Introduction
Antígeno de células 1 (Sca1, o Ly6A / E) del tallo fue identificado por primera vez como un marcador de superficie celular expresada por hematopoyéticas y mesenquimales células 5,6. La fracción vascular del estroma (SVF) de tejido adiposo obtenido de los depósitos de grasa del ratón es una población heterogénea de células que comprenden de fibroblastos, macrófagos, células endoteliales vasculares, células neuronales y células progenitoras de los adipocitos 7. Las células progenitoras de los adipocitos o células madre derivadas de tejido adiposo (ASC) son células no cargadas de lípidos que residen en la matriz extracelular rica en colágeno perivascular (ECM) 8. Aproximadamente el 50% de la SVF constan de ASC, que se caracterizan como linaje negativo (Lin -) y CD29 +: CD34 +: Sca1 + 9. La mayoría de estas células se Sca1 +: CD24 - progenitores de adipocitos, que son capaces de diferenciación de adipocitos in vitro; sin embargo, sólo una fracción de células (0,08% de SVF) constituye Sca1
En el campo de la obesidad y la diabetes, fibrosis tisular y la inflamación juega un papel crítico en el desarrollo y mantenimiento de la diabetes de tipo 2 3. Recientemente, Tokunaga et al. mostraron que las células aisladas de alto Sca1 inguinal (o subcutánea, SQ) y perigonadal (o visceral, VIS) los depósitos de grasa C57BL6 / J exhiben diferentes firmas de genes y la remodelación de ECM in vitro 10. MMP14 (MT1-MMP), un miembro prototípico de la membrana-tmetaloproteinasa de matriz ipo (MMP) de la familia media en el desarrollo del tejido adiposo blanco (WAT) a través de su actividad colagenolítica 1.
Los ejemplos de experimentos que pueden llevarse a cabo con las células aisladas y enriquecidas a través de la siguiente protocolo incluyen cultivo en tres dimensiones, los estudios de diferenciación, los ensayos de degradación de colágeno, y la secuenciación de ARN 10,11. Ensayos de degradación deben llevarse a cabo con el colágeno extraído con ácido para asegurar la preservación de telopéptido 11,12. El siguiente protocolo demostrará los métodos para aislar células del estroma vascular primarias de diferentes depósitos de grasa y enriquecer las células progenitoras de los adipocitos mediante separación celular inmunomagnética. La validez de la clasificación de células se evaluó con citometría de flujo y mediante el uso de ratones Sca1-GFP que expresan GFP en células Sca1 +, dirigido por un promotor Sca1 13.
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Protocol
Declaración de Ética: La Universidad de Michigan, el Comité de Uso y Cuidado de los Animales (UCUCA) ha aprobado todos los métodos y protocolos, de conformidad con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (Instituto para la Investigación de Animales de Laboratorio, Consejo Superior de Investigaciones Científicas). Los ratones se mantienen en un vivero Universidad de Michigan y se les da acceso libre a comida y agua y se mantuvieron en un ciclo de 12 horas de oscuridad / luz.
1. Preparativos
- Preparar medios de cultivo primario con DMEM, 10% de FBS, 1 x P / S / G, y 1x antibióticos / antimicóticos. Esto se utiliza para mantener los tejidos en la digestión antes. Coloque el almacén, la alícuota en baño de agua 37 ºC.
- Preparar cinco mililitros de solución de colagenasa de tipo III en 5 mg / ml disueltos en HBSS (+ Ca, Mg +) para cada tipo de almohadilla de grasa que se aislaron, hasta cinco ratones. Por ejemplo, cuando se aísla SQ y VIS de un solo genotipo, hacer 10 ml, si es de tipo salvaje y mutante SQ y el VIS, hacen 20 ml. Ajustar el pH a 7,4 y steirritar filtro. Alícuota en 50 ml tubos. Ponga a un lado de la luz.
- Utilice 70% de etanol para desinfectar campo quirúrgico. Limpie y cubra con una almohadilla azul. Rociar un poco de etanol en la plataforma azul.
- Utilice las agujas de 22 G de precisar una almohadilla absorbente a la base de poliestireno y recortar con tijeras. Rocíe la almohadilla con etanol y después fijar la placa en la plataforma azul y cubrir con otra almohadilla azul hasta que comienza la disección.
