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Neuroscience

Angiotensin द्वितीय रिसेप्टर्स की स्थानीय दृश्य के लिए रिसेप्टर autoradiography प्रोटोकॉल

Published: June 7, 2016 doi: 10.3791/53866
Automatic Translation
1, 2, 3, 2
1Farquhar College of Arts and Sciences, Nova Southeastern University, 2Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy, Nova Southeastern University, 3School of Medicine, University of Colorado

Abstract

इस प्रोटोकॉल चूहे के मस्तिष्क में Angiotensin द्वितीय (आंग द्वितीय) के लिए रिसेप्टर बंधन पैटर्न एक radioligand विशिष्ट आंग द्वितीय रिसेप्टर्स रिसेप्टर autoradiographic मानचित्रण प्रदर्शन करने के लिए उपयोग कर का वर्णन है।

ऊतक नमूनों काटा और -80 डिग्री सेल्सियस पर जमा हो जाती है। एक cryostat coronally अनुभाग के लिए ऊतक (मस्तिष्क) का इस्तेमाल किया जाता है और आरोप लगाया स्लाइड पर वर्गों पिघलना माउंट। स्लाइड पर चढ़कर ऊतक वर्गों आंग द्वितीय रिसेप्टर्स radiolabel 125 मैं-एसआई आंग द्वितीय में incubated हैं। निकटस्थ स्लाइड दो सेट में विभाजित हैं: (1 में आर) पर 1 आंग द्वितीय रिसेप्टर उप प्रकार 'गैर विशिष्ट बंधन' गैर radiolabeled आंग द्वितीय की एक रिसेप्टर saturating एकाग्रता, या एक की उपस्थिति में (एनएसपी) चयनात्मक आंग द्वितीय रिसेप्टर प्रतिपक्षी और एटी 1 आर प्रतिपक्षी कोई साथ 'बाध्यकारी कुल'। के 2 आंग द्वितीय रिसेप्टर उप प्रकार (2 आर) एक saturating एकाग्रता प्रतिपक्षी (PD123319, 10 माइक्रोन) के भी incubati में मौजूद हैबफर पर 125 मैं-एसआई आंग II में 1 आर उप प्रकार के लिए बाध्य सीमा। ~ 22 डिग्री सेल्सियस, एनएसपी स्लाइड 10 माइक्रोन PD123319 और losartan को उजागर कर रहे हैं पर एक 30 मिनट पूर्व ऊष्मायन के दौरान, जबकि 'बाध्यकारी कुल' स्लाइड 10 माइक्रोन PD123319 के संपर्क में हैं। स्लाइड्स तो बफर में PD123319 की उपस्थिति 'बाध्यकारी कुल' के लिए 125 मैं-एसआई आंग द्वितीय के साथ incubated रहे हैं, और परख बफर में PD123319 और एनएसपी के लिए losartan, कई 'washes' द्वारा पीछा किया, और नमक और गैर दूर करने के लिए पानी विशेष रूप से radioligand बंधे। स्लाइड एक विशेष फिल्म और कैसेट का उपयोग झटका dryers, तो autoradiography फिल्म के संपर्क में उपयोग करते हुए सूख रहे हैं। फिल्म विकसित की है और छवियों दृश्य और मात्रात्मक डेन्टिसिटोमीटरी एक मालिकाना इमेजिंग प्रणाली और एक स्प्रेडशीट का उपयोग कर के लिए एक कंप्यूटर में स्कैन कर रहे हैं। स्लाइड का एक अतिरिक्त सेट ऊतकीय तुलना के लिए thionin-दाग रहे हैं।

रिसेप्टर autoradiography उपयोग कर के लाभ कल्पना करने की क्षमता हैआंग बगल में द्वितीय रिसेप्टर्स, एक ऊतक नमूना के एक वर्ग के भीतर, और संरचनात्मक रूप से एक बगल ऊतकीय संदर्भ अनुभाग के लिए तुलना करके ऊतक के क्षेत्र की पहचान।

Introduction

हृदय रोग 2011 1 में संयुक्त राज्य अमेरिका में मौत और विकलांगता, अमेरिका में होने वाली मौतों के 30% से अधिक के कारण का प्रमुख कारण बना हुआ है। अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन से अंतिम आंकड़ों से संकेत मिलता है कि तीन में एक से अधिक व्यक्ति एक है हृदय रोग की या एक से अधिक प्रकार के। हृदय अनुसंधान इस रोग को समझने के खिलाफ प्रगति कर रहा है, लेकिन के रूप में पीढ़ियों पुराने हो रही शुरू यह इन प्रयासों को जारी रखने के लिए आवश्यक है। रेनिन-एंजियोटेनसिन प्रणाली (रास) मुख्य रूप से atherosclerosis, सूजन, प्रणालीगत वाहिकासंकीर्णन, और सक्रियण सहानुभूति तंत्रिका तंत्र की चित्रा (1) 2-8 बढ़ावा देने के द्वारा हृदय प्रणाली के नियमन में एक केंद्रीय भूमिका निभाता है।

आरएएस एक हार्मोनल प्रणाली है कि जब गुर्दे की कोशिकाओं स्तवकासन्न खून में रेनिन छिपाना जवाब में रक्तचाप कम करने के लिए सक्रिय है, sympat वृद्धि हुईhetic उत्तेजना, या मैक्युला densa द्वारा सोडियम प्रवाह में कमी आई है। रेनिन angiotensinogen (जिगर में संश्लेषित) एंजियोटेनसिन मैं (आंग मैं) के रूप में metabolizes। आंग मैं तो मुख्य रूप से फेफड़े और गुर्दे में, संवहनी endothelial कोशिकाओं की ल्यूमिनल तरफ एंजियोटेनसिन परिवर्तित एंजाइम (ऐस) द्वारा metabolized है, एक ectoenzyme, एंजियोटेनसिन द्वितीय (आंग द्वितीय), आरएएस की मुख्य प्रेरक पेप्टाइड के रूप में। आंग द्वितीय दो रिसेप्टर उपप्रकार को सक्रिय करने के लिए सक्षम है; टाइप 1 रिसेप्टर (1 एटी आर) और टाइप 2 रिसेप्टर (2 आर), जो दोनों के हृदय प्रणाली को विनियमित करने, तरल पदार्थ और इलेक्ट्रोलाइट homeostasis को बनाए रखने और अब संज्ञानात्मक समारोह और neurodegenerative रोग को प्रभावित करने के लिए विचार कर रहे हैं 8,9 प्रक्रियाओं। एक स्थानीय, मस्तिष्क विशिष्ट रास स्वतंत्र रूप से आंग द्वितीय के संश्लेषण के लिए सूचना दी है। मस्तिष्क में, अग्रदूत साबित प्रोटीन angiotensinogen अस्थिकणिका 10 एक रेनिन-तरह के एंजाइम 3 से आंग मैं करने के लिए परिवर्तित में संश्लेषित है, संभवतः prorenin prorenin रिसेप्टर के लिए बाध्य11, और बाद में एंजियोटेनसिन परिवर्तित एंजाइम जो बहुतायत से मस्तिष्क 12 में न्यूरॉन्स की बाह्य सतह पर व्यक्त की है द्वारा आंग द्वितीय को बदल दिया। उत्पन्न आंग द्वितीय यह intrabrain 1 में मस्तिष्क के लिए और 2 रिसेप्टर्स कि रक्त जनित आंग द्वितीय से अलग कर रहे हैं पर एगोनिस्ट है।

एटी 1 आर एक महत्वपूर्ण शारीरिक भूमिका निभाता है, यह बेहतर पूरे शरीर में इसकी pathophysiological प्रभाव के लिए जाना जाता है, मुख्य रूप से हृदय प्रणाली और गुर्दे (चित्रा 2) को प्रभावित। आंग II में 1 आर को बांधता है, यह वाहिकासंकीर्णन का कारण बनता है; बढ़ती रक्त के प्रवाह के लिए प्रतिरोध और रक्तचाप बढ़ गई है। यह भी, संश्लेषण और एल्डोस्टेरोन और वैसोप्रेसिन के स्राव को बढ़ावा देता है वृद्धि हुई सोडियम और पानी की अवधारण के लिए अग्रणी। इन प्रभावों को भी इस्कीमिक मस्तिष्क क्षति और संज्ञानात्मक क्षति पैदा कर सकते हैं और पार्किंसंस रोग, अल्जाइमर रोग से जुड़ा हुआ है, और Diabeटीईएस, साथ ही हाल ही में पहचान की जा रही सीखने और स्मृति 13-15 को प्रभावित करने के लिए। उस में आरएएस में एक राय पाश में गुर्दे में स्तवकासन्न कोशिकाओं पर 1 आर रेनिन स्राव को रोकता है। दिलचस्प है, में 2 आर आम तौर पर 1 आर, कई अन्य लोगों के बीच 16-20 वैसोडायलेटेशन, neurite परिणाम, axonal उत्थान, विरोधी प्रसार, और cerebroprotection पैदा की कार्रवाई जवाबी नियंत्रित करता है। 2 आर भी विरोधी उच्च रक्तचाप और हाल ही में, कैंसर रोधी दवाओं 21 के लिए एक लक्ष्य के रूप में पहचान की गई है। विभिन्न ऊतकों के भीतर स्थानीयकरण और आंग द्वितीय रिसेप्टर्स के घनत्व का निर्धारण और कैसे वे विभिन्न उपचार और रोग राज्यों मात्रात्मक densitometric रिसेप्टर autoradiography का उपयोग कर भूमिका रास विशिष्ट रोगों में खेलता को उजागर करने में मदद करेगा से प्रभावित कर रहे हैं।

