Introduction
الخلايا الجذعية مستضد 1 (Sca1، أو Ly6A / E) كان أول من عرف كعلامة سطح الخلية التي عبرت عنها المكونة للدم والخلايا الجذعية الوسيطة 5،6. جزء الأوعية الدموية اللحمية (صندوق التبرعات الخاص) من الأنسجة الدهنية التي تم الحصول عليها من مستودعات الماوس الدهون هي مجموعة متغايرة من الخلايا التي تتكون من الخلايا الليفية، الضامة، وخلايا بطانة الأوعية الدموية، والخلايا العصبية، وخلايا خلية شحمية السلف 7. الخلايا الاولية خلية شحمية، أو الخلايا الجذعية الدهنية المشتقة (مخولا لصيانة طائرات) هي خلايا غير الدهون لادن الموجودة في المصفوفة خارج الخلية المحيطة بالأوعية الكولاجين الغني (ECM) 8. ما يقرب من 50٪ من صندوق التبرعات الخاص تتكون من مخولا لصيانة طائرات، والتي وصفها بأنها نسب سلبية (لين -) وCD29 +: CD34 +: Sca1 + 9. معظم هذه الخلايا هي Sca1 +: CD24 - الأسلاف خلية شحمية، والتي هي قادرة على التمايز خلية شحمية في المختبر. ومع ذلك، سوى جزء صغير من الخلايا (0.08٪ من صندوق التبرعات الخاص) يشكل Sca1
في مجال السمنة ومرض السكري، تليف الأنسجة والتهاب تلعب دورا حاسما في تطوير وصيانة النوع 2 من داء السكري 3. في الآونة الأخيرة، توكوناجا وآخرون. أظهرت أن Sca1 خلايا عالية معزولة عن الاربية (أو تحت الجلد، SQ) وperigonadal (أو الحشوية، VIS) C57BL6 / J مستودعات الدهون يحمل توقيعات الجينات المختلفة، وECM إعادة عرض في المختبر 10. MMP14 (MT1-MMP)، وهو عضو تنميط للغشاء تييب] مصفوفة الفلزي (MMP) أسرة تتوسط تطوير الأنسجة الدهنية البيضاء (وات) من خلال النشاط حال للكولاجين ل1.
وتشمل الأمثلة من التجارب التي يمكن أن تجري مع الخلايا المعزولة والتخصيب من خلال بروتوكول التالي ثقافة ثلاثية الأبعاد، دراسات التمايز، المقايسات تدهور الكولاجين، وRNA تسلسل 10،11. وينبغي إجراء فحوصات تدهور مع الكولاجين حمض المستخرجة لضمان الحفاظ على telopeptide 11،12. فإن بروتوكول التالية لشرح طرق لعزل خلايا انسجة الوعائية الأولية من مستودعات الدهون المختلفة، وإثراء الخلايا الاولية خلية شحمية باستخدام فصل الخلية immunomagnetic. وسيتم تقييم صلاحية فرز الخلايا مع التدفق الخلوي ومن خلال استخدام-Sca1 GFP الفئران التي تعبر عن GFP في Sca1 + الخلايا، يقودها Sca1 المروج 13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
أخلاقيات الإعلان: جامعة ميشيغان اللجنة على استخدام ورعاية الحيوانات (UCUCA) تمت الموافقة على جميع الطرق والبروتوكولات وفقا لدليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية (معهد مختبر أبحاث الحيوان، المجلس الوطني للبحوث). تتم المحافظة على الفئران في جامعة ميشيغان الحظيرة وتعطى حرية الوصول إلى الغذاء والماء وأبقى على 12 ساعة الظلام دورة / الخفيفة.
1. التحضيرات
- إعداد وسائل الإعلام ثقافة الأساسي مع DMEM، و 10٪ FBS، 1X P / S / G، و1X المضادات الحيوية / مضادات الفطريات. وسوف تستخدم هذه للحفاظ على الأنسجة الدخول قبل الهضم. وضع الأسهم وقسامة في 37 حمام ماء درجة مئوية.
