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Neuroscience

A autorradiografia do receptor Protocolo para a visualização localizada da angiotensina II Receptores

Published: June 7, 2016 doi: 10.3791/53866
Automatic Translation
1, 2, 3, 2
1Farquhar College of Arts and Sciences, Nova Southeastern University, 2Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy, Nova Southeastern University, 3School of Medicine, University of Colorado

Abstract

Este protocolo descreve os padrões de ligação do receptor de angiotensina II (Ang II) no cérebro de rato usando um radioligando específica para os receptores de Ang II para executar o mapeamento do receptor de auto-radiografia.

Os espécimes de tecido são colhidas e armazenadas a -80 ° C. A criostato é usado para a secção coronal do tecido (cérebro) e descongelar-montar as secções em lâminas carregadas. As secções de tecido em lâminas são incubadas em 125I-SI-Ang II para marcar radioactivamente receptores de Ang II. Lâminas adjacentes são separados em dois conjuntos: "ligação não específica" (NSP) na presença de uma concentração saturante de receptores de não-marcado radioactivamente Ang II, ou um subtipo AT 1 do receptor de angiotensina II (AT 1 R) antagonista selectivo do receptor Ang II e 'ligação total ", sem AT 1 antagonista R. Uma concentração saturante de AT 2 subtipo do receptor Ang II (2R) antagonista (PD123319, 10 uM) também está presente no incubatiem tampão de limitar 125I-SI-Ang II se ligarem ao subtipo AT 1 R. Durante 30 min de pré-incubação à temperatura de ~ 22 ° C, as lâminas NSP são expostas a 10? M e PD123319 losartan, enquanto 'ligação total "slides são expostas a 10? M PD123319. As lâminas são então incubadas com 125 I-Si-Ang II, na presença de PD 123319 para 'ligação total ", e PD 123319 e de losartan para PEN em tampão de ensaio, seguido de várias lavagens' 'em tampão, e água para remover o sal e não- radioligando especificamente ligado. As lâminas são secas com secador por, em seguida, exposto a filme de auto-radiografia usando um filme especializada e cassete. O filme é desenvolvido e as imagens são digitalizadas em um computador para densitometria visual e quantitativa usando um sistema de imagem proprietária e uma planilha. Um conjunto adicional de slides são tionina-coradas para comparações histológicas.

A vantagem de utilizar a autorradiografia do receptor é a capacidade de visualizarAng II receptores in situ, dentro de uma secção de uma amostra de tecido, e anatomicamente identificar a região do tecido por comparação desta com uma secção histológica de referência adjacente.

Introduction

A doença cardiovascular continua a ser a principal causa de morte e incapacidade nos Estados Unidos, causando mais de 30% das mortes em os EUA em 2011 1. As estatísticas mais recentes da American Heart Association indicam que mais de uma em cada três pessoas tem uma ou mais tipos de doenças cardiovasculares. pesquisa cardiovascular continua a fazer progressos contra a compreensão desta doença, mas como as gerações começam a envelhecer, é imperativo para continuar esses esforços. O sistema renina-angiotensina (RAS) desempenha um papel central na regulação do sistema cardiovascular, principalmente através da promoção da aterosclerose, a inflamação, a vasoconstrição sistémica, e a activação do sistema nervoso simpático (Figura 1) 2-8.

O RAS é um sistema hormonal que é activada quando as células justaglomerulares do rim secretam renina na corrente sanguínea em resposta à diminuição da pressão sanguínea, aumento sympatestimulação hetic, ou diminuição do fluxo de sódio pela mácula densa. A renina metaboliza o angiotensinogénio (sintetizado no fígado) para formar a angiotensina I (Ang I). Ang I é então metabolizado pela enzima conversora de angiotensina (ACE), uma ectoenzima no lado luminal das células endoteliais vasculares, principalmente nos pulmões e rins, para formar angiotensina II (Ang II), o péptido de efector principal do RAS. Ang II é capaz de activar dois subtipos de receptores; o receptor de tipo 1 (AT1 R) e o receptor de tipo 2 (AT 2 R), tanto que regulam o sistema cardiovascular, manter a homeostase de fluidos e eletrólitos e agora são considerados para afetar a função cognitiva e doença neurodegenerativa processa 8,9. A RAS local, específica do cérebro é relatado para sintetizar de forma independente Ang II. No cérebro, o angiotensinogénio proteína precursora é sintetizado de astroglia 10 convertido a Ang I por uma enzima renina-3 como, possivelmente, a pro-renina ligado ao receptor de pro-renina11, e, subsequentemente, convertida em angiotensina II pela enzima conversora de angiotensina que é abundantemente expresso na superfície extracelular de neurónios no cérebro 12. Este intrabrain gerado Ang II é o agonista para o cérebro AT 1 e AT 2 receptores que são isoladas a partir de sangue-carregada de Ang II.

Enquanto o NO desempenha um R um importante papel fisiológico, é melhor conhecida pelos seus efeitos patofisiológicos de todo o corpo, que afecta principalmente o sistema cardiovascular e nos rins (figura 2). Quando a Ang II liga-se a AT 1 R, que provoca vasoconstrição; aumento da resistência ao fluxo sanguíneo e aumentar a pressão sanguínea. Além disso, promove a síntese e secreção de aldosterona e vasopressina, levando ao aumento da retenção de sódio e água. Estes efeitos podem também induzir a lesão cerebral isquémica e deficiências cognitivas e está ligada à doença de Parkinson, doença de Alzheimer, e diabetes, bem como a ser recentemente identificado para afectar de aprendizagem e de memória 13-15. Há um ciclo de feedback no RAS em que a AT 1 R nas células justaglomerulares no rim inibe a secreção de renina. Curiosamente, o NO 2 R geralmente contra-regula a acção de pelo 1R, causando vasodilatação, o crescimento de neurites, a regeneração axonal, anti-proliferação e cerebroprotection entre muitos outros 16-20. O NO 2 R também foi identificado como um alvo para anti-hipertensão e, recentemente, drogas anti-câncer 21. Determinar a localização e densidade de receptores de Ang II no prazo de vários tecidos e como eles são influenciados por diversos tratamentos e estados de doença, utilizando auto-radiografia receptor densitometria quantitativa irá ajudar a descobrir o papel que o RAS desempenha nas doenças específicas.

