Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

קולטן autoradiography פרוטוקול עבור ויזואליזציה המרוכזת של אנגיוטנסין II רצפטורים

Published: June 7, 2016 doi: 10.3791/53866
Automatic Translation
1, 2, 3, 2
1Farquhar College of Arts and Sciences, Nova Southeastern University, 2Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy, Nova Southeastern University, 3School of Medicine, University of Colorado

Abstract

פרוטוקול זה מתאר דפוסים מחייבים קולטן עבור אנגיוטנסין II (אנג II) במוח החולדה באמצעות radioligand ספציפי לקולטניים אנג השנייה לבצע מיפוי קולטן autoradiographic.

דגימות רקמות נקצרות ומאוחסנות ב -80 מעלות צלזיוס. Cryostat משמש סעיף coronally הרקמה (המוח) הפשרת הר בסעיפים גבי שקופיות טעונות. סעיפי הרקמות רכובי השקופיות מודגרת 125 I-SI-אנג שני radiolabel קולטנים אנג השני. שקופיות סמוכות מופרדים לשתי קבוצות: "הלא ספציפיות מחייבים" (NSP) בנוכחות ריכוז להרוות הקולטן של הלא רדיואקטיבי אנג השנייה, או AT 1 תת סוג קולטן אנג השני (AT 1 R) אנטגוניסט לרצפטור אנג שני סלקטיבית , ו 'סה"כ מחייב "ללא AT אנטגוניסט R 1. ריכוז להרוות של תת-סוג קולטן AT 2 אנג השנייה (AT 2 R) אנטגוניסט (PD123319, 10 מיקרומטר) קיים גם incubatiעל חיץ להגביל 125 I-SI-אנג השנייה מחייב את תת סוג R AT 1. במהלך 30 דקות הדגירה טרום ב ~ 22 ° C, מגלשות NSP נחשפים 10 מיקרומטר PD123319 ו Losartan, כאשר בוחרים באפשרות 'סה"כ מחייב' שקופיות נחשפים 10 מיקרומטר PD123319. שקופיות מודגרת מכן עם 125 I-SI-אנג השנייה בנוכחות PD123319 עבור 'להסתכם מחייב', ו PD123319 ו Losartan עבור NSP חיץ assay, ואחריו כמה 'שוטף' חיץ, ומים כדי להסיר מלח אי כבול radioligand במיוחד. השקופיות הן יבשות באמצעות מכת מייבשים, אז נחשפו סרט autoradiography באמצעות סרט קלטת מיוחד. הסרט הוא פיתח את התמונות נסרקים לתוך המחשב עבור צפיפות ויזואלית וכמותית באמצעות מערכת הדמיה קנייני גיליון אלקטרוני. סט נוסף של שקופיות thionin מוכתם להשוואות היסטולוגית.

היתרון של שימוש autoradiography קולטן הוא היכולת לדמייןאנג השנייה קולטנים באתרו, בתוך קטע של דגימת רקמות, אנטומית לזהות את האזור של הרקמה על ידי השוואתה קטע התייחסות היסטולוגית סמוך.

Introduction

מחלות לב וכלי דם ממשיכה להיות הגורם המוביל למוות ונכות בארצות הברית, גרימה יותר מ -30% ממקרי המוות בארצות הברית בשנת 2011 1. הנתונים הסטטיסטיים העדכניים ביותר של איגוד הלב האמריקאי עולה כי יותר מאדם אחד מכל שלוש יש אחד או יותר סוג של מחלות לב וכלי דם. מחקר לב וכלי דם ממשיך לעשות צעדים נגד להבנת המחלה הזאת, אבל כמו דורות להתחיל מזדקן זה הכרחי כדי להמשיך במאמצים אלה. מערכת רנין-אנגיוטנסין (RAS) ממלא תפקיד מרכזי בוויסות של מערכת הלב וכלי הדם בעיקר על ידי קידום טרשת עורקים, דלקת, vasoconstriction מערכתית, והפעלה של מערכת העצבים הסימפתטית (איור 1) 2-8.

ראס הוא המערכת ההורמונלית, כי הוא מופעל כאשר תאים juxtaglomerular של הכליה להפריש רנין לתוך זרם הדם בתגובה וירידה בלחץ דם, גדל sympatגירוי hetic, או ירידה בזרימת נתרן ידי Densa המקולה. רנין חילוף החומרים angiotensinogen (מסונתז בכבד) כדי ליצור אנגיוטנסין I (אנג לי). אנג לי עובר מטבוליזם מכן על ידי אנזים-המרת אנגיוטנסין (ACE), גידול ectoenzyme בצד luminal של תאי האנדותל של כלי הדם, בעיקר הריאות והכליות, כדי ליצור אנגיוטנסין II (אנג II), הפפטיד מפעיל הראשי של RAS. אנג II הוא מסוגל הפעלת שתי תת קולטן; הקולטן מסוג 1 (AT 1 R) לבין הקולטן מסוג 2 (AT 2 R), הן המסדירות את מערכת הלב וכלי הדם, לשמור על הומאוסטזיס נוזלים ואלקטרוליטים ו נחשבים כיום להשפיע על התפקוד הקוגניטיבי ומחלות ניווניות מעבדת 8,9. RAS מקומי, מוח ספציפי מדווח באופן עצמאי לסנתז אנג שנייה. בשנת המוח, angiotensinogen חלבון מבשר הוא מסונתז astroglia 10 מומר אנג לי על ידי אנזים רנין דמוי 3, ואולי כבול prorenin לקולטן prorenin11, ולאחר מכן להמיר אנג השנייה על ידי אנזים-המרת אנגיוטנסין אשר מבוטא בשפע על פני השטח התאיים של נוירונים במוח 12. Intrabrain זה שנוצר אנג II הוא אגוניסט למוח AT 1 ו- AT 2 קולטנים מבודדים השנייה אנג שמקורן בדם.

בעוד AT 1 R ממלא תפקיד פיזיולוגי חשוב, זה ידוע יותר עבור אפקטים pathophysiological שלה בכל הגוף, המשפיעים על מערכת הלב וכלי הדם בעיקר והכליות (איור 2). כאשר אנג II נקשר R 1 AT, שהיא גורמת vasoconstriction; הגדלת התנגדות לזרימת דם והעלאת לחץ דם. זה גם מקדם סינתזה הפרשת אלדוסטרון ווסופרסין, שמוביל נתרן מוגברת החזקת מים. תופעות אלה יכולים גם לגרום נזק מוחי איסכמי וליקויים קוגניטיביים והיא צמודה מחלת פרקינסון, מחלת אלצהיימר, ואת diabetes, כמו גם להיות זיהו באחרונה להשפיע למידה וזיכרון 13-15. יש לולאת משוב בשכונת ראס באותה AT 1 R על תאי juxtaglomerular בכליות מעכב הפרשת רנין. מעניין לציין, כי R AT 2 בדרך כלל נגד מווסת את הפעולה של AT 1 R, גרימת התרחבות, תולדה neurite, התחדשות axonal, אנטי התפשטות, cerebroprotection בקרב רבים אחרים 16-20. ה- R AT 2 גם זוהה כיעד אנטי יתר לחץ דם ולאחרונה, תרופות אנטי-סרטני 21. קביעת לוקליזציה הצפיפות של קולטנים אנג השניים בתוך רקמות שונות וכיצד הם מושפעים טיפולים שונים ומצבי המחלה באמצעות autoradiography קולטן densitometric כמותית יעזור לחשוף את התפקיד RAS משחק במחלות ספציפיות.