रिसेप्टर autoradiography एंजियोटेनसिन मैं की उपस्थिति का संकेत के लिए एक प्रभावी तरीके के रूप में 30 से अधिक वर्षों के लिए इस्तेमाल किया गया हैमैं रिसेप्टर्स और मस्तिष्क में रास के अन्य घटकों और चूहे, माउस, गिनी पिग, कुत्ते और प्रयोगात्मक शर्तों 22-34 की एक किस्म के तहत मानव के अन्य ऊतकों। मस्तिष्क के भीतर आंग द्वितीय रिसेप्टर्स लगाने का महत्व यह है कि एक मस्तिष्क में आंग द्वितीय की कार्रवाई करने के लिए कार्यात्मक neuroanatomy आवेदन कर सकते हैं, जैसे, हाइपोथैलेमस (PVN) की paraventricular नाभिक में से 1 आर की उपस्थिति आंग के एक समारोह का सुझाव मस्तिष्क में द्वितीय वैसोप्रेसिन, ऑक्सीटोसिन या corticotropin रिहा हार्मोन (CRH) रिलीज, या सहानुभूति तंत्रिका तंत्र की सक्रियता को प्रोत्साहित करने के लिए। इस प्रकार, दवाओं है कि ब्लॉक में 1 आर इन PVN की मध्यस्थता मस्तिष्क आरएएस की गतिविधि से अधिक के साथ जुड़े प्रभाव के कुछ कम हो सकता है। प्रगति में काम चलता है कि कम 1 आर विरोधी के उपयोग के बाद अभिघातजन्य तनाव विकार (पीटीएसडी) सीआरएच की रिहाई प्रेरित कम होती है और PTSD के लक्षण उन्नति कर सकते हैं (चोट एट अल।, प्रकाशन के लिए प्रस्तुत)। PVN, subfornicalअंग (एसएफओ), और प्रमस्तिष्कखंड homeostasis, भूख / प्यास, नींद, स्मृति, भावनात्मक प्रतिक्रियाओं को विनियमित करने के लिए जाना जाता है, और इस प्रदर्शन के अध्ययन का लक्ष्य क्षेत्रों रहे हैं। इन क्षेत्रों में खुर्दबीन स्लाइड पर एक मस्तिष्क के राज्याभिषेक वर्गों का संग्रह है, और आंग द्वितीय रिसेप्टर्स के लिए एक विशिष्ट radioligand के साथ-साथ विशिष्ट अवरोधकों के साथ वर्गों के इलाज से जांच की गई। इस अध्ययन में, सभी सामग्री और अभिकर्मकों सुझाव विक्रेताओं के साथ साथ कर रहे हैं सूचीबद्ध, आयोडीन -125 एक आंग द्वितीय रिसेप्टर प्रतिपक्षी, sarcosine 1, isoleucine 8 आंग द्वितीय (एसआई आंग द्वितीय) है, जो तब मोनो 125 मैं के रूप में शुद्ध किया गया था radiolabel करने के लिए इस्तेमाल किया गया था -si आंग द्वितीय के रूप में पहले 35 में वर्णित एचपीएलसी तरीकों का उपयोग कर। इस उच्च विशिष्ट गतिविधि radioligand के उपयोग के एक्स-रे फिल्म के लिए radiolabeled वर्गों के प्रदर्शन के बाद, कम, मध्यम और उच्च घनत्व रिसेप्टर के क्षेत्रों के दृश्य के लिए अनुमति देता है। मस्तिष्क पेस्ट आयोडीन -125, विशेष राशि के ज्ञात मात्रा युक्त मानकों के साथ फिल्म औजार द्वाराएक क्षेत्र में बाध्यकारी आंग द्वितीय रिसेप्टर की मात्रा निर्धारित किया जा सकता है। प्रयोगात्मक अध्ययन में, प्रायोगिक विषयों के दिमाग में बाध्यकारी आंग द्वितीय रिसेप्टर कि नियंत्रण विषयों के दिमाग में तुलना की जा सकती। यह संकेत मिलता है कि क्या कर सकते हैं आंग द्वितीय की कार्रवाई एक आनुवंशिक हालत, प्ररूपी विषमता, रोग राज्य या नशीली दवाओं के उपचार के जवाब में बदल रहे हैं। यह ज्ञान तो उपचारों रास का अनियंत्रण के साथ जुड़े रोगों के इलाज के लिए के विकास के लिए लागू किया जा सकता है। वैकल्पिक तकनीकों है कि बाध्यकारी साइटों रिसेप्टर की पहचान है, लेकिन कम शारीरिक संकल्प के साथ, assays कि ऊतक झिल्ली ऊतक homogenates, जो सांद्रता हदबंदी निरंतर रूप radioligand बंधन आत्मीयता का आकलन करने की एक सीमा से अधिक radioligand के साथ incubated हैं से निकाली गई तैयारियों का उपयोग (कश्मीर डी बाध्यकारी हैं ) और अधिक से अधिक बाध्यकारी क्षमता (बी अधिकतम) ब्याज के ऊतकों की।

यहां वर्णित प्रोटोकॉल 5 प्रमुख सह में नीचे टूट सकता हैmponents: रिसेप्टर autoradiography के लिए ऊतक वर्गों तैयारी; रिसेप्टर autoradiography; फिल्म प्रदर्शन और विकास; प्रोटोकॉल; और densitometric छवि विश्लेषण।

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Protocol

सभी पशु प्रक्रियाओं इस अध्ययन के लिए बाहर ले देखभाल और प्रयोगशाला पशु के उपयोग के लिए गाइड के साथ समझौते में नोवा दक्षिण विश्वविद्यालय की संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया, 8 वें संस्करण (राष्ट्रीय अकादमियों प्रेस, वाशिंगटन, डीसी, 2011 )।

रिसेप्टर autoradiography के लिए 1. तैयारी ऊतक वर्गों

  1. बलिदान पर, फसल ताजा मस्तिष्क के ऊतकों, और एल्यूमीनियम पन्नी और जगह में एक में जितनी जल्दी हो सके लपेटो -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर। 20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर - सही आकार को बनाए रखने के लिए, एक मस्तिष्क ढालना है कि खोपड़ी के अंदर simulates में दिमाग जगह है, एक में एल्यूमीनियम पन्नी और जगह में लपेट। 30 मिनट के बाद, एक sealable फ्रीजर भंडारण बैग में जगह ऊतकों और लंबी अवधि के भंडारण के लिए एक -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर के लिए कदम।
    1. -80 सी फ्रीजर, और एक cryostat -10 डिग्री सेल्सियस और -18 डिग्री सेल्सियस के अधिकतम की एक न्यूनतम करने के लिए सेट करने के लिए स्थानांतरण °, से बचने के लिए विगलन से ब्याज की ताजा जमे हुए ऊतक नमूना प्राप्त करते हैं। ऊतक पर नमूना एक ग्लाइकोल और राल आधारित embedding माध्यम के साथ माउंट, केवल माध्यम में नमूना के एक छोटे से हिस्से embedding रखें। मस्तिष्क के लिए, मस्तिष्क राज्याभिषेक विमान में सेक्शनिंग सक्षम करने के लिए खड़ी मुहिम शुरू की है।
  2. जगह ऊतक cryostat भीतर microtome पर माउंट और जगह में मजबूती कस लें। मस्तिष्क के बाएँ और दाएँ पक्ष सुनिश्चित ही Antero-postero निर्देशांक में हैं, और कि dorso उदर अक्ष सीधा आमतौर पर इस्तेमाल करने के लिए मस्तिष्क एटलस है।
  3. इच्छित मोटाई पर काटने शुरू (20 माइक्रोन) की सिफारिश की है और एक ऊर्ध्वाधर दिशा में माइक्रोस्कोप स्लाइड पर वर्गों माउंट स्लाइड में अंतरिक्ष का एक बड़ा सतह क्षेत्र है पिघलना। , पांच की अनुक्रमिक सेट में स्लाइड पर वर्गों लीजिए यानी स्लाइड का पहला सेट 1-1 से चिह्नित कर रहे हैं, 1-2, 1-3, 1-4, और 1-5 (चित्रा 3)।
  4. वर्गों के साथ स्लाइड का एक सेट भरने के बाद, अप करने के लिए 1 घंटे के लिए शुष्क हवा के लिए स्लाइड, तो SLI जगह की अनुमति-20 डिग्री सेल्सियस पर एक आत्म सील फ्रीजर भंडारण बैग में एक प्लास्टिक स्लाइड बॉक्स, और दुकान में des।

