Introduction
Staminali antigene cella 1 (Sca1, o Ly6A / E) per la prima volta identificata come un marcatore di superficie cellulare espressa da ematopoietiche e mesenchimali staminali cellule 5,6. La frazione vascolare stromale (SVF) di tessuto adiposo ottenuto da depositi di grasso del mouse è una popolazione eterogenea di cellule che compongono dei fibroblasti, macrofagi, cellule endoteliali vascolari, cellule neuronali e cellule progenitrici degli adipociti 7. Cellule progenitrici degli adipociti, o le cellule staminali derivate da tessuto adiposo (CSA) sono cellule non carichi di lipidi che si trovano nella matrice extracellulare perivascolare ricchi di collagene (ECM) 8. Circa il 50% della SVF costituiti da ASC, caratterizzati come lineage-negative (Lin -) e CD29 +: CD34 +: Sca1 + 9. La maggior parte di queste cellule sono Sca1 +: CD24 - progenitori adipociti, che sono capaci di adipociti differenziazione in vitro; Tuttavia, solo una frazione di cellule (0,08% del SVF) costituisce Sca1
Nel campo di obesità e diabete, fibrosi dei tessuti e l'infiammazione gioca un ruolo fondamentale nello sviluppo e nella manutenzione del diabete di tipo-2 3. Recentemente, Tokunaga et al. hanno dimostrato che le cellule di alta SCA1 isolate da inguinale (o sottocutanea, SQ) e perigonadal (o viscerale, VIS) depositi di grasso C57BL6 / J mostrano diverse firme genetiche e ECM rimodellamento in vitro 10. MMP14 (MT1-MMP), un membro prototipico della membrana-tmatrix ipo metalloproteinasi (MMP) famiglia media lo sviluppo di tessuto adiposo bianco (WAT), attraverso la sua attività collagenolitica 1.
Esempi di esperimenti che possono essere eseguite con le cellule isolate e arricchite attraverso il seguente protocollo includono cultura tridimensionale, studi di differenziazione, saggi di degradazione del collagene, e RNA sequenziamento 10,11. Test di degradazione devono essere condotte con il collagene acido estratto per garantire la conservazione di telopeptide 11,12. Il seguente protocollo dimostrerà i metodi per isolare le cellule stromali vascolari primarie da diversi depositi di grasso e di arricchire le cellule progenitrici degli adipociti utilizzando separazione immunomagnetica. La validità della separazione delle cellule sarà valutata con la citometria a flusso e attraverso l'utilizzo di topi Sca1-GFP che esprimono GFP in Sca1 + cellule, guidata da un promotore Sca1 13.
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Protocol
Etica Dichiarazione: L'Università del Michigan Comitato Uso e manutenzione degli animali (UCUCA) ha approvato tutti i metodi ei protocolli in conformità con la guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio (Institute for Research Laboratory Animal, Consiglio Nazionale delle Ricerche). I topi sono mantenuti in una Università del Michigan Vivarium e sono dati il libero accesso a cibo e acqua e tenuti al / ciclo di luce 12 ore scuro.
1. preparati
- Preparare terreni di coltura primaria con DMEM, 10% FBS, 1x P / S / G, e 1x antibiotici / antimicotici. Questo verrà utilizzato per mantenere i tessuti nella digestione prima. Mettere magazzino e aliquota in 37 ° C bagnomaria.
- Preparare cinque millilitri di Tipo III soluzione di collagenasi a 5 mg / ml sciolti in HBSS (+ Ca, Mg +) per ciascun tipo di cuscinetto adiposo essere isolati, fino a cinque topi. Per esempio, quando isolando SQ e VIS da un singolo genotipo, fare 10 ml, se wild-type e mutante SQ e VIS, fanno 20 ml. Regolare il pH a 7,4 e sterile filtro. Aliquota in provette da 50 ml. Mettere da parte al riparo dalla luce.
- Utilizzare il 70% di etanolo per disinfettare campo chirurgico. Pulire e coprire con un tampone blu. Spruzzare un po 'di etanolo sul pad blu.
- Utilizzare i 22 aghi G da definire un tampone assorbente alla scheda di polistirolo e tagliare con le forbici. Spruzzare il pad con etanolo quindi impostare la scheda sul pad blu e coprire con un altro pad blu fino al inizio dissezione.
