Introduction
Стволовыми клетками антигена за 1 (СЦА1 или Ly6A / E) был впервые идентифицирован как маркера клеточной поверхности , выраженной гемопоэтических и мезенхимальных стволовых клеток 5,6. Стромальные сосудистый фракция (НВФ) из жировой ткани , полученной от мыши жировых депо представляет собой гетерогенную популяцию клеток , состоящих из фибробластов, макрофагов, эндотелиальных клеток сосудов, нервные клетки и клетки - предшественники адипоцитов 7. Клетки - предшественники адипоцитов, или полученные из жировой ткани стволовые клетки (ASCs) не являются липидами клетки , которые находятся в коллагеновой богатых периваскулярного внеклеточного матрикса (ECM) 8. Около 50% СФДВ состоят из ИСС, которые характеризуются как LINEAGE-отрицательной (Lin -) и CD29 + CD34 +:: СЦА1 + 9. Большинство из этих ячеек являются СЦА1 +: CD24 - адипоцитов клетки - предшественники, которые способны к дифференциации адипоцитов в пробирке; Однако, только часть клеток (0,08% от SVF) составляет СЦА1
В области ожирения и диабета, фиброза тканей и воспаления играют решающую роль в развитии и поддержании диабета 3 2- го типа. В последнее время , Токунага и др. показали , что высокие СЦА1 клетки , выделенные из паховая (или подкожно, SQ) и perigonadal (или висцеральный, VIS) C57BL6 / J жировых отложениях имеют разные подписи генов и ECM ремоделирования в пробирке 10. ММР14 (МТ1-ММР), прототипическим член мембранно-Tип семейства металлопротеиназ матрицы (ММР) опосредует развитие белой жировой ткани (WAT) через его коллагенолитического деятельности 1.
Примеры экспериментов , которые могут проводиться с клетками , выделенными и обогащенных по следующему протоколу включают трехмерную культуру, исследования дифференциации, анализы деградации коллагена и РНК последовательности 10,11. Деградация анализы следует проводить с кислотой экстрагируют коллагена , чтобы обеспечить сохранение телопептидом 11,12. Следующий протокол продемонстрирует методы для выделения первичных сосудистых стромальных клеток из различных жировых депо и обогащения клеток-предшественников адипоцитов с использованием иммуномагнитный разделения клеток. Справедливость сортировки клеток будет оцениваться с проточной цитометрии и путем использования СЦА1-GFP мышей , которые выражают GFP в СЦА1 + клеток, движимый СЦА1 промотора 13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Этика Заявление: Мичиганского университета Комитета по использованию и уходу за животными (UCUCA) одобрил все методы и протоколы в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных (Институт лабораторных исследований животных, Национальный исследовательский совет). Мыши поддерживаются в Мичиганском университете вивария и получают свободный доступ к пище и воде и выдерживают на 12 ч темнота / свет цикла.
1. Подготовка
- Подготовка первичной медиакультуру с DMEM, 10% FBS, 1x P / S / G, и 1x антибиотики / противогрибковые средства. Это будет использоваться, чтобы держать ткани в перед пищеварением. Поместите запас и аликвоты в водяной бане 37 ° С.
- Приготовьте пять миллилитров типа III раствора коллагеназы при 5 мг / мл, растворенного в HBSS (+ Са + Mg) для каждого типа жировое изолируя до пяти мышей. Например, при выделении SQ и Вис от одного генотипа, делают 10 мл, если дикого типа и мутанта SQ и Вис, сделать 20 мл. Отрегулируйте рН до 7,4 и STEразозлить фильтр. Алиготе в 50 мл пробирки. Отложите подальше от света.
- Используйте 70% этанола для дезинфекции операционного поля. Протереть и крышка с синим площадку. Спрей некоторое количество этанола на синей панели.
- Используйте 22 G иглы придавить абсорбирующую прокладку на пенопластовой доске и обрезать ножницами. Спрей накладку с этанолом, затем установить доску на синей площадке и накрыть другим синим площадку до начала рассечение.