- إعداد خمسة ملليلتر من النوع الثالث حل كولاجيناز في 5mg / حل مل في HBSS (+ الكالسيوم، المغنيسيوم +) لكل نوع من منصة الدهون عزله، ما يصل إلى خمسة الفئران. على سبيل المثال، عندما عزل SQ وVIS من النمط الجيني واحد، وجعل 10 مل، إذا من النوع البري ومتحولة SQ وVIS، وجعل 20 مل. ضبط درجة الحموضة إلى 7.4 والظريفيثير غضب التصفية. قسامة إلى 50 مل أنابيب. جانبا بعيدا عن الضوء.
- استخدام الايثانول 70٪ لتطهير الجراحي الميداني. مسح أسفل، وتغطي مع لوحة زرقاء. رش بعض الإيثانول على لوحة زرقاء.
- استخدام الإبر 22 G ليتعرفوا على وسادة ماصة لمجلس الستايروفوم وتقليم مع مقص. رش لوحة مع الإيثانول ثم تعيين مجلس على لوحة زرقاء وتغطية مع لوحة زرقاء آخر حتى يبدأ تشريح.
- ملء اثنين من 50 مل أنابيب مع الإيثانول وضعها في موقف مجاور للالجراحي الميداني. وضع مقص وملقط في الإيثانول.
- ملء أنبوب آخر 50 مل مع برنامج تلفزيوني بالإضافة إلى 1X مكافحة المضادة للشطف الإيثانول من الأدوات الجراحية.
- في غطاء محرك السيارة، والتسمية 60 أطباق مم لكل نوع من أنواع الأنسجة وتمتلئ وسائل الإعلام ثقافة تحسنت إلى 37 درجة مئوية. وضع لوحات المتاخمة لمنطقة العمليات الجراحية.
2. عزل تحت الجلد (SQ) الدهون وسادات
- الموت ببطء الفأر مع جرعة زائدة من الأيزوفلورين واسترواح الصدر.
- بلطفرذاذ الفأر مع الايثانول 70٪ ووضع مستلق. دبوس الكفوف إلى مجلس رغوة مع 22 الإبر G.
- جعل قطع صغير في الجلد من أسفل البطن. عقد قمة للقطع مع ملقط، واتخاذ مقص وفصل الجلد من البريتوني.
- مرة واحدة يتم فصل الجلد من البريتوني من البطن إلى القفص الصدري، يعكس الجلد بعيدا عن الصفاق نحو الرأس من خلال جعل التخفيضات الجانبية في الجلد على طول الجانب من الجسم.
- تعكس الجلد المتبقية عقد الدهون الإربي بعيدا عن الجسم ويتعرفوا إلى لوحة مع 22 الإبر G.
- التبديل إلى مقص الجميلة وملقط. الاستيلاء على لوحة الدهون الأربية مع ملقط في أصل قرب الصفاق وقص بعيدا بين الجلد والدهون الإربي تتقدم نحو الفخذ تجنب تلويث SQ مع الجلد.
- وضع insolated الأربية منصة الدهون في الطبق المسمى 60 ملم.
3. عزل الحشوية (VIS) وسادات الدهون
- بطريقة مماثلة إلى الخطوة 2.5، وقطع الصفاق مفتوحة لفضح منصات الدهون والأمعاء الحشوية.
- نقل القناة الهضمية بعيدا نحو الصدر.
- الاستيلاء على VIS منصة الدهون في نهاية القاصي وسحب بلطف صعودا. تشريح خارج VIS وحة الدهون مع الحرص على استبعاد بربخي (أو الرحم، إذا كان استخدام إناث الفئران) الأنسجة.
- مكان في صحن وصفت وكرر الخطوة 3.3 لوحة VIS المتبقية.
4. كولاجيناز هضم الدهون وسادات
- نقل 60 ملم الأطباق إلى غطاء محرك السيارة زراعة الأنسجة، ونضح من وسائل الإعلام.