- Riempire due provette da 50 ml con etanolo e posto in una posizione adiacente al campo chirurgico. Mettere le forbici e pinze in etanolo.
- Riempire un altro tubo da 50 ml con PBS 1x più anti-anti per il risciacquo etanolo off strumenti chirurgici.
- Nel cofano, etichetta di 60 piatti mm per ogni tipo di tessuto e riempire con terreni di coltura riscaldato a 37 ° C. Posizionare le piastre adiacenti alla zona chirurgica.
2. Isolamento di sottocutanea (SQ) Fat Pads
- Euthanize mouse con una dose eccessiva di isoflurano e pneumotorace.
- Delicatamentespruzzare il mouse con il 70% di etanolo e laici in posizione supina. Pin le zampe al bordo della gomma piuma con 22 aghi G.
- Fare un piccolo taglio nella pelle del basso addome. Tenendo la parte superiore del taglio con le pinze, prendere le forbici e separare la pelle dal peritoneo.
- Una volta che la pelle è separato dal peritoneo dall'addome al torace, riflettere la pelle lontano dal peritoneo verso la testa mediante tagli laterali nella pelle lungo il lato del corpo.
- Riflettere il restante pelle tiene il grasso inguinale lontano dal corpo e definire con precisione alla scheda con 22 aghi G.
- Passare a forbici sottili e pinze. Afferra il cuscinetto adiposo inguinale con la pinza all'origine vicino al peritoneo e tagliare via tra la pelle e il grasso inguinale progredendo verso l'inguine evitando di contaminare il SQ con la pelle.
- Posizionare il cuscinetto adiposo inguinale insolated in mm piatto etichettato 60.
3. Isolamento di Visceral (VIS) cuscinetti di grasso
- In modo simile al punto 2.5, tagliare il peritoneo aperto per esporre il viscerale cuscinetti adiposi e intestino.
- Spostare l'intestino via verso il torace.
- Afferra il cuscinetto adiposo VIS alla fine distale e delicatamente tirare su. Sezionare il cuscinetto adiposo VIS facendo attenzione ad escludere dell'epididimo (o uterina, se si utilizza topi di sesso femminile) dei tessuti.
- Posto nel piatto etichettati e ripetere il punto 3.3 per il pad VIS rimanente.
4. Collagenasi digestione dei grassi Pad
- Spostare 60 mm piatti alla cappa coltura tissutale e aspirare fuori media.
- Tritare i cuscinetti adiposi con forbici curve poi aggiungere alla soluzione di collagenasi. Assicuratevi di risciacquare le forbici e pinze tra tipi di tessuto con etanolo e PBS.
- Agitare a 300 rpm e 37 ° C per 10-20 minuti fino a quando i tessuti vengono digeriti. È accettabile se alcuni pezzi di SQ sono ancora visibili. Questo problema verrà affrontato in un passaggio successivo.
- Aggiungere 25 ml di terreni di coltura per la soluzione di collagenasi per fermare la collagtrattamento enase, e pipetta su e giù per 10 volte con una pipetta 10 ml sierologica per disperdere i tessuti digeriti.
- cellule Strain usando un colino cella di 100 micron. Centrifugare per 10 min a 300 x g.
- decantare con cautela media non disturbare il pellet e aggiungere 5 ml di acqua sterile per il pellet e delicatamente pipetta di sospendere le cellule. Attendere 2 minuti per la lisi degli eritrociti.
- Aggiungere 25 ml di media con cellule FBS e di deformazione del 10% attraverso un nuovo colino cella 100 micron.
- Centrifugare per 10 min a 300 x g. mezzi decantare e risospendere pellet in 1 ml di terreni di coltura.
- Contare le cellule con un emocitometro utilizzando 1: 1 trypan blu.
- Piastra 1 x 10 6 cellule in un bene su un 6-pozzetti.
5. separazione cellulare magnetica
- Dopo circa 4 a 6 ore di adesione cellulare, lavare le cellule due volte con HBSS (-Ca, -Mg). Dissociarsi cellule aderenti con 0,05% tripsina. Diluire sospensione cellulare tripsina in tampone di separazione 1 ml e girare per5 min a 300 x g.
- Aspirare il surnatante. Risospendere le cellule in 500 microlitri di buffer. Rimuovere una aliquota di 10 microlitri e contare le cellule utilizzando un emocitometro.