2. रिसेप्टर autoradiography

चेतावनी: रेडियोधर्मिता। रेडियोधर्मिता को संभालने के लिए सुरक्षात्मक पोशाक का प्रयोग करें। निपटान स्थापना पर निर्भर है, और दिशा निर्देशों का पालन करना चाहिए ठीक से (आधा जीवन 60 दिन) क्षय करने के लिए या एक प्रमाणित कंपनी द्वारा उठाया जा सकता है।

  1. -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से ब्याज की "-1" और "-2" स्लाइड निकालें और (चित्रा 5) स्लाइड पकड़ती में माउंट। आरोह 'गैर विशिष्ट' के इलाज के लिए एक साथ "-1" स्लाइड, और "-2" 'कुल' इलाज के लिए स्लाइड। 'गैर-विशिष्ट' जार में 2 आर प्रतिपक्षी 10 माइक्रोन PD123319 एक के अंतिम सांद्रता में शामिल होंगे, और एटी 1 आर प्रतिपक्षी एक losartan, परख मध्यम बफर में (AM5) (तालिका 1), 'कुल' बाध्यकारी जार केवल 10 में शामिल होंगे AM5 में सुक्ष्ममापी PD123319।
  2. स्लाइड पलटनापकड़ती कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए पूर्व ऊष्मायन Coplin AM5 के 35-40 मिलीलीटर से भरा जार में स्लाइड, और संबंधित अवरोधकों जगह है। 4 मिनट के अंतराल पर उनके पूर्व ऊष्मायन के स्नान में बाद के सेट की शुरुआत करें।
  3. तुरंत कमरे में ऊष्मायन स्लाइड मेलर्स करने के लिए पूर्व ऊष्मायन समाधान से स्लाइड हस्तांतरण, 60-90 मिनट के लिए AM5 के 10 मिलीलीटर, प्लस 125 मैं-एसआई आंग द्वितीय के एक पूर्व निर्धारित एकाग्रता संबंधित अवरोधकों के साथ (चित्रा 4 में गणना), युक्त तापमान। अगर वहाँ पर्याप्त radioligand, 10 स्लाइड्स रखा जा सकता है (वापस वापस करने के लिए) को संशोधित स्लाइड पकड़ में और Coplin जार में 125 मैं-एसआई आंग द्वितीय के साथ incubated।
  4. प्लेस स्लाइड पकड़ती में वापस स्लाइड (यदि आवश्यक), दाग, और से कुल्ला धीरे दो अलग कंटेनर में आसुत पानी की 400 मिलीलीटर में 1-2 सेकंड के लिए घूमता।
  5. स्लाइड बिल्कुल 1 मिनट प्रत्येक (के रूप में चित्रा 4 <में सचित्र के लिए AM5 की 35-40 मिलीग्राम से युक्त चार Coplin जार में क्रमिक रूप से स्थानांतरण/ Strong>)।
  6. पिछले 1 मिनट कुल्ला करने के बाद, धीरे बर्फ के ठंडे आसुत जल के चार परिवर्तन में 1-2 सेकंड के लिए वर्गों ज़ुल्फ़।
  7. झटका सूखी ठंडी हवा के साथ स्लाइड्स (सावधानी: गर्म हवा रेडियोधर्मी यौगिक volatizes) चार बाल dryers 4 मिनट (चित्रा 5) के लिए अलग-अलग कोणों से सेट अप का उपयोग कर, जब तक सभी वर्गों सूख रहे हैं, तो एक कागज तौलिया पर जगह है।
  8. माउंट ऊतकों को दो तरफा टेप का उपयोग कर एक्स-रे फिल्म के लिए समानाधिकरण के लिए एक कार्डबोर्ड पर का सामना करना पड़ के साथ स्लाइड।
  9. माउंट कम से कम एक, 125 आयोडीन अंशांकन प्रत्येक कार्डबोर्ड पर मानक स्लाइड (चित्रा 6)।
    नोट: कैलिब्रेशन मानकों को अच्छी तरह से है कि cryostat मस्तिष्क वर्गों के रूप में एक ही मोटाई में sectioned और माइक्रोस्कोप पर गल-बढ़ रहे हैं एक परिसर में एक फिनोल की अंगूठी, एक 1 मिलीलीटर सिरिंज ट्यूबरकुलीन में centrifugation द्वारा जमा युक्त, के लिए बाध्य 125 आयोडीन के साथ मिश्रित मस्तिष्क पेस्ट से मिलकर बनता है स्लाइड। वैकल्पिक रूप से, 125 में मैं अंशांकन मानकोंप्लास्टिक राल 20 माइक्रोन मोटाई में sectioned व्यावसायिक रूप से प्राप्त किया जा सकता है। इन मानकों में प्लास्टिक राल आंशिक रूप से इस तरह ~ का 40% एक ऊतक समानक अंशांकन में सकारात्मक असर होना चाहिए कि विकिरण से फिल्म ढालें।

3. फिल्म प्रदर्शन और विकास

  1. एक पट्टा वापस एक्स-रे कैसेट और autoradiography फिल्म के साथ एक darkroom करने के लिए आगे बढ़ें। कैसेट खुला और अंदर स्लाइड (चित्रा 6) के साथ गत्ते जगह है।
    1. लाइट बंद करें और safelight पर बारी। ध्यान से, एक्स-रे फिल्म के बॉक्स को खोलने के एक फिल्म से हटा दें, और फिल्म चमकदार पक्ष को जगह कैसेट में स्लाइड्स के शीर्ष पर (नीचे दायें कोने पर दांतेदार बढ़त के साथ)। ध्यान से कैसेट बंद है, और लॉकिंग सलाखों मोड़ प्रकाश (चित्रा 6) बाहर सील करने के लिए। -20 डिग्री सेल्सियस पर कई हफ्तों के लिए कई दिनों के लिए स्लाइड बेनकाब।
  2. darkroom में, कैसेट खोलने के लिए और फिल्म के विकास के साथ आगे बढ़ना procईएसएस।
    1. ट्रे लगातार स्लाइड्स में रखें; 2 मिनट के लिए डेवलपर, 5 मिनट के लिए 30 सेकंड के लिए 5% हिमनदों एसिटिक एसिड, और फिक्सर युक्त पानी। फिल्मों 20 मिनट के लिए पानी चल रहा है के साथ एक ट्रे में रखा जाता है, तो कोई 10 से अधिक सेकंड के लिए Photoflo में रखा गया है और फोन काट दिया।
      नोट: जोखिम समय अनुभव से निर्धारित किया जाता है और अलग-अलग जोखिम समय के साथ कई फिल्मों में शामिल कर सकते हैं: लंबे समय से काफी कम बंधन के साथ क्षेत्रों से औसत दर्जे का संकेत प्राप्त करने के लिए, लेकिन नहीं तो बहुत उच्च बंधन के साथ क्षेत्रों से फिल्म तर करने के रूप में। एक बार स्वीकार्य जोखिम प्राप्त कर रहे हैं, तो अगले कदम के लिए आगे बढ़ें।

4. प्रोटोकॉल

  1. Thionin दाग और धुंधला अभिकर्मकों (तालिका 2, चित्रा 7) तैयार करें।
    1. स्लाइड रैक में "-3" स्लाइड प्लेस, और 1 मिनट के लिए विआयनीकृत पानी के साथ शुरुआत अनुक्रमिक क्रम में हस्तांतरण, तो 10 मिनट के लिए thionin दाग समाधान Deion में तीन गिरावट के द्वारा पीछाized पानी, और विआयनीकृत पानी में एक 30 सेकंड धोने।
    2. इस प्रकार के रूप में पानी के बाद, इथेनॉल washes में स्लाइड रैक जगह; 50%, 70%, और 30 सेकंड के लिए 90%, 1 मिनट प्रत्येक के लिए 100% से कम दो इथेनॉल washes के द्वारा पीछा किया। अन्त में, 3 मिनट के लिए xylene में स्लाइड रैक जगह फिर 5 मिनट के लिए एक दूसरे xylene समाधान के लिए स्थानांतरण।
  2. पिछले xylene स्नान से एक समय में एक स्लाइड निकालें, और कार्बनिक विलायक बढ़ते मध्यम में एक राल आधार के साथ स्लाइड के ऊपरी किनारे कवर, और स्लाइड पर एक 24 मिमी x 60 मिमी coverslip जगह। स्लाइड्स के लिए पर्याप्त ~ 48 घंटे के लिए सूखी अनुमति दें और फिर 2400 डीपीआई स्केल पर कंप्यूटर में स्कैन।