- تخطر على منصات الدهون مع مقص منحني ثم يضاف إلى حل كولاجيناز. يجب التأكد من شطف مقص وملقط بين أنواع الأنسجة مع الايثانول وبرنامج تلفزيوني.
- هزة في 300 دورة في الدقيقة و 37 درجة مئوية لمدة 10-20 دقيقة حتى يتم هضمها الأنسجة. كان مقبولا إذا كان بعض القطع من SQ لا تزال مرئية. وسيتم تناول ذلك في خطوة لاحقة.
- إضافة 25 مل من وسائل الاعلام والثقافة في حل كولاجيناز لوقف collagالعلاج enase، وماصة صعودا وهبوطا 10 مرات مع 10 مل ماصة المصلية لتفريق الأنسجة هضمها.
- خلايا السلالة باستخدام مصفاة الخلية 100 ميكرون. أجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 300 × ز.
- صب بعناية من وسائل الإعلام على عدم تعكير صفو بيليه وإضافة 5 مل من الماء المعقم لبيليه وبلطف ماصة لتعليق الخلايا. الانتظار 2 دقيقة لليز كريات الدم الحمراء.
- إضافة 25 مل من وسائل الاعلام مع FBS 10٪ وسلالة الخلايا من خلال جديدة 100 ميكرومتر مصفاة الخلية.
- أجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 300 × ز. وسائل الإعلام صب وبيليه resuspend في 1 مل من ثقافة وسائل الإعلام.
- عدد الخلايا مع عدادة الكريات باستخدام 1: 1 التريبان الأزرق.
- لوحة 1 × 10 6 خلايا في بئر واحدة على لوحة 6 جيدا.
5. المغناطيسي فصل خلية
- بعد حوالي 4-6 ساعة من التصاق الخلية، وشطف الخلايا مرتين مع HBSS (-CA، -Mg). فصل الخلايا الملتصقة باستخدام التربسين 0.05٪. تمييع تعليق خلية التربسين في المخزن الفصل 1 مل وتدور ل5 دقائق في 300 × ز.
- نضح طاف. Resuspend الخلايا في 500 العازلة ميكرولتر. إزالة قسامة 10 ميكرولتر وعدد الخلايا باستخدام عدادة الكريات.
- خلايا تدور لمدة 5 دقائق في 300 × ز.
- نضح طاف تماما. خلايا resuspend في 90 العازلة ميكرولتر. إضافة 10 الأجسام المضادة الأولية مكافحة Sca1-FITC ميكرولتر. تخلط جيدا واحتضان لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية في الظلام.
- غسل الخلايا مع 1 مل العازلة والخلايا الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 300 × ز. إزالة طاف تماما.
- خلايا resuspend في 80 العازلة ميكرولتر. إضافة 20 ميكرولتر ميكروبيدات مكافحة FITC. تخلط جيدا واحتضان لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية في الظلام.
- غسل الخلايا مع 1 مل العازلة والخلايا الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 300 × ز.
- إزالة وطاف بيليه resuspend في 500 ميكرولتر عازلة.
- وضع عمود في حامل المغناطيسي وشطف العمود مع 500 العازلة ميكرولتر.
- إضافة تعليق الخلية إلى العمود. تجنب فقاعات في حين pipetting ل.
- جمع Sca1 الخالي من الملصقات - </ sup> في الخلايا وغسل العمود 3 مرات مع 500 ميكرولتر عازلة. فقط إضافة عازلة الجديد عند الخزان فارغ. تجنب فقاعات في حين pipetting ل.
- إزالة عمود من حامل المغناطيسي والمكان الى 15 مل أنبوب مخروطي الشكل.
- إضافة 1 مل العازلة إلى العمود وأزل Sca1 + عن طريق دفع المكبس توفيره من خلال الخزان العمود.
- تدور باستمرار كسور خلية لمدة 5 دقائق في 300 × ز. Resuspend الخلايا في وسائل الإعلام والثقافة 1 مل.
- إزالة قسامة 10 ميكرولتر من الكسور وصفت وغير المسماة وعدد الخلايا باستخدام عدادة الكريات.
