Introduction
干细胞抗原-1（SCA1，或Ly6A / E）最初被鉴定为通过造血细胞和间质干细胞5,6-表达的细胞表面标记。从小鼠脂肪库获得脂肪组织的基质血管级分（SVF）为含有成纤维细胞，巨噬细胞，血管内皮细胞，神经细胞，以及脂肪细胞祖细胞7的细胞的异质群体。脂肪细胞祖细胞，或脂肪干细胞（ASCs）是驻留在富含胶原蛋白的血管周围的细胞外基质（ECM）8非载脂细胞。大约SVF的50％由携带者，其特点为谱系阴性（林- ）和CD29 +：CD34 +：SCA1 + 9。大多数这些细胞是SCA1 +：CD24 -脂肪细胞祖细胞，其能够在体外脂肪细胞分化的;然而，只有细胞的级分（SVF的0.08％）构成SCA1
在肥胖和糖尿病，组织纤维化和炎症的领域发挥在2型糖尿病3的开发和维护的关键作用。最近，德永等人 。表明，腹股沟（或皮下，SQ）和perigonadal（或内脏，VIS）隔离SCA1 高细胞C57BL6 / J脂肪库表现出体外 10个不同的基因签名和ECM重塑。 MMP14（MT1-MMP），膜 - t的典型构件YPE基质金属蛋白酶（MMP）家族通过其原活性1介导的白色脂肪组织（WAT）的开发。
可与分离和富集通过以下方案中的细胞进行的实验的例子包括三维培养，分化研究，胶原降解测定法，和RNA测序10,11。降解测定法应与酸提取胶原进行，以确保端肽11,12的保存。下面的协议将演示方法主要血管基质细胞从不同的脂肪库分离和使用免疫细胞分离脂肪细胞丰富的祖细胞。在细胞分选的有效性将用流式细胞仪，并通过使用SCA1-GFP小鼠表达SCA1 +细胞GFP，由SCA1启动子驱动13进行评估。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
伦理学声明：密歇根委员会对动物的使用和注意事项大学（UCUCA）已批准按照指南实验动物的护理和使用（学院实验动物研究，国家研究理事会）的所有方法和协议。小鼠均保持在密歇根大学的动物饲养，并给予食物和水自由进入并保持在12小时黑暗/光照周期。
1.准备
- 制备原代培养介质用DMEM，10％FBS，1×P / S / G，和1x抗生素/抗真菌剂。这将被用来保持组织中之前消化。将股票和分装在37ºC水浴。
- 制备的III型胶原酶溶液5毫升在5毫克/毫升溶于HBSS（+钙+镁）为每种类型的脂肪垫的被隔离，最多5只小鼠。例如，从一个单一的基因型分离SQ和可见光时，使10毫升，如果野生型和突变型的SQ和可见光，使20毫升调节pH值至7.4，STE激怒过滤器。分装成50ml试管。从光一边远位置。
- 使用70％的乙醇消毒手术区域。擦拭，并用蓝色的垫覆盖。喷上蓝色垫些乙醇。
- 使用22克针牵制的吸水垫的保丽龙板，并用剪刀修剪。喷雾用乙醇垫然后设置蓝色垫板并与另一个蓝色垫，直到开始清扫覆盖。
- 填充两个50ml试管用乙醇和发生在邻近于外科领域的立场。放置在乙醇剪刀和镊子。
- 填另一50ml管中，用PBS加1×防反冲洗乙醇关闭手术工具。
- 在油烟机，标签60毫米菜肴每个组织类型，并填写与文化传媒加热到37ºC。放置邻近于手术区板。
2.皮下（SQ）脂肪垫的分离
- 安乐死鼠标异氟醚和气胸过量。
- 平缓鼠标喷用70％乙醇打下平卧。针脚的爪子泡沫板与22克针。
- 使下腹部皮肤的一小截。拿着切的顶部，镊子，拿剪刀和皮肤腹膜分开。
- 一旦皮肤是从腹部到胸部的腹膜分离，通过在沿所述主体的一侧的皮肤侧向切口反映皮肤从朝向头部腹膜程。
- 反映剩余的皮肤保持腹股沟的脂肪远离身体和牵制到板22克针。
- 切换到精细剪刀和镊子。抓住用钳子腹股沟脂肪垫在腹膜附近的起源和剪断掉皮肤和脂肪腹股沟向腹股沟避免污染皮肤的SQ进展之间。
- 放置曝晒腹股沟脂肪垫在标有60mm培养皿。
3.内脏（VIS）脂肪垫的分离
- 以类似的方式执行步骤2.5，切开腹膜打开以暴露内脏脂肪垫和肠道。
- 移动肠道远朝胸部。
- 抓住VIS脂肪垫在远端，轻轻往上拉。解剖出VIS脂肪垫，同时注意排除附睾（或子宫，如果使用雌性小鼠）组织。
- 发生在标盘，并重复步骤3.3为剩余的VIS垫。
4.脂肪垫的胶原酶消化
- 移动60毫米菜的组织培养罩，吸了媒体。
- 剁碎脂肪垫用弯剪，然后添加到胶原酶溶液。请务必用乙醇和PBS冲洗剪刀和镊子组织类型之间。
- 在300rpm和37ºC10-20分钟摇动直至组织被消化。如果SQ的一些作品仍然可见这是可以接受的。这将在以后的步骤来解决。