autoradiography קולטן שימש במשך למעלה מ -30 שנה כשיטה יעילה עבור המעידים על נוכחות של אנגיוטנסין Iאני קולטנים ורכיבים אחרים של RAS במוח וברקמות אחרות של חולדה, עכבר, שרקן, הכלב האנושי תחת מגוון רחב של תנאי הניסוי 22-34. החשיבות של איתור קולטנים השני אנג בתוך המוח היא שאפשר להחיל הנוירואנטומיה פונקציונלי לפעולות של אנג השנייה במוח, למשל, הנוכחות של R AT 1 בגרעין paraventricular של ההיפותלמוס (PVN) מציעה פונקציה של אנג שני במוח כדי לעורר וזופרסין, אוקסיטוצין או שחרור הורמון קורטיקוטרופין (CRH) שחרור, או הפעלה של מערכת העצבים הסימפתטית. לכן, תרופות החוסמות את R AT 1 עשויות להקטין כמה תופעות PVN בתיווך אלה הקשורים על פעילות של RAS המוח. תוצרת בעיבוד מראה שהשימוש של AT 1 יריבי R יכול להקטין הפרעת דחק פוסט-טראומטי (PTSD) שחרור -induced של CRH ו לשפר את הסימפטומים של PTSD (Hurt et al., שהוגש לפרסום). PVN, subfornicalהאיבר (SFO), ו האמיגדלה ידוע להסדרת הומאוסטזיס, תיאבון / צמא, שינה, זיכרון, תגובות רגשיות, והם בתחומי היעד של מחקר הפגנה הזאת. אזורים אלה נבחנו על ידי איסוף חלקי עטרה של מוח על שקופיות מיקרוסקופ, וטיפול הקטעים עם מעכבים ספציפיים יחד עם radioligand ספציפי לקולטניים אנג השני. במחקר זה, כל החומרים ריאגנטים יחד עם ספקים הציעו מפורטים, יוד-125 שמשו radiolabel אנטגוניסט לקולטן אנג השנייה, sarcosine 1, isoleucine 8 אנג שני (SI אנג II), אשר היה מטוהר אז כמו שאני מוניתי 125 -SI אנג II באמצעות שיטות HPLC כפי שתואר לעיל 35. השימוש radioligand פעילות ספציפית גבוהה זה מאפשר הדמיה של תחומי צפיפות קולטני נמוך, בינוני וגבוה לאחר חשיפה של חלקים רדיואקטיבי כדי הסרט רנטגן. על ידי כיול הסרט לתקני רסק מוח המכילים לסכומים ידועים של יוד-125, הסכום המבוקששל קולטן אנג השני מחייב בשטח ניתן לכמת. במחקרים ניסיוניים, הקולטן אנג השנייה מחייב במוחם של הנבדקים הניסוי ניתן בהשוואה לזו במוחם של נבדקים בריאים. זה יכול לציין אם הפעולות של אנג שנייה הם שינו בתגובת מחלה גנטית, נורמליות פנוטיפי, מצב מחלה או טיפול תרופתי. ידע זה יכול להיות מיושם על הפיתוח של טיפולים לטיפול במחלות הקשורות חוסר ויסות של RAS. טכניקות חלופיות המזהות קולטן אתרי קישור, אבל עם רזולוציה אנטומיים מופחתת, מחייבות מבחנים המשתמשות הכנות קרום רקמות נגזרות homogenates רקמות, אשר מודגרת עם radioligand על פני טווח של ריכוזיים להעריך זיקה מחייבת radioligand כמו הקבוע דיסוציאציה (K D ) וקיבולת מחייב מקסימלי (מקסימום B) של הרקמה של עניין.

הפרוטוקול המתואר כאן יכול להיות שבור למטה לתוך 5 שיתוף גדולmponents: הכנת סעיפי רקמות עבור קולטן autoradiography; קולטן autoradiography; חשיפה לקולנוע פיתוח; היסטולוגיה; ניתוח תמונה densitometric.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הנהלים כל חיה שהתקיימו לצורכי מחקר זה אושרו על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים השתמש של נובה אוניברסיטת מזרח בהסכמה עם מדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה, 8 מהדורה עשירית (סוכנות הידיעות האקדמיה הלאומית, וושינגטון הבירה, 2011 ).

1. סעיפי רקמות הכנות לקראת קולטן autoradiography

  1. עם הקרבה, רקמות המוח הקציר טרי, ועוטפים בנייר אלומיניום ומכניסים -20 ° C במקפיא בהקדם האפשרי. כדי לשמור על הצורה הנכונה, למקם את המוח בתוך תבנית המוח המדמה את החלק הפנימי של הגולגולת, לעטוף בנייר אלומיניום ומכניסים - 20 ° C במקפיא. לאחר 30 דקות, רקמות מקום בתוך שקית אחסון במקפיא סגר ולעבור במקפיא -80 מעלות צלזיוס במשך אחסון לטווח ארוך.
    1. השג את דגימת רקמות הקפואה של עניין מן המקפיא -80 מעלות צלזיוס, ולהעביר cryostat להגדיר עד למינימום של 10 מעלות צלזיוס לכל היותר -18 ° C, כדי למנוע הפשרה. מניח את הדגימה על מרקמם הר עם גליקול ובינוני הטבעה מבוססת שרף, הטמעה רק חלק קטן של הדגימה לתוך המדיום. עבור מוח, המוח הוא רכוב אנכי כדי לאפשר חתך במישור העטרה.
  2. הנח את רקמת הר על microtome בתוך cryostat והדק במקומו. ודא צד שמאל וימין של המוח נמצאים באותו הקואורדינטות אנטרו-postero, וכי הציר dorso- הגחון הוא בניצב אטלסים המוח נפוץ.
  3. בגין חיתוך ב לעובי הרצוי (20 מיקרומטר מומלץ) ולהפשיר הר בסעיפים גבי שקופיות מיקרוסקופ בכיוון אנכי יש שטח פנים גדול יותר של שטח בשקופית. אסוף חלקים על גבי שקופיות בסטים רציפים של חמש, כלומר את הסט הראשון של שקופיות מסומנים 1-1, 1-2, 1-3, 1-4, ו 1-5 (איור 3).
  4. לאחר מילוי קבוצה של שקופיות עם קטעים, לאפשר שקופיות לייבוש באוויר עד שעה 1, ולאחר מכן למקם את SLIdes בתיבת שקופיות פלסטיק בשקית אחסון במקפיא עצמית איטום, ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס.

2. קולטן autoradiography

זהירות: רדיואקטיביות. השתמש לבוש מגן לטפל רדיואקטיביות. המיועדת לסילוק תלוי ממסד, והן חייב לציית להנחיות להירקב כמו שצריך (זמן מחצית חיים 60 ימים) או להיות נטל על ידי חברה מוסמכת.

  1. הסר את "-1" ו "-2" שקופיות של עניין מהמקפיא -20 ° C ו הר לתוך אוחז שקופיות (איור 5). הר השקופיות "-1" יחד לטיפול "הלא ספציפי", ואת השקופיות "-2" לטיפול "הכולל". 'שאינן ספציפיות "צנצנות תכלנה 10 מיקרומטר ריכוזיות סופי של PD123319 AT 2 אנטגוניסט R, ו Losartan AT 1 אנטגוניסט R, במאגר בינוני assay (AM5) (טבלה 1), את' הכוללים 'צנצנות מחייב תכלנה רק 10 מיקרומטר PD123319 ב AM5.
  2. הפוך את השקופיתאוחז למקם את השקופיות לתוך צנצנות Coplin מראש הדגירה מלאים 35-40 מ"ל של AM5, ומעכבי בהתאמה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. התחל סטים עוקבים באמבט טרום הדגירה שלהם ב 4 מרווחי דקות.
  3. מיד להעביר שקופיות מפתרון הדגירה מראש כדי הדיוורים שקופיות הדגירה, המכיל 10 מ"ל של AM5, בתוספת ריכוז קבוע מראש של 125 I-SI-אנג השנייה (מחושב באיור 4) עם מעכבי בהתאמה, עבור 60-90 דקות ב חדר טֶמפֶּרָטוּרָה. אם יש radioligand מספיק, 10 מגלשות ניתן למקם (BACK TO BACK) ב אוחז שקופיות שונה וטופחו עם 125 I-SI-אנג השנייה בצנצנות Coplin.
  4. מקום מחליק בחזרה לתוך אוחז שקופיות (במידת הצורך), כתם, ולשטוף ידי מתערבל בעדינות במשך 1-2 שניות ב -400 מ"ל מים מזוקקים בשני מיכלים נפרדים.
  5. העברת שקופיות ברצף לארבע צנצנות Coplin המכיל 35-40 מ"ל של AM5 בדיוק 1 דקות כל אחד (כפי שמודגם באיור 4 </ Strong>).
  6. לאחר שטיפה 1 דק 'האחרון, בעדינות מערבולת בסעיפים 1-2 שניות בארבעה שינויים של מים מזוקקים קרים כקרח.
  7. לייבש את השקופיות עם אוויר קריר (זהירות: אוויר חם volatizes במתחם רדיואקטיבי) באמצעות ארבעה מייבשי שיער להגדיר מזוויות שונות למשך 4 דקות (איור 5), עד שכל החלקים יבשים, ואז למקם על מגבת נייר.
  8. הר שקופיות עם רקמות פונות כלפי מעלה על גבי קרטון עבור פרד לסרטו רנטגן באמצעות סרט דו צדדי.
  9. הר אחד לפחות, כיול יוד 125 שקופית סטנדרטית על כל קרטון (איור 6).
    הערה: סטנדרטים כיול מורכב להדביק המוח מעורב באופן יסודי עם 125 יוד חייב תרכובת המכילה טבעת פנול, נדחס על ידי צנטריפוגה בתוך מזרק טוברקולין 1 מ"ל, כי הם cryostat מחולק באותו עובי כמו חלקים במוח להפשיר רכוב על גבי מיקרוסקופ שקופיות. לחלופין, 125 תקנים כיול לי בשרף פלסטיק מחולק על 20 עובי מיקרומטר ניתן להשיג באופן מסחרי. שרף הפלסטיק בתקנים אלו חלקית מגן הסרט מן הקרינה כזו כי שקילות רקמות של ~ 40% צריכות להיות בחשבון את הכיול.