Autorradiografia do receptor foi usado há mais de 30 anos como um método eficaz para a indicação da presença de angiotensina II receptores e outros componentes do RAS no cérebro e outros tecidos do rato, murganho, cobaia, cão e ser humano sob uma variedade de condições experimentais 22-34. A importância de localizar receptores de Ang II no cérebro é que se pode aplicar neuroanatomy funcional para as acções de Ang II no cérebro, por exemplo, a presença de pelo um de R no núcleo paraventricular do hipotálamo (PVN) sugere uma função de Ang II no cérebro para estimular a vasopressina, a oxitocina ou libertação da hormona de libertação de corticotropina (CRH), ou a activação do sistema nervoso simpático. Assim, as drogas que bloqueiam a AT 1 R pode diminuir alguns destes efeitos PVN mediadas associados com relação à actividade das RAS cerebrais. Trabalhos em curso sugere que o uso de AT 1 antagonistas R pode diminuir Stress Disorder (PTSD) a libertação induzida pós-traumático de CRH e melhorar os sintomas de PTSD (ferir et al., Submetido para publicação). O PVN, subfornicialórgão (SFO), e na amígdala são conhecidas por regular a homeostase, o apetite / sede, sono, memória, reações emocionais, e são as áreas-alvo deste estudo demonstração. Estas regiões foram examinados através da recolha de secções coronais de cérebro em lâminas de microscópio, e o tratamento das secções com inibidores específicos, juntamente com um ligando radioactivo específico para receptores de Ang II. Neste estudo, todos os materiais e reagentes juntamente com os fornecedores sugeridas são listados, Iodo-125 foi utilizado para radiomarcar um antagonista de angiotensina II receptor, sarcosina 1, isoleucina 8 Ang II (SI Ang II), que foi depois purificado como o mono 125I -Si Ang II utilizando métodos de HPLC conforme descrito anteriormente 35. O uso desta elevada actividade específica de radioligando permite a visualização de áreas de baixa, moderada e alta densidade de receptor após a exposição das secções radiomarcado a um filme de raios-x. Ao calibrar o filme com os padrões de pasta cerebrais que contenham quantidades conhecidas de iodo-125, a quantidade específicaAng II de ligação ao receptor em uma área pode ser quantificada. Em estudos experimentais, o receptor de Ang II de ligação nos cérebros de sujeitos experimentais pode ser comparada com a no cérebro de indivíduos de controlo. Isto pode indicar se as acções de Ang II são alteradas em resposta a uma condição genética, anormalidade fenotípica, estado de doença ou de tratamento da droga. Este conhecimento pode, então, ser aplicada ao desenvolvimento de terapias para o tratamento de doenças associadas com a desregulação da RAS. As técnicas alternativas que a identificação de sítios de ligação ao receptor, mas com uma resolução reduzida anatómica, são ensaios que utilizam preparações de membrana de tecidos derivadas de homogenatos de tecidos, as quais são incubadas com o radioligando ao longo de uma gama de concentrações a fim de avaliar a afinidade de ligação de radioligandos como a constante de dissociação (Kd de ligação ) e capacidade de ligação máxima (B max) do tecido de interesse.

O protocolo aqui descrito pode ser dividido em 5 dos principais components: Preparando secções de tecido para o receptor autorradiografia; Receptor autorradiografia; Exposição de Cinema e Desenvolvimento; Histologia; Análise de Imagem e densitométrica.

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Protocol

Todos os procedimentos com animais realizados para este estudo foram aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso Institucional animal da Nova Southeastern University de acordo com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório, 8 th Edition (The National Academies Press, Washington, DC, 2011 ).

1. Preparar as secções de tecido para o receptor A autorradiografia

  1. No momento do sacrifício, colheita frescos tecidos cerebrais, e embrulhe em papel alumínio e coloque em um freezer -20 ° C o mais rapidamente possível. Para manter a forma correta, coloque cérebros em um molde cérebro que simula o interior do crânio, embrulhe em papel alumínio e coloque em um - 20 ° C congelador. Após 30 min, os tecidos lugar em um saco de armazenamento vedável congelador e mover-se para um congelador de -80 ° C para armazenamento a longo prazo.
    1. Obter os amostra fresca de tecido congelado de interesse a partir do descongelamento -80 ° C congelador, e transferir para um criostato definido para um mínimo de -10 ° C e um máximo de -18 ° C, a fim de evitar. Coloque a amostra sobre o tecido de montagem com um glicol e meio de incorporação à base de resina, apenas a incorporação de uma pequena parte da amostra para o meio. Para cérebro, o cérebro é montado verticalmente para permitir que o corte no plano coronal.
  2. Coloque montar o tecido para o micrótomo dentro do criostato e aperte firmemente no lugar. Assegurar o lado esquerdo e direito do cérebro estão nas mesmas coordenadas ântero-póstero, e que o eixo dorso-ventral do cérebro é atlas perpendicular ao vulgarmente utilizados.
  3. Iniciar o corte com a espessura desejada (20 uM recomendado) e descongelar montar as secções em lâminas de microscópio numa direcção vertical para ter uma área de superfície maior de espaço na corrediça. Recolha secções em lâminas em conjuntos sequenciais de cinco anos, ou seja, o primeiro conjunto de slides são rotulados 1-1, 1-2, 1-3, 1-4, e 1-5 (Figura 3).
  4. Depois de preencher um conjunto de slides com seções, deixar as lâminas secar ao ar durante até 1 hora, em seguida, coloque o SLIdes em uma caixa plástica de slides em um saco de armazenamento congelador auto-selante, e armazenar a -20 ° C.

2. Receptor autorradiografia

CUIDADO: Radioactividade. Use roupas de proteção para lidar com radioatividade. Eliminação é dependia estabelecimento, e deve seguir as orientações para se decompor adequadamente (meia-vida de 60 dias) ou ser pego por uma empresa certificada.

  1. Retire o "-1" e "-2" slides de juros a partir do freezer -20 ° C e montar em suportes de slide (Figura 5). Monte os "-1" slides juntos para o tratamento "não específica", e os "-2" desliza para o tratamento 'total'. Frascos 'não-específicas "irá conter 10 uM concentrações finais de PD123319 um antagonista 2 R, e do losartan um AT um antagonista de R, em tampão de meio de ensaio (AM5) (Tabela 1), o" total "frascos de ligação irá conter apenas 10 ? M PD123319 em AM5.
  2. Inverta a corrediçaapertos para colocar as lâminas em frascos Coplin pré-incubação enchidos com 35-40 ml de AM5, e respectivos inibidores durante 30 min à temperatura ambiente. Comece séries subsequentes em seu banho de pré-incubação em intervalos de 4 min.
  3. Imediatamente transferir lâminas a partir da solução de incubação pré aos utentes incubação de deslizamento, contendo 10 ml de AM5, além de uma concentração pré-determinada de 125I-SI-Ang II (calculada na Figura 4) com os respectivos inibidores, para 60-90 min a sala temperatura. Se houver radioactivo suficiente, 10 lâminas podem ser colocados (back to back) em suportes de slide modificados e incubadas com 125 I-SI-Ang II em frascos Coplin.
  4. Colocar as lâminas de volta para os suportes de slide (se necessário), mancha, e lavar por agitação suave para 1-2 seg em 400 ml de água destilada em dois recipientes separados.
  5. Transferir as lâminas sequencialmente em quatro frascos Coplin contendo 35-40 ml de AM5 durante exactamente 1 min cada (como ilustrado na Figura 4 </ Strong>).
  6. Após a última lavagem 1 min, agitar suavemente as seções de 1-2 segundos em quatro mudanças de gelo frio água destilada.
  7. Seque as lâminas com ar frio (Atenção: o ar quente volatiliza o composto radioactivo) usando quatro secadores de cabelo criados a partir de ângulos diferentes para 4 min (Figura 5), até que todas as seções estão secos, em seguida, coloque sobre uma toalha de papel.
  8. Mount desliza com os tecidos para cima em um papelão para aposição ao filme de raios-X usando fita dupla face.
  9. Montar pelo menos um, 125 calibração corrediça iodo padrão para cada cartão (Figura 6).
    Nota: Os padrões de calibração consiste de pasta de cérebro completamente misturado com 125 Iodo ligado a um composto contendo um anel de fenol, compactado por centrifugação numa seringa de 1 ml de tuberculina, que são criostato segmentado com a mesma espessura como as secções do cérebro e descongelar-montada em microscópio slides. Alternativamente, 125 padrões de calibração em Iresina plástica seccionados a 20 uM de espessura podem ser obtidas comercialmente. A resina plástica nestas normas protege parcialmente o filme da radiação tal que uma equivalência de tecido de ~ 40% devem ser tidos em conta na calibração.