- Наполните две 50 мл пробирки с этанолом и место в стойке, примыкающей к операционному полю. Поместите ножницы и пинцет в этаноле.
- Заполните другую 50 мл пробирку с PBS плюс 1x анти-анти для полоскания этанол от хирургических инструментов.
- В капот, этикетка 60 мм блюда для каждого типа ткани и заполнения культуральной средой нагревают до 37 ° С. Место пластин, прилегающих к хирургической области.
2. Выделение подкожного (SQ) жировым
- Эвтаназии мышь с передозировкой изофлуран и пневмоторакса.
- нежноспрей мышь с 70% этанола и лежал навзничь. Закрепление лапы к пенополистирол с 22 г хвои.
- Сделать небольшой разрез в коже нижней части живота. Держа верхнюю часть разреза с помощью пинцета, возьмите ножницы и отделить кожу от брюшины.
- После того как кожа отделяется от брюшину от живота к грудной клетке, отражают кожу от брюшины к голове, сделав боковые разрезы в коже вдоль стороны тела.
- Отражать оставшуюся кожу держит паховой жир прочь от тела и придавить к плате 22 G иглы.
- Переключиться на тонких ножниц и пинцетов. Захват паховой жировой ткани с помощью пинцета в начале координат около брюшины и надрез прочь между кожей и паховых жира движется к паховой области, избегая загрязняя SQ с кожей.
- Поместите инсолируемой паховой жировой ткани в мм блюдо маркированы 60.
3. Выделение Visceral (VIS) жировым
- Аналогичным образом к шагу 2.5, разрезать брюшину открытую подвергать висцерального жира колодки и кишечника.
- Переместить кишку прочь к грудной клетке.
- Захватите VIS жировой ткани на дальнем конце и осторожно потяните вверх. Рассеките из VIS жировой ткани, стараясь при этом, чтобы исключить эпидидимальной (или матки, при использовании самок мышей) ткани.
- Место в меченого блюдо и повторите шаг 3.3 для оставшейся VIS площадки.
4. коллагеназы жира колодки
- Перемещение 60 мм блюд в капот культуре ткани и аспирата от средств массовой информации.
- Фарш жировые подушечки с изогнутыми ножницами затем добавить в раствор коллагеназы. Обязательно полоскать ножницы и пинцет между типами тканей с этанолом и PBS.
- Встряска при 300 оборотах в минуту и 37 ° С в течение 10-20 мин, пока ткани не перевариваются. Это приемлемо, если некоторые части SQ еще видны. Этот вопрос будет рассмотрен на более позднем этапе.
- Добавить 25 мл культуральной среды в раствор коллагеназы, чтобы остановить collagenase лечение, и пипетку вверх и вниз 10 раз с 10 мл серологической пипетки, чтобы разогнать переваренные ткани.
- Штамм клеток с использованием ячейки фильтра 100 мкм. Центрифуга в течение 10 мин при 300 х г.
- Тщательно переливать от средств массовой информации, чтобы не нарушить осадок и добавляют 5 мл стерильной воды к осадку и осторожно пипеткой приостановить клетки. Подождите 2 мин для лизиса эритроцитов.
- Добавьте 25 мл среды с 10% FBS и деформации клеток через новый 100 мкм клеточный фильтр.
- Центрифуга в течение 10 мин при 300 х г. Декантируйте СМИ и ресуспендируют осадок в 1 мл культуральной среды.
- Граф клеток с помощью гемоцитометра, использу 1: 1 трипановым синим.
- Пластина 1 х 10 6 клеток в одну лунку на 6-луночный планшет.
5. Магнитная разделение клеток
- После того, как приблизительно от 4 до 6 ч клеточной адгезии, ополоснуть клетки дважды HBSS (-ca, -Mg). Диссоциируют прилипших клеток с использованием 0,05% трипсина. Развести суспензии клеток трипсина в буфере разделения 1 мл и спина для5 мин при 300 х г.
- Отберите супернатант. Ресуспендируют клеток в 500 мкл буфера. Удалить 10 мкл аликвоты и подсчета клеток с использованием гемоцитометра.