חשיפת קולנוע 3. ופיתוח

  1. המשך חושך עם סרט קלטת autoradiography רצועת גב רנטגן. פתח את הקלטת ומקום הקרטון עם מגלשות בפנים (איור 6).
    1. לכבות את האור ולהדליק את safelight. בזהירות לפתוח את קופסא סרט X-Ray, להסיר סרט אחד, ומניח את צד מבריק סרט מעלה (עם הקצה המשונן על בפינה הימנית התחתונה) על גבי שקופיות הקלטת. בזהירות לסגור את הקלטת, ולסובב את סורגי הנעילה לאטום את האור (איור 6). לחשוף את השקופיות עבור מספר ימים עד מספר שבועות ב -20 ° C.
  2. בחדר החושך, לפתוח את הקלטת ולהמשיך עם proc מפתח הסרטESS.
    1. מניח את השקופיות במגשים ברציפות; יזם למשך 2 דקות, מים המכילים חומצה אצטית קרחונית 5% למשך 30 שניות, ו מסדר למשך 5 דקות. הסרטים הם מכניסים מגש עם מים זורמים במשך 20 דקות, ולאחר מכן להציב לתוך Photoflo לא יותר מ -10 שניות ותלה.
      הערה: זמן החשיפה נקבע באופן אמפירי יכול לערב סרטים מרובים עם זמני חשיפה שונים: מספיק זמן כדי לקבל אותות מדידים מאזורים עם נמוך מחייב, אבל לא כל עוד להרוות את הסרט לפי תחומים עם גבוה מחייב. לאחר מתקבלות חשיפות מקובלות, ולאחר מכן להמשיך לשלב הבא.

4. היסטולוגיה

  1. מכינים את הכתם thionin ריאגנטים מכתים (טבלה 2, איור 7).
    1. מניחים את השקופיות "-3" במעמד שקופיות, והעברת בסדר רציף החל מים ללא יונים 1 דקות, ואז thionin פתרון כתם במשך 10 דקות ולאחריה שלושה מטבלים לתוך Deionמי ized, לשטוף אחד 30 שניות במי deionized.
    2. בעקבות המים, מניחים את מתלה להחליק לתוך שוטף אתנול כדלקמן; 50%, 70%, ו -90% למשך 30 שניות, ואחריו שני שוטף אתנול ב -100% עבור 1 דקות כל אחד. לבסוף, הניחו את מתלה להחליק לתוך קסילן במשך 3 דקות, ולאחר מכן להעביר לידי פתרון קסילן השני במשך 5 דקות.
  2. סר שקופית אחת בכל פעם מאמבטית קסילן האחרונה, ולכסות את הקצה העליון של השקופית עם בסיס שרף במדיום הרכבה ממס אורגני, ומקום coverslip 24 מ"מ x 60 מ"מ לשקופית. אפשר שקופיות יבשות מספיק עבור ~ 48 שעות ולאחר מכן סרוק למחשב ב- 2400 בגווני אפור dpi.

5. ניתוח תמונה densitometric

  1. מניח את צד מבריק סרט למטה, עם הקצה המשונן על הפינה השמאלית התחתונה ולסרוק באמצעות סורק קניינית מסוגל לשדר את מידע צפיפות סרט ללא כל עיוות במחשב מערכת הדמיה.
  2. פתח את sys הדמית הקנייניםTEM ולנצל הסורגים כיול לקבוע כללים כיול לניתוח densitometric העתיד של התמונות על הסרט (איורים 9 - 12).
  3. באזורי מידה של עניין או על ידי הקמת תבנית או אמפירי אשר מתווה את תחומי העניין. נתונים נאספו והפרידו מבוסס על סרט, או שליטה או סוג בר (פסק), ובאזור. הקפד לכלול צפיפות (fmol / g), אזור הסריקה, ואזור היעד הכולל במדידות (איור 9).
    1. התאם ברי אזור סריקה ידי והבטיח כי האזור של עניין נופל בין פרמטרים של הדגשה (איור 10).
    2. נתוני יצוא לתוך גיליון אלקטרוני (לוח 4). הכפל את פעמי הצפיפות באזור היעד הכולל, ולאחר מכן חלק את אזור הסריקה על מנת לקבל את הערך עבור המחייב כי אזור מסוים. ברגע שזה נעשה לכל הערכים שנמדדו, למצע לדגמים הקיימים שאינם ספציפיים ממניין להניב הספציפי מחייב pלְהִתְרַעֵם. ממוצעים עשויים גם להתבצע על ערכים אלה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

בראייה כוללת של המסלול מהטבולים של מערכת רנין-אנגיוטנסין מוצגת באיור 1 והפוקוס הישיר על תת קולטן אנגיוטנסין II (AT 1 R ו- AT 2 R) מתואר באיור 2. איור 3 מציג את העברת מוח עטרה חלקים על גבי שקופיות מיקרוסקופ, אשר לאחר מכן מנוהלים באמצעות הליך autoradiography הקולטן באמצעות ריכוז קבוע מראש 125 I-סיאנג השנייה כפי שניתן לראות באיור 4. איור 5 ממחיש את הצעד ייבוש עבור השקופיות autoradiography קולטן אשר מודבקת אז על גבי קרטון כמו לראות באיור 6, ולאחר מכן מתפתח. טבלה 2 רשימות חומרים כימיים המשמשים עבור ההליך מכתים thionin עבור קטעי רקמה רכוב שקופיות המתוארים באיור 7. ביחידות סטנדרטיות כיול כימות נקבעים based במועד של assay כפי שניתן לראות בטבלה 3. איור 8 מציג את הקמת עקומת סטנדרט הנוגעות 125 ואני ריכוז (רקמת fmol / g) לצלם חשיפה (צפיפות אופטומטרי יחסית). איור 11 ממחיש את ההבדל בין 'NSP " קבוצות 'הכולל', כמו גם התוויות רקמות, בעוד איור 10 מתאר את ההגדרה של סף לערך אפס ליד להשיג ערך ממוצע מדויק עבור האזור שנסרק כולו (שטח סריקה-פיקסל). לוח 4 מציג את כימות תהליך הקבלה ספציפי מחייבים מבוסס על הפחתת 'הלא ספציפית "מערכים" הכוללים ". 'שאינו ספציפי' מחייב המכיל לוסרטן ו / או PD123319 נוצר על ידי כמות radioligand כבול שאינם AT 1, או AT 2 קולטנים. כל radioligand כבול AT 1 קולטנים בנוכחות PD123319 מניב את 'הכולל' מחייב. F מציג igure 11 האזורים שנמדדו הסופיים של PVN בסך הכל לעומת הלא ספציפי מחייב סמוך קטע מוכתם thionin עבור האישור האנטומי של PVN.