3. Exposição e Desenvolvimento Film

  1. Proceder a uma câmara escura com uma cassete de raios-X strap-costas e filmes auto-radiografia. Abrir a cassete e colocar o cartão com corrediças no interior (Figura 6).
    1. Desligue as luzes e ligue a luz de segurança. Cuidadosamente abra a caixa de filme de Raios-X, remova um filme, e coloque o lado da película brilhante para cima (com a borda irregular no canto inferior direito) sobre os slides da cassete. Feche cuidadosamente a cassete, e torcer as barras de travamento para selar a luz (Figura 6). Expor as lâminas para vários dias a várias semanas a -20 ° C.
  2. Na câmara escura, abra a gaveta e prossiga com a proc revelação de filmesess.
    1. Colocar as lâminas nas bandejas consecutivamente; programador durante 2 min, água contendo 5% de ácido acético glacial durante 30 seg, e fixador durante 5 min. As películas são colocadas no dentro de um tabuleiro com água corrente durante 20 minutos, em seguida, colocados em Photoflo para não mais do que 10 segundos e penduradas.
      Nota: O tempo de exposição é determinada empiricamente e pode envolver vários filmes com diferentes tempos de exposição: o tempo suficiente para obter sinais mensuráveis ​​de áreas com baixa ligação, mas não tão longo como a saturar o filme de áreas com alta de ligação. Uma vez que as exposições aceitáveis ​​são obtidos, em seguida, avance para a próxima etapa.

4. Histologia

  1. Preparar a mancha tionina e reagentes de coloração (Tabela 2, Figura 7).
    1. Colocar as lâminas "-3" no porta-lâminas, e transferência de forma sequencial começando com água desionizada durante 1 min, em seguida, tionina solução corante durante 10 min seguido de três mergulha deionáguas ized, e uma lavagem de 30 segundos em água deionizada.
    2. Após a água, coloque o porta-lâminas para lavagens de etanol como segue; 50%, 70% e 90% durante 30 segundos, seguido por duas lavagens de etanol a 100% durante 1 min cada. Por último, coloque o porta-lâminas em xileno por 3 min, em seguida, transferir para uma segunda solução xileno durante 5 min.
  2. Remover uma lâmina de cada vez a partir do último banho de xileno, e cobrir a borda superior da lâmina com uma base de resina em meio de montagem solvente orgânico, e colocar uma lamela de 24 milímetros x 60 milímetros sobre a lâmina. Deixar as lâminas suficientemente seca para ~ 48 horas e, em seguida, digitalizar para o computador a 2.400 dpi em tons de cinza.

5. densitom�rica Análise de Imagem

  1. Coloque o lado do filme brilhante para baixo, com a borda irregular no canto inferior esquerdo e digitalizar usando um scanner proprietária capaz de transmitir a informação densidade do filme, sem qualquer distorção no computador sistema de imagem.
  2. Abra as sys imagem proprietáriasTEM e utilizam as barras de calibração para estabelecer padrões de calibração para a futura análise densitométrica das imagens sobre o filme (Figuras 9 - 12).
  3. áreas medida de interesse por qualquer estabelecimento de um modelo ou empiricamente, indicando as áreas de interesse. Os dados são recolhidas e separadas baseado no filme, controlo ou de tipo selvagem (seção), e região. Certifique-se incluir densidade (fmol / g), área de digitalização, e uma área de meta total nas medições (Figura 9).
    1. Ajuste bares área de digitalização, assegurando que a região de interesse cai entre parâmetros de destacar (Figura 10).
    2. Exportar dados em uma planilha (Tabela 4). Multiplicar as vezes de densidade da área alvo total, então dividir pela área de leitura, a fim de obter o valor para a ligação do que a área específica. Uma vez que isto é feito para todos os valores medidos, o substrato não-específica estabelecida total e produzir o p de ligação específicaressentir-se. Médias também pode ser realizada por estes valores.

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Representative Results

A síntese da via metabólica do sistema renina-angiotensina é mostrado na Figura 1 e o foco directo sobre os subtipos de receptores da angiotensina II (AT 1 R e AT 2 R) está descrita na Figura 2. A Figura 3 mostra a transferência de cérebro coronal secções em lâminas de microscópio, que são executados através de um processo de auto-radiograf ia do receptor utilizando uma concentração pré-determinada de 125I-SIANG II, tal como visto na Figura 4. a Figura 5 ilustra o passo de secagem para as lâminas na autorradiografia do receptor que são, em seguida, fixada num cartão como visto na Figura 6, e subsequentemente desenvolvidas. a Tabela 2 enumera os reagentes utilizados para o procedimento de coloração tionina para as secções de tecido em lâminas descritas na Figura 7. calibração unidades padrão para quantificação são BA determinadased na data do ensaio, como visto na Tabela 3. A Figura 8 mostra o estabelecimento de uma curva padrão respeitante 125I concentração (fmol / g de tecido) a exposição (densidade relativa optometric) filmar. A Figura 11 ilustra a distinção entre "PEN" e os grupos "total", bem como as etiquetas de tecido, enquanto a Figura 10 descreve a configuração do limiar para um valor próximo de zero para se obter um valor médio precisas para toda a área digitalizada (area-pixel Scan). Tabela 4 exibe a quantificação processo de obtenção de ligação específica com base na subtraindo o "não-específica" de valores "total". "Não específica" vinculativo que contém losartan e / ou PD123319 é criado pela quantidade de radioligando ligado à não-AT 1 ou a 2 receptores. Todo o radioligando ligado aos receptores AT 1 na presença de PD123319 produz o "total" de ligação. F IGURA 11 exibe as áreas medidas finais do PVN no total adjacente ligação vs. não-específico para uma seção manchada tionina para a confirmação anatômica do PVN.

figura 1
Figura 1:. Via metabólica do sistema renina angiotensina (RAS) no corpo O fígado liberta o angiotensinogénio zimogénio, que é clivado pela renina secretada-renal, formando angiotensina I. A enzima conversora de angiotensina (ACE) converte a Ang I em angiotensina II ( Ang II), o principal precursor da doença cardiovascular. Ang II causa vasoconstrição e aumenta a pressão arterial, débito cardíaco, o apetite de sal, sede e retenção de água. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