- لوحة كل جزء الخلية في 1 بئر من لوحة 6 جيدا.
6. التأكيد من الفصل Immunomagnetic من Sca1 عالية ACSS مع التدفق الخلوي
- شطف الخلايا مرتين مع HBSS (-CA، -Mg) وفصل الخلايا باستخدام 0.05٪ التربسين.
- خلايا الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق. Resuspend الخلايا في وسائل الإعلام والثقافة 1 مل وتحسب باستخدام عدادة الكريات.
- الحصول على> 10 6
- إزالة طاف وكرر الخطوة 6.3 مرتين أخريين.
- Resuspend الخلايا مع 1 مل من 2٪ مصل الماعز + 2٪ BSA وكتلة لمدة 30 دقيقة في RT.
- خلايا الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق.
- إزالة عرقلة الحل.
- إضافة الفئران IgG2a اليكسا فلور 647 (0.25 ميكروغرام، 1: 400) أو مكافحة Sca1 اليكسا فلور 647 (0.25 ميكروغرام، 1: 400)، في 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني مع 2٪ مصل الماعز و 2٪ BSA + برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة في الظلام.
- إضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني الباردة إلى الخلايا. الطرد المركزي 300 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
- إزالة طاف وكرر الخطوة 6.9 مرتين أخريين.
- Resuspend الخلايا في 1 مل برنامج تلفزيوني. تمرير تعليق الخلية من خلال مصفاة الخلية 100 ميكرومتر في إعداد لتحليل تدفق cytometric.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
إثراء مخولا لصيانة طائرات عالية Sca1 من سادات الدهون المختلفة.
خلايا انسجة الوعائية معزولة عن مثل الخلايا الليفية عرض SQ الدهون، امتدت شكل الخلية بغض النظر عن مستوى التعبير Sca1 (الشكل 1A). من ناحية أخرى، VIS (eWAT المشتقة) Sca1 عالية وSca1 خلايا المنخفضة تظهر فرق واضح في شكل الخلية الخاصة بهم. مثل SQ (مشتقة iWAT) خلايا عالية Sca1، VIS (eWAT المشتقة) خلايا عالية Sca1 العرض امتدت، تشبه الخلايا الليفية شكل الخلية، في حين VIS Sca1 خلايا المنخفضة تظهر شكل ظهاراني. وحددت Sca1 خلايا عالية المعزولة من الفئران Sca1 GFP بسهولة كما GFP إيجابية الخلايا في نسيج الثقافة (الشكل 1B). عندما تم تقييم هذه الخلايا مع التدفق الخلوي، وقد أكد معظم الخلايا GFP إيجابية للتعبير عن البروتينات Sca1 على سطح الخلية حيث الكشف مع أحدTI-Sca1 الأجسام المضادة (الشكل 1C). خلايا عالية Sca1 المستمدة من منصة الدهون الأربية تحتفظ زيادة قدرة التمايز خلية شحمية في حين الخلايا عالية Sca1 المستمدة eWAT-أكثر صعوبة على التمايز إلى خلية شحمية مع مزيج مكون الشحم التقليدية 10.
الدهون التعبير الجيني مستودع التي تعتمد من مخولا لصيانة طائرات عالية Sca1 (الشكل 2).
Transcriptome على الجينوم على نطاق التحليلات مع تسلسل الحمض النووي الريبي أظهرت إثراء الجينات المتعلقة البروتينات المصفوفة خارج الخلية والمعدلات (GO: 0031012، GO: 0005578) في تلك مخولا لصيانة طائرات عالية Sca1 10. إلى جانب الوقت الحقيقي تحليل PCR، كنا قادرين على إثبات التعبير التفاضلي لتقوم ال MMPs حال الكولاجين (MMP2، MMP8، MMP13، MMP14) بين iWAT- وeWAT مشتقة Sca1 مخولا لصيانة طائرات عالية. عندما وصفت فلوريسئين النوع الأول الكولاجين استخدمت المواد الهلامية ر س تقييم النشاط تدهور المحيطة بالخلايا، لاحظنا زيادة ملحوظة النشاط الكولاجين إعادة بوساطة مخولا لصيانة طائرات عالية VIS Sca1 10.