5. densitometric छवि विश्लेषण

  1. फिल्म चमकदार पक्ष नीचे रखें, नीचे बाएँ कोने पर दांतेदार बढ़त के साथ और एक मालिकाना इमेजिंग सिस्टम कंप्यूटर में किसी भी विकृति के बिना फिल्म घनत्व जानकारी प्रसारित करने में सक्षम स्कैनर का उपयोग कर स्कैन।
  2. मालिकाना इमेजिंग व्यवस्था खोलेंमंदिर और अंशांकन सलाखों के उपयोग फिल्म पर छवियों (- 12 आंकड़े 9) के भविष्य densitometric विश्लेषण के लिए अंशांकन मानकों को स्थापित करने के लिए।
  3. या तो एक टेम्पलेट की स्थापना या अनुभव से हित के क्षेत्रों की रूपरेखा द्वारा ब्याज के उपाय क्षेत्रों में। डेटा या तो नियंत्रण या जंगली प्रकार (खंड), और इस क्षेत्र एकत्र की है और फिल्म पर आधारित अलग किया जाता है। माप में घनत्व (fmol / छ), क्षेत्र स्कैन, और कुल लक्ष्य क्षेत्र (9 चित्रा) को शामिल करने के लिए सुनिश्चित करें।
    1. आश्वस्त ब्याज के क्षेत्र (चित्रा 10) पर प्रकाश डाला के मापदंडों के बीच गिर जाता है कि द्वारा स्कैन क्षेत्र सलाखों समायोजित करें।
    2. एक स्प्रेडशीट में निर्यात डेटा (तालिका 4)। , घनत्व बार कुल लक्ष्य क्षेत्र गुणा तो आदेश है कि विशिष्ट क्षेत्र की बाइंडिंग के लिए मूल्य प्राप्त करने के लिए स्कैन क्षेत्र से विभाजित। एक बार इस मापा सभी मूल्यों को किया जाता है, विशेष रूप से बाध्यकारी पी उपज के लिए कुल से स्थापित गैर विशिष्ट सब्सट्रेटबुरा मानना। मूविंग भी इन मूल्यों के लिए किया जा सकता है।

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Representative Results

रेनिन-एंजियोटेनसिन प्रणाली की चयापचय मार्ग का अवलोकन चित्रा 1 और Angiotensin द्वितीय रिसेप्टर उपप्रकार पर सीधे ध्यान (1 आर और 2 में आर) चित्रा 2 में वर्णित में दिखाया गया है। 3 दिखाता चित्रा राज्याभिषेक मस्तिष्क के हस्तांतरण माइक्रोस्कोप स्लाइड, जो तब के रूप में चित्रा 4 में देखा एक पूर्व निर्धारित 125 मैं-सियांग द्वितीय एकाग्रता का उपयोग कर एक रिसेप्टर autoradiography प्रक्रिया के माध्यम से चलाए जा रहे हैं पर वर्गों। चित्रा 5 रिसेप्टर autoradiography में स्लाइड्स जो तब के रूप में एक कार्डबोर्ड पर चिपका रहे हैं के लिए सुखाने कदम दिखाता है चित्रा 6 में देखा, और बाद में विकसित तालिका। 2 सूचियों स्लाइड पर चढ़कर ऊतक 7। कैलिब्रेशन मानक इकाइयों चित्रा में वर्णित मात्रा का ठहराव के लिए वर्गों के लिए thionin धुंधला प्रक्रिया के लिए इस्तेमाल किया अभिकर्मकों बीए निर्धारित कर रहे हैंके रूप में तालिका में देखा परख की तारीख पर sed 3. 8 चित्रा 125 मैं एकाग्रता (fmol / जी ऊतक) फिल्म के लिए जोखिम (सापेक्ष ऑटोमेटिक घनत्व) से संबंधित एक मानक वक्र की स्थापना से पता चलता है। चित्रा 11 'एनएसपी' के बीच के अंतर को दिखाता है और 'कुल' समूहों, साथ ही ऊतक लेबल, (स्कैन क्षेत्र पिक्सेल)। टेबल जबकि चित्रा 10 एक के पास शून्य मान के लिए सीमा की स्थापना का वर्णन पूरे स्कैन क्षेत्र के लिए एक सटीक औसत मूल्य प्राप्त करने के लिए 4 दिखाता मात्रा का ठहराव विशिष्ट प्राप्त करने की प्रक्रिया 'कुल' मूल्यों से 'गैर विशिष्ट' घटाकर पर आधारित बंधन। 'गैर-विशिष्ट' बाध्यकारी जो losartan में शामिल है और / या PD123319 radioligand की राशि गैर-1, या 2 रिसेप्टर्स पर बाध्य द्वारा बनाई गई है। Radioligand PD123319 की उपस्थिति में 1 रिसेप्टर्स पर करने के लिए बाध्य सभी पैदावार 'कुल' बाध्यकारी। एफ igure 11 प्रदर्शित करता अंतिम मापा PVN के संरचनात्मक पुष्टि के लिए एक thionin दाग खंड के लिए कुल बनाम गैर विशिष्ट बंधन आसन्न में PVN के क्षेत्रों में।

आकृति 1
चित्रा 1:। शरीर में रेनिन एंजियोटेनसिन प्रणाली (रास) की चयापचय मार्ग जिगर zymogen angiotensinogen है, जो गुर्दे के स्रावित रेनिन से चिपके रहते है, एंजियोटेनसिन मैं Angiotensin बनाने एंजियोटेनसिन द्वितीय में परिवर्तित एंजाइम (ऐस) धर्मान्तरित आंग मैं (विज्ञप्ति आंग द्वितीय), हृदय रोग का मुख्य अग्रदूत। आंग द्वितीय वाहिकासंकीर्णन का कारण बनता है, और रक्तचाप, हृदय उत्पादन, नमक भूख, प्यास, और पानी प्रतिधारण बढ़ जाती है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

"> चित्र 2
चित्रा 2:। Angiotensin टाइप 1 और 2 रिसेप्टर्स के कार्य (एटी 1 आर, 2 आर) पर 1 आर pathologically हृदय रोग को प्रभावित करता है, सीधे प्यास और नमक भूख बढ़ाने के लिए कार्य करता है, और मध्य के रूप में के रूप में अच्छी तरह से कई अन्य परिधीय सेलुलर गतिविधियों डाल रही है मनोवैज्ञानिक प्रभाव। 2 पर आर, एटी 1 रिसेप्टर के एक शारीरिक प्रतिपक्षी है एटी 1 आर की प्रभावकारिता में सहायता 36 संवहनी संरचना पर होने जिससे लाभकारी प्रभाव विरोधी। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: Cryoseमाइक्रोस्कोप पर मस्तिष्क की ctioning 20 माइक्रोन मोटाई में स्लाइड। cryostat के तापमान पर निर्भर करता है, वर्गों बार सिलवटों, दरारें, कर्लिंग प्रदर्शित करें, या microtome ब्लेड या चाकू धारक पर जमा हो पर होगा। ऐसे मामलों में धारा खारिज कर दिया है और एक नोट से संकेत मिलता है कि एक अतिरिक्त 20 माइक्रोन पिछले अनुभाग से इस खंड अलग कर देगा बना है। धारा के क्रम में कुल क्षेत्र एक स्लाइड को भरने और इसलिए प्रत्येक स्लाइड पर वर्गों की सबसे बड़ी राशि एकत्र करने के लिए की जरूरत को अधिकतम करने के लिए एक ऊर्ध्वाधर दिशा में स्लाइड्स पर एकत्र किया जाना चाहिए। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4:। प्रायोगिक डिजाइन एवं प्रोटोकॉल रिसेप्टर autoradiography के लिए का नमूना Differenti'कुल' (-2) और 'गैर विशिष्ट' (-1) के व्यावहारिक सीधे उपस्थिति और रिसेप्टर उप प्रकार प्रतिपक्षी के अभाव से संबंधित है। प्रोटोकॉल स्लाइड्स की संख्या के आधार पर भिन्न हो सकते हैं, और कुल और गैर विशिष्ट स्लाइड के प्रत्येक जोड़ी के लिए 2 की वेतन वृद्धि की वृद्धि होगी। Radioligand एकाग्रता, पहले से निर्धारित AM5 में शेयर के कमजोर पड़ने से प्राप्त की है। यह समाधान तो समान रूप से ऊष्मायन कंटेनरों को वितरित किया जाता है। प्रत्यक्ष मायने रखता से पहले लिया जाता है और ऊष्मायन radioligand की सटीक एकाग्रता स्थापित करने के बाद। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5:। रिसेप्टर autoradiography में सुखाने स्टेशन के लिए विन्यास सूखने बार उड़ाने की दक्षता के आधार पर अलग अलग होंगेdryers साथ ही पिछले rinses के बाद किसी भी अतिरिक्त पानी दूर दाग करने की क्षमता। एक बार खंड स्पष्ट से सफेद करने के लिए बदल जाता है स्लाइड सूखे की जाएगी। स्लाइड पूरी तरह से सूख तो नहीं कर रहे हैं radioligand एक फजी छवि है कि रिसेप्टर बाध्यकारी साइटों के लिए विशिष्ट नहीं है उत्पादन रिसेप्टर से दूर फैलाना कर सकते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6
चित्रा 6:।। एक्स-रे फिल्म के लिए इलाज स्लाइड उजागर एक विशेष कैसेट का उपयोग स्लाइड सेट अप एक पैटर्न जहां दोनों समूहों की तुलना की है का पालन करने की सिफारिश की है यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।