איור 1
איור 1:. מסלול מטבולי של מערכת רנין אנגיוטנסין (RAS) בגוף הכבד משחרר את angiotensinogen אַב תַסָס, אשר ביקע ידי רנין כליות-המופרש, ויוצרים אנגיוטנסין I. אנגיוטנסין המרת אנזים (ACE) ממירה אנג לי אנגיוטנסין II ( אנג II), המבשר העיקרי למחלות לב וכלי דם. אנג שנייה גורם vasoconstriction, ומגביר את לחץ דם, תפוקת לב, תיאבון מלח, צמא, ושימור מים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

"> איור 2
איור 2:. פונקציות של סוג אנגיוטנסין 1 ו -2 קולטנים (AT 1 R, AT 2 R) ליום 1 R פתולוגית משפיע מחלות לב וכלי דם, ישירות פועל להגברת הצמא ותיאבון מלח, והוא בעל רבות פעילות הסלולר היקפית אחרת כמו גם מרכזי השפעות פסיכולוגיות. AT 2 R הוא אנטגוניסט פיזיולוגי של הקולטן 1 AT ובכך מסייע בתהליכי היעילות של 1 AT R היריבים 36 ובכך שיש להם השפעה מיטיבה על מבנה כלי הדם. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3: Cryosectioning של מוח על שקופיות מיקרוסקופ על עובי 20 מיקרומטר. תלוי בטמפרטורה של cryostat, החלקים יהיו להציג לעתים קפלים, סדקים, סלסול, או להיות דחוס על להב microtome או בעל סכין. במקרים כאלה בסעיף נמחק ופתק נעשה כדי לציין כי 20 מיקרומטר נוסף יפריד סעיף זה מהסעיף הקודם. סעיפים יש לאסוף בשקופיות בכיוון אנכי על מנת למקסם את השטח הכולל הנדרש כדי למלא את שקופית ולכן לאסוף את הכמות הגדולה ביותר של קטעים על כל שקופית. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4:. מדגם ניסיוני עיצוב פרוטוקול קולטן autoradiography Differentiation של 'הכולל' (-2) ו 'הלא ספציפית "(-1) מתייחס ישירות נוכחות והיעדרות של אנטגוניסט תת סוג קולטן. פרוטוקול עשוי להשתנות בהתבסס על המספר של שקופיות, ויגביר במרווחים של 2 עבור כל זוג של שקופיות סכו הלא ספציפיות. ריכוז Radioligand, נקבע בעבר מתקבל על ידי דילול של המניות לתוך AM5. פתרון זה אז מופץ באופן שווה על מכולות הדגירה. ספירה ישירה נלקחת לפני ואחרי הדגירה להקים את הריכוז המדויק של radioligand. אנא לחצי כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5
איור 5:. תצורה עבור תחנת ייבוש autoradiography קולטן פעמי ייבוש ישתנה בהתאם את היעילות של המכה מייבשים כמו גם את היכולת למחוק משם כל מים עודפים לאחר השטיפות האחרונות. שקופיות תהיינה יבשות פעם בקטע הופך ברור ללבן. אם שקופיות לא הן יבשות לחלוטין אז radioligand יכול לפזר משם מקולט לייצר תמונה מטושטשת שאינה ספציפי עבור קולטן אתרי קישור. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 6
איור 6:.. חשיפת שקופיות מטופלי סרט רנטגן באמצעות קלטת מיוחדת שקופיות הגדרה מומלצת לעקוב אחר דפוס שבו השוואה של שני הקבוצות היא הקל אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

r.within-page = "1"> איור 7
איור 7: הגדרה עבור Thionin מכתים. שקופיות נטענות לתוך החזיק שקופיות ו שקועה לתוך פתרונות רציפים. תזמון מאפשר מכתים יעיל של חומר Nissl (reticulum endoplasmic הגס) של נוירונים. יישום הרכבה בינוני על השקופיות הבאות התייבשות מאפשר לתיקון של coverslip לשקופית, שמירה על החלקים עבור ניתוח השוואתי. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

הספרה 8
איור 8:. הגדרת תקן כיול סרט מכיל סטנדרטי כיול הפרט שלה, המבוססים על רסק המוח לבין המועד שבו הניסוי נעשה . קו רגרסיה המתאר את הערכים בכושר הטובים ביותר מופק על ידי תכנית מערכת הדמית קניינים עבור בסטנדרטי רסק המוח נמדד. זו ממירה את צפיפות אופטומטרי יחסית (ROD) ערך מן הסטנדרטים כיול (מחלות מין קאל, ב אליפסה אדומה) ליחידות של radioligand מחייב, בדוגמה זו יחידות (fmol / g, מוקף בעיגול אדום) הם radioligand fmole כבול לגרם של רטוב משקל רקמות (fmol / g). המדידה בסטנדרטי רסק המוח נעשית עם הכלי העגול והניחה באמצע המדגם יוצג בפינה הימנית ב pseudocolor באמצעות הסמל להציג תמונה (מוקף בעיגול אדום). המעגל למדוד את תקן הכיול לא צריך לכסות את המדגם כולו, אלא למדוד שטח אפילו של ההתקן. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

/53866fig9.jpg "/>
איור 9:. זיהוי קבוצות לפי מספר מדגם, שאינו ספציפיים / סה"כ, ואזורים לקריאת מדגם בגלל מוח מרובה, אזורים במוח, ואת קבוצות ניסוי מרובות הם לכמת יחד, חשוב להבדיל בין כל הגורמים. הנושא מציין את מדגם המוח וגם יכול להצביע קבוצה; הפרק מציין אם מנוע הלא ספציפי (NSP) או מוחלט, ואילו באזור מאפשר זיהוי של אזורי מוח מרובים שמתבצעים שנדגמו. סרגל כלי מדגם (המלבן אדום) מתאר כלי דגימה שונים, למשל, עיגול, ריבוע, תבנית, ביד חופשית, מחק; ניתן להשתמש כי להתוות באזור כדי להימדד. ערכי ROD שהושגו בתחום של כלי הדגימה נרשמים על הגיליון האלקטרוני כיחידות המרה של מחייב, fmol / g (מוקפים בעיגול אדום). בנוסף, את אזור הסריקה הכולל בתוך כלי הדגימה נרשם בעמודה "סריקה באזור פיקסל" בעוד t הכוללאזור arget (מספר הפיקסלים החורגים מערך הסף (כמתואר באיור 10 אגדה) נרשם בעמודה "פיקסל פינת TGT סה"כ". אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 10
איור 10: קביעת הסף עבור דגימות כדי להימדד על בסיס התקני אזור הסריקה הוא ייחודי עבור כל סרט, ותלוי בסטנדרטים שנקבעו.. באמצעות כלי thresholding (מוקף בעיגול אדום) כדי לקבוע ערכי סף עבור טווח הצפיפות עבור אזור הסריקה בסול fmol / יאפשר האזורים הנמדדים (מסומן באמצעות חצים אלכסוניים) לנפול בין מגוון של 0, עד לנקודה שבה עקומת הכיול מתחילה אסימפטוטה המציין כי הסרט מתקרב חשיפה מקסימלית, שמעברו נוסף אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 11
איור 11: נציג תמונות של autoradiography קולטן מחייבות חלקי עטרה של חולדה עם יתר לחץ דם נשית באופן ספונטני (SHR) ב ~ 1.8 מ"מ זנב גבחת, מוצגות בגרעין paraventricular של ההיפותלמוס (PVN) ואת גרעין המצע של דרך ריח האבזר (BAOT ). (א </ strong>) סה"כ עקדת AT 1 R מחייב (אדומי PVN, צהוב BAOT). (ב) שאינו ספציפי מחייב עם Losartan (אנטגוניסט AT1R) ו PD123319 (אנטגוניסט AT2R). (ג) סך הכל מחייב של AT 1 R מחייב עם סף שרירותי הגדרת כגון להתוות את הצורה של (מילוי שחור) PVN העולה על ערך הסף בתוך שטח סריקה הנרשמת כשטח TGT סה"כ). סעיף (ד) Thionin מוכתם לאישור האנטומי של המבנים המראים גבוה הכולל מחייב, לצורך השוואה עם אזורים אחרים במוח או קבוצות ניסוי אחרות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

ריאגנטים כמות
NaCl 8.76 g
Na 2 EDTA 1.86 גרם
Bacitracin 141 מ"ג
500 מ"מ dibasic Na 2 PO 4 100 מ"ל
מזוקקים Deionized מים 900 מ"ל
התאם את ה- pH ל -7.1 עד 7.2 עם NaOH או HCl

טבלה 1: Assay בינוני (AM5) מרכיבים כימיים של למאגר המשמשים בהכנת רקמות..

