Abstract
Здесь мы демонстрируем простой способ быстрого производства размера контролируемым, монодисперсных, W микрокапель / вывода с использованием капиллярной основе центробежной микрожидкостных устройств. микрокапли Вт / вывода были недавно использованы в мощных методов, которые позволяют миниатюрных химических опытов. Таким образом, разработка универсальный метод для получения монодисперсных Вт требуется / вывода микрокапель. Мы разработали способ генерации монодисперсных Вт микрокапель / вывода на основе капиллярного основе центробежной осесимметричного совместно течет микрожидкостных устройств. Нам удалось регулировать размер микрокапель путем регулировки капиллярную отверстие. Наш метод требует оборудования, которое легче в использовании, чем с другими микрофлюидальных методов, требует лишь небольшого объема (0,1-1 мкл) раствора образца для инкапсуляции и позволяет производить сотни тысяч числа W микрокапель / вывода в секунду , Мы ожидаем, что это метод поможет биологические исследования, которые требуют драгоценное биологическую Samples по сохранению объема образцов для быстрого количественного биохимического анализа и биологических исследований.
Introduction
В / М микрокапли 1-5 имеют много важных приложений для изучения биохимии и биотехнологии, в том числе белкового синтеза 6, 7 кристаллизации белков, эмульсии ПЦР 8,9, сотовый инкапсуляции 10 и строительство искусственных клеток-подобных системах 5,6. Чтобы произвести микрокапель Вт / вывода для этих приложений, важные критерии контроль размера и monodispersibility микрокапель Вт / вывода. Микрожидком устройства для изготовления монодисперсных, размер контролируемым Вт / вывода микрокапель 11 основаны на взаимодействии текучий методом 12,13, 14,15 методом проточной фокусировки и способ Т-перехода 16 в микроканалов. Хотя эти методы дают весьма монодисперсных W микрокапель / вывода, процесс микротехнологий требует сложной обработки и специализированные методики для подготовки микроканалов, а также требует большого количества раствора образца (по крайней мере, несколько сотен81; л) из-за неизбежного мертвого объема в шприцевые насосы и трубы, которые проводят растворе образца, микроканалов. Таким образом, метод прост в использовании и низким мертвым объемом для генерации монодисперсных Вт необходим / вывода микрокапли.
Эта статья, вместе с видео, экспериментальных процедур, описывает центробежный капиллярную основе осесимметричной сотрудничества сыпучих микрожидкостных устройство 17 для генерации клеток размера, монодисперсное без микрокапель (рисунок 1). Этот простой метод достигает размера монодисперсность и размер управляемость. Она требует только настольный мини-центрифуги и капиллярную основе осесимметричной сотрудничества сыпучих микрожидкостных устройств фиксированной в микропробирок выборки. Наш метод нуждается лишь очень небольшой объем (0,1 мкл), и не тратить значительный объем образца.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Изготовление капилляра основе микрожидкостных устройств
- Настройка держателей
Примечание: Конструкция держателя представлен на фиг.2A.- Вырез каждого из четырех дисков держателей (фиг.2А (I) - (IV)) из 2-мм толщиной полиацетальной пластиковой пластине с помощью фрезерного станка. Используйте следующие размеры для каждого из четырех дисков в держателе: (I) диск диаметром 1 8,5 мм, капиллярная отверстие (СН) диаметр 1,3 мм, отверстие под винт (SH) диаметр 1,8 мм; (Б) диск 2 Диаметр 8,7 мм, диаметр СН 2,0 мм, диаметр 1,8 мм SH; (III) диск 3 диаметром 8,7 мм, диаметр СН 0,5 мм, диаметр 1,8 мм SH; и (IV) диск 4 Диаметр 9,1 мм, СН диаметр 1,0 мм, диаметр 1,8 мм SH.
- Соберите держатели используя M2 × 40 винты (рис 2б). Дно часть держателя (рис 2В) состоит из диска 1 и диска 2 на фиг.2А (I), (II) и верхнюю часть (рисЮр 2B) держателя состоит из диска 3 и диском 4 в рисунке 2А (III), (IV).
- Для построения нижнюю часть держателя, вставьте винт в три SH каждого диска 1 и 2. Сократить винты по колючий от кусок части резьбы. Хранить длину винта на 0,9 см (той же длины, как в нижней части держателя).
- Для построения верхнюю часть держателя, вставьте винты в двух SH каждого диска 3 и 4. Сократить винты по колючий от кусок части резьбы. Хранить длину винта на 0,7 см (той же длины, как в верхней части держателя).