- Спин клетки в течение 5 мин при 300 х г.
- Отберите супернатанту полностью. Ресуспендируют клеток в 90 мкл буфера. Добавляют 10 мкл анти-СЦА1-FITC первичное антитело. Хорошо перемешать и инкубировать в течение 10 мин при 4 ° С в темноте.
- Промыть клетки с 1 мл буфера и центрифугировать клетки в течение 5 мин при 300 х г. Удалить супернатант полностью.
- Ресуспендируют клеток в 80 мкл буфера. Добавьте 20 мкл анти-FITC микрогранулы. Хорошо перемешать и инкубировать в течение 15 мин при 4 ° С в темноте.
- Промыть клетки с 1 мл буфера и центрифугировать клетки в течение 5 мин при 300 х г.
- Удалить супернатант и ресуспендируют осадок в 500 мкл буфера.
- Поместите колонку в магнитный держатель и полоскать колонку с 500 мкл буфера.
- Добавить клеточной суспензии в колонну. Избегайте пузырей в то время как пипеткой.
- Соберите немеченого СЦА1 - </ SUP> клетки и мыть колонке 3 раза 500 мкл буфера. Только добавить новый буфер, когда резервуар пуст. Избегайте пузырей в то время как пипеткой.
- Удалить столбец из магнитного держателя и поместить в 15 мл коническую трубку.
- Добавьте 1 мл буфера в колонку и элюции СЦА1 +, нажав поставляемый поршень через резервуар колонны.
- Спин вниз клеточных фракций в течение 5 мин при 300 х г. Ресуспендируют клеток в 1 мл культуральной среды.
- Удалить 10 мкл аликвоты из меченых и немеченых фракций и подсчета клеток с использованием гемоцитометра.
- Пластинчатый каждую фракцию клеток в 1 лунку 6-луночного планшета.
6. Проверка иммуномагнитного Разделение СЦА1 высокой с АСУ проточной цитометрии
- Промойте клетки дважды HBSS (-ca, -Mg) и диссоциируют клеток с использованием 0,05% трипсина.
- Центрифуга клетки при 300 мкг в течение 5 мин. Ресуспендируют клеток в 1 мл среды культивирования и подсчет с помощью гемоцитометра.
- Получить> 10 6
- Удалить супернатант и повторите шаг 6,3 еще два раза.
- Ресуспендируют клетки с 1 мл 2% козьей сывороткой + 2% бычьего сывороточного альбумина и блок в течение 30 мин при комнатной температуре.
- Центрифуга клетки при 300 мкг в течение 5 мин.
- Удалите блокирующий раствор.
- Добавить крысу IgG2a Alexa Fluor 647 (0,25 мкг, 1: 400) или анти-СЦА1 Alexa Fluor 647 (0,25 мкг, 1: 400), в 100 мкл PBS с 2% сыворотки козьего молока и 2% БСА + PBS при 4 ° C в течение 30 мин в темноте.
- Добавьте 1 мл холодного PBS к клеткам. Центрифуга 300 мкг в течение 5 мин при температуре 4 ° С.
- Удалить супернатант и повторите шаг 6,9 еще два раза.
- Ресуспендируют клеток в 1 мл PBS. Pass клеточные суспензии через сито 100 клеток мкм в рамках подготовки к проточной цитометрии анализа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Обогащение СЦА1 высоких ИСС из разных жировым.