- cellule Spin per 5 min a 300 x g.
- Aspirare il surnatante completamente. Risospendere le cellule in 90 microlitri di buffer. Aggiungere 10 microlitri anticorpo primario anti-Sca1-FITC. Mescolare bene e incubare per 10 minuti a 4 ° C al buio.
- Lavare le cellule con 1 ml di tampone e celle di centrifugazione per 5 min a 300 x g. Rimuovere completamente il surnatante.
- Risospendere le cellule in 80 microlitri di buffer. Aggiungere 20 microsfere anti-FITC microlitri. Mescolare bene e incubare per 15 min a 4 ° C al buio.
- Lavare le cellule con 1 ml di tampone e celle di centrifugazione per 5 min a 300 x g.
- Rimuovere il surnatante e risospendere pellet in 500 microlitri di buffer.
- Mettere colonna del supporto magnetico e risciacquare colonna con 500 microlitri di buffer.
- Aggiungere sospensione cellulare a colonna. Evitare bolle mentre pipettaggio.
- Raccogliere il Sca1 senza etichetta - </ Sup> cellule e lavare colonna 3 volte con 500 microlitri di buffer. Solo aggiungere nuovo buffer quando il serbatoio è vuoto. Evitare bolle mentre pipettaggio.
- Rimuovere colonna dal supporto magnetico e posto in un tubo da 15 ml.
- Aggiungere 1 ml di tampone a colonna ed eluire Sca1 + spingendo stantuffo fornito attraverso il serbatoio di colonna.
- Centrifugare frazioni cellulari per 5 min a 300 x g. Risospendere le cellule in terreni di coltura 1 ml.
- Rimuovere una aliquota di 10 microlitri dalle frazioni etichettati e senza etichetta e contare le cellule utilizzando un emocitometro.
- Piastra ogni frazione di cellule in 1 pozzetto di una piastra da 6 pozzetti.
6. Verifica di separazione immunomagnetica di Sca1 alta ACSS con citometria a flusso
- Lavare le cellule due volte con HBSS (-Ca, -Mg) e dissociare le cellule utilizzando 0,05% tripsina.
- cellule centrifugare a 300 xg per 5 min. Risospendere le cellule in terreni di coltura 1 ml e contare con un emocitometro.
- Ottenere> 10 6
- Rimuovere il surnatante e ripetere il punto 6.3 altre due volte.
- Risospendere le cellule con 1 ml di 2% siero di capra + 2% BSA e blocco per 30 minuti a RT.
- cellule centrifugare a 300 xg per 5 min.
- Rimuovere soluzione bloccante.
- Aggiungere topo IgG2a Alexa Fluor 647 (0,25 mg, 1: 400) o anti-Sca1 Alexa Fluor 647 (0,25 mg, 1: 400), in 100 ml di PBS con siero di capra 2% e il 2% BSA + PBS a 4 ° C per 30 minuti al buio.
- Aggiungere 1 ml di PBS freddo per le cellule. Centrifugare 300 xg per 5 minuti a 4 ° C.
- Rimuovere il surnatante e ripetere il punto 6.9 altre due volte.
- Risospendere le cellule in 1 ml di PBS. Passare sospensioni cellulari attraverso un colino cella di 100 micron di preparazione per l'analisi di citometria di flusso.
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Representative Results
Arricchimento di alte ASC SCA1 provenienti da diversi cuscinetti di grasso.
Le cellule stromali vascolari isolati dalla visualizzazione grasso SQ fibroblasti-like, allungato la forma delle cellule indipendentemente dal livello di espressione Sca1 (Figura 1A). D'altra parte, VIS (EWAT-derivati) SCA1 alta e bassa Sca1 cellule mostrano netta differenza nella loro forma cellulare. Come SQ (iWAT-derivati) di altezza cellule SCA1, VIS (EWAT-derivato) cellule di alta SCA1 visualizzano allungati, la forma delle cellule di fibroblasti-like, mentre VIS SCA1 cellule bassi dimostrano forma epitelioide. Alti cellule SCA1 isolate da topi SCA1-GFP sono facilmente identificabili come cellule GFP-positive in coltura tissutale (Figura 1B). Quando queste cellule sono state valutate con citometria a flusso, la maggior parte delle cellule GFP positive sono state confermate per esprimere le proteine SCA1 sulla superficie delle cellule, come rilevato con Ananticorpo ti-Sca1 (Figura 1C). Alti cellule SCA1 derivate da cuscinetto adiposo inguinale mantengono un aumento della capacità di differenziazione degli adipociti, mentre cellule di alta SCA1 EWAT-derivati sono più difficili da differenziare in adipociti con convenzionale miscela adipogenico 10.