चित्रा 7: Thionin धुंधला के लिए सेट अप। स्लाइड एक स्लाइड धारक में भरी हुई है और अनुक्रमिक समाधान में डूब रहे हैं। टाइमिंग प्रभावी न्यूरॉन्स की Nissl पदार्थ का धुंधला (किसी न किसी जालिका) के लिए अनुमति देता है। निर्जलीकरण निम्न स्लाइड करने के लिए एक बढ़ते मध्यम आवेदन, स्लाइड coverslip के फिक्सिंग के तुलनात्मक विश्लेषण के लिए वर्गों के संरक्षण के लिए अनुमति देता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

आंकड़ा 8
8 चित्रा:। अंशांकन मानक सेटिंग प्रत्येक फिल्म अपने व्यक्तिगत अंशांकन मानकों, मस्तिष्क का पेस्ट और समय जिस पर प्रयोग किया गया था पर आधारित होता है । सबसे अच्छा फिट मूल्यों का वर्णन एक प्रतिगमन लाइन मापा मस्तिष्क पेस्ट मानकों के लिए एक मालिकाना इमेजिंग प्रणाली कार्यक्रम के द्वारा उत्पन्न होता है। इस रिश्तेदार ऑटोमेटिक घनत्व (छड़ी) radioligand की इकाइयों बाध्यकारी अंशांकन मानकों से मूल्य (सीएएल एसटीडी, लाल अंडाकार में) धर्मान्तरित, इस उदाहरण में इकाइयों (fmol / जी, लाल रंग में परिक्रमा) fmole radioligand गीला के ग्राम प्रति बाध्य हैं ऊतक वजन (fmol / छ)। मस्तिष्क पेस्ट मानकों की माप परिपत्र उपकरण के साथ किया और नमूना छवि दृश्य आइकन (लाल रंग में परिक्रमा) का उपयोग pseudocolor में सही पर दिखाया गया के बीच में रखा गया है। वृत्त को मापने के लिए अंशांकन मानक पूरे नमूना कवर करने के लिए नहीं है, बल्कि मानक का एक भी क्षेत्र को मापने। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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चित्रा 9:। नमूना संख्या, गैर विशिष्ट / कुल, और नमूना रीडिंग के लिए क्षेत्रों की पहचान करके समूहों क्योंकि कई दिमाग, मस्तिष्क क्षेत्रों, और कई प्रयोगात्मक समूहों को एक साथ मात्रा निर्धारित कर रहे हैं, यह सभी कारकों के बीच अंतर करने के लिए महत्वपूर्ण है। विषय मस्तिष्क नमूना इंगित करता है और यह भी समूह का संकेत कर सकते हैं; अनुभाग को इंगित करता है कि क्या यह गैर विशिष्ट (एनएसपी) या कुल है, जबकि इस क्षेत्र के कई मस्तिष्क क्षेत्रों कि जांचा जा रहा है की पहचान के लिए अनुमति देता है। नमूना उपकरण पट्टी (लाल आयत) विभिन्न नमूने उपकरण, जैसे, वृत्त, वर्ग, टेम्पलेट, मुक्तहस्त, रबड़ का वर्णन करता है; उस क्षेत्र चित्रित करने के लिए मापा जा करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। नमूना लेने के उपकरण के क्षेत्र के भीतर प्राप्त रॉड मूल्यों बंधन के रूप में परिवर्तित इकाइयों स्प्रेडशीट पर दर्ज हैं, fmol / जी (लाल रंग में परिक्रमा)। इसके अलावा, नमूने उपकरण के भीतर कुल क्षेत्रफल स्कैन "स्कैन क्षेत्र पिक्सेल" कॉलम जबकि कुल टी में दर्ज की गई हैarget क्षेत्र (पिक्सल है कि मूल्य सीमा (10 चित्रा कथा में वर्णित से अधिक की संख्या) "कुल Tgt क्षेत्र पिक्सेल" कॉलम में दर्ज की गई है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 10
चित्रा 10: नमूने के लिए सीमा का निर्धारण मानकों के आधार पर मापा जा स्कैन क्षेत्र प्रत्येक फिल्म के लिए अद्वितीय है, और मानकों के सेट पर निर्भर करता है।। thresholding उपकरण (लाल रंग में परिक्रमा) fmol / जी में स्कैन क्षेत्र मापा क्षेत्रों के लिए अनुमति देगा के लिए घनत्व रेंज के लिए सीमा मूल्यों को निर्धारित करने का उपयोग करना (विकर्ण तीर से चित्रित) एक बिंदु है जहां पर निर्भर है, 0 की एक सीमा के बीच गिर करने के लिए अंशांकन वक्र asymptote यह दर्शाता है कि यह फिल्म एक अधिक से अधिक जोखिम होने वाला है शुरू होता है, जो अतिरिक्त परे यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

11 चित्रा
चित्रा 11: ~ 1.8 मिमी शीर्षस्थान के लिए दुम पर एक महिला अनायास उच्च रक्तचाप से ग्रस्त चूहे (SHR) के राज्याभिषेक वर्गों के लिए बाध्य रिसेप्टर autoradiography की छवियों प्रतिनिधि, हाइपोथैलेमस (PVN) और गौण घ्राण पथ के बिस्तर नाभिक की paraventricular नाभिक प्रदर्शित (Baot )। (ए </ strong>) कुल 1 आर बाध्यकारी (लाल PVN, पीला Baot) के बंधन। (बी) गैर विशिष्ट losartan (AT1R प्रतिपक्षी) और PD123319 (AT2R प्रतिपक्षी) के साथ बंधन। (सी) कुल एक मनमाना सीमा में इस तरह के रूप में स्थापित करने PVN (काला भरने) के आकार को चित्रित करने के लिए स्कैन क्षेत्र के रूप में जो कुल Tgt क्षेत्र दर्ज की गई है) के भीतर सीमा मूल्य से अधिक के साथ बंधन में 1 आर के बंधन। (डी) Thionin दाग दिखा संरचनाओं के संरचनात्मक पुष्टि करने के लिए खंड उच्च कुल बंधन, और अन्य मस्तिष्क क्षेत्रों या अन्य प्रयोगात्मक समूहों के साथ तुलना के लिए। कृपया यहाँ यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

अभिकर्मकों रकम
NaCl 8.76जी
ना 2 EDTA 1.86 छ
Bacitracin 141 मिलीग्राम
500 मिमी Dibasic ना 2 पीओ 4 100 मिलीलीटर
आसुत विआयनीकृत पानी 900 मिलीलीटर
NaOH या एचसीएल के साथ 7.2 के लिए 7.1 पीएच को समायोजित करें

तालिका 1: परख मध्यम (AM5) ऊतक तैयार करने में इस्तेमाल किया बफर के रासायनिक घटकों।।

तालिका एक
तालिका 2:। Thionin दाग अभिकर्मकों thionin दाग समाधान thionin एक 0.5% जोड़ने से पहले आसुत जल से बना है, 1.0 एम सोडियम एसीटेट और 1.0 एम हिमनदों एसिटिक एसिड समाधान, 4.3 का पीएच को titrated।

पिछले दिनों संदर्भ तिथि
जत्था fmol / जी गीला वजन रेफरी की तारीख 1 2 3 4 5
मानक NCI / मिलीग्राम fmol / जी डीपीएम / जी fmol / जी FOM / जी fmol / जी fmol / जी fmol / जी fmol / जी
संख्या 30 मई को 30 मई को 30 मई को 30 मई को 31 मई 1 जून 2-जून 3-जून 4 जून
1 9706 4463 21547320 4463 4411 4361 4,311 4,261 4,212
2 5838 2684 12960360 2684 2,653 2,623 2593 2,563 2533
3 2798 1,286 6211560 1,286 1,272 1,257 1243 1,228 1,214
4 1,451 667 3221220 667 659 652 644 637 630
5 787 362 1747140 362 358 354 350 345 342
6 385 177 854,700 177 174 173 171 169 167

तालिका 3:। अंशांकन मानकों के लिए दैनिक क्षय की दर की गणना अंशांकन मानकों के लिए एक दैनिक क्षय की दर स्प्रेडशीट तिथियों जिस पर प्रयोग किया गया था पर आधारित पैदा किए जाने की जरूरत होगी। यह स्प्रैडशीट पहले के आदेश को दर 60 दिनों की एक आधा जीवन (टी आधा) के साथ लगातार पर आधारित है। एन = एन 0 ई * के.टी., जहां एन 125 मैं की एकाग्रता =, पर समय 0 (एन 0), और कश्मीर = LN2 / टी 1/2 पर एकाग्रता के लिए समय टी रिश्तेदार।