- 25毫升培养基添加到胶原酶溶液以停止collagenase治疗和吸管上下10次，10毫升血清吸管驱散消化的组织。
- 使用100微米的细胞滤网株细胞。离心机在300×g下10分钟。
- 小心倒出了媒体不要打扰颗粒和5毫升无菌水添加到颗粒，轻轻吸暂停细胞。等待2分钟，以溶解红细胞。
- 通过一个新的100微米的细胞滤网加入25毫升含10％FBS和应变细胞介质。
- 离心机在300×g下10分钟。倒出培养基，并在1ml培养基重悬沉淀。
- 计数使用1血球细胞：1台盼蓝。
- 板1×10 6个细胞在一个阱上的6孔板中。
5.磁性细胞分离
- 约4至6小时细胞粘附后，冲洗细胞两次用HBSS（-Ca，-Mg）。分离使用0.05％胰蛋白酶粘附细胞。稀释胰蛋白酶细胞悬浮于1ml分离缓冲液和自旋为5分钟，在300×g的。
- 吸上清。悬浮细胞于500μl缓冲液中。删除10微升等分试样并使用血球计数细胞。
- 自旋细胞在300×g下5分钟。
- 吸完全上清。悬浮细胞在90微升缓冲液中。添加10微升抗SCA1-FITC初级抗体。拌匀并在黑暗中在4ºC孵育10分钟。
- 洗涤细胞用1毫升缓冲液中，离心细胞，在300×g下5分钟。完全取出上清液。
- 悬浮细胞在80μl的缓冲液中。加入20微升抗FITC微珠。拌匀并在黑暗中在4ºC孵育15分钟。
- 洗涤细胞用1毫升缓冲液中，离心细胞，在300×g下5分钟。
- 在500微升缓冲液中取出上清，重新悬浮颗粒。
- 放置列在磁性支架并用500μl缓冲液冲洗柱。
- 细胞悬液添加到列。避免气泡而吹打。
- 收集未标记SCA1 - </ SUP>细胞并用500μl的缓冲液洗涤柱3次。只有增加新的缓冲区时，水库是空的。避免气泡而吹打。
- 从磁性支架上取下柱并放入15毫升锥形管中。
- 加入1ml通过柱水库推柱塞提供缓冲柱和洗脱SCA1 +。
- 降速细胞组分在300×克5分钟。重悬细胞于1ml培养基中。
- 除去来自标记的和未标记的级分10微升等分试样并使用血球计数细胞。
- 板1以及一个6孔板的每一个单元级分。
6.流式细胞仪SCA1 高 ACSs中的免疫磁珠分离的验证
- 冲洗细胞两次用HBSS（-Ca，-Mg），并解离用0.05％胰蛋白酶的细胞。
- 离心细胞，在300×g离心5分钟。重悬细胞于1ml培养基和计数使用血球。
- 获得“10 6
- 除去上清液，并重复步骤6.3两次。
- 悬浮细胞用1毫升2％山羊血清的+ 2％BSA中并在室温30分钟块。
- 离心细胞，在300×g离心5分钟。
- 除去封闭液。
- 添加大鼠IgG2a的Alexa Fluor 647（0.25微克，1：400）或抗SCA1的Alexa Fluor 647（0.25微克，1：400），在100μlPBS中，用2％山羊血清和2％BSA + PBS在4℃下在黑暗中30分钟。
- 1毫升冷PBS加入细胞。离心机300 xg离心在4℃下5分钟。
- 除去上清液，并重复步骤6.9两次。
- 重悬细胞于1ml PBS中。通过100微米的细胞过滤细胞悬浮液中进行流式细胞术分析制剂。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
从不同的脂肪垫SCA1 高的ASC的富集。
从SQ脂肪显示成纤维样分离出来的血管间质细胞，拉伸细胞形态，无论SCA1表达水平（ 图1A）。另一方面，VIS（eWAT衍生）SCA1 高和SCA1 低细胞证明其细胞形态明显的差异。像SQ（iWAT衍生）SCA1 高细胞，VIS（eWAT衍生）SCA1 高细胞显示拉伸，成纤维细胞样细胞形态，而VIS SCA1 低细胞表现出上皮样的形状。从SCA1-GFP小鼠分离SCA1 高细胞很容易识别为在组织培养中（ 图1B）的GFP阳性细胞。当这些细胞用流式细胞仪检测，大部分GFP阳性细胞被证实表达细胞表面上SCA1蛋白与一种检测到的TI-SCA1抗体（ 图1C）。从腹股沟脂肪垫来源的SCA1 高细胞维持增加脂肪细胞分化的能力而eWAT衍生SCA1 高细胞更难分化成与常规的脂肪形成混合10脂肪细胞。
SCA1 高携带者的脂肪库相关的基因表达（ 图2）。
全基因组转录与RNA测序分析表明与细胞外基质蛋白和基因修饰的富集（GO：0031012，GO：0005578），在那些高 SCA1 10携带者。再加上实时PCR分析，我们能够证明胶原溶解基质金属蛋白酶（MMP2，MMP8，MMP13，MMP14）iWAT-之间eWAT衍生SCA1 高的ASC的差异表达。当荧光标记的I型胶原凝胶被用来吨 o评估细胞外降解活性，我们观察到VIS SCA1 高的ASC 10所介导的显着增加胶原重塑活动。