- Чтобы собрать держатель, присоединиться к дну и верхние части держателя, используя длинный винт.
Примечание: Держите длину каждой части держателя точным: нижняя часть составляет 0,9 см; верхняя часть составляет 0,7 см (рис 2b).
- Изготовление стеклянных капилляров
- Используйте два типа стеклянных капилляров: внутреннее стекло капиллярные (Наружный диаметр (OD) / Внутренний диаметр (ID): 1,0 / 0,6 мм) и внешний стеклянный капилляр (OD / ID: 2.0 / 1.12 мм).
- Используйте стеклорез разделить внешнюю стеклянный капилляр на три равные части, а затем использовать стеклорез разделить внутреннюю стеклянный капилляр на две равные части.
- Четкость каждый из которых разделен внутренние и внешние капилляры стекла с использованием стеклянного капиллярного съемник (рис 3а). Установите вес съемника при макс. Установите уровень тепла съемник под углом 60 градусов для внешней стеклянного капилляра и 70 градусов для внутренней капилляра. Осторожно заточить стеклянный капилляр.
- Хранить длине наконечника в суженной части стеклянного капилляра: внутренний капилляр 1,5-1,8 см; внешний капилляр 0,8-1,0 см (рис 3C). Если эта длина короче или длиннее, чем описанная длина, пожалуйста регулировать уровень тепла съемник.
- FIX внутренней или наружной стеклянные капилляры к microforge стоять с помощью липкой ленты (рис 3B).
- Отрежьте верхушку стеклянного капилляра с помощью microforge в три этапа (рис 3В): (я) прикоснуться кончиком стеклянного капилляра к стеклянным бисером на платиновой проволоки, (II) нагреть платиновую проволоку наступив на ногу переключиться на 1-2 сек, и (III) через 1-2 сек, отрезать кончик стеклянный капилляр путем охлаждения платиновой проволоки.
- Регулировка диаметры внутренней (D I) и внешней (г о) капиллярных отверстий, соответственно. Диаметр отверстия внутреннего стеклянного капилляра составляет 5, 10, и 20 мкм (d = я 5,10, 20 мкм) и внешний стеклянный капилляр (д о) 60 мкм (d о = 60 мкм) в этом эксперименте.
Примечание: стеклянный капилляр является одноразовым. Повторите изготовление стеклянной капиллярх гг.
- Регулировка диаметры внутренней (D I) и внешней (г о) капиллярных отверстий, соответственно. Диаметр отверстия внутреннего стеклянного капилляра составляет 5, 10, и 20 мкм (d = я 5,10, 20 мкм) и внешний стеклянный капилляр (д о) 60 мкм (d о = 60 мкм) в этом эксперименте.
2. Порядок микрокапель генерирующая W / O
- Заполните внешнюю стеклянный капилляр с нефтесодержащих ПАВ. Смесь масла и поверхностно-активного вещества является гексадекан, содержащим 2% (вес / вес) сорбита в этом эксперименте (фиг.4А).
Примечание: Есть много комбинаций масел и поверхностно-активных веществ (например, масла могут быть фторированной или газированной; поверхностно-активные вещества могут быть ионными, неионные, или фторсодержащей).- Представьте 10 мкл гексадекана содержащий моноолеат в наружную стеклянного капилляра. В фиг.4А, диаметр отверстия наружного стеклянного капилляра (д O) составляет 60 мкм (d о = 60 мкм). Чтобы отрегулировать отверстие стеклянной капиллярной, вернуться к шагам 1.2.4-1.2.5.
- Установите наружную капилляр в нижней части держателя (рис 4В).
- Драж около 0,1 мкл водного раствора во внутреннюю стеклянного капилляра (рис 4C) под действием капиллярных сил. В фиг.4С, диаметр отверстия внутреннего стеклянного капилляра (д I) составляет 10 мкм (д I = 10 мкм). Чтобы отрегулировать отверстие в стеклянный капилляр, вернуться к шагам 1.2.4-1.2.5.
- Установите внутреннюю капилляр в верхней части держателя (рис 4D-а). Вставьте внутреннюю капилляр в космическом капилляра (рис 4D-а). Глядя на белую точку круга как на фиг.4D-а, наблюдать положение внутренней капилляра внутри наружной капилляра (внутренний диаметр наружного капилляра (ш) = 130 мкм) (рис 4D-B, C) с использованием цифровой микроскоп , Положение внутренней капилляра во внешнем капилляра должен быть установлен в ш = 100-150 мкм.