अनुभाग </ Tr>
हाइपोथेलेमस paraventricular Nucleous
लक्ष्य घनत्व-fmol / जी स्कैन क्षेत्र कुल लक्ष्य क्षेत्र कुल*
कुल 1 996 4383 4383 996
कुल 2 921 3362 3362 921
कुल 3 818 3445 3445 818 विशिष्ट बंधन
कुल 4 710 2906 2906 710 967
औसत 861 3,524 3,524 861 895
763
अनुभाग लक्ष्य घनत्व-fmol / जी स्कैन क्षेत्र कुल लक्ष्य क्षेत्र गैर विशिष्ट * 678
एनएसपी 1 53 3,072 1,737 30 826
एनएसपी 2 52 2959 1,455 26
एनएसपी 3 86 3180 2,035 55
एनएसपी 4 53 3293 1,995 32
औसत 61 3126 1,805.5 36
गौण Olfac के बिस्तर न्यूक्लियसइतिहास पथ
अनुभाग लक्ष्य भट-fmol / जी स्कैन क्षेत्र कुल लक्ष्य क्षेत्र कुल*
कुल 1 439 3632 3632 439
कुल 2 435 3632 3632 435
कुल 3 355 3632 3,620 354
कुल 4 435 3632 3631 435 विशिष्ट बंधन
कुल 5 342 3632 3,630 342 414
कुल 6 334 3632 3,606 331 393
औसत 390 3632 3,625 389 321
394
315
अनुभाग लक्ष्य भट-fmol / जी स्कैन क्षेत्र कुल लक्ष्य क्षेत्र गैर विशिष्ट * 320
एनएसपी 1 49 3632 1,846 25 360
एनएसपी 2 64 3632 2362 42
एनएसपी 3 53 3632 2,275 33
एनएसपी 4 64 3632 2,339 41
एनएसपी 5 51 3632 1,879 26
एनएसपी 6 41 3632 966 1 1
औसत 54 3632 1,945 30
* कुल और गैर-speciic fmol / जी का घनत्व इकाइयां हैं।
कुल = घनत्व * कुल लक्ष्य क्षेत्र / क्षेत्र स्कैन
गैर विशिष्ट = घनत्व * कुल लक्ष्य क्षेत्र / क्षेत्र स्कैन
कुल लक्ष्य क्षेत्र पिक्सल है कि सीमा मूल्य से अधिक है, के लिए 0.00 fmol / संभव के रूप में ग्राम के रूप में बंद सेट है।
पिक्सल सीमा से अधिक नहींमूल्य के कुल घनत्व के आकलन के लिए 0 के एक मूल्य प्राप्त करते हैं।
सीमा मूल्य से अधिक नहीं पिक्सल गैर विशिष्ट घनत्व के आकलन के लिए 0 के एक मूल्य प्राप्त करते हैं।
विशिष्ट बंधन शून्य से गैर विशिष्ट fmol / जी का घनत्व इकाइयों के रूप में व्यक्त बंधन कुल है।

सारणी 4:। पिक्सल में fmol / एक स्प्रेडशीट जी, क्षेत्र स्कैन, और कुल लक्ष्य क्षेत्र के रूप में गौण घ्राण पथ की इमेजिंग सॉफ्टवेयर निर्यात डेटा हाइपोथेलेमस और बिस्तर नाभिक की paraventricular नाभिक के मात्रात्मक विश्लेषण। 'गैर-विशिष्ट' बंधन 'कुल' आदेश 1 मात्रात्मक बाध्यकारी पर विशिष्ट प्राप्त करने के बंधन से घटाया जाता है।

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Discussion

प्रोटोकॉल वर्णित 'कुल' और 'गैर विशिष्ट' एक कृंतक मस्तिष्क पहले से काटा और -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत का राज्याभिषेक वर्गों के आसन्न वर्गों में radioligand के बंधन के दृश्य दिखाता है, और लगभग हर ऊतकों को आसानी से लागू किया जा सकता है कि संरचनात्मक रूप substructures जो रिसेप्टर्स या radioligand बाध्यकारी साइटों का अंतर मात्रा में प्रदर्शित संकल्प किया है। प्रक्रियाओं प्रोटोकॉल के भीतर वर्णित सरल कर रहे हैं और विश्लेषण सही ढंग से परिणामों की व्याख्या के लिए महत्वपूर्ण है। 20 माइक्रोन मोटाई इष्टतम होने के लिए निर्धारित किया गया था; यदि खंड भी मोटी है गैर विशिष्ट बंधन में वृद्धि होगी, यह मुश्किल अपने लक्ष्य के लिए radioligand के बंधन को हल करने के लिए कर रही है। खंड पतले काट रहा है, इसे सफलतापूर्वक कटौती और विरूपण के बिना अनुक्रमिक वर्गों को बचाने के लिए मुश्किल हो जाता है। इष्टतम काटने तापमान ऊतक की प्रकृति और वर्गों और मैं की मोटाई के कारण थोड़ा भिन्न होगीआमतौर पर अनुभव से निर्धारित। एक बार संपर्क ब्लेड और ऊतकों के बीच किया जाता है, नमूना के उन्मुखीकरण की समीक्षा की जा सकती है, और ऊतक नमूना वापस ब्लेड से दूर जा रहा है, और बढ़ते गेंद reorienting द्वारा पुनः संगठित। जब एक कृंतक मस्तिष्क काटने यह मस्तिष्क के बाएँ और दाएँ पक्ष सुनिश्चित करने के लिए एक ही Antero-postero निर्देशांक में हैं महत्वपूर्ण है, और है कि dorso उदर अक्ष सीधा आमतौर पर इस्तेमाल करने के लिए मस्तिष्क एटलस है। स्लाइड सेट आदेश के ऊतकों के आसन्न वर्गों पर अध्ययन का संचालन करने में पूर्व लेबल रहे हैं। 5 स्लाइड के पहले सेट में 1-1, 1-2, 1-3, 1-4, 1-5 और लेबल रहे हैं। पहली कट खंड ऊपरी बाएँ कोने में स्लाइड 1-1 पर चला जाता है (इस स्लाइड के ऊपरी दाएँ हाथ के कोने में जब यह नीचे की ओर पाले है); दूसरी कट खंड स्लाइड 1-2, आदि पांचवें कटौती अनुभाग स्लाइड 1-5 पर चला जाता है पर चला जाता है। छठे कटौती खंड प्रथम खंड के बाईं ओर स्लाइड 1-1 पर चला जाता है। बाद स्लाइड्स का पहला सेट भर जाता है, खिसक 5 का एक और सेट शुरूes, 2-1, 2-2, 2-3, 2-4, 2-5 और लेबल। इस चक्र में अब तक आवश्यक रूप में मस्तिष्क में वापस के रूप में जारी किया जाता है। "-4" और "-5" स्लाइड एक बैकअप के रूप में या एक अलग रिसेप्टर radiolabel करने के लिए रखा जाता है।

रिसेप्टर autoradiography प्रोटोकॉल का इस्तेमाल किया radioligand पर निर्भर करता है और रिसेप्टर्स की विशेषताओं buffers, लवण और अवरोधकों की सांद्रता निर्धारित करने के लिए सर्वेक्षण किया जा रहा है। इस प्रक्रिया में आंग द्वितीय रिसेप्टर्स की AT1 उप प्रकार की माप के लिए, एक उच्च आत्मीयता आयोडीन -125 लेबल ligand, 125 मैं-सार 1 इले 8 -Ang द्वितीय (125 मैं-एसआई आंग द्वितीय); रॉबर्ट सी स्पेथ, पीएच.डी. radiolabeled (पेप्टाइड Radioiodination साझा संसाधन, जॉर्ज टाउन विश्वविद्यालय), जो भी व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है) AM5 बफर में भंग कर रहा है (तालिका 1); सोडियम क्लोराइड, EDTA और bacitracin के साथ एक सोडियम फॉस्फेट बफर। AM5 metallopeptidases और bacitracin के प्रति संवेदनशील peptida से radioligand की अच्छी सुरक्षा प्रदान करता हैसत्र एक शारीरिक पीएच और सोडियम क्लोराइड एकाग्रता प्रदान करने बाध्यकारी विशेषताओं अनुकूलन करने के लिए। AM5 में पूर्व ऊष्मायन radioligand गिरावट को कम करने के लिए अवरोधकों पेप्टिडेज़ करने के लिए ऊतक वर्गों को उजागर करता है, और यह भी आंग द्वितीय रिसेप्टर्स से अंतर्जात आंग द्वितीय विघटित। Losartan और PD123319, AT1R और AT2R विरोधी, क्रमशः, कि तर अपने लक्ष्य रिसेप्टर्स सांद्रता (10 माइक्रोन) के कम से जोड़ रहे हैं इन रिसेप्टर्स के लिए बाध्य बाध्यकारी गैर विशिष्ट आकलन और AT1 रिसेप्टर के लिए बाध्य विशिष्ट सीमा क्रमश से radioligand रोकने के लिए। परख के लिए 125 मैं-एसआई आंग द्वितीय के वांछित एकाग्रता निर्धारित किया जाता है और शेयर के समाधान के लिए जरूरी कमजोर पड़ने रेडियो आइसोटोप क्षय की दर की एक स्प्रेडशीट से निर्धारित किया जाता है (देखें प्रोटोकॉल 3 टेबल)। बेहतर radioligand की एकाग्रता कश्मीर डी approximating जो वर्तमान रिसेप्टर्स के 50% पर कब्जा होगा प्रयोग किया जाता है। हालांकि, क्योंकि radioligands महंगा कम सांद्रता ई हो सकता है.g। कश्मीर डी एकाग्रता का 10-20% के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। यह कम करने के गैर विशिष्ट विशिष्ट बंधन से अधिक बंधन से शोर अनुपात करने के लिए संकेत में वृद्धि का एक संभावित लाभ दिया है। हालांकि, अब जोखिम बार बाध्यकारी की एक छवि विकसित करने के लिए आवश्यक हैं। (धारा 3.4) से ऊपर बताया गया है, अगर जोखिम प्राप्त ओवर या उजागर किया जा रहा है, स्लाइड एक छोटे और / या लंबे समय के वांछित जोखिम को प्राप्त करने के लिए एक नई फिल्म के लिए फिर से अवगत कराया जा सकता है।