图1： 从不同的脂肪库 小鼠SCA1 高 携带者 的免疫磁珠分离 （A）SCA1 高和低 SCA1从携带者SQ（iWAT）及VIS（eWAT）隔离。比例= 100微米。 （B）选自的Sca-GFP小鼠的iWAT分离SCA1-GFP细胞。比例= 100微米。在具有流量评估流式细胞SCA1-GFP阳性细胞SCA1（C）的细胞表面表达。 （左）控制大鼠IgG（右）抗SCA1抗体。 X轴，GFP强度。 Y轴的Alexa-氟647.面板A中德永，M。 等人先前所示，（2014）。ig1large.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。
图2：节能措施的胶原溶解蛋白酶抑制物和胶原蛋白的脂肪库依赖性表达 （A）基因表达差异和ECM修饰符SCA1 高携带者从不同的脂肪库中分离。 （ 二 ）增加VIS胶原降解活性（eWAT衍生）SCA1 高携带者。胶原蛋白的降解显示为荧光信号（箭头和箭头）的消失。插图是由SQ的ASC的个别细胞介导的聚焦胶原降解的放大图像。细胞72小时中培养。在德永，M 等人以前显示的数据。（2014）。 请点击此处到vIEW这个数字的放大版本。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
在此，我们展示了隔离，并从不同的脂肪垫鼠携带者的免疫细胞分离和体外实验。所提出的方法是有效的的大量SCA1阳性的ASC的，这是过度的ASC 9,14的技术复杂和昂贵的FACS介导的隔离有利的快速隔离。不像FACS，免疫细胞分离不允许靶细胞群体的鉴定使用多个抗原。然而，如果表面抗原表征良好，利用免疫磁性分离的增加不依赖于使用的FACS设备15，其仍然不小院所许多生物学研究人员容易获得没有核心设施待分析细胞的数量。
有迹象表明，必须遵守，以确保成功的结果的过程的某些关键方面。 ADIP采购OSE来源的干细胞，需要小鼠脂肪组织库的手术隔离。因此，组织检索的速度和精度是势在必行，得到大量的活菌。此外，清洁外科领域和仪器的维护是对程序的通过防止细胞和组织样品的微生物污染的结果是至关重要的。解剖脂肪组织必须在II型胶原酶溶液进行酶促解离。 ECM成分SQ和VIS脂肪垫10,16，其中VIS含有比SQ少胶原蛋白是不同的。因此，可见脂肪垫消化的持续时间需要大约一半的SQ的时间量。它是可以接受的规定的潜伏期后，停止组织消化即使组织的小颗粒仍然存在于胶原酶溶液。这些部件可以与吸液进行机械解离一次培养基已被添加到抑制胶原酶活性。而能够继续进行直接免疫排序如下SVF隔离，我们组的种子在塑料板1×10 6无序细胞约4至6小时与细胞分选，然后再继续。尽管SVF隔离期间多次过滤步骤，碎片仍然会在细胞悬液中存在。在进行免疫细胞分离之前电镀细胞提供了一个机会来洗碎片和未附着的细胞远，从而允许磁性分选，以只应用于包含脂肪生成祖细胞的贴壁细胞。
而在人类基因组中没有找到SCA1，识别和对脂肪库依赖性人脂肪干细胞17，当与该细胞分离技术耦合表示替代的细胞表面抗原的验证，可以帮助我们定义人脂肪干细胞的生物学。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者什么都没有透露。
Acknowledgments
这项工作是由美国国立卫生研究院DK095137（THC到）的支持。我们感谢现任和前任实验室成员是谁所描述的方法的发展和成熟作出了贡献。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Type 3 Collagenase | Worthington Biochemical | LS004182 | Tissue digestion |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | High-glucose culture medium |
| Pen/Strep/Glutamine (100x) | Gibco | 10378-016 | Media antibiotic |
| Anti-anti (100x) | Gibco | 15240-062 | Media antifungal |
| FBS | Gibco | 16000-044 | |
| PBS (1x, pH 7.4) | Gibco | 10010-023 | |