Примечание: Чтобы изменить положение внутреннийкапиллярная во внешнем капилляра, пожалуйста повернуть винт в верхней части держателя. Таким образом, расстояние ш можно контролировать точно. - Представьте 100 мкл гексадекана содержащий моноолеат (2% вес / вес) в нижней части 1,5 мл образца микропробирок. Установите держатель, с внутренней и наружной капилляров, в образце микропробирок (рис 4E-а). Обязательно проверьте внешний капилляр, чтобы держать его подальше от границы раздела воздух-масла (рис 4E-б).
- Центрифуга образец микропробирки с помощью мини-центрифуги настольные качается отъезда типа на тяжести 1600 мкг в течение 1-2 сек, чтобы сгенерировать микрокапель (рис 4F). Выполнить все эксперименты при комнатной температуре.
Примечание: Используйте качается отъезда типа центрифуги. Каплю может столкнуться с боковой стенкой образца микропробирок и распадаются, когда используется с фиксированным углом типа центрифуги. - Медленно составить W / O капельки пипеткой, а затем, положить их на стеклянную сLiDE.
- Захват изображения микрокапель генерируется с использованием цифровой микроскоп (увеличение, 200X).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В этом исследовании мы представляем простой метод для генерации клеток размера микрокапель Вт / вывода с помощью капиллярной основе центробежной микрожидкостных устройств (рисунок 1). Микрожидкостных Устройство состоит из держателя капиллярной (Фигура 2В), две стеклянные капилляры (внутренний и внешний стеклянные капилляры в фиг.3С), и микропробирки, содержащей масло, включая ПАВ. Мы вводили 0,1 мкл раствора образца во внутреннюю стеклянного капилляра и помещают внутреннюю стеклянный капилляр во внешнюю стеклянного капилляра (рис 4D). Микрокапли Сотовые размера W / O были сгенерированы Плато-Рэлея неустойчивости струйного потока пробы раствора 17 (Фиг.1В) и были стабильны в течение, по меньшей мере 2 ч 17.
Типичные примеры различных размеров W / O микрокапли генерируется из капиллярной-баСЭД центробежный Микрожидкостных устройство показаны на рис 5. 5А-F показывает цифровые изображения микроскопии и распределение по размерам гистограммы (п = 200) от микрокапель Вт / вывода. Микрокапель W / O были получены с использованием внутренний капилляр с D я = 5 (А, В), 10 (С, D), или 20 мкм (E, F) диаметр отверстия, сохраняя Н е и ж постоянной при 60 мкм и 115 мкм соответственно. Измерения размера генерируемых микрокапель W / O были приобретены анализа микроскопа изображения, полученного. Для D I = 5, 10, и 20 мкм отверстий, средние диаметры микрокапель составили 8,3 мкм (стандартное отклонение (SD) 0,9 мкм, коэффициент вариации (КВ) 10,8%), 12,7 мкм (SD 1,1 мкм, CV 8,6%), и 17,9 мкм (SD 1,4 мкм, CV 7,8%), соответственно. Эти результаты указывают на то, что мы успешно получили монодисперсное W / O microdropleTS с помощью предложенного метода. Кроме того, диаметры микрокапель Вт / вывода были почти такими же, как внутренний капиллярного отверстия (рис 5G). Таким образом, средний размер микрокапель Вт / вывода может быть легко настроена в широком диапазоне, как правило, от 5 до 20 мкм, с помощью микро устройства.
Рисунок 1. Обзор центробежной капиллярной основе осесимметричного совместно течет микрожидкостных устройств и образование микрокапель W / O с помощью устройства. (A) Иллюстрация центробежная капиллярной основе осесимметричных совместно течет микрожидкостных устройств и генерирующего процесс W / O микрокапель ( в пределах круга), (Б) W микрокапель / вывода, генерируемых Плато-Рэлея неустойчивости струйного потока водного раствора 17, д я это диаметр отверстия внутреннего стеклянного капилляра, д оэто диаметр отверстия внутреннего стеклянного капилляра, ш внутренний диаметр наружной капилляра, (С) Фотография изготовленной устройства. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуре.
Рисунок 2. Настройка держателя капиллярной (А) Конструкция держателя капиллярной из полиацетальной пластика:. Блок диаметров в держателе является мм. (B) Фотографии держателя состоят из верхней части и нижней части. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуре.