"> Figura 2
Figura 2:. Funções do tipo A angiotensina 1 e 2 receptores (a 1 R, AT 2 R) a 1 R patologicamente afeta doença cardiovascular, atua diretamente para aumentar a sede e do apetite de sal, e exerce muitas outras atividades celulares periféricos, bem como central efeitos psicológicos. AT 2 R é um antagonista fisiológico do receptor AT 1, auxiliando na eficácia da AT 1 R antagonistas 36 tendo assim efeitos benéficos sobre a estrutura vascular. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3: Cryosectioning do cérebro em lâminas de microscópio a 20 mm de espessura. Dependendo da temperatura do criostato, as seções irão às vezes exibir dobras, fissuras, curling, ou tornar-se compactado na lâmina micrótomo ou navalha. Em tais casos, a secção é descartada e uma nota é feita para indicar que um extra de 20 uM separará esta secção a partir da secção anterior. Seções devem ser recolhidos em lâminas em uma direção vertical, a fim de maximizar a área total necessária para encher um slide e, portanto, recolher a maior quantidade de seções sobre cada slide. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4
Figura 4:. Amostra de Desenho Experimental e Protocolo para Receptor autorradiografia diferenciaramção de "total" (-2) e "não específica" (-1) está directamente relacionada com a presença e ausência de antagonista do subtipo do receptor. Protocolo pode variar de acordo com o número de slides, e vai aumentar em incrementos de 2 para cada par de lâminas totais e não-específicas. concentração do radioligando, previamente determinado é obtido por diluição do estoque em AM5. Esta solução é então distribuída para os recipientes de incubação. Contagens directas são tomadas antes e depois da incubação para estabelecer a exata concentração do ligando radioactivo. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5
Figura 5:. Configuração para a estação de secagem em autorradiografia do receptor Os tempos de secagem podem variar com base na eficiência do soprosecadores, bem como a capacidade de apagar qualquer excesso de água após as últimas lavagens. Slides serão seca uma vez que a secção se transforma de transparente para branco. Se as lâminas não estão completamente secos, em seguida, ligando radioactivo pode difundir para longe do receptor produzindo uma imagem difusa, que não é específico para os locais de ligação ao receptor. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6
Figura 6:.. Expondo lâminas tratadas com filme de raios-x usando uma cassete especializada slide set-up é recomendado para seguir um padrão em que a comparação dos dois grupos é facilitada por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.


Figura 7: Configuração para Tionina coloração. Slides serem carregados em um suporte de slides e imersos em soluções sequenciais. Sincronismo permite a coloração eficaz da substância de Nissl (retículo endoplasmático) dos neurônios. A montagem aplicação médio e os slides seguintes desidratação permite a fixação da lamela para o slide, preservando as seções para análise comparativa. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 8
Figura 8:. Ajustar o padrão de calibração Cada película contém seus padrões de calibração individuais, com base na pasta de cérebro e o momento em que a experiência foi realizada . Uma linha de regressão descrevendo os melhores valores de ajuste é gerado por um programa de sistema de imagem de propriedade para os padrões de pasta de cérebro medidos. Isto converte o valor relativo densidade optometric (ROD) a partir de padrões de calibração (DST cal, em oval vermelho) às unidades de ligação de radioligandos, neste exemplo as unidades (fmol / g, circulado em vermelho) estão radioligandos fmol ligada por grama de molhado o peso do tecido (fmol / g). A medição dos padrões colar cérebro é feito com a ferramenta circular e colocado no meio da amostra mostrado à direita na pseudo usando o ícone de visualização de imagem (circulado em vermelho). O círculo para medir o padrão de calibração não tem que cobrir toda a amostra, mas sim medir uma área ainda da norma. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 9:. Identificar os grupos por número da amostra, não específica / total e regiões para leituras de amostra Como vários cérebros, regiões do cérebro, e vários grupos experimentais são quantificados em conjunto, é crucial para diferenciar entre todos os fatores. O assunto indica que a amostra do cérebro e também pode indicar grupo; a secção indica se é não-específico (PEN) ou total, ao passo que a região permite a identificação de várias regiões do cérebro que estão a ser amostrados. A barra de ferramentas da amostra (retângulo vermelho) descreve diferentes instrumentos de amostragem, por exemplo, círculo, quadrado, modelo, à mão livre, borracha; que pode ser usada para delinear a área a ser medida. Os valores ROD obtidos dentro da área da ferramenta de amostragem são registrados na planilha como unidades convertidos de ligação, fmol / g (circulado em vermelho). Além disso, a área de digitalização total dentro a ferramenta de amostragem é gravada na coluna "Scan área-pixel", enquanto o total de tárea arget (o número de pixels que excedam o valor limiar (descrito na Figura 10 legenda) é gravada na coluna "Total Tgt Area-pixel". Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 10
Figura 10: Determinação do limiar de amostras a ser medido com base nas normas A área de digitalização é único para cada filme, e depende dos padrões estabelecidos.. Usando a ferramenta de limiar (circulado em vermelho) para definir valores de limite para a faixa de densidade para a área de digitalização em fmol / g irá permitir para as áreas medidos (delineada por setas diagonais) para situar-se entre um intervalo de 0, até um ponto onde a curva de calibragem começa a assíntota indicando que a película está a chegar uma exposição máxima, para além do qual adicional por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 11
Figura 11: Imagens representativas de autorradiografia de receptores que se ligam a secções coronais de uma fêmea de ratos espontaneamente hipertensos (SHR) em ~ caudal 1,8 milímetros em relação ao bregma, exibindo o núcleo paraventricular do hipotálamo (PVN) e o núcleo leito do tracto olfactivo acessório (baot ). (A </ strong>) Total ligação da AT vinculativo 1 R (Red- PVN, amarelo-baot). (B) a ligação não específica com losartan (antagonista AT1R) e PD123319 (antagonista AT2R). Ligação (C) Total de AT 1 R obrigatório, com um limite arbitrário colocação como para delinear a forma do PVN (preenchimento preto) superior ao valor limite dentro a área de digitalização que está registrado como total Tgt Area). (D) Tionina manchado seção para confirmação anatômica das estruturas com elevada ligação total e, para comparação com outras regiões do cérebro ou de outros grupos experimentais. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

reagentes Quantidade
NaCl 8,76g
Na2EDTA 1,86 g
bacitracina 141 mg
500 mM dibásico Na 2 PO 4 100 ml
Destilada Água deionizada 900 ml
Ajustar o pH para 7,1 a 7,2 com NaOH ou HCl

Tabela 1: Meio de Ensaio (AM5) componentes químicos do tampão utilizado na preparação do tecido..

tabela 1
Tabela 2:. Tionina Stain Reagentes A mancha tionina é constituído por água destilada, 1,0 M de acetato de sódio e solução M Ácido acético glacial 1,0, titulado para um pH de 4,3 antes da adição de uma solução 0,5% de tionina.