Сосудистые стромальные клетки , выделенные из жира SQ дисплей фибробластоподобных, растянуты форму клетки , независимо от уровня экспрессии СЦА1 (рис 1А). С другой стороны, Вис (eWAT происхождения) СЦА1 высокие и низкие СЦА1 клетки демонстрируют отчетливую разницу в их форме клетки. Как и SQ (iWAT происхождения) СЦА1 высоких клеток, Vis (eWAT происхождения) СЦА1 высокие клетки - дисплей растянуты, фибробласты-образную форму клеток, тогда как VIS СЦА1 низкие клетки демонстрируют эпителиоидный форму. Высокие клетки , выделенные из СЦА1 СЦА1-GFP мышей легко идентифицированы как GFP-положительных клеток в культуре ткани (Фиг.1В). Когда эти клетки были оценены с проточной цитометрии, большинство положительных клеток GFP были подтверждены выразить СЦА1 белки на поверхности клетки, как обнаружено сти-СЦА1 антител (рис 1C). Высокие клетки СЦА1 , полученные из жировой ткани паховой поддержания увеличена емкость дифференциации адипоцитов , тогда как eWAT производные СЦА1 высокие клетки более трудно дифференцировать в адипоцитов с обычным адипогенной смесью 10.
Жировое депо-зависимой экспрессии генов СЦА1 высоких ИСС (Рисунок 2).
Генома транскриптом анализа с РНК - секвенирования продемонстрировал обогащение генов , связанных с белками внеклеточного матрикса и модификаторов (GO: 0031012, GO: 0005578) в этих СЦА1 высоких ИСС 10. В сочетании с ПЦР в реальном времени анализы, мы смогли продемонстрировать дифференциальную экспрессию коллагенолитических ММР (ММР2, ММР8, ММР13, ММР14) между iWAT- и eWAT производных СЦА1 высоких ИСС. Когда меченных флуоресцеином типа коллагена гели использовались т O оценки активности перицеллюлярный деградации, мы наблюдали заметно повышенную активность ремоделирование коллагена , опосредованного VIS СЦА1 высокими ИСС 10.
Рисунок 1: иммуномагнитного Разделение Мышиные СЦА1 высоких ИСС из различных жировых отложений (А) СЦА1 высокие и низкие СЦА1 ИСС , выделенные из SQ (iWAT) и VIS (eWAT).. Масштаб = 100 мкм. (В) СЦА1-GFP - клетки , выделенные из iWAT мышей Sca-GFP. Масштаб = 100 мкм. Выражение поверхности (C) Cell СЦА1 в СЦА1-GFP-позитивных клеток с начисленными проточной цитометрии. (Слева) контроль крысы IgG (справа) анти-СЦА1 антитела. По оси Х, интенсивность GFP. Y-ось, Alexa Fluor-647. Панель А было показано ранее в Токунага, М. и др., (2014).ig1large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рис . 2: жировое депо-зависимый экспрессия коллагенолитические ММР, TIMPs и коллагенов (А) выражение Дифференциальный ген ЕСМ и модификаторы ECM в СЦА1 высоких ИСС , выделенных из различных жировых депо. (B) Увеличение коллагена деградации активности VIS (eWAT происхождения) СЦА1 высокие ИСС. Деградация коллагена проявляется как исчезновение флуоресцентных сигналов (стрелки и стрелки). Врезка представляет собой увеличенное изображение сфокусированного деградации коллагена, опосредованных отдельной клетки из SQ ИСС. Клетки культивировали в течение 72 ч. Данные , приведенные ранее в Токунага, М. и др., (2014). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы VIEW большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы демонстрируем изоляцию и иммуномагнитный разделение клеток мышиных ИСС от различных жировых отложений и их использование для проведения экспериментов в лабораторных условиях . Представленный метод эффективен для быстрого выделения большого количества СЦА1-положительных ИСС, что является преимуществом по технически сложной и дорогой FACS-опосредованной изоляции ИСС 9,14. В отличие от FACS, иммуномагнитный разделения клеток не позволяет использовать несколько антигена для идентификации популяции клеток-мишеней. Тем не менее, если поверхностный антиген хорошо охарактеризован, использование иммуномагнитного разделения увеличивает количество клеток для анализа , не полагаясь на использование FACS оборудования 15, которое до сих пор не легко доступны для многих биологических исследователей при малых институтах без основных средств ,