Рисунок 4. Блок-схема из микрожидкостных устройств настройки и генерации микрокапель W / O. (А) Получение внешней капилляра. Нефть с поверхностно-активными веществами, вводимых в космическом капилляра, (B) Внешний капиллярной установлен в нижней части держателя, (с) Получение внутренней капилляра: др Водный растворость во внутренний капилляр под действием капиллярных сил, (D) Внутренний капилляр установлен в верхней части держателя (а). Проверка, что внутренний капиллярный был во внешнем капилляра с помощью цифровой микроскоп (B, C), (Е) держатель с внутренним и наружным капилляров, установленных в пробирку (а). Проверка, что внешний капилляр держать подальше от границы раздела воздух-масла, (F) И наконец, образец микропробирки центрифугировали по мини-центрифуге настольный качается отъезда типа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуре.
Рисунок 5. Формирование монодисперсных микрокапель клеточных размера W / O. Цифровых изображений микроскоп и распределение по размерам гистограммы (п = 200) генерируемых микрокапель с использованием капилляров различных диамметров, д я = 5 (A, B), 10 (С, D), и 20 мкм (E, F), (G) Соотношение между диаметром отверстия в стеклянного капилляра и диаметром микрокапель генерируется W / O , Столбики ошибок показывают стандартные отклонения диаметра генерируемых микрокапель Вт / вывода. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуре.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Используя это устройство, монодисперсных без микрокапель были сгенерированы Плато-Рэлея неустойчивости струи потока 17. Микроскопическое исследование не выявило наличие капель-спутников. При изготовлении устройства, три важные шаги необходимы, чтобы успешно генерировать монодисперсных W микрокапель / вывода. Во-первых, чтобы поставлять прямую поток нефти, содержащей поверхностно-активное вещество и водного раствора, капиллярные отверстия четырех дисков должны быть расположены в концентрической рисунком. Во-вторых, внутренний капилляр тщательно вставлены в наружную капилляра потому что кончик капилляра легко ломается, если он контактирует с верхним держателем. Эта операция может быть трудно, поэтому мы рекомендуем с помощью увеличительного стекла. Наконец, для того, чтобы сделать струйной-поток водного раствора 17, положение внутренней капилляра в наружную капилляра должен быть установлен в ш = 100-150 мкм. Если распределение размера микрокапель Вт / вывода генерируется за счет центробежной микрофономrofluidic устройство не монодисперсных, проверьте положение внутренней капилляра во внешнем капилляра. Чтобы изменить положение внутренней капилляра во внешнем капилляра, пожалуйста повернуть винт в верхней части держателя. Таким образом, расстояние ш можно контролировать точно.
Чтобы сделать монодисперсных W микрокапель / вывода, есть текущие ограничения. Существует трудность в увеличении центробежной скорости (при необходимости), потому что все эксперименты в исследовании были выполнены при максимальном центробежной скорости настольной центрифуге. Кроме того, капли поколение трудно из множества различных решений выборочных, ограничение которого зависит от конструкции центрифуги. Multi-ствольного капилляры качестве внутреннего капилляра может обеспечить инкапсулированные микрокапель из различных комбинаций материалов и решений 18.
Микрожидкостных устройство имеет два основных преимущества по сравнению с традиционными методами микроканальных: я) еASY и надежный изготовление и II) требование только небольшого объема (0,1 мкл) раствора образца. Во-первых, изготовление капиллярной основе центробежной осесимметричного совместно течет микрожидком устройства простой и надежной. Только тонкие капилляры, держатель капиллярного и образец микропробирки требуются. Время изготовления составляет 5-10 мин для устройства. Изготовление устройства занимает меньше времени по сравнению с изготовлением другой микрожидком устройства. Кроме того, держатель капиллярного является надежной и может быть повторно использован. Таким образом, только расходные материалы стеклянные капилляры и образец микропробирки в устройстве, что делает его дешевле, чем другие микрофлюидальных систем. Наконец, поскольку нефтяные и водные потоки были произведены за счет центробежной силы, не было впустую объем. Для 1-2 сек, устройство генерирует большое количество микрокапель.