Dias data de referência passado
fornada fmol / g de peso molhado Ref Data 1 2 3 4 5
Padrão nCi / mg fmol / g dpm / g fmol / g fom / g fmol / g fmol / g fmol / g fmol / g
número 30 de maio 30 de maio 30 de maio 30 de maio 31 de maio 1-Jun 2 de junho 3 de junho 4 de junho
1 9706 4463 21547320 4463 4411 4361 4311 4261 4212
2 5838 2.684 12960360 2.684 2653 2623 2593 2563 2533
3 2798 1286 6.211.560 1286 1272 1.257 1243 1228 1214
4 1451 667 3.221.220 667 659 652 644 637 630
5 787 362 1.747.140 362 358 354 350 345 342
6 385 177 854700 177 174 173 171 169 167

Tabela 3:. Cálculos diário Decay Taxa para Padrões de Calibração A planilha taxa de decaimento diária para os padrões de calibração terá de ser criado com base nas datas em que o experimento foi realizado. Esta folha de cálculo baseia-se na constante de primeira ordem com uma meia-vida (t meia) de 60 dias. N = N 0 * E KT, em que N = concentração de 125I, no instante t em relação à concentração no tempo 0 (N 0), e k = ln2 / T 1/2.

Seção </ Tr>
Paraventricular Núcleo do hipotálamo
Alvo Densidade-fmol / g Área de digitalização Área meta total Total*
Total 1 996 4383 4383 996
Total 2 921 3362 3362 921
Total 3 818 3445 3445 818 A ligação específica
Total 4 710 2.906 2.906 710 967
MÉDIA 861 3524 3524 861 895
763
Seção Alvo Densidade-fmol / g Área de digitalização Área meta total Não especificado * 678
NSP 1 53 3072 1737 30 826
NSP 2 52 2959 1455 26
NSP 3 86 3180 2035 55
NSP 4 53 3293 1.995 32
MÉDIA 61 3126 1,805.5 36
Núcleo leito do Acessório Olfactory Tract
Seção Alvo Dens-fmol / g Área de digitalização Área meta total Total*
Total 1 439 3632 3632 439
Total 2 435 3632 3632 435
Total 3 355 3632 3620 354
Total 4 435 3632 3631 435 A ligação específica
Total 5 342 3632 3630 342 414
Total 6 334 3632 3606 331 393
MÉDIA 390 3632 3625 389 321
394
315
Seção Alvo Dens-fmol / g Área de digitalização Área meta total Não especificado * 320
NSP 1 49 3632 1846 25 360
NSP 2 64 3632 2362 42
NSP 3 53 3632 2275 33
NSP 4 64 3632 2.339 41
NSP 5 51 3632 1879 26
NSP 6 41 3632 966 11
MÉDIA 54 3632 1945 30
* Total e Não-especíico são unidades de densidade de fmol / g.
Total = densidade * Área meta total / área de digitalização
Não específica = densidade * Área meta total / área de digitalização
Área Total Target é pixels que excedeu o valor limite, definido como perto de 0,00 fmol / g quanto possível.
Pixels que não exceda o limitevalor receber um valor de 0 para a avaliação da densidade total.
Pixels que não excedam o valor limiar de receber um valor de 0 para a avaliação da densidade não-específica.
A ligação específica é específica total menos a ligação não-expressos em unidades de densidade de fmol / g.

Tabela 4: Análise quantitativa do núcleo paraventricular do hipotálamo e cama núcleo do acessório olfativa trato exporta dados software de imagem como uma planilha em fmol / g, área de digitalização, e uma área de meta total em pixels.. Vinculativo "não específica" é subtraído do 'total' de ligação, a fim de obter o específica AT 1 quantitativa vinculativo.

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Discussion

O protocolo descrito identifica a visualização de "total" e "não específica" de ligação do radioligando em secções adjacentes de secções coronais de cérebro de roedor anteriormente colhido e armazenado a -80 ° C, e pode ser facilmente aplicável a virtualmente todos os tecidos que tem anatomicamente resolvido subestruturas que mostram quantidades diferenciais de receptores ou locais de ligação de radioligandos. Os procedimentos descritos no âmbito do protocolo são simples e a análise é fundamental para interpretar corretamente os resultados. A espessura de 20 um foi determinado como sendo óptima; Se a secção é muito espesso a ligação não-específica irá aumentar, tornando-o difícil de resolver a ligação do radioligando ao seu alvo. Se a seção é cortado mais fino, torna-se difícil de cortar e guardar secções sequenciais sem distorção com sucesso. A temperatura de corte óptima irá variar um pouco, devido à natureza do tecido e a espessura das secções e ié geralmente determinada empiricamente. Uma vez que o contato é feito entre a lâmina e o tecido, a orientação da amostra podem ser revistos e realinhados movendo a amostra de tecido de volta para longe da lâmina, e reorientar a bola de montagem. Quando o corte de um cérebro de roedor é crítico para assegurar o lado esquerdo e direito do cérebro estão nas mesmas coordenadas ântero-póstero, e que o eixo dorso-ventral do cérebro é atlas perpendicular ao vulgarmente utilizados. conjuntos de slides são pré-marcados, a fim de realizar estudos sobre seções adjacentes de tecidos. Os primeiros conjuntos de 5 slides são rotulados 1-1, 1-2, 1-3, 1-4 e 1-5. A primeira seção de corte vai no slide 1-1 no canto superior esquerdo (este é o canto superior direito do slide quando é lado fosco para baixo); a segunda seção de corte vai no slide 1-2, etc. A seção quinta corte vai no slide 1-5. A secção de corte de sexta vai no slide 1-1 à esquerda da primeira seção. Após o primeiro conjunto de lâminas é preenchido, iniciar um outro conjunto de 5 deslizouES, marcado 2-1, 2-2, 2-3, 2-4, e 2-5. Este ciclo é continuada na medida de volta para o cérebro, como necessário. O "4" e "-5" slides são mantidos como um backup ou para marcar radioactivamente um receptor diferente.

O protocolo de autorradiografia do receptor depende do radioligando utilizada e as características dos receptores sendo pesquisados ​​para determinar as concentrações de sais e tampões, inibidores de. Para a medição do subtipo AT1 de receptores de Ang II no presente processo, um ligando marcado de elevada afinidade, iodo-125, 125I-Sar Ile 1 8 -Ang II (125I-SI-Ang II); radiomarcado por Robert C. Speth, Ph.D. (Radioiodação de Recursos Shared Peptide, Georgetown University), que também está comercialmente disponível) é dissolvido em tampão AM5 (Tabela 1); um tampão de fosfato de sódio com cloreto de sódio, EDTA e bacitracina. AM5 proporciona uma boa protecção do ligando radioactivo de metalopeptidases e peptida sensível à bacitracinases que proporcione um pH fisiológico e a concentração de NaCl para optimizar as características de ligação. A pré-incubação em AM5 expõe as secções de tecido para a peptidase inibidores para minimizar a degradação do radioligando, e também se dissocia Ang II endógeno a partir dos receptores de Ang II. antagonistas de losartan e PD123319, AT1R e AT2R, respectivamente, que saturar os seus receptores alvo, são adicionados em concentrações (10 uM) para impedir que o ligando radioactivo a partir da ligação a estes receptores para avaliar a ligação não específica e limitar a ligação ao receptor AT1 específica, respectivamente. A concentração desejada de 125I-SI-Ang II para o ensaio é determinada e a diluição necessária da solução é determinado a partir de uma folha de cálculo da taxa de decaimento radioisótopo (ver protocolo Tabela 3). Optimamente uma concentração de radioligando aproximar a K D é utilizado o que iria ocupar 50% dos receptores presentes. No entanto, porque radioligandos podem ser caros e inferior concentrações.g. pode ser utilizado 10-20% da concentração de K D. Isto tem uma vantagem potencial de aumentar a relação sinal-ruído através da redução ligação não específica de mais do que a ligação específica. No entanto, os tempos de exposição mais longos são necessários para desenvolver uma imagem da ligação. Como notado acima (ponto 3.4), se a exposição obtida está acima ou abaixo exposto, as lâminas podem ser re-expostos a um filme para um mais curto e / ou um tempo mais longo para atingir a exposição desejada.