Fat espressione genica Depot-dipendente di SCA1 alti ASC (Figura 2).
Trascrittoma livello di genoma analisi con l'RNA sequenziamento dimostrato l'arricchimento di geni legati alle proteine della matrice extracellulare e modificatori (GO: 0.031.012, GO: 0.005.578) in quelle alte ASCs SCA1 10. Accoppiato con real-time PCR analisi, siamo stati in grado di dimostrare l'espressione differenziale dei MMP collagenolitica (MMP2, MMP8, MMP13, MMP14) SCA1 tra iWAT- e EWAT di derivazione alti ASC. Quando marcato con fluoresceina collagene di tipo I gel sono stati usati t o valutare l'attività di degradazione pericellulare, abbiamo osservato il marcato aumento di attività rimodellamento del collagene mediata dal VIS SCA1 alte ASC 10.
Figura 1: Separazione immunomagnetica di Murine SCA1 alti ASC provenienti da diversi Fat Depositi (A) SCA1 alti e bassi SCA1 ASC isolati da SQ (iWAT) e il VIS (EWAT).. Scala = 100 micron. (B) le cellule Sca1-GFP isolati da iWAT di topi Sca-GFP. Scala = 100 micron. Superficie espressione (C) delle cellule di Sca1 nelle cellule Sca1-GFP-positive valutati con citometria a flusso. (A sinistra) il controllo ratto IgG (a destra) anticorpo anti-Sca1. Asse X, intensità GFP. Asse Y, Alexa-Fluor 647. Pannello A mostrato precedentemente in Tokunaga, M. et al., (2014).ig1large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2:. Espressione Fat Depot-dipendente di collagenolitica MMP, TIMP, e Collageni (A) gene differenziale espressione di ECM e modificatori ECM in SCA1 alti ASC isolate da diversi depositi di grasso. (B) L'aumento dell'attività di degradazione del collagene del VIS (EWAT-derivato) SCA1 ASC alti. La degradazione del collagene è mostrato come la scomparsa dei segnali fluorescenti (frecce e punte di freccia). Inserto è l'immagine ingrandita di degradazione del collagene focalizzata mediata da cellule individuali di ASC SQ. Le cellule sono state coltivate per 72 ore. I dati riportati in precedenza in Tokunaga, M. et al., (2014). Cliccate qui per view una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Qui dimostriamo l'isolamento e la separazione immunomagnetica cellule di ASC murine da diversi cuscinetti di grasso e il loro utilizzo per esperimenti in vitro. Il metodo presentato è efficace per la rapida isolamento di un gran numero di ASC SCA1-positivo, che è vantaggiosa sulla tecnicamente complessi e costosi isolamento FACS-mediata di ASC 9,14. Diversamente FACS, separazione immunomagnetica non consente l'uso di antigeni multipli per l'identificazione di una popolazione di cellule bersaglio. Tuttavia, se l'antigene di superficie è ben caratterizzata, l'uso della separazione immunomagnetica aumenta il numero di cellule da analizzare senza basarsi sull'uso delle attrezzature FACS 15, che non è ancora facilmente accessibile a molti ricercatori biologici durante piccola istituti senza servizi di base .