Есть некоторые критические аспекты процедуры, которые необходимо соблюдать, чтобы обеспечить успешный исход. Закупка ADIPOSE стволовых клеток, полученных требует хирургической изоляции депо жировой ткани мыши. Таким образом, скорость и точность поиска ткани необходимо, чтобы получить большое количество жизнеспособных клеток. Кроме того, содержание чистых хирургических инструментов и полей имеют жизненно важное значение для исхода процедуры путем предотвращения микробного загрязнения образцов тканей и клеток. Препарированные ткани жировой ткани должны быть ферментативно диссоциированных в растворе коллагеназы типа II. ECM состав отличается от SQ и VIS жировым 10,16, где VIS содержат меньше коллагенов , чем SQ. Таким образом, продолжительность VIS жировой ткани пищеварения требует примерно половину количества времени, как SQ. Приемлемо, чтобы остановить переваривания ткани после указанного периода инкубации, даже если мелкие частицы ткани по-прежнему присутствует в растворе коллагеназы. Эти части могут быть механически диссоциируют с пипеткой раз культуральные среды были добавлены, чтобы ингибировать активность коллагеназы. В то время как можно продолжитьнепосредственно к иммуномагнитного сортировкой следующие Svf изоляции, наши семена Группа 1 × 10 6 клеток на несортированных пластиковых пластин в течение приблизительно от 4 до 6 часов , прежде чем продолжить сортировки клеток. Несмотря на несколько стадий фильтрации во время СВП изоляции, мусор все равно будет присутствовать в клеточной суспензии. Обшивка клетки, прежде чем приступить к разделению иммуномагнитного клеток дает возможность вымыть мусор бесхозяйного клетки прочь, таким образом позволяя магнитной сортировки будет применяться только к прилипшие клетки, которые содержат Adipogenic клетки-предшественники.
В то время как СЦА1 не найден в геноме человека, идентификация и проверка альтернативных антигенов клеточной поверхности , экспрессируемых на жировых депо-зависимых человек из жировой ткани стволовых клеток 17, в сочетании с этим методом разделения клеток, может помочь нам определить биологии человека из жировой ткани стволовых клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа поддерживается NIH DK095137 (к THC). Мы благодарим текущих и бывших членов лаборатории, которые внесли вклад в развитие и сложности описанных способов.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Type 3 Collagenase | Worthington Biochemical | LS004182 | Tissue digestion |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | High-glucose culture medium |
| Pen/Strep/Glutamine (100x) | Gibco | 10378-016 | Media antibiotic |
| Anti-anti (100x) | Gibco | 15240-062 | Media antifungal |
| FBS | Gibco | 16000-044 | |
| PBS (1x, pH 7.4) | Gibco | 10010-023 | |
| Trypsin (0.05%) | Gibco | 25300-054 | |
| Cell strainer | BD Bioscience | 352360 | 100-μm cell strainer |
| 60 mm plates | BD Falcon | 353004 | |
| Scissors | FST | 14001-12 | Large |
| Scissors | FST | 14091-11 | Fine, curved tip |
| Large Forceps | FST | 11000-12 | |
| Fine Forceps | Any vendor | ||
| 25G 5/8” needles | BD | 305122 | |
| 22G 1.5” needles | BD | 305159 | |
| 15 ml conical tubes | BD Falcon | 352097 | |
| 50 ml conical tubes | BD Falcon | 352098 | |
| MACS separation columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Anti-Sca1 microbead kit (FITC) | Miltenyi Biotec | 130-092-529 | FITC-anti-Sca1 1ºAb and anti-FITC microbeads 2ºAb |
| AutoMACS running buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| MiniMACS separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| Blue chux pads | Fisher | 276-12424 | |
| Absorbent pads | Fisher | 19-165-621 | |
| Styrofoam board | Use from 50 ml tubes | ||
| 70% ethanol | |||
| Isoflurane | Any vendor | ||
| Rat IgG2a Alexa Fluor 647 | Invitrogen | R2a21 | |
| Rat IgG2a anti-mouse Sca1 Alexa Fluor 647 | Invitrogen | MSCA21 | |
| Rat IgG2a R-PE | Invitrogen | R2a04 | |
| Rat IgG2a anti-mouse F4/80 R-PE | Invitrogen | MF48004 | |
| Round-bottom tube | BD Falcon | 352058 | |
| HBSS (–Ca, –Mg) | Gibco | 14175-095 | |
| HBSS (+Ca, +Mg) | Gibco | 14025-092 | For collagenase solution |
| Type I collagen (2.7 mg/ml in 37mm acetic acid | Prepare in house12 | ||
| 10x MEM | Gibco | 11430-030 | |
| 1 M HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| 0.34 N NaOH | Prepare in house | ||
| Cover slips | Corning | 2870-22 | |
| Alexa Fluor 594 carboxylic acid, succinimidyl ester, mixed isomers | Invitrogen | A-20004 | |
| 0.89 M NaHCO3 | Gibco | 25080-094 |
References
- Chun, T. H., et al. A pericellular collagenase directs the 3-dimensional development of white adipose tissue. Cell. 125 (3), 577-591 (2006).
