Mater. 17 (8), 1067-1072 (2005).
- Thorsen, T., Roberts, R. W., Arnold, F. H., Quake, S. R. Dynamic pattern formation in a vesicle-generating microfluidic device. Phys. Rev. Lett. 86 (18), 4163-4166 (2001).
- Yamashita, H., et al. Generation of monodisperse cell-sized microdroplets using a centrifuge-based axisymmetric co-flowing microfluidic device. J. Biosci. Biotech. 119 (4), 492-495 (2015).
- Maeda, K., Onoe, H., Takinoue, M., Takeuchi, S. Controlled synthesis of 3D multi-compartmental particles with centrifuge-based microdroplet formation from a multi-barrelled capillary. Adv. Mater. 24 (10), 1340-1346 (2012).