الشكل 1: فصل Immunomagnetic الفئران Sca1 مخولا لصيانة طائرات عالية من الدهون مستودعات مختلفة (A) Sca1 عالية وSca1 مخولا لصيانة طائرات منخفضة معزولة عن SQ (iWAT) وVIS (eWAT). مقياس = 100 ميكرون. (ب) خلايا Sca1-GFP معزولة عن iWAT من الفئران هيئة السلع التموينية، GFP. مقياس = 100 ميكرون. التعبير سطح (C) خلية من خلايا Sca1 في Sca1-GFP إيجابية في تقدير التدفق الخلوي. (يسار) مكافحة الفئران مفتش (يمين) المضادة للأجسام المضادة Sca1. المحور السيني، وكثافة GFP. العمودي، اليكسا فلور 647. لوحة وأظهرت في وقت سابق في توكوناجا، M. وآخرون، (2014).ig1large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: التعبير الدهون مستودع-المعتمد على حال الكولاجين وتقوم ال MMPs، TIMPs، والكولاجين (أ) التعبير الجيني التفريقي للموبينيل ومعدلات ECM في مخولا لصيانة طائرات عالية Sca1 معزولة عن مستودعات الدهون المختلفة. (ب) زيادة الكولاجين النشاط تدهور VIS (eWAT المشتقة) مخولا لصيانة طائرات عالية Sca1. وأظهرت تدهور الكولاجين كما اختفاء إشارات فلوري (السهام والنصال). أقحم هو صورة مكبرة لتدهور الكولاجين تركز بوساطة الخلايا الفردية مخولا لصيانة طائرات مربعا. كان المثقف الخلايا لمدة 72 ساعة. البيانات الواردة سابقا في توكوناجا، M. وآخرون، (2014). يرجى النقر هنا لضدiew نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وهنا علينا أن نبرهن على العزلة والانفصال خلية immunomagnetic من مخولا لصيانة طائرات الفئران من منصات الدهون المختلفة واستخدامها لاجراء تجارب في المختبر. الطريقة المعروضة فعال لعزل سريعة لعدد كبير من مخولا لصيانة طائرات-Sca1 إيجابي، وهو أمر مفيد على العزلة معقدة ومكلفة من الناحية الفنية بوساطة نظام مراقبة الأصول الميدانية من مخولا لصيانة طائرات 9،14. وخلافا لنظام مراقبة الأصول الميدانية، فصل الخلية immunomagnetic لا تسمح باستخدام مستضد متعددة لتحديد السكان الخلية المستهدفة. ومع ذلك، إذا كان متميزا بطابع جيدا على المستضد السطحي، واستخدام الفصل immunomagnetic يزيد من عدد الخلايا لتحليلها دون الاعتماد على استخدام معدات FACS 15، والتي لا تزال لا يمكن الوصول إليها بسهولة إلى العديد من الباحثين البيولوجي في المعاهد، من دون مرافق الأساسية .