שולחן 1
טבלה 2:. ריאגנטים כתם Thionin הכתם thionin מורכב של מים מזוקקים, 1.0 M נתרן אצטט 1.0 M קרחוני חומצה אצטית פתרון, טיטרציה pH של 4.3 לפני הוספת 0.5% thionin פתרון.

t.within-page = "תמיד">
תאריך הפניה הימים האחרונים
קְבוּצָה fmol / g משקל רטוב תאריך אסמכתא 1 2 3 4 5
תֶקֶן NCI / מ"ג fmol / g DPM / g fmol / g FOM / g fmol / g fmol / g fmol / g fmol / g
מספר 30-מאי 30-מאי 30-מאי 30-מאי 31-מאי 1-ג'ון 2-יוני 3-יוני 4 יוני
1 9706 4463 21,547,320 4463 4,411 4361 4,311 4261 4,212
2 5,838 2684 12,960,360 2684 2,653 2,623 2,593 2,563 2,533
3 2,798 1,286 6,211,560 1,286 1,272 1,257 1,243 1,228 1,214
4 1,451 667 3,221,220 667 659 652 644 637 630
5 787 362 1,747,140 362 358 354 350 345 342
6 385 177 854,700 177 174 173 171 169 167

טבלה 3:. חישובים שיעור יומי Decay לתקני כיול גיליון אלקטרוני קצב הדעיכה יומי עבור סטנדרטים כיול יהיה צורך נבנתה בהתבסס על המועדים שבהם הניסוי בוצע. גיליון אלקטרוני זה מבוסס על השיעור מהמדרגה הראשונה מתמיד עם זמן מחצית חיים (½ t) של 60 ימים. N = N 0 * דואר KT, כאשר N = ריכוז 125 אני, בזמן t ביחס לריכוז בזמן 0 (N 0), ו- k = LN2 / t 1/2.

סָעִיף </ Tr>
Paraventricular Nucleous של ההיפותלמוס
יַעַד צפיפות-fmol / g שטח סריקה אזור היעד סה"כ סה"כ*
סה"כ 1 996 4383 4383 996
סה"כ 2 921 3,362 3,362 921
סה"כ 3 818 3,445 3,445 818 ספציפי מחייב
סה"כ 4 710 2,906 2,906 710 967
מְמוּצָע 861 3,524 3,524 861 895
763
סָעִיף יַעַד צפיפות-fmol / g שטח סריקה אזור היעד סה"כ שאינו ספציפי * 678
NSP 1 53 3,072 1,737 30 826
NSP 2 52 2,959 1,455 26
NSP 3 86 3,180 2,035 55
NSP 4 53 3,293 1,995 32
מְמוּצָע 61 3,126 1,805.5 36
גרעין המצע של אביזר Olfacבדרכי טורים
סָעִיף יַעַד מאורות-fmol / g שטח סריקה אזור היעד סה"כ סה"כ*
סה"כ 1 439 3,632 3,632 439
סה"כ 2 435 3,632 3,632 435
סה"כ 3 355 3,632 3,620 354
סה"כ 4 435 3,632 3,631 435 ספציפי מחייב
סה"כ 5 342 3,632 3,630 342 414
סה"כ 6 334 3,632 3,606 331 393
מְמוּצָע 390 3,632 3,625 389 321
394
315
סָעִיף יַעַד מאורות-fmol / g שטח סריקה אזור היעד סה"כ שאינו ספציפי * 320
NSP 1 49 3,632 1,846 25 360
NSP 2 64 3,632 2,362 42
NSP 3 53 3,632 2,275 33
NSP 4 64 3,632 2,339 41
NSP 5 51 3,632 1,879 26
NSP 6 41 3,632 966 11
מְמוּצָע 54 3,632 1,945 30
* סך הכל ללא speciic הן יחידות צפיפות fmol / g.
סה"כ = צפיפות * אזור יעד הכל / אזור סריקה
שאינו ספציפי = צפיפות * אזור יעד הכל / אזור סריקה
אזור היעד הכולל הוא פיקסלים כי חריגה מערך הסף, להגדיר קרוב ל 0.00 fmol / g ככל האפשר.
פיקסלים שלא יעלה על הסףערך לקבל ערך של 0 להערכת צפיפות כוללת.
פיקסלים שלא יעלו על ערך הסף לקבל ערך של 0 להערכת צפיפות שאינה ספציפית.
ספציפית מחייב הוא סה"כ מינוס הלא ספציפי מחייב מבוטא יחידות צפיפות fmol / g.

לוח 4: ניתוח כמותי של גרעין paraventricular של הגרעין ההיפותלמוס והמיטה של דרכי אבזר הרחת נתוני יצוא תוכנת הדמיה כמו גיליון אלקטרוני ב- fmol / g, אזור סריקה, ואזור היעד הכולל בפיקסלים.. 'שאינו ספציפי "כריכת ונגרע' הכולל 'מחייב על מנת להשיג את המבוקש AT 1 כמותית מחייב.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הפרוטוקול מתואר מזהה את להדמיה של 'הכולל' ו 'הלא ספציפי "מחייב של radioligand בסעיפים סמוכים סעיפי עטרה של מוח מכרסם שנקטף בעבר ומאוחסן ב -80 מעלות צלזיוס, והוא יכול להיות ישים בקלות כמעט בכל רקמה אנטומית פתר substructures אשר להציג כמויות הפרש של קולטנים או אתרי קישור radioligand. הנהלים התואר בתוך הפרוטוקול פשוטים הניתוח הוא קריטי עבור בפירוש תוצאות כראוי. 20 מיקרומטר העובי היה נחוש בדעתו להיות אופטימלי; אם הסעיף עבה מדי הלא ספציפי המחייב יגדל, ולכן קשה לפתור את הכריכה של radioligand למטרתה. אם הקטע הוא חתך דק יותר, הוא הופך להיות קשה לחתוך בהצלחה ולשמור חלקים רציפים ללא עיוות. טמפרטורת החיתוך האופטימלית תשתנה מעט בשל אופיו של הרקמה ואת העובי של חלקים ואניזה בדרך כלל נקבע באופן אמפירי. לאחר יצירת קשרים בין הלהב לבין הרקמות, את הכיוון של הדגימה יכול להיבדק, ומכוון את עצמם מחדש על ידי העברת דגימת הרקמות בחזרה מן הלהב, ושינוי מוכוונות הכדור הגובר. כשמנסרים מוח מכרסם זה קריטי על מנת להבטיח שמאל לצד ימין של המוח נמצאים באותו הקואורדינטות אנטרו-postero, וכי הציר dorso- הגחון הוא בניצב אטלסים המוח נפוץ. סטי שקופיות הם מראש שכותרתו כדי לבצע מחקרים על חלקים סמוכים של רקמות. הסטים הראשונים של 5 מגלשות מסומנים 1-1, 1-2, 1-3, 1-4, ו 1-5. סעיף החתך הראשון ממשיך שקופיות 1-1 בפינה השמאלית העליונה (זה בפינה הימנית העליונה של השקופית כאשר הוא בצד חלבי למטה); בסעיף לחתוך השני ממשיך שקופיות 1-2, וכו 'החלק לחתוך החמישי ממשיך שקופיות 1-5. החלק לחתוך השישי ממשיך שקופיות 1-1 משמאל את החלק הראשון. לאחר הסדרה של השקפים הראשונות מלאה, להתחיל קבוצה נוספת של 5 החליקהes, שכותרתו 2-1, 2-2, 2-3, 2-4, ו 2-5. מחזור זה נמשך עד בחזרה לתוך המוח לפי הצורך. את "-4" ו "-5" שקופיות נשמרים כגיבוי או radiolabel קולטן שונה.