Densitometric छवि विश्लेषण एक मालिकाना इमेजिंग प्रणाली है कि autoradiography के लिए आवेदनों की एक व्यापक संग्रह के साथ ही अन्य अनुप्रयोगों प्रदान करता है के द्वारा किया जा सकता है। अंशांकन मानकों गीले टिश्यू वजन (ऊतक के लिए एक के एक विशिष्ट गुरुत्व संभालने) की fmol / जी रहे हैं। प्रत्येक मानक सेट, एक पृष्ठभूमि के साथ एक मानक वक्र उत्पन्न होगा। वहाँ कई वक्र ढाले के साथ और उपलब्ध भार रिश्तेदार ऑटोमेटिक डी से एक मानक वक्र उत्पन्न करने के लिए बिना एल्गोरिदम हैंensity (रॉड) विभिन्न अंशांकन मानकों के लिए मूल्यों। वक्र सबसे अच्छा डेटा का प्रतिनिधित्व करता है कि चयन की वक्र ढाले के लिए उपनेमका अलग मानक घटता के लिए रिश्तेदार त्रुटि मान प्रदान नहीं करता है के रूप में अनुभव से किया जाता है। अप ~ 0.6 छड़ में मानक वक्र pseudolinear है। हालांकि, फिल्म इस मुद्दे पर एक वक्र है कि चारों ओर 0.8 0.9 करने के लिए रॉड इकाइयों के गठन asymptotes परे तर करने के लिए शुरू होता है। मानक है कि नमूने bracketing कर रहे हैं ऊपर 0.9 रॉड इकाइयां हैं, तो यह fmol / छ मानक के pseudolinear सीमा के करीब नमूने के बंधन की अधिक विश्वसनीय मूल्यों को प्राप्त करने के लिए समय की एक छोटी अवधि के लिए फिल्म को फिर से बेनकाब करने के लिए सिफारिश की है वक्र। मानक वक्र के इस चरम पर प्राप्त मान बाध्यकारी radioligand में काफी बड़ा अंतर के लिए रॉड में छोटे मतभेदों में परिणाम होगा। इसलिए क्षमता कम हो जाती है बाध्यकारी में परिवर्तन के रूप में अपनी फिल्म संतृप्ति बिंदु दृष्टिकोण का पता लगाने के लिए।

विशिष्ट क्षेत्रों की माप के लिए,सिफारिश उपाय 'घनत्व' fmol / जी में, पिक्सल में 'स्कैन क्षेत्र', और पिक्सल में 'कुल लक्ष्य क्षेत्र' (9 चित्रा) कर रहे हैं। यह संभव (चित्रा 10) के रूप में शून्य के करीब एक सीमा से मूल्य निर्धारित करने के लिए है क्योंकि फिल्म घनत्व या मानक वक्र अंशांकन मानकों से निकाली गई की मनमानी पहलू में बदलाव कभी कभी शून्य से भी कम मूल्यों दे सकते हैं महत्वपूर्ण है। इस तरह के मूल्यों स्कैन क्षेत्र में सभी पिक्सल के लिए औसत रहे हैं, तो यह एक कृत्रिम रूप से कम मूल्य प्राप्त होगा। बाध्यकारी बहुत व्यक्तिपरक हो सकता है के साथ क्षेत्रों की पहचान करने के लिए इस्तेमाल मापदंड है, तो यह सबसे अच्छा है बारीकी से नियंत्रण और प्रयोगात्मक दिमाग जितना संभव हो उतना जोड़ी के लिए व्यक्तिपरक त्रुटियों की घटनाओं को कम करने के लिए। एक और चुनौती कितने वर्गों के लिए एक अंतिम पढ़ पाने के लिए औसत करने के बारे में फैसला करने के लिए है। वर्गों का विश्लेषण करने के लिए एक अच्छा संकेत है एक स्वीकृत चूहे के मस्तिष्क एटलस के बाद, दाग ऊतक विज्ञान स्लाइड के साथ-साथ द्वारा निर्धारित किया जा सकता है। नमूना क्षेत्र का आकार भी एक हो सकता हैमुसीबत। आदेश की भरपाई करने के लिए, एक खाका किसी भी आकार की विसंगतियों को दूर करने के लिए स्थापित किया जा सकता है। वर्गों का इलाज भी संरचना है कि उच्च बाध्यकारी है के एक क्षेत्र को प्रभावित करने और विश्लेषण के दौरान माना जा रहे हैं सकता है। इस स्वामित्व इमेजिंग प्रणाली के रूप में तो मस्तिष्क क्षेत्र के संरचनात्मक विशेषताओं का प्रतिनिधित्व करने के लिए एक मनमाना मूल्य से अधिक घनत्व सीमा निर्धारित करने के लिए 'thresholding' उपकरण के लिए एक विकल्प के उपयोग की आवश्यकता है एक नमूना उपकरण के भीतर हाइपोथेलेमस की paraventricular नाभिक के रूप में इस तरह के जांचा जा रहा है कि ब्याज के क्षेत्र (11 चित्रा, पैनल सी) शामिल हैं। यह भी बाध्यकारी की राशि के निर्धारण में क्षेत्र माप शामिल करने के लिए संभव है। यह पिक्सल है कि मापा गया की संख्या विशिष्ट बंधन बार के लिए मूल्य गुणा करके किया जा सकता है। पिक्सल दो विमानों में एक शासक, या ज्ञात आयामों की एक आयत इमेजिंग द्वारा मीट्रिक इकाइयों के लिए परिवर्तित किया जा सकता है। पिक्सेल की संख्या के अनुरूप है किलंबाई या आयत के क्षेत्र में तो मीट्रिक इकाइयों में व्यक्त किया जा सकता है। 2400 डीपीआई संकल्प में ~ 9000 पिक्सल = 1 मिमी 2 हमारी प्रणाली में।