Микрокапель являются идеальными кандидатами для проведения экспериментов с высокой пропускной способностью, связанных небольших количеств образца SOLUTIOп. С помощью этого устройства, то теоретически возможно генерировать сотни тысяч 10-микронных микрокапель в секунду от 0,1 мкл раствора образца. Таким образом, устройство вмещает работать с драгоценными биологических образцов путем минимизации объема образцов, необходимых для быстрого количественного анализа. Это устройство может быть использовано для анализа биохимических реакций 6-9 и одноклеточные ферментативных реакций 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-mm-thick polyacetal plastic plate | Tool | Nikkyo Technos, Co., Ltd. (Japan) | 244-6432-08 |
| Milling machine | Tool | Roland DG Co., Ltd. (Japan) | MDX-40A |
| End Mill RSE230-0.5*2.5 | Tool | NS Tool Co., Ltd. (Japan) | 01-00644-00501 |
| M2*40 screws | Tool | Jujo Synthetic Chemistry Labo. (Japan) | 0001-024 |
| Glass Capillry Puller | Tool | Narishige (Japan) | PC-10 |
| Microforge | Tool | Narishige (Japan) | MF-900 |
| Inner Glass Capillary | Tool | Narishige (Japan) | G-1 |
| Outer Glass Capillary | Tool | World Precision Instruments Inc. (USA) | 1B200-6 |
| 1.5 ml Sample tube | Tool | INA OPTIKA CO.,LTD (Japan) | ST-0150F |
| Hexadecane | Reagent | Wako Pure Chemical Industries Ltd. (Japan) | 080-03685 |
| Sorbitan monooleate (Span 80) | Reagent | Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. (Japan) | S0060 |
| Milli Q system | Reagent | Merck Millipore Corporation (Germany) | ZRQSVP030 |
| Swinging-out-type Mini-centrifuge | Tool | Hitech Co., Ltd. (Japan) | ATT101 |
| Digital Microscope | Tool | KEYENCE Corporation (Japan) | VHX-2001 |
References
- Song, H., Chen, D. L., Ismagilov, R. F.
- Huebner, A., et al.
- Taly, V., Kelly, B. T., Griffiths, A. D. Droplets as microreactors for highthroughput biology. ChemBioChem. 8 (3), 263-272 (2007).
- Teh, S. Y., Lin, R., Hung, L. H., Lee, A. P.
- Takinoue, M., Takeuchi, S. Droplet microfluidics for the study of artificial cells. Anal. Bioanal. Chem. 400 (6), 1705-1716 (2011).
- Hase, M., Yamada, A., Hamada, T., Baigl, D., Yoshikawa, K. Manipulation of cell-sized phospholipid-coated microdroplets and their use as biochemical microreactors. Langmuir. 23 (2), 348-352 (2007).
- Zheng, B., Tice, J. D., Roach, L. S., Ismagilov, R. F. A Droplet-Based, Composite PDMS/Glass Capillary Microfluidic System for Evaluating Protein Crystallization Conditions by Microbatch and Vapor-Diffusion Methods with On-Chip X-Ray Diffraction. Angew. Chem., Int. Ed. 43 (19), 2508-2511 (2004).
- Nakano, M., et al. Single-molecule PCR using water-in-oil emulsion. J. Biotechnol. 102 (2), 117-124 (2003).
- Diehl, F., et al. BEAMing: single-molecule PCR on microparticles in water-in-oil emulsions. Nat. Methods. 3, 551-559 (2006).
- He, M., et al. Selective encapsulation of single cells and subcellular organelles into picoliter- and femtoliter-volume droplets. Anal. Chem. 77 (6), 1539-1544 (2005).
- Baroud, C., Gallaire, F., Dangla, R.
- Utada, A. S., Nieves, A. F., Stone, H. A., Weitz, D. A. Dripping to jetting transitions in coflowing liquid streams. Phys. Rev. Lett. 99 (9), 094502 (2007).
- Cramer, C., Fischer, P., Windhab, E. J. Drop formation in a co-flowing ambient fluid. Chem. Eng. Sci. 59 (15), 3045-3058 (2004).
- Anna, S. L., Bontoux, N., Stone, H. A. Formation of dispersions using "flow-focusing" in microchannels. Appl. Phys. Lett. 82, 364-366 (2003).
- Takeuchi, S., Garstecki, P., Weibel, D. B., Whitesides, G. M. An axisymmetric flow-focusing microfluidic device. Adv. Mater. 17 (8), 1067-1072 (2005).
- Thorsen, T., Roberts, R. W., Arnold, F. H., Quake, S. R. Dynamic pattern formation in a vesicle-generating microfluidic device. Phys. Rev. Lett. 86 (18), 4163-4166 (2001).
- Yamashita, H., et al. Generation of monodisperse cell-sized microdroplets using a centrifuge-based axisymmetric co-flowing microfluidic device. J. Biosci. Biotech. 119 (4), 492-495 (2015).
- Maeda, K., Onoe, H., Takinoue, M., Takeuchi, S. Controlled synthesis of 3D multi-compartmental particles with centrifuge-based microdroplet formation from a multi-barrelled capillary. Adv. Mater. 24 (10), 1340-1346 (2012).