| Trypsin (0.05%) | Gibco | 25300-054 | |
| Cell strainer | BD Bioscience | 352360 | 100-μm cell strainer |
| 60 mm plates | BD Falcon | 353004 | |
| Scissors | FST | 14001-12 | Large |
| Scissors | FST | 14091-11 | Fine, curved tip |
| Large Forceps | FST | 11000-12 | |
| Fine Forceps | Any vendor | ||
| 25G 5/8” needles | BD | 305122 | |
| 22G 1.5” needles | BD | 305159 | |
| 15 ml conical tubes | BD Falcon | 352097 | |
| 50 ml conical tubes | BD Falcon | 352098 | |
| MACS separation columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Anti-Sca1 microbead kit (FITC) | Miltenyi Biotec | 130-092-529 | FITC-anti-Sca1 1ºAb and anti-FITC microbeads 2ºAb |
| AutoMACS running buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| MiniMACS separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| Blue chux pads | Fisher | 276-12424 | |
| Absorbent pads | Fisher | 19-165-621 | |
| Styrofoam board | Use from 50 ml tubes | ||
| 70% ethanol | |||
| Isoflurane | Any vendor | ||
| Rat IgG2a Alexa Fluor 647 | Invitrogen | R2a21 | |
| Rat IgG2a anti-mouse Sca1 Alexa Fluor 647 | Invitrogen | MSCA21 | |
| Rat IgG2a R-PE | Invitrogen | R2a04 | |
| Rat IgG2a anti-mouse F4/80 R-PE | Invitrogen | MF48004 | |
| Round-bottom tube | BD Falcon | 352058 | |
| HBSS (–Ca, –Mg) | Gibco | 14175-095 | |
| HBSS (+Ca, +Mg) | Gibco | 14025-092 | For collagenase solution |
| Type I collagen (2.7 mg/ml in 37mm acetic acid | Prepare in house12 | ||
| 10x MEM | Gibco | 11430-030 | |
| 1 M HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| 0.34 N NaOH | Prepare in house | ||
| Cover slips | Corning | 2870-22 | |
| Alexa Fluor 594 carboxylic acid, succinimidyl ester, mixed isomers | Invitrogen | A-20004 | |
| 0.89 M NaHCO3 | Gibco | 25080-094 |
References
- Chun, T. H., et al. A pericellular collagenase directs the 3-dimensional development of white adipose tissue. Cell. 125 (3), 577-591 (2006).