- Chun, T. H., et al. Genetic link between obesity and MMP14-dependent adipogenic collagen turnover. Diabetes. 59 (10), 2484-2494 (2010).
- Chun, T. H. Peri-adipocyte ECM remodeling in obesity and adipose tissue fibrosis. Adipocyte. 1 (2), 89-95 (2012).
- Sun, K., Tordjman, J., Clement, K., Scherer, P. E. Fibrosis and adipose tissue dysfunction. Cell Metab. 18 (4), 470-477 (2013).
- Spangrude, G., Heimfeld, S., Weissman, I. Purification and Characterization of Mouse Hematopoietic Stem Cells. Science. 241, 58-62 (1988).
- Welm, B. E., et al. Sca-1(pos) cells in the mouse mammary gland represent an enriched progenitor cell population. Dev Biol. 245 (1), 42-56 (2002).
- Gesta, S., Tseng, Y. H., Kahn, C. R. Developmental origin of fat: tracking obesity to its source. Cell. 131 (2), 242-256 (2007).
- Tang, W., Zeve, D., Suh, J. M., Bosnakovski, D., Kyba, M., Hammer, R. E., Tallquist, M. D., Graff, J. M. White fat progenitor cells reside in the adipose vasculature. Science. 322, 583-586 (2008).
- Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo. Cell. 135 (2), 240-249 (2008).
- Tokunaga, M., et al. Fat depot-specific gene signature and ECM remodeling of Sca1(high) adipose-derived stem cells. Matrix Biol. 36, 28-38 (2014).
- Chun, T. H., Inoue, M. 3-D adipocyte differentiation and peri-adipocyte collagen turnover. Methods Enzymol. 538, 15-34 (2014).
- Rajan, N., Habermehl, J., Cote, M. F., Doillon, C. J., Mantovani, D. Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications. Nat Protoc. 1 (6), 2753-2758 (2006).
- Ma, X., Robin, C., Ottersbach, K., Dzierzak, E. The Ly-6A (Sca-1) GFP Transgene is Expressed in all Adult Mouse Hematopoietic Stem Cells. Stem Cells. 20 (6), 514-521 (2002).
- Berry, R., Rodeheffer, M. S. Characterization of the adipocyte cellular lineage in vivo. Nat Cell Biol. 15 (3), 302-308 (2013).
- Jeffery, E., Church, C. D., Holtrup, B., Colman, L., Rodeheffer, M. S. Rapid depot-specific activation of adipocyte precursor cells at the onset of obesity. Nat Cell Biol. 17 (4), 376-385 (2015).
- Mori, S., Kiuchi, S., Ouchi, A., Hase, T., Murase, T. Characteristic Expression of Extracellular Matrix in Subcutaneous Adipose Tissue Development and Adipogenesis; Comparison with Visceral Adipose Tissue. Int J Biol Sci. 10 (8), 825-833 (2014).
- Ong, W. K., et al. Identification of Specific Cell-Surface Markers of Adipose-Derived Stem Cells from Subcutaneous and Visceral Fat Depots. Stem Cell Reports. 2 (2), 171-179 (2014).