هناك بعض الجوانب الهامة من الإجراء التي يجب مراعاتها لضمان تحقيق نتائج ناجحة. شراء ADIPالخلايا الجذعية بيئة نظام التشغيل مشتقة يتطلب العزلة الجراحية مستودعات الأنسجة الدهنية الماوس. ولذلك، فإن سرعة ودقة استرجاع الأنسجة أمر حتمي لانتاج عدد كبير من خلايا قابلة للحياة. بالإضافة إلى ذلك، صيانة الحقول والأدوات الجراحية النظيفة حيوية لنتائج الإجراء عن طريق منع التلوث الميكروبي لعينات من الخلايا والأنسجة. الأنسجة الدهنية تشريح يجب فصلها إنزيمي في حل كولاجيناز من النوع الثاني. يختلف تكوين ECM بين SQ وVIS منصات الدهون 10،16، حيث VIS يحتوي على الكولاجين أقل من SQ. ولذلك، فإن مدة VIS منصة الدهون الهضم وتتطلب ما يقرب من نصف كمية الوقت الذي SQ. كان مقبولا لوقف عملية الهضم الأنسجة بعد فترة الحضانة المعلنة حتى لو جزيئات صغيرة من الأنسجة لا تزال موجودة في حل كولاجيناز. هذه القطع يمكن فصلها ميكانيكيا مع pipetting لمرة واحدة تم إضافة سائل الإعلام والثقافة لمنع النشاط كولاجيناز. في حين أنه من الممكن المضي قدمامباشرة إلى الفرز immunomagnetic التالية العزلة صندوق التبرعات الخاص، بذور مجموعتنا 1 × 10 6 خلايا لم يتم فرزها على لوحات من البلاستيك لمدة 4 إلى 6 ساعات قبل متابعة فرز الخلايا. وعلى الرغم من الخطوات الترشيح متعددة خلال العزلة صندوق التبرعات الخاص، سوف الحطام لا يزال موجودا داخل الخلية تعليق. طلاء الخلايا قبل الشروع في فصل الخلية immunomagnetic يوفر فرصة لغسل الحطام والخلايا غير مرتبط بعيدا، مما يسمح الفرز المغناطيسي لتطبيقه فقط على الخلايا الملتصقة التي تحتوي على الخلايا الاصلية مكون الشحم.
في حين لم يتم العثور Sca1 في الجينوم البشري، وتحديد والتحقق من مستضدات سطح الخلية بديلة أعرب عن الدهون التي تعتمد على مستودع الخلايا الدهنية الإنسان الجذعية 17، عندما يقترن مع هذه التقنية فصل الخلية، قد تساعدنا على تحديد بيولوجيا الخلايا الدهنية الجذعية البشرية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
ويؤيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة DK095137 (لTHC). نشكر أعضاء المختبر الحاليين والسابقين الذين ساهموا في تنمية وتطور الأساليب المذكورة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Type 3 Collagenase | Worthington Biochemical | LS004182 | Tissue digestion |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | High-glucose culture medium |
| Pen/Strep/Glutamine (100x) | Gibco | 10378-016 | Media antibiotic |
| Anti-anti (100x) | Gibco | 15240-062 | Media antifungal |
| FBS | Gibco | 16000-044 | |
| PBS (1x, pH 7.4) | Gibco | 10010-023 | |
| Trypsin (0.05%) | Gibco | 25300-054 | |
| Cell strainer | BD Bioscience | 352360 | 100-μm cell strainer |
| 60 mm plates | BD Falcon | 353004 | |
| Scissors | FST | 14001-12 | Large |
| Scissors | FST | 14091-11 | Fine, curved tip |
| Large Forceps | FST | 11000-12 | |
| Fine Forceps | Any vendor | ||
| 25G 5/8” needles | BD | 305122 | |
| 22G 1.5” needles | BD | 305159 | |
| 15 ml conical tubes | BD Falcon | 352097 | |
| 50 ml conical tubes | BD Falcon | 352098 | |
| MACS separation columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Anti-Sca1 microbead kit (FITC) | Miltenyi Biotec | 130-092-529 | FITC-anti-Sca1 1ºAb and anti-FITC microbeads 2ºAb |
| AutoMACS running buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| MiniMACS separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| Blue chux pads | Fisher | 276-12424 | |
| Absorbent pads | Fisher | 19-165-621 | |
| Styrofoam board | Use from 50 ml tubes | ||
| 70% ethanol | |||
| Isoflurane | Any vendor | ||
| Rat IgG2a Alexa Fluor 647 | Invitrogen | R2a21 | |
| Rat IgG2a anti-mouse Sca1 Alexa Fluor 647 | Invitrogen | MSCA21 | |
| Rat IgG2a R-PE | Invitrogen | R2a04 | |
| Rat IgG2a anti-mouse F4/80 R-PE | Invitrogen | MF48004 | |
| Round-bottom tube | BD Falcon | 352058 | |
| HBSS (–Ca, –Mg) | Gibco | 14175-095 | |
| HBSS (+Ca, +Mg) | Gibco | 14025-092 | For collagenase solution |
| Type I collagen (2.7 mg/ml in 37mm acetic acid | Prepare in house12 | ||
| 10x MEM | Gibco | 11430-030 | |
| 1 M HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| 0.34 N NaOH | Prepare in house | ||
| Cover slips | Corning | 2870-22 | |
| Alexa Fluor 594 carboxylic acid, succinimidyl ester, mixed isomers | Invitrogen | A-20004 | |
| 0.89 M NaHCO3 | Gibco | 25080-094 |
References
- Chun, T. H., et al. A pericellular collagenase directs the 3-dimensional development of white adipose tissue. Cell. 125 (3), 577-591 (2006).