פרוטוקול autoradiography קולטן תלוי radioligand המשמש ואת המאפיינים של קולטנים הנסקרים לשם קביעת הריכוזים של מאגרים, מלחים מעכבים. עבור מדידה של תת-סוג AT1 של קולטנים אנג השנייה בהליך זה, ליגנד שכותרתו גבוהה זיקה יוד-125, 125 I-סאר 1 Ile 8 -Ang השנייה (125 I-SI-אנג II); רדיואקטיבי על ידי רוברט ג Speth, Ph.D. (משאב משותף פפטיד Radioiodination, אוניברסיטת ג'ורג'טאון), שהוא גם זמינים מסחרית) הוא מומס חיץ AM5 (טבלה 1); חיץ פוספט נתרן כלוריד נתרן, EDTA ו Bacitracin. AM5 מספק הגנה טובה של radioligand מ metallopeptidases ו peptida Bacitracin רגישses מתן pH פיזיולוגי וריכוז NaCl כדי לייעל מאפיינים מחייב. הדגירה טרום ב AM5 חושף את הסעיפים רקמות כדי peptidase inhibitors כדי למזער השפלה radioligand, וגם מנתק אנדוגני אנג השנייה מן הקולטנים אנג השנייה. יריבי Losartan ו PD123319, AT1R ו AT2R, בהתאמה, כי להרוות קולטנים היעד שלהם מתווספים בריכוזים (10 מיקרומטר) כדי למנוע את radioligand מלהיקשר קולטנים אלה להעריך את הלא ספציפיים מחייבים ולהגביל ספציפיים מחייבים לקולטן AT1, בהתאמה. הריכוז הרצוי של 125 I-SI-אנג II עבור assay נקבע ואת דילול הנדרש של פתרון המניות נקבע מגיליון אלקטרוני של קצב הדעיכה רדיואיזוטופיים (ראה פרוטוקול טבלה 3). באופן אופטימלי ריכוז של radioligand בקירוב K D משמש אשר יכבוש 50% של קולטנים הנוכחי. עם זאת, בגלל radioligands יכול להיות דואר ריכוזים יקר תחתון.g. 10-20% של ריכוז D K ניתן להשתמש. יש לכך יתרון פוטנציאלי של הגדלת יחס אות לרעש על ידי צמצום הלא ספציפית מחייב יותר מחייב ספציפית. עם זאת, פעמי חשיפה ארוכות יותר נדרשות לפתח דימוי של הכריכה. כפי שצוין לעיל (סעיף 3.4), אם החשיפה המתקבלת היא מעל או מתחת חשופים, השקופיות ניתנות מחדש נחשפו סרט חדש עבור קצר ו / או ארוך יותר זמן כדי להשיג את החשיפה הרצויה.

ניתוח תמונת densitometric יכול להיעשות על ידי מערכת הדמית קניינים המספקת מצבור נרחב של היישומים עבור autoradiography כמו גם יישומים אחרים. סטנדרטי כיול נמצאים fmol / גרם של משקל רקמות רטוב (בהנחה סגולית של אחד עבור הרקמה). כל ערכה סטנדרטית, יחד עם רקע תפיק עקומת סטנדרט. ישנם מספר אלגוריתמים ההולמים עקומים עם ובלי שקלול זמין לייצר עקומת סטנדרט מן ד ביחס אופטומטריערכי ensity (ROD) עבור סטנדרטי כיול השונים. בחירה של העקומה מייצגת בצורה הטובה ביותר את הנתונים נעשתה באופן אמפירי כמו שהשגרה עבור הולם עקום אינו מספקת ערכי שגיאה יחסיים עבור העקומות הסטנדרטיות השונות. בשעה מוטה עד ~ 0.6, העקומה הסטנדרטית היא pseudolinear. עם זאת, הסרט מתחיל להרוות מעבר לנקודה זו ויוצרת עקום כי אסימפטוטה סביב 0.8 ל 0.9 יחידות ROD. אם את הסטנדרטים למסגר את הדגימות הם מעל 0.9 יחידות ROD, מומלץ מחדש לחשוף את הסרט לתקופה קצרה של זמן להשיג ערכים אמינים יותר של fmol / g המחייב של הדגימות קרובות יותר בטווח pseudolinear של ההתקן עֲקוּמָה. ערכים הנגזרים בקיצוניותו זו של עקומת הסטנדרט יגרמו הבדלים קטנים ROD להבדלים גדולים משמעותי radioligand מחייבים. מכאן היכולת לזהות שינויי ירידות מחייבות כסרט מתקרב לנקודת הרוויה שלה.

עבור מדידות של אזורים ספציפיים,צעדים מומלצים הם 'צפיפות' ב fmol / g, 'אזור סרוק "בפיקסלים, ו' סה"כ יעד פינה 'בפיקסלים (איור 9). חשוב להגדיר ערך סף קרוב לאפס ככל האפשר (איור 10), כי וריאציות צפיפות סרט או את ההיבט השרירותי של עקומת הסטנדרט נגזרת סטנדרטי הכיול לפעמים יכולות לתת ערכים פחות מאפסת. אם ערכים כאלה הם ממוצעים עבור כל הפיקסלים שטח סריקה זה היה להפיק ערך נמוך באופן מלאכותי. הקריטריונים המשמשים כדי לזהות אזורים עם המחייב יכול להיות מאוד סובייקטיבי, ולכן עדיף לעקוב מקרוב לשייך את מלאת מוח ניסוי ככל האפשר כדי להפחית את השכיחות של טעויות סובייקטיבי. אתגר נוסף הוא להחליט כמה סעיפי הסכום ממוצעים לקבל קריאה סופית. אינדיקציה טובה סעיפים לנתח יכולה להיקבע על ידי ביצוע אטלס מוח עכברוש מקובלים, יחד עם מגלשות היסטולוגיה המוכתמות. גודלו של שטח הדגימה גם יכול להיותבְּעָיָה. כדי לפצות, תבנית ניתן להקים לתקן בגין אי-התאמות גודל. הטיפול בסעיפים יכול גם להשפיע על שטח של המבנה גבוה יש כריכה, נחשב במהלך ניתוח. זה דורש שימוש אלטרנטיבי של הכלי 'thresholding' במערכת ההדמיה קנייני להגדיר טווח צפיפות העולה על ערך שרירותי כדי לייצג את המאפיינים האנטומיים של האזור במוח להיות שנדגמו כגון גרעין paraventricular של ההיפותלמוס בתוך כלי דגימה המקיף את האזור של עניין (איור 11, לוח ג). כמו כן ניתן לכלול את מדידת השטח אל תוך קביעת הסכום של הכריכה. ניתן לעשות זאת על ידי הכפלת הערך עבור פעמים מחייבות ספציפית את מספר הפיקסלים שנמדדו. פיקסלים ניתן להמיר יחידות מטר ידי הדמית סרגל בשני מישורים, או מלבן של ממדים ידועים. מספר הפיקסלים מתאיםאורך או שטח של מלבן אז יכול לבוא לידי ביטוי ביחידות מטריות. ב- 2400 dpi רזולוציה, ~ 9,000 פיקסלים = 1 מ"מ 2 במערכת שלנו.

למרות השימוש הליגנדים רדיואקטיבי הוא כבר לא טכניקה בשימוש נרחב; זה אחד בודדי הדרכים כדי להמחיש את ההפצה הפיסית של קולטנים בתוך רקמת הדגימות עצמם תפקודיים (מסוגלים מחייבים ליגנד המולד שלה). בנוסף, זה יכול לכמת את מספר הקולטנים כדי לאפשר הערכה של שינויים בביטוי קולטן פונקציונלי בין קבוצות הטיפול, בין אזורי מוח שונים או מבנים אחרים, בין זנים שונים של בעלי חיים, או בעלי חיים בגילאים שונים, וכו 'שיטות חלופיות זמינים לאפיין היבטי neuroanatomical ביטוי קולטן 1 AT, אולם, יש להם ערך מוגבל. הכלאה באתרו של mRNA עבור AT 1 קולטנים אינו תואם תמיד עם קולטן AT 1 הביטוי או חלוקהמוֹחַ. בעוד טכניקות חיסוניות יכולות משוערות הבדלי הביטוי הקולטן בוסס על עוצמת מכתים סעיפי רקמות, זה לא אפשרי כדי ליצור עקומת תקן מכתים כדי לאפשר קביעה מספרית של ביטוי הקולטן. autoradiography קולטן גם מספק רמה של וספציפיות קולטנים (או מטרות אחרות באופן ספציפי להיקשר radioligands) כי לא ניתן להבטיח באמצעות טכניקות אימונולוגיות. בשנת 2009, סדרה של מאמרים פורסמו 37-43 כי ספק בתוקפו של 49 נוגדנים שהיו בשימוש כדי להעריך 18 קולטנים שונים G חלבון בשילוב ופוטנציאל הקולטן חולף ערוץ (TRP). בעיקרו של דבר, נוגדנים שכותרתו להקות זהות על כתמים מערביים wild-type ועכברים בנוקאאוט עבור הקולטניים מדובר. בהמשך לכך, כמה קבוצות עשו תצפיות דומות באמצעות זמינים מסחריים AT 1 ו- AT 2 נוגדנים לקולטן 44-49. שימוש חיידקיםאל כרומוזום מלאכותי אשר מייצר מולקולת כתב, למשל, חלבון פלואורסצנטי ירוק, מונעת על ידי AT 1 האמרגן הוא אמצעי עקיף של קביעת קיומו או אי קיומו של AT 1 תאים לבטא קולטן עכבר (אך לא עכברוש) מוח מבוסס על היותן פונקציונלי AT 1 קולטן האמרגן 50. אפשר לספור "תאים חיוביים" באזורי המוח זיהו מיקרוסקופי, אבל לא כדי לכמת שינויים בעוצמת הביטוי של הקולטן AT 1 באזורים אלו. לכן בשלב זה את הטכניקות תוקפות רק כי זמין יחיד למדוד ישירות ביטוי הקולטן אנג השני הן radioligand שיטות מחייבות. וגם, אם ברזולוציה האנטומי של פעילות לפי 1 חלבון קולטן יש צורך ברמה מיקרוסקופית, autoradiography קולטן הוא הטכניקה היחידה העומדת למדידה ישירה כזו.