- Chun, T. H., et al. Genetic link between obesity and MMP14-dependent adipogenic collagen turnover. Diabetes. 59 (10), 2484-2494 (2010).
- Chun, T. H. Peri-adipocyte ECM remodeling in obesity and adipose tissue fibrosis. Adipocyte. 1 (2), 89-95 (2012).
- Sun, K., Tordjman, J., Clement, K., Scherer, P. E. Fibrosis and adipose tissue dysfunction. Cell Metab. 18 (4), 470-477 (2013).
- Spangrude, G., Heimfeld, S., Weissman, I. Purification and Characterization of Mouse Hematopoietic Stem Cells. Science. 241, 58-62 (1988).
- Welm, B. E., et al. Sca-1(pos) cells in the mouse mammary gland represent an enriched progenitor cell population. Dev Biol. 245 (1), 42-56 (2002).
- Gesta, S., Tseng, Y. H., Kahn, C. R. Developmental origin of fat: tracking obesity to its source. Cell. 131 (2), 242-256 (2007).
- Tang, W., Zeve, D., Suh, J. M., Bosnakovski, D., Kyba, M., Hammer, R. E., Tallquist, M. D., Graff, J. M. White fat progenitor cells reside in the adipose vasculature. Science. 322, 583-586 (2008).
- Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo. Cell. 135 (2), 240-249 (2008).
- Tokunaga, M., et al. Fat depot-specific gene signature and ECM remodeling of Sca1(high) adipose-derived stem cells. Matrix Biol. 36, 28-38 (2014).
- Chun, T. H., Inoue, M. 3-D adipocyte differentiation and peri-adipocyte collagen turnover. Methods Enzymol. 538, 15-34 (2014).
- Rajan, N., Habermehl, J., Cote, M. F., Doillon, C. J., Mantovani, D. Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications. Nat Protoc. 1 (6), 2753-2758 (2006).
- Ma, X., Robin, C., Ottersbach, K., Dzierzak, E. The Ly-6A (Sca-1) GFP Transgene is Expressed in all Adult Mouse Hematopoietic Stem Cells. Stem Cells. 20 (6), 514-521 (2002).
- Berry, R., Rodeheffer, M. S. Characterization of the adipocyte cellular lineage in vivo. Nat Cell Biol. 15 (3), 302-308 (2013).
- Jeffery, E., Church, C. D., Holtrup, B., Colman, L., Rodeheffer, M. S. Rapid depot-specific activation of adipocyte precursor cells at the onset of obesity. Nat Cell Biol. 17 (4), 376-385 (2015).
- Mori, S., Kiuchi, S., Ouchi, A., Hase, T., Murase, T. Characteristic Expression of Extracellular Matrix in Subcutaneous Adipose Tissue Development and Adipogenesis; Comparison with Visceral Adipose Tissue. Int J Biol Sci. 10 (8), 825-833 (2014).
- Ong, W. K., et al. Identification of Specific Cell-Surface Markers of Adipose-Derived Stem Cells from Subcutaneous and Visceral Fat Depots. Stem Cell Reports. 2 (2), 171-179 (2014).