Ci sono alcuni aspetti critici della procedura che deve essere osservato per garantire un esito positivo. L'approvvigionamento di ADIPose-derivato cellule staminali richiede l'isolamento chirurgico di depositi di tessuto adiposo del mouse. Pertanto, la velocità e la precisione di recupero dei tessuti è indispensabile per produrre un elevato numero di cellule vitali. Inoltre, la manutenzione di campi chirurgici puliti e strumenti sono essenziali per l'esito della procedura impedendo la contaminazione microbica dei campioni di cellule e tessuti. tessuti adiposi sezionati devono essere enzimaticamente dissociati in una soluzione di collagenasi di tipo II. Composizione ECM varia tra SQ e cuscinetti di grasso VIS 10,16, dove VIS contengono meno collagene rispetto a SQ. Pertanto, la durata del VIS cuscinetto adiposo digestione richiede circa metà della quantità di tempo come SQ. È accettabile per fermare la digestione tessuto dopo il periodo di incubazione dichiarato anche se piccole particelle di tessuto sono ancora presenti nella soluzione di collagenasi. Questi pezzi possono essere dissociate meccanicamente con pipettaggio una volta terreni di coltura è stato aggiunto di inibire l'attività collagenasi. Mentre è possibile procederedirettamente a cernita immunomagnetica seguendo isolamento SVF, i nostri semi di gruppo 1 x 10 6 cellule non ordinati su piastre di plastica per circa 4-6 ore prima di continuare con l'ordinamento delle cellule. Nonostante più passaggi di filtrazione durante l'isolamento SVF, detriti sarà ancora presente all'interno della sospensione cellulare. Placcatura le cellule prima di procedere alla separazione delle cellule immunomagnetica offre l'opportunità di lavare i detriti e le cellule senza legami di distanza, consentendo in tal modo l'ordinamento magnetica da applicare solo alle cellule aderenti che contengono le cellule progenitrici adipogenici.
Mentre Sca1 non si trova nel genoma umano, l'individuazione e la convalida degli antigeni di superficie delle cellule alternativi espressi sulle cellule staminali adiposo umano depot-dipendente grassi 17, quando accoppiato con questa tecnica di separazione delle cellule, possono aiutare a definire la biologia delle cellule staminali adipose umane.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è sostenuto da NIH DK095137 (al THC). Ringraziamo i membri del laboratorio attuali ed ex che hanno contribuito allo sviluppo e alla sofisticazione dei metodi descritti.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Type 3 Collagenase | Worthington Biochemical | LS004182 | Tissue digestion |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | High-glucose culture medium |
| Pen/Strep/Glutamine (100x) | Gibco | 10378-016 | Media antibiotic |
| Anti-anti (100x) | Gibco | 15240-062 | Media antifungal |
| FBS | Gibco | 16000-044 | |
| PBS (1x, pH 7.4) | Gibco | 10010-023 | |
| Trypsin (0.05%) | Gibco | 25300-054 | |
| Cell strainer | BD Bioscience | 352360 | 100-μm cell strainer |
| 60 mm plates | BD Falcon | 353004 | |
| Scissors | FST | 14001-12 | Large |
| Scissors | FST | 14091-11 | Fine, curved tip |
| Large Forceps | FST | 11000-12 | |
| Fine Forceps | Any vendor | ||
| 25G 5/8” needles | BD | 305122 | |
| 22G 1.5” needles | BD | 305159 | |
| 15 ml conical tubes | BD Falcon | 352097 | |
| 50 ml conical tubes | BD Falcon | 352098 | |
| MACS separation columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Anti-Sca1 microbead kit (FITC) | Miltenyi Biotec | 130-092-529 | FITC-anti-Sca1 1ºAb and anti-FITC microbeads 2ºAb |
| AutoMACS running buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| MiniMACS separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| Blue chux pads | Fisher | 276-12424 | |
| Absorbent pads | Fisher | 19-165-621 | |
| Styrofoam board | Use from 50 ml tubes | ||
| 70% ethanol | |||
| Isoflurane | Any vendor | ||
| Rat IgG2a Alexa Fluor 647 | Invitrogen | R2a21 | |
| Rat IgG2a anti-mouse Sca1 Alexa Fluor 647 | Invitrogen | MSCA21 | |
| Rat IgG2a R-PE | Invitrogen | R2a04 | |
| Rat IgG2a anti-mouse F4/80 R-PE | Invitrogen | MF48004 | |
| Round-bottom tube | BD Falcon | 352058 | |
| HBSS (–Ca, –Mg) | Gibco | 14175-095 | |
| HBSS (+Ca, +Mg) | Gibco | 14025-092 | For collagenase solution |
| Type I collagen (2.7 mg/ml in 37mm acetic acid | Prepare in house12 | ||
| 10x MEM | Gibco | 11430-030 | |
| 1 M HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| 0.34 N NaOH | Prepare in house | ||
| Cover slips | Corning | 2870-22 | |
| Alexa Fluor 594 carboxylic acid, succinimidyl ester, mixed isomers | Invitrogen | A-20004 | |
| 0.89 M NaHCO3 | Gibco | 25080-094 |
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