A análise densitométrica de imagem pode ser realizado por um sistema de imagem proprietária que fornece uma extensa compêndio dos pedidos de autorradiografia, bem como outras aplicações. Os padrões de calibração são em fmol / g de peso de tecido húmido (assumindo um peso específico de um para o tecido). Cada conjunto padrão, juntamente com um fundo vai gerar uma curva padrão. Há vários algoritmos de ajuste de curvas com e sem ponderação disponíveis para gerar uma curva padrão a partir da d optometric relativaensity (haste) valores diferentes para os padrões de calibração. Selecção da curva que melhor representa os dados é feito empiricamente como a sub-rotina de ajuste de curvas não fornece valores de erro relativas para as diferentes curvas padrão. No hastes até ~ 0,6, a curva padrão é pseudolinear. No entanto, o filme começa a saturar além deste ponto formando uma curva que Assimptotas cerca de 0,8 a 0,9 unidades da haste. Se os padrões que são delimitam as amostras são acima unidades 0,9 haste, recomenda-se a re-expor a película durante um período de tempo mais curto para obter valores mais fiáveis ​​de fmol / g de ligação das amostras para mais perto da gama pseudolinear da norma curva. Valores obtidos neste extremo da curva padrão vai resultar em pequenas diferenças na vara para diferenças significativamente maiores em ligação de radioligandos. Daí a capacidade de detectar mudanças em diminuições de ligação como o filme se aproxima de seu ponto de saturação.

Para medições de regiões específicas,medidas recomendadas são "densidade" em fmol / g, "área Scan 'em pixels, e' Alvo Área Total 'em pixels (Figura 9). É importante estabelecer um valor limite mais próximo de zero quanto possível (Figura 10) porque as variações na densidade do filme ou o aspecto arbitrária da curva padrão derivada dos padrões de calibração pode, por vezes, dão valores inferiores a zero. Se esses valores são a média para todos os pixels na área de digitalização não retiraria um valor artificialmente baixo. Os critérios utilizados para identificar as áreas com a ligação pode ser muito subjetiva, por isso é melhor para emparelhar perto o controle e cérebros experimentais, tanto quanto possível para reduzir a incidência de erros subjetivos. Outro desafio é decidir quantas seções a média para obter uma leitura final. Uma boa indicação de secções para analisar pode ser determinada pelo seguimento de uma aceitos atlas do cérebro de rato, juntamente com as lâminas histológicas coradas. O tamanho da área de amostragem também pode ser umproblema. A fim de compensar, um modelo pode ser estabelecido para corrigir quaisquer discrepâncias de tamanho. O tratamento das secções podem também afectar uma área da estrutura que tem uma elevada ligação e devem ser considerados durante a análise. Isto requer uma utilização alternativa da ferramenta "limiar" no sistema de imagem proprietária para definir um intervalo de densidade superior a um valor arbitrário de modo a representar as características anatômicas da região do cérebro que está sendo amostrado como o núcleo paraventricular do hipotálamo dentro de uma ferramenta de amostragem que abrange a região de interesse (Figura 11, painel C). É também possível incluir a medição da área para a determinação da quantidade de ligação. Isto pode ser feito através da multiplicação do valor para os tempos de ligação específicos o número de pixels que foram medidos. Os pixels podem ser convertidas em unidades métricas por imagiologia de uma régua em dois planos, ou um rectângulo de dimensões conhecidas. O número de pixels que correspondem àscomprimento ou área do rectângulo pode então ser expressa em unidades métricas. Com resolução de 2.400 dpi, ~ 9000 pixels = 1 mm 2 no nosso sistema.

Embora o uso de ligandos radioactivos já não é uma técnica amplamente utilizada; é uma das poucas maneiras para visualizar a distribuição física de receptores no interior do tecido espécimes-se como funcional (capaz de se ligar ao seu ligando inata). Além disso, pode quantificar o número de receptores para permitir a avaliação de alterações na expressão do receptor funcional entre os grupos de tratamento, entre diferentes regiões do cérebro ou outras estruturas, entre diferentes estirpes de animais ou animais de diferentes idades, etc. Os métodos alternativos estão disponíveis para caracterizar aspectos neuroanatômicos de expressão do receptor AT 1, no entanto, eles têm valor limitado. A hibridização in situ de mRNA para receptores AT 1 nem sempre corresponde com a AT 1 do receptor de expressão ou a distribuição nocérebro. Embora as técnicas imunológicas pode aproximar diferenças na expressão do receptor com base na intensidade da coloração de secções de tecido, não é possível gerar uma curva padrão para a coloração para permitir uma determinação numérica de expressão do receptor. Receptor de auto-radiografia também fornece um nível de especificidade para os receptores (ou outros alvos que se ligam especificamente a radioligandos) que não pode ser garantida utilizando técnicas imunológicas. Em 2009, uma série de artigos foram publicados 37-43 que questionaram a validade de 49 anticorpos que estavam sendo usados ​​para avaliar 18 receptores acoplados à proteína G diferentes e um canal de potencial transitório receptor (TRP). Em essência, anticorpos marcados bandas idênticas em transferências de Western de tipo selvagem e ratinhos knockout para os receptores em questão. Posteriormente, vários grupos fizeram observações semelhantes usando comercialmente disponíveis AT 1 e AT anticorpos do receptor 2 44-49. O uso de um bacteriai cromossoma artificial, que gera uma molécula repórter, por exemplo, a proteína fluorescente verde, impulsionado pela AT um promotor é um meio indirecto para a determinação da presença ou ausência de AT 1 células que expressam o receptor no rato (mas não de rato) cérebros com base na sua tendo um funcional promotor 1 receptor 50. É possível contar "células" positivas nas regiões do cérebro microscopicamente identificados, mas não para quantificar as alterações na intensidade da expressão do receptor AT 1 nestas regiões. Assim, neste momento, as técnicas só validado que disponíveis para medir directamente a expressão do receptor Ang II são radioactivo métodos de encadernação. E, se a resolução anatômica funcional AT proteína receptora 1 é necessária em um nível microscópico, autoradiografia do receptor é a única técnica disponível para tal medição direta.