autoradiography קולטן אינו נטול מגבלות. Concer הגדולהn הוא כי העמידה בדרישות להשתמש בחומרים רדיואקטיביים במסגרת מחקרית. זה הכרחי כדי לקבל תכנית בטיחות קרינה עם הנחיות קפדניות במקום כדי להבטיח את שלומם של חוקרים שעובדים עם חומרים רדיואקטיביים ואת הפריסה הבטוחה של החומרים רדיואקטיביים. זה מסלים את עלות המחקר תוך שימוש בחומרים רדיואקטיביים עד כדי כך מונע את השימוש שלהם בה בסביבות מחקר רבות. בנוסף, העלות של radioligands יכולה להיות משמעותית. כך ניסוי autoradiography קולטן שבו מספר רב של קטעי רקמה רכוב שקופיות מודגרת במיכלים של radioligand יכול להשתמש מאות אם לא אלפי דולרים של radioligand. מגבלה נוספת היא כי רקמות חייבות להיות קפוא לפני החתך על cryostat, מאוחסנות במשך תקופה מסוימת, ושטפו במהירות יבשה לאחר הדגרה עם radioligand, כל מה שיכול לפגוע ביכולת של קולטנים או חלבון העניין לחייב את radioligand . לקבלת הליגנדים שיש תחת מהירקינטיקה ociation / דיסוציאציה, זה לא יכול להיות אפשרי כדי לשמור את הכריכה של radioligand לקולטן במהלך הזמן הדרוש כדי לשטוף ממני radioligand כבול שאינם במיוחד. כמו כן, עם כמויות נמוכות של radioligand מחייב תקופות ארוכות של חשיפת סרט - חודש או יותר - ייתכן שיידרש לפני תמונה למדידה יכולה להיוצר על הסרט. אתגר נוסף הוא כי תוספת של יוד-125 ליגנד עלולה להביא לפגיעה ביכולת של ליגנד להיקשר לקולטן היעד שלה או חלבון עקב הפרעה סטרית. שימוש מולקולה קטנה, למשל, טריטיום (3 H) מבטל את הבעיה של הפרעה סטרית, אבל יש טריטיום כגון אנרגיה נמוכה ופעילות סגולית נמוכה (יחסית יוד-125) כי זה מאוד קשה כדי ליצור תמונת סרט עבור רוב אוכלוסיות קולטן. לאור בעיות אלו, ישנם מצבים רבים בהם autoradiography הקולטן אינו מסוגל לזהות קולטנים או מבנים מולקולריים אחרים בעלי עניין.

למרות li שלהmitations, autoradiography הקולטן יכול לזהות מבנים ספציפיים בתוך רקמה, למשל, אזורים במוח שינו בתגובה המשתנית ניסיוני לעומת מוח שליטה נורמלי. ידע זה יכול לעזור לקבוע את התפקיד של R 1 AT עבור אנג שנייה או קולטן אחר או אנזימים בפתולוגיה של מחלה. יש ידע זה השלכות תרופתיות יקרות, כפי שהוא מעיד באזורים למקד עבור טיפולים פוטנציאליים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
500 ml Plastic Beakers Fisher 02-591-30
24 mm x 60 mm Coverslips Fisher 22-050-25
Autoradiography Imaging Film 24 mm x 30 cm Carestream-Biomax MR Film 891-2560
Bacitracin (from Bacillus licheniformis) Sigma B-0125
Cardboard Sheet 8 x 11 Crescent Illustration Board #201 201
Coplin Jars Fisher Scientific E94
Commercial hair dryers Conair Model SD6X
Disposable Culture Tubes Fisher 14-961-26
EDTA (Disodium salt, Dihydrate) USB Corporation 15-699
Ethanol Fisher 16-100-210 
Formulary Substitute for D-19 Developer Photographers Formulary, Inc.  01-0036
Glacial Acetic Acid Fisher A38 SI-212
Histoprep/OCT Fisher SH75-125D
Film Fixer Kodak 5160320
Photo flo Kodak 1464502
Losartan Fisher/Tocris 37-985-0
MCID™ Core 7.0 MCID N/A
NaCl Fisher S271
Peel-A-Way slide grips VWR 48440-003
Permount Fisher SP15-100
PD123319 Fisher 13-615-0
Premium Charged Slides, Fine Ground Edge Premiere Microscope Slides 9308W
125I Ligands Perkin Elmer NEX- 248
125SI-Ang II  George Washington University Radioiodinated by Dr. Speth
Slide Mailers Fisher Scientific HS15986
Sodium Dibasic Phosphate Anhydrous (Na2PO4) Fisher RDCS0750500
Sodium Acetate (Anhydrous) Fisher BP333-500
Thionin  Fisher T409-25
X-Ray Casette (10 x 12) Spectronics Corporation Four Square
Xylene Fisher  X3P-1GAL