- Chun, T. H., et al. Genetic link between obesity and MMP14-dependent adipogenic collagen turnover. Diabetes. 59 (10), 2484-2494 (2010).
- Chun, T. H. Peri-adipocyte ECM remodeling in obesity and adipose tissue fibrosis. Adipocyte. 1 (2), 89-95 (2012).
- Sun, K., Tordjman, J., Clement, K., Scherer, P. E. Fibrosis and adipose tissue dysfunction. Cell Metab. 18 (4), 470-477 (2013).
- Spangrude, G., Heimfeld, S., Weissman, I. Purification and Characterization of Mouse Hematopoietic Stem Cells. Science. 241, 58-62 (1988).
- Welm, B. E., et al. Sca-1(pos) cells in the mouse mammary gland represent an enriched progenitor cell population. Dev Biol. 245 (1), 42-56 (2002).
- Gesta, S., Tseng, Y. H., Kahn, C. R. Developmental origin of fat: tracking obesity to its source. Cell. 131 (2), 242-256 (2007).
- Tang, W., Zeve, D., Suh, J. M., Bosnakovski, D., Kyba, M., Hammer, R. E., Tallquist, M. D., Graff, J. M. White fat progenitor cells reside in the adipose vasculature. Science. 322, 583-586 (2008).
- Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo. Cell. 135 (2), 240-249 (2008).
- Tokunaga, M., et al. Fat depot-specific gene signature and ECM remodeling of Sca1(high) adipose-derived stem cells. Matrix Biol. 36, 28-38 (2014).
- Chun, T. H., Inoue, M. 3-D adipocyte differentiation and peri-adipocyte collagen turnover. Methods Enzymol. 538, 15-34 (2014).
- Rajan, N., Habermehl, J., Cote, M. F., Doillon, C. J., Mantovani, D. Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications. Nat Protoc. 1 (6), 2753-2758 (2006).
- Ma, X., Robin, C., Ottersbach, K., Dzierzak, E. The Ly-6A (Sca-1) GFP Transgene is Expressed in all Adult Mouse Hematopoietic Stem Cells. Stem Cells. 20 (6), 514-521 (2002).
- Berry, R., Rodeheffer, M. S. Characterization of the adipocyte cellular lineage in vivo. Nat Cell Biol. 15 (3), 302-308 (2013).
- Jeffery, E., Church, C. D., Holtrup, B., Colman, L., Rodeheffer, M. S. Rapid depot-specific activation of adipocyte precursor cells at the onset of obesity. Nat Cell Biol. 17 (4), 376-385 (2015).
- Mori, S., Kiuchi, S., Ouchi, A., Hase, T., Murase, T. Characteristic Expression of Extracellular Matrix in Subcutaneous Adipose Tissue Development and Adipogenesis; Comparison with Visceral Adipose Tissue. Int J Biol Sci. 10 (8), 825-833 (2014).
- Ong, W. K., et al. Identification of Specific Cell-Surface Markers of Adipose-Derived Stem Cells from Subcutaneous and Visceral Fat Depots. Stem Cell Reports. 2 (2), 171-179 (2014).