Receptor autoradiografia não é sem limitações. A principal concern é o de cumprir os requisitos para usar materiais radioativos em um ambiente de pesquisa. É necessário ter um programa de segurança de radiação com diretrizes rigorosas para garantir a segurança de pesquisadores que trabalham com materiais radioativos e a disposição segura dos materiais radioativos. Isso aumenta o custo da pesquisa utilizando materiais radioativos a um ponto que impede o seu uso em muitos ambientes de pesquisa. Além disso, o custo de radioligandos podem ser substanciais. Assim, um receptor de auto-radiografia experimento em que um grande número de secções de tecido em lâminas são incubadas em recipientes de radioligando pode utilizar centenas, se não milhares de dólares de radioligando. Outra limitação é que os tecidos devem ser congelados antes de seccionamento num crióstato, armazenado por um período de tempo, e rapidamente enxaguada e seca após a incubação com radioligandos, todos os quais podem prejudicar a capacidade dos receptores ou proteínas de interesse para ligar o radioligando . Para ligantes que têm rabo rápidaociation cinética / dissociação, pode não ser possível manter a ligação do radioligando para o receptor durante o tempo necessário para enxaguar radioligando não ligado especificamente. Além disso, com baixas quantidades de ligação de longos períodos de exposição do filme radioligando - um mês ou mais - podem ser necessárias antes de uma imagem mensurável pode formar no filme. Um outro desafio é que a adição de iodo-125 para um ligando pode comprometer a capacidade do ligando para se ligar ao seu receptor ou proteína alvo devido a impedimento estérico. A utilização de uma molécula mais pequena, por exemplo, trítio (3H) elimina o problema de impedimento estereoquímico, mas trítio tem uma energia baixa e baixa actividade específica (em relação a iodo-125) que é extremamente difícil de gerar uma imagem do filme para a maioria populações de receptores. À luz dessas questões, há muitas situações em que autoradiografia receptor não consegue identificar receptores ou outras estruturas moleculares de interesse.

Apesar da sua limitations, autorradiografia do receptor pode identificar estruturas específicas dentro de um tecido, por exemplo, regiões cerebrais alteradas em resposta às variáveis ​​experimentais em comparação com um controlo normal do cérebro. Este conhecimento pode ajudar a determinar o papel da NA 1R para Ang II, ou outro receptor ou enzimas na patologia da doença. Este conhecimento tem implicações farmacológicas importantes, uma vez que indica áreas de alvo para terapias potenciais.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
500 ml Plastic Beakers Fisher 02-591-30
24 mm x 60 mm Coverslips Fisher 22-050-25
Autoradiography Imaging Film 24 mm x 30 cm Carestream-Biomax MR Film 891-2560
Bacitracin (from Bacillus licheniformis) Sigma B-0125
Cardboard Sheet 8 x 11 Crescent Illustration Board #201 201
Coplin Jars Fisher Scientific E94
Commercial hair dryers Conair Model SD6X
Disposable Culture Tubes Fisher 14-961-26
EDTA (Disodium salt, Dihydrate) USB Corporation 15-699
Ethanol Fisher 16-100-210 
Formulary Substitute for D-19 Developer Photographers Formulary, Inc.  01-0036
Glacial Acetic Acid Fisher A38 SI-212
Histoprep/OCT Fisher SH75-125D
Film Fixer Kodak 5160320
Photo flo Kodak 1464502
Losartan Fisher/Tocris 37-985-0
MCID™ Core 7.0 MCID N/A
NaCl Fisher S271
Peel-A-Way slide grips VWR 48440-003
Permount Fisher SP15-100
PD123319 Fisher 13-615-0
Premium Charged Slides, Fine Ground Edge Premiere Microscope Slides 9308W
125I Ligands Perkin Elmer NEX- 248
125SI-Ang II  George Washington University Radioiodinated by Dr. Speth
Slide Mailers Fisher Scientific HS15986
Sodium Dibasic Phosphate Anhydrous (Na2PO4) Fisher RDCS0750500
Sodium Acetate (Anhydrous) Fisher BP333-500
Thionin  Fisher T409-25
X-Ray Casette (10 x 12) Spectronics Corporation Four Square
Xylene Fisher  X3P-1GAL