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mozaffarian, D., et al. Heart disease and stroke statistics--2015 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 131 (4), 29-322 (2015).
  2. Peart, W. S. The Renin-Angiotensin System. Pharmacol Rev. 17, 143-182 (1965).
  3. Ganten, D., et al. Angiotensin-forming enzyme in brain tissue. Science. 173 (3991), 64-65 (1971).
  4. Ganten, D., Fuxe, K., Phillips, M. I., Mann, J. F. E., Ganten, U. Frontiers in Neuroendocrinology. Ganong, W. F., Martini, L. , Raven Press. N.Y. Vol. 5 61-99 (1978).
  5. Fyhrquist, F., Metsarinne, K., Tikkanen, I. Role of angiotensin II in blood pressure regulation and in the pathophysiology of cardiovascular disorders. J Hum Hypertens. 9, Suppl 5 19-24 (1995).
  6. von Bohlenund und Halbach, O., Albrecht, D. The CNS renin-angiotensin system. Cell Tissue Res. 326 (2), 599-616 (2006).
  7. Speth, R., Giese, M. Update on the renin-angiotensin system. J Pharmacol Clin Toxicol. 1 (1), 1004 (2013).
  8. de Kloet, A. D., Liu, M., Rodriguez, V., Krause, E. G., Sumners, C. Role of neurons and glia in the CNS actions of the renin-angiotensin system in cardiovascular control. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. , (2015).
  9. Saavedra, J. M., Sanchez-Lemus, E., Benicky, J. Blockade of brain angiotensin II AT1 receptors ameliorates stress, anxiety, brain inflammation and ischemia: Therapeutic implications. Psychoneuroendocrinology. 36 (1), 1-18 (2011).
  10. Stornetta, R. L., Hawelu-Johnson, C. L., Guyenet, P. G., Lynch, K. R. Astrocytes synthesize angiotensinogen in brain. Science. 242, 1444-1446 (1988).
  11. Li, W., Peng, H., Seth, D. M., Feng, Y. The Prorenin and (Pro)renin Receptor: New Players in the Brain Renin-Angiotensin System. Int.J.Hypertens. 2012, 290635 (2012).
  12. Strittmatter, S. M., Kapiloff, M. S., Snyder, S. H. [3H]captopril binding to membrane associated angiotensin converting enzyme. Biochem. Biophys. Res. Commun. 112, 1027-1033 (1983).
  13. Bild, W., Hritcu, L., Stefanescu, C., Ciobica, A. Inhibition of central angiotensin II enhances memory function and reduces oxidative stress status in rat hippocampus. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 43, 79-88 (2013).
  14. Wright, J. W., Harding, J. W. Brain renin-angiotensin-A new look at an old system. Progress in Neurobiology. 95 (1), 49-67 (2011).
  15. Tashev, R., Stefanova, M. Hippocampal asymmetry in angiotensin II modulatory effects on learning and memory in rats. Acta Neurobiol Exp (Wars). 75 (1), 48-59 (2015).
  16. Reudelhuber, T. L. The continuing saga of the AT2 receptor: a case of the good, the bad, and the innocuous. Hypertension. 46 (6), 1261-1262 (2005).
  17. Carey, R. M. Cardiovascular and renal regulation by the angiotensin type 2 receptor: the AT2 receptor comes of age. Hypertension. 45 (5), 840-844 (2005).
  18. Valero-Esquitino, V., et al. Direct angiotensin type 2 receptor (AT2R) stimulation attenuates T-cell and microglia activation and prevents demyelination in experimental autoimmune encephalomyelitis in mice. Clin Sci (Lond). 128 (2), 95-109 (2015).
  19. Chen, J., et al. Neuronal over-expression of ACE2 protects brain from ischemia-induced damage. Neuropharmacology. 79, 550-558 (2014).
  20. Kalra, J., Prakash, A., Kumar, P., Majeed, A. B. Cerebroprotective effects of RAS inhibitors: Beyond their cardio-renal actions. J Renin Angiotensin Aldosterone Syst. , (2015).
  21. Zhao, Y., et al. Activation of intracellular angiotensin AT(2) receptors induces rapid cell death in human uterine leiomyosarcoma cells. Clin Sci (Lond). 128 (9), 567-578 (2015).
  22. Gehlert, D. R., Speth, R. C., Wamsley, J. K. Quantitative autoradiography of angiotensin II receptors in the SHR brain. Peptides. 7 (6), 1021-1027 (1986).
  23. Mendelsohn, F. A., Quirion, R., Saavedra, J. M., Aguilera, G., Catt, K. J. Autoradiographic localization of angiotensin II receptors in rat brain. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (5), 1575-1579 (1984).
  24. Gehlert, D. R., Speth, R. C., Wamsley, J. K. Autoradiographic localization of angiotensin II receptors in the rat brain and kidney. Eur J Pharmacol. 98 (1), 145-146 (1984).
  25. Speth, R. C., et al. Angiotensin II receptor localization in the canine CNS. Brain Res. 326 (1), 137-143 (1985).
  26. Santos, R. A. S., et al. Angiotensin-(1-7) is an endogenous ligand for the G protein-coupled receptor Mas. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (14), 8258-8263 (2003).
  27. Karamyan, V. T., Gembardt, F., Rabey, F. M., Walther, T., Speth, R. C. Characterization of the brain-specific non-AT(1), non-AT(2) angiotensin binding site in the mouse. Eur J Pharmacol. 590 (1-3), 87-92 (2008).
  28. Karamyan, V. T., Speth, R. C. Distribution of the non-AT1, non-AT2 angiotensin-binding site in the rat brain: preliminary characterization. Neuroendocrinology. 88 (4), 256-265 (2008).
  29. Karamyan, V. T., Stockmeier, C. A., Speth, R. C. Human brain contains a novel non-AT1, non-AT2 binding site for active angiotensin peptides. Life Sci. 83 (11-12), 421-425 (2008).
  30. Miller-Wing, A. V., et al. Central angiotensin IV binding sites: distribution and specificity in guinea pig brain. J Pharmacol Exp Ther. 266 (3), 1718-1726 (1993).
  31. Castren, E., Kurihara, M., Saavedra, J. M. Autoradiographic localization and characterization of angiotensin II binding sites in the spleen of rats and mice. Peptides. 8 (4), 737-742 (1987).
  32. MacGregor, D. P., et al. Angiotensin II receptor subtypes in the human central nervous system. Brain Res. 675 (1-2), 231-240 (1995).
  33. Plunkett, L. M., Correa, F. M. A., Saavedra, J. M. Quantitative autoradiographic determination of angiotensin-converting enzyme binding in rat pituitary and adrenal glands with 125I-351/A, a specific inhibitor. Regul Pept. 12, 263-272 (1985).
  34. Armando, I., et al. Increased angiotensin II AT(1) receptor expression in paraventricular nucleus and hypothalamic-pituitary-adrenal axis stimulation in AT(2) receptor gene disrupted mice. Neuroendocrinology. 76 (3), 137-147 (2002).
  35. Speth, R. C., Harding, J. W. Angiotensin Protocols Vol. 51 Methods in Molecular Medicine. Wang, D. H. , Humana Press. 275-295 (2001).
  36. Widdop, R. E., Jones, E. S., Hannan, R. E., Gaspari, T. A. Angiotensin AT2 receptors: cardiovascular hope or hype. Br J Pharmacol. 140 (5), 809-824 (2003).
  37. Michel, M. C., Wieland, T., Tsujimoto, G. How reliable are G-protein-coupled receptor antibodies. Naunyn Schmiedebergs Arch.Pharmacol. 379 (4), 385-388 (2009).
  38. Jensen, B. C., Swigart, P. M., Simpson, P. C. Ten commercial antibodies for alpha-1-adrenergic receptor subtypes are nonspecific. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 379 (4), 409-412 (2009).
  39. Jositsch, G., et al. Suitability of muscarinic acetylcholine receptor antibodies for immunohistochemistry evaluated on tissue sections of receptor gene-deficient mice. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 379 (4), 389-395 (2009).
  40. Hamdani, N., van der Velden, J. Lack of specificity of antibodies directed against human beta-adrenergic receptors. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 379 (4), 403-407 (2009).
  41. Bodei, S., Arrighi, N., Spano, P., Sigala, S. Should we be cautious on the use of commercially available antibodies to dopamine receptors. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 379 (4), 413-415 (2009).
  42. Lu, X., Bartfai, T. Analyzing the validity of GalR1 and GalR2 antibodies using knockout mice. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 379 (4), 417-420 (2009).
  43. Everaerts, W., et al. Where is TRPV1 expressed in the bladder, do we see the real channel. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 379 (4), 421-425 (2009).
  44. Adams, J. M., McCarthy, J. J., Stocker, S. D. Excess dietary salt alters angiotensinergic regulation of neurons in the rostral ventrolateral medulla. Hypertension. 52 (5), 932-937 (2008).
  45. Herrera, M., Sparks, M. A., Alfonso-Pecchio, A. R., Harrison-Bernard, L. M., Coffman, T. M. Lack of specificity of commercial antibodies leads to misidentification of Angiotensin type 1 receptor protein. Hypertension. 61 (1), 253-258 (2013).
  46. Rateri, D. L., et al. Endothelial Cell-Specific Deficiency of Ang II Type 1a Receptors Attenuates Ang II-Induced Ascending Aortic Aneurysms in LDL Receptor(-/-) Mice. Circ Res. 108 (5), 574-583 (2011).
  47. Benicky, J., Hafko, R., Sanchez-Lemus, E., Aguilera, G., Saavedra, J. M. Six Commercially Available Angiotensin II AT(1) Receptor Antibodies are Non-specific. Cell Mol Neurobiol. 32 (8), 1353-1365 (2012).
  48. Elliott, K. J., Kimura, K., Eguchi, S. Lack of specificity of commercial antibodies leads to misidentification of angiotensin type-1 receptor protein. Hypertension. 61 (4), 31 (2013).
  49. Hafko, R., et al. Commercially available angiotensin II At(2) receptor antibodies are nonspecific. PLoS One. 8 (7), 69234 (2013).
  50. Gonzalez, A. D., et al. Distribution of angiotensin type 1a receptor-containing cells in the brains of bacterial artificial chromosome transgenic mice. Neuroscience. 226, 489-509 (2012).

Tags

Neuroscience גיליון 112 קולטן autoradiography cryostat המוח חתך רנטגן סרטים פיתוח AT אנגיוטנסין II
קולטן autoradiography פרוטוקול עבור ויזואליזציה המרוכזת של אנגיוטנסין II רצפטורים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Linares, A., Couling, L. E.,… More

Linares, A., Couling, L. E., Carrera, E. J., Speth, R. C. Receptor Autoradiography Protocol for the Localized Visualization of Angiotensin II Receptors. J. Vis. Exp. (112), e53866, doi:10.3791/53866 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter