Abstract
Denne protokol beskriver receptorbindende mønstre for angiotensin II (Ang II) i rottehjerne under anvendelse af en radioligand specifikt for Ang II-receptorer til at udføre receptor autoradiografisk kortlægning.
Vævsprøver høstes og opbevares ved -80 ° C. En kryostat anvendes til coronalt sektion vævet (hjernen) og tø-mount afsnittene på ladede objektglas. Slide-monterede vævssnit inkuberes i 125I-SI-Ang II til radiomærke Ang II-receptorer. Tilstødende objektglas er adskilt i to sæt: "ikke-specifik binding" (NSP) i nærvær af en receptor mættende koncentration af ikke-radiomærket Ang II eller en AT 1 Ang II-receptor subtype (AT 1R) selektiv Ang II-receptorantagonist og 'TOTAL bindende' uden AT 1 R antagonist. En mættende koncentration af AT 2 Ang II-receptor subtype (AT 2R) antagonist (PD123319, 10 uM) er også til stede i incubatipå buffer at begrænse 125I-SI-Ang II-binding til AT 1 R subtype. Under en 30 min før inkubation ved ~ 22 ° C, er NSP slides udsat for 10 uM PD123319 og losartan, mens "total binding" slides er udsat for 10 uM PD123319. Slides inkuberes derefter med 125I-SI-Ang II i overværelse af PD123319 for "alt bindende«, og PD123319 og losartan for NSP i assaypuffer, efterfulgt af flere 'vasker' i buffer, og vand for at fjerne salt og ikke- specifikt bundet radioligand. Objektglassene tørres ved hjælp slag-tørretumblere, derefter udsat for autoradiografi film ved hjælp af en specialiseret film og kassette. Filmen fremkaldes og billederne scannet ind i en computer til visuel og kvantitativ densitometri under anvendelse af en navnebeskyttet billedbehandlingssystem og et regneark. En ekstra sæt dias thionin-farvet for histologiske sammenligninger.
Fordelen ved at anvende receptor autoradiografi er evnen til at visualisereAng II-receptorer in situ, inden for en sektion af en vævsprøve, og anatomisk identificere det område af væv ved at sammenligne den med en tilstødende histologisk henvisning sektion.
Introduction
Hjerte-kar-sygdom fortsætter med at være den førende årsag til død og invaliditet i USA, der forårsager mere end 30% af alle dødsfald i USA i 2011 1. De seneste statistikker fra American Heart Association viser, at mere end én person i tre har en eller flere typer for hjerte-kar-sygdom. Hjerte-kar-forskning fortsætter med at gøre fremskridt mod at forstå denne sygdom, men som generationer begynder at blive ældre er det bydende nødvendigt at fortsætte disse bestræbelser. Renin-angiotensin-systemet (RAS) spiller en central rolle i reguleringen af det cardiovaskulære system primært ved at fremme aterosklerose, betændelse, systemisk vasokonstriktion, og aktivering af det sympatiske nervesystem (figur 1) 2-8.
RAS er et hormonale system, der aktiveres, når juxtaglomerulære celler i nyren udskille renin i blodstrømmen som reaktion på nedsat blodtryk, øget sympathetic stimulering eller nedsat natrium strømning af macula densa. Renin metabolizes angiotensinogen (syntetiseret i leveren) for at danne angiotensin I (Ang I). Ang I derefter metaboliseres af angiotensin-omdannende enzym (ACE), en ectoenzyme på den luminale side af vaskulære endotelceller, primært i lunger og nyrer, til dannelse angiotensin II (Ang II), den vigtigste effektor peptidet RAS. Ang II er stand til at aktivere to receptorundertyper; type 1 receptor (AT 1 R) og type 2-receptor (AT 2R), begge som regulerer det kardiovaskulære system, vedligeholde væske- og elektrolytbalancen homeostase og er nu anses for at påvirke den kognitive funktion og neurodegenerativ sygdom processer 8,9. En lokal, hjerne-specifikke RAS er rapporteret til selvstændigt syntetisere Ang II. I hjernen er precursorproteinet angiotensinogen syntetiseret i astroglia 10 omdannet til angiotensin I ved en renin-lignende enzym 3, muligvis prorenin bundet til prorenin receptoren11, og efterfølgende omdannes til Ang II ved angiotensin-konverterende enzym, som rigeligt udtrykt på den ekstracellulære overflade af neuroner i hjernen 12. Denne intrabrain genereret Ang II er agonist til hjernen AT 1 og AT 2-receptorer, som er isoleret fra blod-bårne Ang II.
Mens AT 1 R spiller en vigtig fysiologisk rolle, er det bedre kendt for sine patofysiologiske virkninger i hele kroppen, primært påvirker det kardiovaskulære system og nyrerne (figur 2). Når Ang II binder til AT 1 R, det forårsager vasokonstriktion; stigende modstand mod blodgennemstrømning og hæve blodtrykket. Det fremmer også syntesen og sekretionen af aldosteron og vasopressin, hvilket fører til øget natrium og væskeophobning. Disse effekter kan også inducere iskæmisk hjerneskade og kognitive svækkelser og er knyttet til Parkinsons sygdom, Alzheimers sygdom, og diabeTES, samt at være for nylig identificeret til at påvirke indlæring og hukommelse 13-15. Der er en tilbagekoblingssløjfe i RAS ved, at 1 R på de juxtaglomerulære celler i nyren hæmmer renin sekretion. Interessant, AT 2 R generelt mod regulerer virkningen af AT 1 R, der forårsager vasodilatation, neuritudvækst, axonal regenerering, anti-spredning, og cerebroprotection blandt mange andre 16-20. AT 2R er også blevet identificeret som et mål for anti-hypertension og for nylig, anticancerlægemidler 21. Bestemmelse af lokaliseringen og tætheden af Ang II-receptorer i forskellige væv, og hvordan de er påvirket af forskellige behandlinger og sygdomstilstande der anvender kvantitativ densitometrisk receptor autoradiografi vil bidrage til at belyse den rolle RAS spiller i specifikke sygdomme.
Receptor-autoradiografi har været anvendt i over 30 år som en effektiv metode til at indikere tilstedeværelsen af angiotensin IJeg receptorer og andre dele af anlægget RAS i hjernen og andre væv i rotter, mus, marsvin, hund og menneske under forskellige forsøgsbetingelser 22-34. Vigtigheden af at lokalisere Ang II-receptorer i hjernen er, at man kan anvende funktionelle neuroanatomi for virkningerne af Ang II i hjernen, fx tilstedeværelsen af AT 1 R i paraventrikulære kerne i hypothalamus (PVN) antyder en funktion af Ang II i hjernen til at stimulere vasopressin, oxytocin eller corticotropin-frigørende hormon (CRH) frigivelse eller aktivering af det sympatiske nervesystem. Således kan lægemidler, der blokerer AT 1 R mindske nogle af disse PVN-medierede virkninger forbundet med overaktivitet af hjernen RAS. Igangværende arbejder tyder på, at brugen af AT 1 R-antagonister kan nedsætte Post-traumatisk stress syndrom (PTSD) induceret frigivelse af CRH og lindre symptomerne på PTSD (Hurt et al., Indsendt til publikation). Den PVN, subfornikaleorgan (SFO), og amygdala er kendt for at regulere homeostase, appetit / tørst, søvn, hukommelse, følelsesmæssige reaktioner, og er målområderne for denne demonstration undersøgelse. Disse regioner blev undersøgt ved at indsamle koronale sektioner af en hjerne på objektglas, og behandling af de sektioner med specifikke hæmmere sammen med en specifik radioaktiv for Ang II-receptorer. I denne undersøgelse alle materialer og reagenser sammen med foreslåede leverandører er anført, iod-125 blev anvendt til at radiomærke et Ang II-receptorantagonist, sarcosin 1, isoleucin 8 Ang II (SI Ang II), som derefter blev oprenset som mono 125I -Si Ang II ved hjælp HPLC-metoder som tidligere 35 beskrevet. Brugen af denne høj specifik aktivitet radioligand tillader visualisering af områder med lav, moderat og høj receptordensitet efter eksponering af de radioaktivt mærkede sektioner til røntgenfilm. Ved at kalibrere filmen med hjernen pasta standarder indeholder kendte mængder af jod-125, det specifikke beløbaf Ang II receptorbinding i et område kan kvantificeres. I eksperimentelle studier kan Ang II receptorbinding i hjernerne hos forsøgspersoner sammenlignes med i hjernerne hos kontrolindivider. Dette kan indikere, om handlinger Ang II ændres som reaktion på en genetisk tilstand, fænotypisk abnormitet, sygdomstilstand eller lægemiddelbehandling. Denne viden kan derefter anvendes til udvikling af terapier til behandling af sygdomme forbundet med dysregulering af RAS. Alternative teknikker, der identificerer receptor bindingssteder, men med reduceret anatomisk opløsning, er bindingsassays, der anvender væv membranpræparater afledt af vævshomogenater, som er inkuberet med radioliganden over et område af koncentrationer for at vurdere radioligandbinding affinitet som dissociationskonstanten (K D ) og maksimal bindingskapacitet (Bmax) i vævet af interesse.
Den her beskrevne protokol kan opdeles i fem større samarbejdemponents: Forberedelse vævssnit for receptor Autoradiografi; Receptor Autoradiografi; Film Eksponering og udvikling; Histologi; og Densitometrisk Image Analysis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøg udført for denne undersøgelse blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg Nova Southeastern University i overensstemmelse med den vejledning for pleje og anvendelse af forsøgsdyr, 8. udgave (The National Academies Press, Washington, DC, 2011 ).
1. Forberedelse vævssnit for Receptor Autoradiografi
- Ved offer, høst frisk hjernevæv, og pak i alufolie og sted i en -20 ° C fryser så hurtigt som muligt. For at opretholde den korrekte form, placere hjerner i en hjerne støbeform, der simulerer indersiden af kraniet, tildækket med aluminiumsfolie og anbring i - 20 ° C fryser. Efter 30 min place væv i en forseglbar fryser opbevaringspose og flytte til en -80 ° C fryser for langtidsopbevaring.
- Få de friske frosne vævsprøve af interesse fra -80 ° C fryser, og overførsel til en kryostat indstillet til mindst -10 ° C og højst 18 ° C, for at undgå optøning. Placer prøven onto vævet montere med en glykol og harpiks-baserede indlejring medium, kun indlejring en lille del af prøven i mediet. For hjerne, er hjernen monteret lodret for at muliggøre sektionering i koronale plan.
- Placer vævet montere på mikrotomen inden kryostaten og stram på plads. Sørg for venstre og højre side af hjernen er i de samme antero-posterolateral koordinater, og at dorso-ventrale akse er vinkelret på almindeligt anvendte hjernen atlas.
- Begynd at skære i den ønskede tykkelse (20 um anbefales) og tø montere sektionerne onto mikroskopobjektglas i en vertikal retning for at have et større overfladeareal af plads i slæden. Saml sektioner onto dias i sekventielle sæt af fem, dvs. det første sæt af dias er mærket 1-1, 1-2, 1-3, 1-4, og 1-5 (figur 3).
- Efter påfyldning et sæt lysbilleder med sektioner, tillader lysbilleder lufttørre for op til 1 time, og derefter placere SLIdes i en plastik dias boks i en selvlukkende fryser opbevaringspose, og opbevares ved -20 ° C.
2. Receptor Autoradiografi
ADVARSEL: Radioaktivitet. Brug beskyttende påklædning til at håndtere radioaktivitet. Bortskaffelse er afhang etablering, og skal følge retningslinjer for korrekt henfalde (halveringstid 60 dage) eller blive opfanget af en certificeret virksomhed.
- Fjern de "-1" og "-2" slides af interesse fra -20 ° C fryser og montere i skydergrebene (figur 5). Monter de "-1" slides sammen for 'ikke-specifik "behandling, og" -2 "dias for' total 'behandling. 'Ikke-specifikke' krukker vil indeholde 10 uM endelige koncentrationer af PD123319 en AT 2 R antagonist, og losartan en AT 1 R antagonist, i assaymediet buffer (AM5) (tabel 1), det 'total' bindende krukker vil kun indeholde 10 pM PD123319 i AM5.
- Vend diasgreb til at placere objektglassene i præinkuberingen Coplin-skåle fyldt med 35-40 ml AM5, og respektive inhibitorer i 30 minutter ved stuetemperatur. Start efterfølgende sæt i deres pre-inkubation bad ved 4 min intervaller.
- Overdrage slides fra før inkubation løsning på inkubation slide afsendere, indeholdende 10 ml AM5, plus en forudbestemt koncentration af 125I-SI-Ang II (beregnet i figur 4) med de respektive inhibitorer, 60-90 min ved stue temperatur. Hvis der er tilstrækkelig radioaktiv, kan 10 dias placeres (back to back) i modificerede slide greb og inkuberes med 125I-SI-Ang II i Coplin-skåle.
- Anbring objektglassene tilbage i skydergrebene (om nødvendigt), blot og skyl ved forsigtigt hvirvlende i 1-2 sekunder i 400 ml destilleret vand i to separate beholdere.
- Overfør objektglassene successivt i fire Coplin-skåle indeholdende 35-40 ml AM5 i nøjagtigt 1 min hver (som illustreret i figur 4 </ Strong>).
- Efter den sidste 1 min skyl forsigtigt swirl afsnittene for 1-2 sek i fire ændringer i iskoldt destilleret vand.
- Føntør objektglassene med kølig luft (Advarsel: varm luft volatizes det radioaktive stof) ved hjælp af fire hårtørrer oprettet fra forskellige vinkler for 4 min (figur 5), indtil alle sektioner er tørre, og derefter placere på et stykke køkkenrulle.
- Mount glider med væv opad på en pap til apposition til røntgenfilm ved anvendelse af dobbeltklæbende tape.
- Mount mindst en, 125 Jod kalibreringsstandard slide på hver karton (figur 6).
Bemærk: Kalibreringsstandarder består af hjernen pasta blandes grundigt med 125 Jod bundet til en forbindelse indeholdende en phenol ring, komprimeret ved centrifugering i en 1 ml tuberculinsprøjte, der er kryostat snit på samme tykkelse som de hjernesektioner og tø-monteret på mikroskop lysbilleder. Alternativt 125 Jeg kalibreringsstandarder iplastharpiks snit på 20 um tykkelse kan opnås kommercielt. Plasten harpiks i disse standarder skærmer delvist filmen fra stråling, at et væv ækvivalens på ~ 40% bør indgå i kalibreringen.
3. Film Eksponering og Udvikling
- Fortsæt til et mørkekammer med en strap-back røntgen kassette og autoradiografi film. Åbn kassetten og placere pap med dias inde (Figur 6).
- Sluk lyset slukket og tænd for safelight. Åbn forsigtigt kasse med X-Ray film, fjerne en film, og læg filmen blanke side op (med den takkede kant i nederste højre hjørne) på toppen af dias i kassetten. Luk forsigtigt kassetten, og sno låsestængerne at forsegle ud lys (figur 6). Udsætte dias til flere dage til flere uger ved -20 ° C.
- I mørkekammeret, åbne kassetten og fortsætte med filmen udvikler process.
- Placer glider ind bakkerne i træk; udvikler i 2 min, vand indeholdende 5% iseddike i 30 sek, og fixer i 5 min. Filmene den placeres i en bakke med rindende vand i 20 min, derefter anbragt i Photoflo for ikke mere end 10 sek og hængt.
Bemærk: Eksponeringstiden bestemmes empirisk og kan involvere flere film med forskellige eksponeringstider: længe nok til at opnå målbare signaler fra områder med lav binding, men ikke så længe at mætte filmen ved områder med høj binding. Når acceptable eksponering opnås, derefter gå videre til næste trin.
- Placer glider ind bakkerne i træk; udvikler i 2 min, vand indeholdende 5% iseddike i 30 sek, og fixer i 5 min. Filmene den placeres i en bakke med rindende vand i 20 min, derefter anbragt i Photoflo for ikke mere end 10 sek og hængt.
4. Histologi
- Forbered thionin pletten og farvningsreagenser (tabel 2, figur 7).
- Placere "-3" glider i slide rack, og overførsel i rækkefølge begyndende med deioniseret vand i 1 minut, derefter thionin pletten opløsningen i 10 minutter efterfulgt af tre dips til Deionized farvande, og en 30 sek vask i demineraliseret vand.
- Efter vandet, placere slide rack til ethanol vasker som følger; 50%, 70% og 90% i 30 sekunder, efterfulgt af to vaske ved ethanol 100% i 1 min hver. Endelig placere slide rack i xylen i 3 minutter, derefter overføre over til en anden xylenopløsning i 5 min.
- Tag et dias ad gangen fra den sidste xylen bad, og dække den øverste kant af dias med en harpiks base i organisk opløsningsmiddel montering medium, og placere en 24 mm x 60 mm dækglas på objektglasset. Tillad slides til tilstrækkeligt tørt til ~ 48 timer og derefter scanne ind i computeren på 2400 dpi gråtoner.
5. Densitometrisk Image Analysis
- Placer filmen blanke side ned, med den takkede kant på den nederste venstre hjørne og scanne med en proprietær scanner kan overføre information filmen tæthed uden forvrængning i billeddannende system computer.
- Åbn proprietære imaging system og udnytte de kalibrering barer at etablere kalibreringsstandarder for fremtidig densitometrisk analyse af billederne på filmen (figur 9 - 12).
- Mål interesseområder ved enten at etablere en skabelon eller empirisk skitserer interesseområder. Dataene er indsamlet og adskilt baseret på film, enten kontrol eller vildtype (afsnit), og region. Sørg for at medtage densitet (fmol / g), scan område, og det samlede målområde i målinger (figur 9).
- Juster scanningsområdet barer ved at sikre, at området af interesse falder mellem parametre for at fremhæve (figur 10).
- Eksport data i et regneark (tabel 4). Multipliceres densitet gange det samlede målområde, derefter dividere med scanningsområdet for at få værdien for binding af dette specifikke område. Når dette er gjort ved alle målte værdier, substrat den etablerede uspecifik fra total til opnåelse af specifik binding pharmes over. Gennemsnitsværdier kan også udføres for disse værdier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Oversigten over den metaboliske vej af renin-angiotensin-systemet er vist i figur 1 og den direkte fokus på Angiotensin II receptor-undertyper (AT 1 R og AT 2R) er beskrevet i figur 2. Figur 3 viser overførslen af koronale hjerne sektioner onto mikroskopobjektglas, som derefter køres gennem en receptor autoradiografi under anvendelse af en forudbestemt 125I-Siang II-koncentrationen som det ses i figur 4. Figur 5 illustrerer tørringstrinnet for dias i receptoren autoradiografi som derefter fastgjort på en karton som ses i figur 6, og efterfølgende udviklede. tabel 2 viser de reagenser, der anvendes til thionin farvning procedure for slide-monterede vævssnit beskrevet i figur 7. Kalibrering standardenheder til kvantificering bestemmes based på tidspunktet for analysen, som ses i tabel 3. Figur 8 viser etableringen af en standardkurve vedrørende 125I koncentration (fmol / g væv) til at filme eksponering (relativ optometric tæthed). Figur 11 illustrerer sondringen mellem »NSP ' og 'total' grupper, samt etiketterne væv, mens figur 10 beskriver indstilling af tærsklen til en nær nulværdi for at opnå en nøjagtig gennemsnitsværdi for hele scannede område (scanningsområdet-pixel). tabel 4 viser kvantificering processen med at få specifik binding baseret på at trække den "ikke-specifik" fra samlede værdier. "Ikke-specifik 'binding som indeholder losartan og / eller PD123319 er skabt af mængden af radioligand bundet til ikke-AT 1, eller AT 2-receptorer. Alle radioliganden bundet til AT 1-receptorer i nærvær af PD123319 giver den 'total' binding. F igur 11 viser de endelige målte områder i PVN totalt vs. ikke-specifik binding støder op til en thionin farvet sektion til den anatomiske bekræftelse af PVN.
Figur 1:. Metaboliske vej for reninangiotensinsystemet (RAS) i kroppen Leveren frigiver zymogen angiotensinogen, som spaltes ved nyre-secerneret renin, danner angiotensin I. Angiotensin-omdannende enzym (ACE) omdanner angiotensin I til angiotensin II ( Ang II), den vigtigste forløber for hjertekarsygdomme. Ang II forårsager vasokonstriktion, og øger blodtrykket, minutvolumen, salt appetit, tørst, og væskeophobning. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2:. Funktioner angiotensin type 1 og 2-receptorer (AT 1 R, AT 2 R) ved 1 R patologisk påvirker hjerte-kar-sygdom, virker direkte at øge tørst og salt appetit, og udøver mange andre perifere cellulære aktiviteter samt central psykologiske virkninger. AT 2 R er en fysiologisk antagonist af AT 1-receptoren, som bistår i effekten af AT 1 R antagonister 36 derved har gavnlige virkninger på vaskulær struktur. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Cryosectioning af hjernen på objektglas ved 20 um tykkelse. Afhængig af temperaturen af kryostaten, vil sektionerne til tider vise folder, revner, curling, eller blive komprimeret på mikrotom kniv eller knivholder. I sådanne tilfælde afsnittet kasseres, og det noteres at angive, at en ekstra 20 um vil adskille dette afsnit fra det foregående afsnit. Sektioner skal indsamles på dias i lodret retning for at maksimere det samlede areal er nødvendig for at fylde et dias og derfor indsamle det største beløb af sektioner på hvert dias. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4:. Sample of Experimental Design & Protokol for receptor Autoradiografi Differentiation af 'total' (-2) og "ikke-specifik" (-1) direkte vedrører tilstedeværelse og fravær af receptor-undertype-antagonist. Protokol kan variere baseret på antallet af dias, og vil stige med trin på 2 for hvert par af de samlede og ikke-specifikke dias. Radioligand koncentration, tidligere bestemt opnås ved fortynding af bestanden i AM5. Denne opløsning bliver derefter jævnt fordelt til inkuberingstider beholdere. Direkte optællinger er taget før og efter inkubation at fastslå den nøjagtige koncentration af radioligand. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5:. Konfiguration til tørring station i receptor autoradiografi Tørretider vil variere baseret på effektiviteten af slagtørretumblere samt evnen til at udslette overskydende vand væk efter de sidste skylninger. Slides vil blive tørret, når sektionen vender fra klar til hvid. Hvis slides ikke er fuldt tørret så radioliganden kan diffundere væk fra receptoren producere en fuzzy billede, der er ikke specifikke for receptoren bindingssteder. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6:.. Udsættes behandlede slides til x-ray film ved hjælp af en specialiseret kassette anbefales Slide opsætning til at følge et mønster, hvor sammenligning af begge grupper lettes Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: Opsætning for thionin Farvning. Slides indlæses i et dias holder og nedsænket i sekventielle løsninger. Timing giver mulighed for effektiv farvning af Nissl stof (ru endoplasmatisk reticulum) af neuroner. En montering medium ansøgning til dias følgende dehydrering giver mulighed for fastsættelse af dækglasset til dias, bevare de sektioner for sammenlignende analyse. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 8:. Indstilling af kalibreringsstandard Hver film indeholder dets individuelle kalibreringsstandarder, baseret på hjernen pasta og det tidspunkt, hvor eksperimentet blev udført . En regression linje beskriver de bedst tilpassede værdier er genereret af et proprietært imaging-system program for de målte hjerne pasta standarder. Dette omdanner den relative optometric densitet (ROD) værdi fra kalibreringsstandarderne (cal kønssygdomme, i røde ovale) til enheder af radioligandbinding, i dette eksempel enhederne (fmol / g, rød cirkel) er fmol radioligand bundet pr gram våd vævsvægt (fmol / g). Målingen af hjernen pasta standarder gøres med cirkulære værktøj og placeret i midten af prøven vist til højre i pseudofarve ved hjælp af ikonet billedvisning (rød cirkel). Cirklen at måle kalibreringsstandard behøver ikke at dække hele prøven, men snarere måle en jævn område af standarden. Klik her for at se en større version af dette tal.
/53866fig9.jpg "/>
Figur 9:. Identifikation grupper ved prøvenummer, ikke-specifik / total, og regionerne til prøve aflæsninger Fordi flere hjerner, hjernen regioner, og flere forsøgsgrupper er kvantificeret sammen, er det afgørende at skelne mellem alle de faktorer. Emnet viser hjernen prøven og kan også indikere gruppe; afsnittet viser om det er ikke-specifik (NSP) eller total, mens regionen muliggør identifikationen af flere områder hjerne, der bliver i stikprøven. Prøven værktøjslinien (rød rektangel) beskriver forskellige sampling værktøjer, fx cirkel, firkant, skabelon, frihånd, viskelæder; som kan anvendes til at afgrænse område, der skal måles. Stangen værdier opnået inden for området prøveudtagningen værktøj optages på regnearket som konverterede enheder af binding, fmol / g (rød cirkel). Desuden er det samlede scanningsområde inden prøveudtagningsværktøjet registreret i "Scan område-pixel" søjlen, mens den samlede tArget område (antallet af pixels, der overskrider tærskelværdien (beskrevet i figur 10 legende) registreres i kolonnen "Total TGT Area-pixel". Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 10: Bestemmelse af tærsklen for prøver, der skal måles på grundlag af de standarder, Scanningen område er unikt for hver film, og afhænger af de standarder fastsat.. Brug af tærskelværdier værktøj (rød cirkel) for at fastsætte tærskelværdier for tætheden interval for scanningsområdet i fmol / g vil give mulighed for de områder, der måles (afgrænset af diagonale pile) til at falde mellem en række 0, op til et punkt, hvor kalibreringskurven begynder at asymptote indikerer, at filmen nærmer en maksimal eksponering, idet yderligere
Figur 11: Repræsentative billeder af receptor autoradiografi binding til koronale sektioner af en kvindelig spontant hypertensiv rotte (SHR) på ~ 1,8 mm caudale til Bregma, der viser den paraventrikulære kerne i hypothalamus (PVN) og sengen kerne af tilbehøret olfaktoriske tarmkanalen (baot ). (A </ strong>) Samlet binding af AT 1 R binding (Red- PVN, Gul-baot). (B) Ikke-specifik binding med losartan (AT1R antagonist) og PD123319 (AT2R antagonist). (C) Total binding af AT 1R binding med en vilkårlig grænseværdiindstilling såsom at afgrænse formen af PVN (sort udfyldning) overskridelse af tærskelværdien i scanningsområdet som registreres som Total TGT Area). (D) thionin farvet sektion for anatomiske bekræftelse af de strukturer, der viser høj total binding, og til sammenligning med andre områder af hjernen eller andre forsøgsgrupper. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Reagenser | Beløb |
| NaCl | 8,76g |
| Na2EDTA | 1,86 g |
| Bacitracin | 141 mg |
| 500 mM Dibasisk Na 2 PO 4 | 100 ml |
| Destilleret Deioniseret vand | 900 ml |
| Indstil pH til 7,1 til 7,2 med NaOH eller HCI | |
Tabel 1: assaymedium (AM5) Kemiske bestanddele i buffer anvendes som forberedelse væv..
Tabel 2:. Thionin Stain Reagenser Den thionin plet består af destilleret vand, 1,0 M natriumacetat og 1,0 M iseddikesyre opløsning, titreret til en pH-værdi på 4,3 forud for tilsætning af en 0,5% thionin opløsning.
| Dage forløbne referencedato | |||||||||
| Parti | fmol / g vådvægt | Ref Dato | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | ||
| Standard | nCi / mg | fmol / g | dpm / g | fmol / g | fom / g | fmol / g | fmol / g | fmol / g | fmol / g |
| antal | 30-May | 30-May | 30-May | 30-May | 31-May | 1 Jun | 2 juni | 3 juni | 4 juni |
| 1 | 9706 | 4463 | 21.547.320 | 4463 | 4411 | 4361 | 4311 | 4261 | 4212 |
| 2 | 5838 | 2684 | 12.960.360 | 2684 | 2653 | 2623 | 2593 | 2563 | 2533 |
| 3 | 2798 | 1286 | 6.211.560 | 1286 | 1272 | 1257 | 1243 | 1228 | 1214 |
| 4 | 1451 | 667 | 3.221.220 | 667 | 659 | 652 | 644 | 637 | 630 |
| 5 | 787 | 362 | 1.747.140 | 362 | 358 | 354 | 350 | 345 | 342 |
| 6 | 385 | 177 | 854.700 | 177 | 174 | 173 | 171 | 169 | 167 |
Tabel 3:. Daglig Decay Rate Beregninger til kalibrering Standarder En daglig henfald sats regneark til kalibreringsstandarderne skal oprettes på grundlag af de datoer, hvor forsøget blev udført. Dette regneark er baseret på den første ordens hastighedskonstant med en halveringstid (t½) på 60 dage. N = N 0 * e kt, hvor N = koncentrationen af 125I, på tidspunkt t i forhold til koncentrationen ved tiden 0 (N 0), og k = ln2 / t 1/2.
| Paraventrikulære Nucleous af Hypothalamus | Mål | Density-fmol / g | Scan Area | Total Target Area | Total* | |
| Total | 1 | 996 | 4383 | 4383 | 996 | |
| Total | 2 | 921 | 3362 | 3362 | 921 | |
| Total | 3 | 818 | 3445 | 3445 | 818 | specifik binding |
| Total | 4 | 710 | 2906 | 2906 | 710 | 967 |
| GENNEMSNIT | 861 | 3524 | 3524 | 861 | 895 | |
| 763 | </ Tr>||||||
| Sektion | Mål | Density-fmol / g | Scan Area | Total Target Area | Uspecifik * | 678 |
| NSP | 1 | 53 | 3072 | 1737 | 30 | 826 |
| NSP | 2 | 52 | 2959 | 1455 | 26 | |
| NSP | 3 | 86 | 3180 | 2035 | 55 | |
| NSP | 4 | 53 | 3293 | 1995 | 32 | |
| GENNEMSNIT | 61 | 3126 | 1,805.5 | 36 | ||
| Bed Nucleus af Accessory Olfacstillende Tract | ||||||
| Sektion | Mål | Dens-fmol / g | Scan Area | Total Target Area | Total* | |
| Total | 1 | 439 | 3632 | 3632 | 439 | |
| Total | 2 | 435 | 3632 | 3632 | 435 | |
| Total | 3 | 355 | 3632 | 3620 | 354 | |
| Total | 4 | 435 | 3632 | 3631 | 435 | specifik binding |
| Total | 5 | 342 | 3632 | 3630 | 342 | 414 |
| Total | 6 | 334 | 3632 | 3606 | 331 | 393 |
| GENNEMSNIT | 390 | 3632 | 3625 | 389 | 321 | |
| 394 | ||||||
| 315 | ||||||
| Sektion | Mål | Dens-fmol / g | Scan Area | Total Target Area | Uspecifik * | 320 |
| NSP | 1 | 49 | 3632 | 1846 | 25 | 360 |
| NSP | 2 | 64 | 3632 | 2362 | 42 | |
| NSP | 3 | 53 | 3632 | 2275 | 33 | |
| NSP | 4 | 64 | 3632 | 2339 | 41 | |
| NSP | 5 | 51 | 3632 | 1879 | 26 | |
| NSP | 6 | 41 | 3632 | 966 | 11 | |
| GENNEMSNIT | 54 | 3632 | 1945 | 30 | ||
| * Samlet og ikke-speciic er tæthed enheder fmol / g. | ||||||
| I alt = densitet * samlet målområde / scanningsområdet | ||||||
| Uspecifik = densitet * samlet målområde / scanningsområdet | ||||||
| Total Målområdet pixels, der oversteg tærskelværdien, der er så tæt på 0.00 fmol / g som muligt. | ||||||
| Pixels ikke overstiger tærsklenværdi modtage en værdi på 0 for vurdering af den samlede tæthed. | ||||||
| Pixel ikke overstiger tærskelværdien modtager en værdi på 0 for vurdering af ikke-specifik densitet. | ||||||
| Specifik binding er total minus ikke-specifik binding udtrykt som densitetsenheder af fmol / g. | ||||||
Tabel 4: Kvantitativ analyse af paraventrikulære kerne af hypothalamus og seng kerne af tilbehøret olfaktoriske tarmkanalen Imaging software eksport af data som et regneark i fmol / g, scanningsområdet, og samlet indsatsområde i pixels.. 'Ikke-specifik "binding trækkes fra' total 'binding for at opnå den specifikke AT 1 kvantitative bindende.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen beskrevet identificerer visualisering af 'total' og "ikke-specifik" binding af radioliganden i tilstødende sektioner af koronale sektioner af en hjerne gnaver tidligere høstet og opbevaret ved -80 ° C, og kan nemt anvendes på stort set alle væv, har anatomisk løst underlag, som viser differentierede mængder af receptorer eller radioligandbinding sites. De beskrevne inden protokollen er enkle og analysen er kritisk for korrekt fortolkning af resultater. Tykkelsen 20 um blev bestemt til at være optimalt; hvis sektionen er for tyk den ikke-specifikke binding vil stige, hvilket gør det vanskeligt at løse bindingen af radioliganden til dens mål. Hvis sektionen skæres tyndere, bliver det vanskeligt at kunne skære og gemme sekventielle sektioner uden forvrængning. Den optimale skærende temperatur vil variere lidt på grund af arten af vævet og tykkelsen af afsnittene og jegs normalt bestemmes empirisk. Når kontakten er mellem bladet og vævet, kan orienteringen af prøven revideres og udrettet ved at flytte vævsprøve tilbage væk fra kniven, og omlægge montering bolden. Når der skæres en gnaver hjerne er det vigtigt at sikre venstre og højre side af hjernen som under tilsvarende antero-posterolateral koordinater, og at dorso-ventrale akse er vinkelret på almindeligt anvendte hjernen atlas. Slide sæt er pre-mærket for at gennemføre undersøgelser på tilstødende sektioner af væv. De første sæt af 5 dias er mærket 1-1, 1-2, 1-3, 1-4, og 1-5. Den første cut afsnit går slide 1-1 i øverste venstre hjørne (det er det øverste højre hjørne af dias, når det er matteret nedad); det andet snit sektion går slide 1-2, etc. Den femte snit sektion fortsætter slide 1-5. Den sjette snitfelt spillet til slide 1-1 til venstre af den første sektion. Efter det første sæt dias er fyldt, begynder et andet sæt af fem gledes, mærket 2-1, 2-2, 2-3, 2-4, og 2-5. Denne cyklus fortsættes så langt tilbage ind i hjernen efter behov. Den "-4" og "-5" slides holdes som en backup eller til at radiomærke en anden receptor.
Receptoren autoradiografi protokol afhænger radioliganden anvendes, og egenskaberne af receptorerne, der undersøges for at bestemme koncentrationerne af buffere, salte og inhibitorer. Til måling af AT1 undergruppe af Ang II-receptorer i denne procedure, en høj-affinitet Jod-125 mærket ligand, 125I-Sar 1 Ile 8 -Ang II (125I-SI-Ang II); radioaktivt mærket af Robert C. Speth, Ph.D. (Peptid Radioiodering Shared Resource, Georgetown University), som også er tilgængelige kommercielt) opløses i AM5 buffer (tabel 1); en natriumphosphatpuffer med natriumchlorid, EDTA og bacitracin. AM5 giver god beskyttelse af radioliganden fra metallopeptidaser og bacitracin-sensitive peptidases tilvejebringelse af en fysiologisk pH og NaCl-koncentration for at optimere bindingskarakteristika. Præ-inkubering i AM5 udsætter vævssnit at peptidaseinhibitorer at minimere radioligand nedbrydning, og også dissocierer endogen Ang II fra Ang II-receptorer. Losartan og PD123319, AT1R og AT2R antagonister henholdsvis at mætte deres målreceptorer tilsættes ved koncentrationer (10 uM) for at forhindre radioliganden i at binde til disse receptorer til vurdering af ikke-specifik binding og begrænse specifik binding til AT1-receptoren, hhv. Den ønskede koncentration af 125I-SI-Ang II til assayet bestemmes, og den krævede fortynding af stamopløsningen bestemmes ud fra et regneark med radioisotopen henfaldskonstanten (se protokol tabel 3). Optimalt en koncentration på radioligand tilnærme KD benyttes som ville indtage 50% af receptorerne til stede. Men fordi radioligander kan være dyrt lavere koncentrationer e.eks. kan anvendes 10-20% af KD koncentration. Dette har en potentiel fordel ved at øge signal til støj-forhold ved at reducere ikke-specifik binding mere end specifik binding. Imidlertid er længere eksponeringstider kræves for at udvikle et billede af binding. Som nævnt ovenfor (punkt 3.4), hvis den opnåede eksponering er over eller under eksponeret, gliderne kan genbruges udsat for en ny film til en kortere og / eller længere tid at opnå den ønskede eksponering.
Densitometrisk billedanalyse kan udføres ved en proprietær billeddannende system, der giver en omfattende liste over de ansøgninger om autoradiografi samt andre anvendelser. Kalibreringsstandarder er i fmol / g våd vævsvægt (forudsat en massefylde på en for væv). Hver standard sæt, sammen med en baggrund vil generere en standardkurve. Der er flere kurvetilpasning algoritmer med og uden vægtning rådighed til at danne en standardkurve fra den relative optometric density (ROD) værdier for de forskellige kalibreringsstandarder. Valg af kurven, der bedst repræsenterer den data sker empirisk som underprogram for kurvetilpasning giver ikke relative fejl værdier for de forskellige standard kurver. På stænger op til ~ 0,6, standardkurven er pseudolinear. begynder imidlertid filmen at mætte ud over dette punkt danner en kurve, der asymptoter omkring 0,8 til 0,9 ROD enheder. Hvis de standarder, der er bracketing prøverne er over 0,9 ROD enheder, anbefales det at re-eksponere filmen i en kortere periode for at opnå mere pålidelige værdier af fmol / g binding af prøverne tættere på pseudolinear vifte af standarden kurve. Værdier afledt på denne ekstreme af standardkurven vil medføre små forskelle i ROD for betydeligt større forskelle i radioligandbinding. Dermed evnen til at detektere ændringer i binding aftager, når filmen nærmer sig sit mætningspunkt.
For målinger af bestemte regioner,anbefalede foranstaltninger er "Density" i fmol / g, "Scan område« i pixels, og 'Total Target Area' i pixels (figur 9). Det er vigtigt at fastsætte en tærskelværdi så tæt på nul som muligt (fig 10), fordi variationer i filmdensitet eller vilkårlig aspekt af standardkurven afledt kalibreringsstandarderne undertiden kan give værdier mindre end nul. Hvis sådanne værdier gennemsnit for alle pixels i Scan Area han ikke høster en kunstigt lav værdi. De anvendte kriterier til at identificere områder med binding kan være meget subjektive, så det er bedst at nøje parre kontrol og eksperimentelle hjerner så meget som muligt for at reducere forekomsten af subjektive fejl. En anden udfordring er at beslutte, hvor mange sektioner til gennemsnit for at få en sidste behandling. En god indikation af sektioner til at analysere kan bestemmes ved at følge en accepteret rotte hjerne atlas, sammen med de farvede histologiske dias. Størrelsen af prøveudtagningsområdet kan også være enproblem. For at kompensere, kan en skabelon etableres for at korrigere for enhver størrelse uoverensstemmelser. Behandlingen af sektionerne kan også påvirke et område af strukturen, som har høj binding og skal betragtes under analyse. Dette kræver en alternativ anvendelse af "thresholding" værktøj i proprietære billeddannende system for at indstille en densitet på mere end en arbitrær værdi for således at repræsentere de anatomiske egenskaber af hjernen region samples såsom paraventrikulære kerne i hypothalamus i en prøveudtagning værktøj som omfatter regionen af interesse (Figur 11, panel C). Det er også muligt at inkludere måleområdet i bestemmelse af mængden af binding. Dette kan gøres ved at multiplicere værdien for specifikke bindende gange antallet af pixels, der blev målt. Pixels kan omdannes til metriske enheder af imaging en lineal i to planer, eller et rektangel med kendte dimensioner. Antallet af pixels, der svarer til denlængde eller område af rektanglet kan derefter udtrykkes i metriske enheder. Ved 2400 dpi opløsning, ~ 9.000 pixel = 1 mm 2 i vores system.
Selv om brugen af radioaktive ligander er ikke længere en meget anvendt teknik; det er en af de få måder at visualisere den fysiske distribution af receptorer i vævsprøver selv som funktionel (stand til at binde dets medfødte ligand). Derudover kan det kvantificere antallet af receptorer for en vurdering af ændringer i funktionel receptorekspression mellem behandlingsgrupperne, mellem forskellige hjerneområder eller andre strukturer, mellem forskellige stammer af dyr, eller dyr af forskellig alder osv alternative metoder til rådighed til at karakterisere neuroanatomiske aspekter af AT 1 receptor ekspression, men de har begrænset værdi. In situ hybridisering af mRNA for AT 1-receptorer ikke altid svarer til AT 1 receptor udtryk eller fordeling ihjerne. Mens immunologiske teknikker kan tilnærme forskelle i receptorekspression baseret på intensiteten af farvningen af vævssnit, er det ikke muligt at generere en standardkurve for farvning for at muliggøre en numerisk bestemmelse af receptorekspression. Receptor autoradiografi tilvejebringer også en grad af specificitet for receptorer (eller andre mål, som specifikt binder radioligander), der ikke kan garanteres ved hjælp af immunologiske teknikker. I 2009 blev en række artikler offentliggjort 37-43, der satte spørgsmålstegn ved gyldigheden af 49 antistoffer, der blev anvendt til at vurdere 18 forskellige G-protein-koblede receptorer og en forbigående receptor potentiale (TRP) kanal. I det væsentlige, antistoffer mærket identiske bånd på western blots fra vildtype og knockout-mus for receptorerne pågældende. Efterfølgende har flere grupper gjort lignende observationer ved hjælp kommercielt tilgængelig AT 1 og AT 2 receptor antistoffer 44-49. Anvendelsen af en bacterial kunstigt kromosom, som genererer et reportermolekyle, fx grønt fluorescerende protein, drevet af AT 1-promotoren er en indirekte bestemmelse af tilstedeværelsen eller fraværet af AT 1 receptor-udtrykkende celler i mus (men ikke rotte) hjerner baseret på deres der et funktionelt AT 1 receptor promotor 50. Det er muligt at tælle "positive celler" i mikroskopisk identificerede hjerneregioner, men ikke for at kvantificere ændringer i intensiteten af ekspression af AT 1 receptoren i disse regioner. Således på dette tidspunkt de eneste validerede teknikker, til rådighed for direkte at måle Ang II receptor udtryk er radioaktiv bindende metoder. Og, hvis der er behov anatomisk opløsning af funktionel AT 1-receptor-protein på et mikroskopisk niveau, receptor autoradiografi er det eneste teknik der kan anvendes til direkte måling.
Receptor-autoradiografi er ikke uden begrænsninger. Den største concern er at opfylde kravene til at bruge radioaktivt materiale i et forsknings indstilling. Det er nødvendigt at have en strålingssikkerhed program med strenge retningslinjer på plads for at sikre sikkerheden for forskere, der arbejder med radioaktive materialer og sikker anbringelse af radioaktive materialer. Dette eskalerer udgifterne til forskning ved hjælp radioaktive materialer til et punkt, der udelukker deres anvendelse i mange forskningsmiljøer. Endvidere kan omkostningerne til radioligander være betydelige. Således en receptor autoradiografi eksperiment, hvor et stort antal objektglas-monterede vævssnit inkuberes i beholdere med radioligand kan bruge hundreder hvis ikke tusinder af dollars af radioligand. En anden begrænsning er, at væv skal fryses før sektionering på en kryostat, opbevares i en periode, og hurtigt skyllet og tørret efter inkubation med radioligand, som alle kan nedsætte evnen af receptorerne eller proteinet af interesse til at binde radioliganden . For ligander, der har hurtige røvociation / dissociationskinetikken, kan det ikke være muligt at tilbageholde bindingen af radioliganden til receptoren under den nødvendige tid til at skylle væk ikke-specifikt bundet radioligand. Også med lave mængder af radioligandbinding lange perioder med film eksponering - en måned eller mere - kan være påkrævet, før en målelig billede kan dannes på filmen. En anden udfordring er, at tilsætning af jod-125 til en ligand kan nedsætte evnen af liganden til at binde til dens mål-receptor eller protein på grund af sterisk hindring. Anvendelsen af en mindre molekyle, fx tritium (3H) eliminerer problemet med sterisk hindring, men tritium har så lav energi og lav specifik aktivitet (i forhold til jod-125), at det er yderst vanskeligt at generere et filmbillede for de fleste receptorpopulationer. I lyset af disse spørgsmål, er der mange situationer, hvor receptor autoradiografi ikke er i stand til at identificere receptorer eller andre molekylære strukturer af interesse.
Trods sin limitations, kan receptor autoradiografi identificere specifikke strukturer i et væv, f.eks hjerneområder ændret som reaktion på eksperimentelle variabler sammenlignet med en normal kontrol hjerne. Denne viden kan hjælpe med at bestemme den rolle, AT 1 R for Ang II eller anden receptor eller enzymer i patologien af sygdomme. Denne viden har værdifulde farmakologiske konsekvenser, da det indikerer områder at målrette for potentielle behandlinger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 500 ml Plastic Beakers | Fisher | 02-591-30 | |
| 24 mm x 60 mm Coverslips | Fisher | 22-050-25 | |
| Autoradiography Imaging Film 24 mm x 30 cm | Carestream-Biomax MR Film | 891-2560 | |
| Bacitracin (from Bacillus licheniformis) | Sigma | B-0125 | |
| Cardboard Sheet 8 x 11 | Crescent Illustration Board #201 | 201 | |
| Coplin Jars | Fisher Scientific | E94 | |
| Commercial hair dryers | Conair | Model SD6X | |
| Disposable Culture Tubes | Fisher | 14-961-26 | |
| EDTA (Disodium salt, Dihydrate) | USB Corporation | 15-699 | |
| Ethanol | Fisher | 16-100-210 | |
| Formulary Substitute for D-19 Developer | Photographers Formulary, Inc. | 01-0036 | |
| Glacial Acetic Acid | Fisher | A38 SI-212 | |
| Histoprep/OCT | Fisher | SH75-125D | |
| Film Fixer | Kodak | 5160320 | |
| Photo flo | Kodak | 1464502 | |
| Losartan | Fisher/Tocris | 37-985-0 | |
| MCID™ Core 7.0 | MCID | N/A | |
| NaCl | Fisher | S271 | |
| Peel-A-Way slide grips | VWR | 48440-003 | |
| Permount | Fisher | SP15-100 | |
| PD123319 | Fisher | 13-615-0 | |
| Premium Charged Slides, Fine Ground Edge | Premiere Microscope Slides | 9308W | |
| 125I Ligands | Perkin Elmer | NEX- 248 | |
| 125SI-Ang II | George Washington University | Radioiodinated by Dr. Speth | |
| Slide Mailers | Fisher Scientific | HS15986 | |
| Sodium Dibasic Phosphate Anhydrous (Na2PO4) | Fisher | RDCS0750500 | |
| Sodium Acetate (Anhydrous) | Fisher | BP333-500 | |
| Thionin | Fisher | T409-25 | |
| X-Ray Casette (10 x 12) | Spectronics Corporation | Four Square | |
| Xylene | Fisher | X3P-1GAL |
References
- Mozaffarian, D., et al. Heart disease and stroke statistics--2015 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 131 (4), 29-322 (2015).
- Peart, W. S.
- Ganten, D., et al.
- Ganten, D., Fuxe, K., Phillips, M. I., Mann, J. F. E., Ganten, U. Frontiers in Neuroendocrinology. Ganong, W. F., Martini, L. , Raven Press. N.Y. Vol. 5 61-99 (1978).
- Fyhrquist, F., Metsarinne, K., Tikkanen, I. Role of angiotensin II in blood pressure regulation and in the pathophysiology of cardiovascular disorders. J Hum Hypertens. 9, Suppl 5 19-24 (1995).
- von Bohlenund und Halbach, O., Albrecht, D.
- Speth, R., Giese, M.
- de Kloet, A. D., Liu, M., Rodriguez, V., Krause, E. G., Sumners, C. Role of neurons and glia in the CNS actions of the renin-angiotensin system in cardiovascular control. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. , (2015).
- Saavedra, J. M., Sanchez-Lemus, E., Benicky, J. Blockade of brain angiotensin II AT1 receptors ameliorates stress, anxiety, brain inflammation and ischemia: Therapeutic implications. Psychoneuroendocrinology. 36 (1), 1-18 (2011).
- Stornetta, R. L., Hawelu-Johnson, C. L., Guyenet, P. G., Lynch, K. R.
- Li, W., Peng, H., Seth, D. M., Feng, Y. The Prorenin and (Pro)renin Receptor: New Players in the Brain Renin-Angiotensin System. Int.J.Hypertens. 2012, 290635 (2012).
- Strittmatter, S. M., Kapiloff, M. S., Snyder, S. H. [3H]captopril binding to membrane associated angiotensin converting enzyme. Biochem. Biophys. Res. Commun. 112, 1027-1033 (1983).
- Bild, W., Hritcu, L., Stefanescu, C., Ciobica, A. Inhibition of central angiotensin II enhances memory function and reduces oxidative stress status in rat hippocampus. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 43, 79-88 (2013).
- Wright, J. W., Harding, J. W. Brain renin-angiotensin-A new look at an old system. Progress in Neurobiology. 95 (1), 49-67 (2011).
- Tashev, R., Stefanova, M. Hippocampal asymmetry in angiotensin II modulatory effects on learning and memory in rats. Acta Neurobiol Exp (Wars). 75 (1), 48-59 (2015).
- Reudelhuber, T. L. The continuing saga of the AT2 receptor: a case of the good, the bad, and the innocuous. Hypertension. 46 (6), 1261-1262 (2005).
- Carey, R. M. Cardiovascular and renal regulation by the angiotensin type 2 receptor: the AT2 receptor comes of age. Hypertension. 45 (5), 840-844 (2005).
- Valero-Esquitino, V., et al. Direct angiotensin type 2 receptor (AT2R) stimulation attenuates T-cell and microglia activation and prevents demyelination in experimental autoimmune encephalomyelitis in mice. Clin Sci (Lond). 128 (2), 95-109 (2015).
- Chen, J., et al. Neuronal over-expression of ACE2 protects brain from ischemia-induced damage. Neuropharmacology. 79, 550-558 (2014).
- Kalra, J., Prakash, A., Kumar, P., Majeed, A. B. Cerebroprotective effects of RAS inhibitors: Beyond their cardio-renal actions. J Renin Angiotensin Aldosterone Syst. , (2015).
- Zhao, Y., et al. Activation of intracellular angiotensin AT(2) receptors induces rapid cell death in human uterine leiomyosarcoma cells. Clin Sci (Lond). 128 (9), 567-578 (2015).
- Gehlert, D. R., Speth, R. C., Wamsley, J. K. Quantitative autoradiography of angiotensin II receptors in the SHR brain. Peptides. 7 (6), 1021-1027 (1986).
- Mendelsohn, F. A., Quirion, R., Saavedra, J. M., Aguilera, G., Catt, K. J. Autoradiographic localization of angiotensin II receptors in rat brain. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (5), 1575-1579 (1984).
- Gehlert, D. R., Speth, R. C., Wamsley, J. K. Autoradiographic localization of angiotensin II receptors in the rat brain and kidney. Eur J Pharmacol. 98 (1), 145-146 (1984).
- Speth, R. C., et al. Angiotensin II receptor localization in the canine CNS. Brain Res. 326 (1), 137-143 (1985).
- Santos, R. A. S., et al. Angiotensin-(1-7) is an endogenous ligand for the G protein-coupled receptor Mas. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (14), 8258-8263 (2003).
- Karamyan, V. T., Gembardt, F., Rabey, F. M., Walther, T., Speth, R. C. Characterization of the brain-specific non-AT(1), non-AT(2) angiotensin binding site in the mouse. Eur J Pharmacol. 590 (1-3), 87-92 (2008).
- Karamyan, V. T., Speth, R. C. Distribution of the non-AT1, non-AT2 angiotensin-binding site in the rat brain: preliminary characterization. Neuroendocrinology. 88 (4), 256-265 (2008).
- Karamyan, V. T., Stockmeier, C. A., Speth, R. C. Human brain contains a novel non-AT1, non-AT2 binding site for active angiotensin peptides. Life Sci. 83 (11-12), 421-425 (2008).
- Miller-Wing, A. V., et al. Central angiotensin IV binding sites: distribution and specificity in guinea pig brain. J Pharmacol Exp Ther. 266 (3), 1718-1726 (1993).
- Castren, E., Kurihara, M., Saavedra, J. M. Autoradiographic localization and characterization of angiotensin II binding sites in the spleen of rats and mice. Peptides. 8 (4), 737-742 (1987).
- MacGregor, D. P., et al. Angiotensin II receptor subtypes in the human central nervous system. Brain Res. 675 (1-2), 231-240 (1995).
- Plunkett, L. M., Correa, F. M. A., Saavedra, J. M. Quantitative autoradiographic determination of angiotensin-converting enzyme binding in rat pituitary and adrenal glands with 125I-351/A, a specific inhibitor. Regul Pept. 12, 263-272 (1985).
- Armando, I., et al. Increased angiotensin II AT(1) receptor expression in paraventricular nucleus and hypothalamic-pituitary-adrenal axis stimulation in AT(2) receptor gene disrupted mice. Neuroendocrinology. 76 (3), 137-147 (2002).
- Speth, R. C., Harding, J. W. Angiotensin Protocols Vol. 51 Methods in Molecular Medicine. Wang, D. H. , Humana Press. 275-295 (2001).
- Widdop, R. E., Jones, E. S., Hannan, R. E., Gaspari, T. A. Angiotensin AT2 receptors: cardiovascular hope or hype. Br J Pharmacol. 140 (5), 809-824 (2003).
- Michel, M. C., Wieland, T., Tsujimoto, G. How reliable are G-protein-coupled receptor antibodies. Naunyn Schmiedebergs Arch.Pharmacol. 379 (4), 385-388 (2009).
- Jensen, B. C., Swigart, P. M., Simpson, P. C. Ten commercial antibodies for alpha-1-adrenergic receptor subtypes are nonspecific. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 379 (4), 409-412 (2009).
- Jositsch, G., et al. Suitability of muscarinic acetylcholine receptor antibodies for immunohistochemistry evaluated on tissue sections of receptor gene-deficient mice. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 379 (4), 389-395 (2009).
- Hamdani, N., van der Velden, J. Lack of specificity of antibodies directed against human beta-adrenergic receptors. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 379 (4), 403-407 (2009).
- Bodei, S., Arrighi, N., Spano, P., Sigala, S. Should we be cautious on the use of commercially available antibodies to dopamine receptors. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 379 (4), 413-415 (2009).
- Lu, X., Bartfai, T. Analyzing the validity of GalR1 and GalR2 antibodies using knockout mice. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 379 (4), 417-420 (2009).
- Everaerts, W., et al. Where is TRPV1 expressed in the bladder, do we see the real channel. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 379 (4), 421-425 (2009).
- Adams, J. M., McCarthy, J. J., Stocker, S. D. Excess dietary salt alters angiotensinergic regulation of neurons in the rostral ventrolateral medulla. Hypertension. 52 (5), 932-937 (2008).
- Herrera, M., Sparks, M. A., Alfonso-Pecchio, A. R., Harrison-Bernard, L. M., Coffman, T. M. Lack of specificity of commercial antibodies leads to misidentification of Angiotensin type 1 receptor protein. Hypertension. 61 (1), 253-258 (2013).
- Rateri, D. L., et al. Endothelial Cell-Specific Deficiency of Ang II Type 1a Receptors Attenuates Ang II-Induced Ascending Aortic Aneurysms in LDL Receptor(-/-) Mice. Circ Res. 108 (5), 574-583 (2011).
- Benicky, J., Hafko, R., Sanchez-Lemus, E., Aguilera, G., Saavedra, J. M. Six Commercially Available Angiotensin II AT(1) Receptor Antibodies are Non-specific. Cell Mol Neurobiol. 32 (8), 1353-1365 (2012).
- Elliott, K. J., Kimura, K., Eguchi, S. Lack of specificity of commercial antibodies leads to misidentification of angiotensin type-1 receptor protein. Hypertension. 61 (4), 31 (2013).
- Hafko, R., et al. Commercially available angiotensin II At(2) receptor antibodies are nonspecific. PLoS One. 8 (7), 69234 (2013).
- Gonzalez, A. D., et al. Distribution of angiotensin type 1a receptor-containing cells in the brains of bacterial artificial chromosome transgenic mice. Neuroscience. 226, 489-509 (2012).