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References

  1. Mozaffarian, D., et al. Heart disease and stroke statistics--2015 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 131 (4), 29-322 (2015).
  2. Peart, W. S. The Renin-Angiotensin System. Pharmacol Rev. 17, 143-182 (1965).
  3. Ganten, D., et al. Angiotensin-forming enzyme in brain tissue. Science. 173 (3991), 64-65 (1971).
  4. Ganten, D., Fuxe, K., Phillips, M. I., Mann, J. F. E., Ganten, U. Frontiers in Neuroendocrinology. Ganong, W. F., Martini, L. , Raven Press. N.Y. Vol. 5 61-99 (1978).
  5. Fyhrquist, F., Metsarinne, K., Tikkanen, I. Role of angiotensin II in blood pressure regulation and in the pathophysiology of cardiovascular disorders. J Hum Hypertens. 9, Suppl 5 19-24 (1995).
  6. von Bohlenund und Halbach, O., Albrecht, D. The CNS renin-angiotensin system. Cell Tissue Res. 326 (2), 599-616 (2006).
  7. Speth, R., Giese, M. Update on the renin-angiotensin system. J Pharmacol Clin Toxicol. 1 (1), 1004 (2013).
  8. de Kloet, A. D., Liu, M., Rodriguez, V., Krause, E. G., Sumners, C. Role of neurons and glia in the CNS actions of the renin-angiotensin system in cardiovascular control. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. , (2015).
  9. Saavedra, J. M., Sanchez-Lemus, E., Benicky, J. Blockade of brain angiotensin II AT1 receptors ameliorates stress, anxiety, brain inflammation and ischemia: Therapeutic implications. Psychoneuroendocrinology. 36 (1), 1-18 (2011).
  10. Stornetta, R. L., Hawelu-Johnson, C. L., Guyenet, P. G., Lynch, K. R. Astrocytes synthesize angiotensinogen in brain. Science. 242, 1444-1446 (1988).
  11. Li, W., Peng, H., Seth, D. M., Feng, Y. The Prorenin and (Pro)renin Receptor: New Players in the Brain Renin-Angiotensin System. Int.J.Hypertens. 2012, 290635 (2012).
  12. Strittmatter, S. M., Kapiloff, M. S., Snyder, S. H. [3H]captopril binding to membrane associated angiotensin converting enzyme. Biochem. Biophys. Res. Commun. 112, 1027-1033 (1983).
  13. Bild, W., Hritcu, L., Stefanescu, C., Ciobica, A. Inhibition of central angiotensin II enhances memory function and reduces oxidative stress status in rat hippocampus. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 43, 79-88 (2013).
  14. Wright, J. W., Harding, J. W. Brain renin-angiotensin-A new look at an old system. Progress in Neurobiology. 95 (1), 49-67 (2011).
  15. Tashev, R., Stefanova, M. Hippocampal asymmetry in angiotensin II modulatory effects on learning and memory in rats. Acta Neurobiol Exp (Wars). 75 (1), 48-59 (2015).
  16. Reudelhuber, T. L. The continuing saga of the AT2 receptor: a case of the good, the bad, and the innocuous. Hypertension. 46 (6), 1261-1262 (2005).
  17. Carey, R. M. Cardiovascular and renal regulation by the angiotensin type 2 receptor: the AT2 receptor comes of age. Hypertension. 45 (5), 840-844 (2005).
  18. Valero-Esquitino, V., et al. Direct angiotensin type 2 receptor (AT2R) stimulation attenuates T-cell and microglia activation and prevents demyelination in experimental autoimmune encephalomyelitis in mice. Clin Sci (Lond). 128 (2), 95-109 (2015).
  19. Chen, J., et al. Neuronal over-expression of ACE2 protects brain from ischemia-induced damage. Neuropharmacology. 79, 550-558 (2014).
  20. Kalra, J., Prakash, A., Kumar, P., Majeed, A. B. Cerebroprotective effects of RAS inhibitors: Beyond their cardio-renal actions. J Renin Angiotensin Aldosterone Syst. , (2015).
  21. Zhao, Y., et al. Activation of intracellular angiotensin AT(2) receptors induces rapid cell death in human uterine leiomyosarcoma cells. Clin Sci (Lond). 128 (9), 567-578 (2015).
  22. Gehlert, D. R., Speth, R. C., Wamsley, J. K. Quantitative autoradiography of angiotensin II receptors in the SHR brain. Peptides. 7 (6), 1021-1027 (1986).
  23. Mendelsohn, F. A., Quirion, R., Saavedra, J. M., Aguilera, G., Catt, K. J. Autoradiographic localization of angiotensin II receptors in rat brain. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (5), 1575-1579 (1984).
  24. Gehlert, D. R., Speth, R. C., Wamsley, J. K. Autoradiographic localization of angiotensin II receptors in the rat brain and kidney. Eur J Pharmacol. 98 (1), 145-146 (1984).
  25. Speth, R. C., et al. Angiotensin II receptor localization in the canine CNS. Brain Res. 326 (1), 137-143 (1985).
  26. Santos, R. A. S., et al. Angiotensin-(1-7) is an endogenous ligand for the G protein-coupled receptor Mas. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (14), 8258-8263 (2003).
  27. Karamyan, V. T., Gembardt, F., Rabey, F. M., Walther, T., Speth, R. C. Characterization of the brain-specific non-AT(1), non-AT(2) angiotensin binding site in the mouse. Eur J Pharmacol. 590 (1-3), 87-92 (2008).
  28. Karamyan, V. T., Speth, R. C. Distribution of the non-AT1, non-AT2 angiotensin-binding site in the rat brain: preliminary characterization. Neuroendocrinology. 88 (4), 256-265 (2008).
  29. Karamyan, V. T., Stockmeier, C. A., Speth, R. C. Human brain contains a novel non-AT1, non-AT2 binding site for active angiotensin peptides. Life Sci. 83 (11-12), 421-425 (2008).
  30. Miller-Wing, A. V., et al. Central angiotensin IV binding sites: distribution and specificity in guinea pig brain. J Pharmacol Exp Ther. 266 (3), 1718-1726 (1993).
  31. Castren, E., Kurihara, M., Saavedra, J. M. Autoradiographic localization and characterization of angiotensin II binding sites in the spleen of rats and mice. Peptides. 8 (4), 737-742 (1987).
  32. MacGregor, D. P., et al. Angiotensin II receptor subtypes in the human central nervous system. Brain Res. 675 (1-2), 231-240 (1995).
  33. Plunkett, L. M., Correa, F. M. A., Saavedra, J. M. Quantitative autoradiographic determination of angiotensin-converting enzyme binding in rat pituitary and adrenal glands with 125I-351/A, a specific inhibitor. Regul Pept. 12, 263-272 (1985).
  34. Armando, I., et al. Increased angiotensin II AT(1) receptor expression in paraventricular nucleus and hypothalamic-pituitary-adrenal axis stimulation in AT(2) receptor gene disrupted mice. Neuroendocrinology. 76 (3), 137-147 (2002).
  35. Speth, R. C., Harding, J. W. Angiotensin Protocols Vol. 51 Methods in Molecular Medicine. Wang, D. H. , Humana Press. 275-295 (2001).
  36. Widdop, R. E., Jones, E. S., Hannan, R. E., Gaspari, T. A. Angiotensin AT2 receptors: cardiovascular hope or hype. Br J Pharmacol. 140 (5), 809-824 (2003).
  37. Michel, M. C., Wieland, T., Tsujimoto, G. How reliable are G-protein-coupled receptor antibodies. Naunyn Schmiedebergs Arch.Pharmacol. 379 (4), 385-388 (2009).
  38. Jensen, B. C., Swigart, P. M., Simpson, P. C. Ten commercial antibodies for alpha-1-adrenergic receptor subtypes are nonspecific. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 379 (4), 409-412 (2009).
  39. Jositsch, G., et al. Suitability of muscarinic acetylcholine receptor antibodies for immunohistochemistry evaluated on tissue sections of receptor gene-deficient mice. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 379 (4), 389-395 (2009).
  40. Hamdani, N., van der Velden, J. Lack of specificity of antibodies directed against human beta-adrenergic receptors. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 379 (4), 403-407 (2009).
  41. Bodei, S., Arrighi, N., Spano, P., Sigala, S. Should we be cautious on the use of commercially available antibodies to dopamine receptors. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 379 (4), 413-415 (2009).
  42. Lu, X., Bartfai, T. Analyzing the validity of GalR1 and GalR2 antibodies using knockout mice. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 379 (4), 417-420 (2009).
  43. Everaerts, W., et al. Where is TRPV1 expressed in the bladder, do we see the real channel. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 379 (4), 421-425 (2009).
  44. Adams, J. M., McCarthy, J. J., Stocker, S. D. Excess dietary salt alters angiotensinergic regulation of neurons in the rostral ventrolateral medulla. Hypertension. 52 (5), 932-937 (2008).
  45. Herrera, M., Sparks, M. A., Alfonso-Pecchio, A. R., Harrison-Bernard, L. M., Coffman, T. M. Lack of specificity of commercial antibodies leads to misidentification of Angiotensin type 1 receptor protein. Hypertension. 61 (1), 253-258 (2013).
  46. Rateri, D. L., et al. Endothelial Cell-Specific Deficiency of Ang II Type 1a Receptors Attenuates Ang II-Induced Ascending Aortic Aneurysms in LDL Receptor(-/-) Mice. Circ Res. 108 (5), 574-583 (2011).
  47. Benicky, J., Hafko, R., Sanchez-Lemus, E., Aguilera, G., Saavedra, J. M. Six Commercially Available Angiotensin II AT(1) Receptor Antibodies are Non-specific. Cell Mol Neurobiol. 32 (8), 1353-1365 (2012).
  48. Elliott, K. J., Kimura, K., Eguchi, S. Lack of specificity of commercial antibodies leads to misidentification of angiotensin type-1 receptor protein. Hypertension. 61 (4), 31 (2013).
  49. Hafko, R., et al. Commercially available angiotensin II At(2) receptor antibodies are nonspecific. PLoS One. 8 (7), 69234 (2013).
  50. Gonzalez, A. D., et al. Distribution of angiotensin type 1a receptor-containing cells in the brains of bacterial artificial chromosome transgenic mice. Neuroscience. 226, 489-509 (2012).

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