हालांकि रेडियोधर्मी ligands के उपयोग अब एक व्यापक रूप से इस्तेमाल तकनीक है; यह ऊतक के भीतर नमूनों को खुद के रूप में कार्य रिसेप्टर्स की शारीरिक वितरण कल्पना करने के लिए कुछ तरीके (अपने सहज ligand बाध्यकारी में सक्षम) में से एक है। इसके अतिरिक्त, यह, उपचार समूहों के बीच कार्यात्मक रिसेप्टर अभिव्यक्ति में परिवर्तन का मूल्यांकन करने के लिए सक्षम रिसेप्टर्स की संख्या, अलग मस्तिष्क क्षेत्रों या अन्य संरचनाओं के बीच quantitate कर सकते हैं आदि जानवरों के विभिन्न प्रकारों, या अलग अलग उम्र के जानवरों, वैकल्पिक तरीकों को चिह्नित करने के लिए उपलब्ध हैं के बीच में 1 रिसेप्टर अभिव्यक्ति की neuroanatomical पहलुओं, तथापि, वे सीमित महत्व होता है। MRNA की स्वस्थानी संकरण में 1 रिसेप्टर्स पर हमेशा 1 रिसेप्टर पर अभिव्यक्ति या वितरण के साथ अनुरूप नहीं है के लिएदिमाग। प्रतिरक्षा तकनीक ऊतक वर्गों के धुंधला की तीव्रता के आधार पर रिसेप्टर अभिव्यक्ति में मतभेद का अनुमान लगा सकता है, यह रिसेप्टर अभिव्यक्ति का एक संख्यात्मक निर्धारण के लिए अनुमति देने के लिए धुंधला करने के लिए एक मानक वक्र उत्पन्न करने के लिए संभव नहीं है। रिसेप्टर autoradiography भी रिसेप्टर्स (या अन्य लक्ष्य है कि विशेष रूप से radioligands बाँध) के लिए विशिष्टता प्रतिरक्षा तकनीक का उपयोग गारंटी नहीं किया जा सकता है की एक स्तर प्रदान करता है। 2009 में, लेख की एक श्रृंखला 37-43 कि 49 एंटीबॉडी कि 18 विभिन्न जी प्रोटीन-युग्मित रिसेप्टर्स और एक क्षणिक रिसेप्टर संभावित (टीआरपी) चैनल का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा रहा था की वैधता पर सवाल प्रकाशित किए गए थे। संक्षेप में, एंटीबॉडी प्रकार के जंगली और प्रश्न में रिसेप्टर्स के लिए पीटा चूहों से पश्चिमी blots पर समान बैंड लेबल। बाद में, कई समूहों 1 और 2 रिसेप्टर एंटीबॉडी 44-49 एटी व्यावसायिक रूप से उपलब्ध का उपयोग कर इसी तरह की टिप्पणियों बना दिया है। एक bacteri का उपयोगअल कृत्रिम गुणसूत्र जो एक पत्रकार अणु, जैसे, हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन, 1 प्रमोटर पर द्वारा संचालित उत्पन्न माउस में 1 रिसेप्टर व्यक्त कोशिकाओं में उपस्थिति या अनुपस्थिति का निर्धारण करने का एक अप्रत्यक्ष साधन (लेकिन चूहे नहीं) दिमाग को अपने होने पर आधारित है में 1 रिसेप्टर प्रमोटर 50 एक कार्यात्मक। यह microscopically पहचान मस्तिष्क क्षेत्रों में "सकारात्मक कोशिकाओं" गिनती करने के लिए है, लेकिन इन क्षेत्रों में से कम 1 रिसेप्टर की अभिव्यक्ति की तीव्रता में परिवर्तन quantitate करने के लिए संभव नहीं है। इस प्रकार इस समय में केवल मान्य तकनीक है कि सीधे आंग द्वितीय रिसेप्टर अभिव्यक्ति को मापने के लिए उपलब्ध radioligand बाध्यकारी तरीके हैं। और, कार्यात्मक के संरचनात्मक संकल्प पर 1 रिसेप्टर प्रोटीन एक सूक्ष्म स्तर पर की जरूरत है, रिसेप्टर autoradiography केवल तकनीक इस तरह के प्रत्यक्ष माप के लिए उपलब्ध है।

रिसेप्टर autoradiography सीमाओं के बिना नहीं है। प्रमुख concern जरूरतों को पूरा करने के लिए एक अनुसंधान की स्थापना में रेडियोधर्मी सामग्री का उपयोग करने का है। यह जगह में सख्त दिशा निर्देशों के साथ एक विकिरण सुरक्षा कार्यक्रम शोधकर्ताओं जो रेडियोधर्मी सामग्री और रेडियोधर्मी सामग्री के सुरक्षित स्वभाव के साथ काम की सुरक्षा को आश्वस्त करने के लिए आवश्यक है। यह एक बात है कि कई अनुसंधान सेटिंग में उनके उपयोग को अलग करने के लिए रेडियोधर्मी सामग्री का उपयोग कर अनुसंधान की लागत बदले। इसके अतिरिक्त, radioligands की लागत पर्याप्त हो सकता है। इस प्रकार एक रिसेप्टर autoradiography प्रयोग है जिसमें स्लाइड पर चढ़कर ऊतक वर्गों की एक बड़ी संख्या radioligand के कंटेनरों में incubated रहे हैं नहीं तो radioligand के डॉलर के हजारों सैकड़ों का उपयोग कर सकते हैं। एक और सीमा ऊतकों, एक cryostat पर सेक्शनिंग के लिए पहले से जमे हुए किया जाना चाहिए समय की अवधि के लिए जमा हो जाती है, और जल्दी rinsed और radioligand, जो सभी के रिसेप्टर्स की क्षमता या ब्याज की प्रोटीन radioligand बाध्य करने ख़राब कर सकते हैं के साथ ऊष्मायन के बाद सूखे है । ligands तेजी गधा है कि के लिएसंघ / हदबंदी कैनेटीक्स, यह समय दूर कुल्ला करने के लिए गैर-विशेष रूप से बाध्य radioligand जरूरत दौरान रिसेप्टर को radioligand के बंधन को बनाए रखने के लिए संभव नहीं हो सकता है। इसके अलावा, radioligand फिल्म प्रदर्शन की लंबी अवधि के लिए बाध्यकारी की कम मात्रा के साथ - एक महीने या उससे अधिक - से पहले एक measureable छवि फिल्म पर फार्म कर सकते हैं की आवश्यकता हो सकती है। एक और चुनौती है कि एक ligand के लिए आयोडीन -125 के अलावा steric बाधा के कारण अपने लक्ष्य रिसेप्टर या प्रोटीन के लिए बाध्य करने ligand की क्षमता क्षीण हो सकता है। एक छोटे अणु, जैसे, ट्रिटियम (3 एच) के उपयोग steric बाधा की समस्या को समाप्त, लेकिन ट्रिटियम इतनी कम ऊर्जा और कम विशिष्ट गतिविधि (आयोडीन -125 के सापेक्ष) है कि यह बहुत मुश्किल है अधिकांश के लिए एक फिल्म छवि उत्पन्न करने के लिए रिसेप्टर आबादी। इन मुद्दों के प्रकाश में, वहाँ जिसमें रिसेप्टर autoradiography रिसेप्टर्स या हित के अन्य आणविक संरचना की पहचान करने में असमर्थ है कई स्थितियों रहे हैं।

इसकी ली के बावजूदmitations, रिसेप्टर autoradiography एक ऊतक के भीतर विशिष्ट संरचनाओं की पहचान कर सकते हैं, जैसे, प्रयोगात्मक चर के जवाब में बदल मस्तिष्क क्षेत्रों में एक सामान्य नियंत्रण मस्तिष्क की तुलना में। यह ज्ञान आंग द्वितीय या अन्य रिसेप्टर या रोग की विकृति में एंजाइमों के लिए कम 1 आर की भूमिका निर्धारित करने में मदद कर सकते हैं। के रूप में यह संभावित उपचार के लिए लक्षित करने क्षेत्रों इंगित करता है यह ज्ञान, बहुमूल्य औषधीय प्रभाव पड़ता है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
500 ml Plastic Beakers Fisher 02-591-30
24 mm x 60 mm Coverslips Fisher 22-050-25
Autoradiography Imaging Film 24 mm x 30 cm Carestream-Biomax MR Film 891-2560
Bacitracin (from Bacillus licheniformis) Sigma B-0125
Cardboard Sheet 8 x 11 Crescent Illustration Board #201 201
Coplin Jars Fisher Scientific E94
Commercial hair dryers Conair Model SD6X
Disposable Culture Tubes Fisher 14-961-26
EDTA (Disodium salt, Dihydrate) USB Corporation 15-699
Ethanol Fisher 16-100-210 
Formulary Substitute for D-19 Developer Photographers Formulary, Inc.  01-0036
Glacial Acetic Acid Fisher A38 SI-212
Histoprep/OCT Fisher SH75-125D
Film Fixer Kodak 5160320
Photo flo Kodak 1464502
Losartan Fisher/Tocris 37-985-0
MCID™ Core 7.0 MCID N/A
NaCl Fisher S271
Peel-A-Way slide grips VWR 48440-003
Permount Fisher SP15-100
PD123319 Fisher 13-615-0
Premium Charged Slides, Fine Ground Edge Premiere Microscope Slides 9308W
125I Ligands Perkin Elmer NEX- 248
125SI-Ang II  George Washington University Radioiodinated by Dr. Speth
Slide Mailers Fisher Scientific HS15986
Sodium Dibasic Phosphate Anhydrous (Na2PO4) Fisher RDCS0750500
Sodium Acetate (Anhydrous) Fisher BP333-500
Thionin  Fisher T409-25
X-Ray Casette (10 x 12) Spectronics Corporation Four Square
Xylene Fisher  X3P-1GAL

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तंत्रिका विज्ञान अंक 112 रिसेप्टर autoradiography Cryostat मस्तिष्क सेक्शनिंग एक्स-रे फिल्म विकसित करने कम Angiotensin द्वितीय
Angiotensin द्वितीय रिसेप्टर्स की स्थानीय दृश्य के लिए रिसेप्टर autoradiography प्रोटोकॉल
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Linares, A., Couling, L. E.,… More

Linares, A., Couling, L. E., Carrera, E. J., Speth, R. C. Receptor Autoradiography Protocol for the Localized Visualization of Angiotensin II Receptors. J. Vis. Exp. (112), e53866, doi:10.3791/53866 (2016).

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