- Llenar dos tubos de 50 ml con etanol y colocar en una posición adyacente al campo quirúrgico. Coloque las tijeras y pinzas en el etanol.
- Llene otro tubo de 50 ml con PBS más 1 x anti-anti etanol para enjuagar fuera herramientas quirúrgicas.
- En la capilla, etiqueta placas de 60 mm para cada tipo de tejido y se llenan de medios de cultivo se calentó a 37 ºC. Colocar las placas adyacentes a la zona quirúrgica.
2. Aislamiento del subcutánea (SQ) de grasa de ratones
- La eutanasia de ratón con una sobredosis de isoflurano y neumotórax.
- Suavementerocíe ratón con 70% de etanol y poner en posición supina. Fijar las patas al tablero de la espuma con 22 agujas G.
- Hacer un pequeño corte en la piel de la parte inferior del abdomen. Sosteniendo la parte superior del corte con las pinzas, tomar las tijeras y separar la piel del peritoneo.
- Una vez que la piel se separa de el peritoneo desde el abdomen al tórax, reflejar la piel de la peritoneo hacia la cabeza, mediante cortes laterales en la piel a lo largo del lado del cuerpo.
- Reflejar la piel restante sostiene la grasa inguinal lejos del cuerpo y fijar abajo a la placa con 22 agujas G.
- Cambiar a unas tijeras finas y pinzas. Coge la almohadilla de grasa inguinal con las pinzas en el origen cerca del peritoneo y cortar distancia entre la piel y la grasa inguinal avanzar hacia la ingle evitando la contaminación de la SQ con la piel.
- Coloque la almohadilla de grasa inguinal insolated en el plato marcado 60 mm.
3. Aislamiento de Visceral (VIS) almohadillas de grasa
- De una manera similar a la etapa 2.5, cortar el peritoneo abierto para exponer la almohadillas de grasa y el intestino visceral.
- Mover el intestino de distancia hacia el tórax.
- Coge la almohadilla de grasa VIS en el extremo distal y tire suavemente hacia arriba. Diseccionar la almohadilla de grasa VIS teniendo cuidado de excluir del epidídimo (o del útero, si se utilizan ratones hembra) de tejido.
- Colocar en el plato de la etiqueta y repita el paso 3.3 para la plataforma de VIS restante.
4. La colagenasa digestión de la grasa de ratones
- Mueva placas de 60 mm a la campana de cultivo de tejido y aspirar fuera de los medios de comunicación.
- Picar las almohadillas de grasa con tijeras curvas a continuación, añadir a la solución de colagenasa. Asegúrese de enjuagar las tijeras y pinzas entre tipos de tejidos con etanol y PBS.
- Se agita a 300 rpm y 37 ° C durante 10-20 minutos hasta que los tejidos se digieren. Es aceptable si algunas piezas de SQ son todavía visibles. Este problema se solucionará en un paso posterior.
- Se añaden 25 ml de medio de cultivo a la solución de colagenasa para detener la collagENasa tratamiento, y la pipeta hacia arriba y hacia abajo 10 veces con una pipeta serológica de 10 ml para dispersar a los tejidos digeridos.
- células de la cepa utilizando un filtro de células de 100 micras. Centrifugar durante 10 min a 300 x g.
- decantar con cuidado los medios de comunicación de no perturbar el pellet y añadir 5 ml de agua estéril al sedimento y suavemente pipeta para suspender las células. Espere 2 minutos para lisar los eritrocitos.
- Se añaden 25 ml de medio con FBS células y deformación del 10% a través de un nuevo filtro de células de 100 micras.
- Centrifugar durante 10 min a 300 x g. medios Decantar y pellet se resuspende en 1 ml de medio de cultivo.
- Recuento de células con un hemocitómetro usando 1: 1 de azul de tripano.
- Placa 1 x 10 6 células en un pocillo en una placa de 6 pocillos.
5. separación celular magnética
- Después de aproximadamente 4 a 6 horas de la adhesión celular, enjuagar las células dos veces con HBSS (-Ca, Mg). Disociar las células adherentes utilizando tripsina al 0,05%. Diluir la suspensión celular de tripsina en tampón de separación de 1 ml y se giro para5 min a 300 x g.
- Aspirar el sobrenadante. Resuspender las células en 500 l de tampón. Retirar una alícuota de 10 l y contar las células usando un hemocitómetro.
- Centrifugar las células durante 5 minutos a 300 x g.
- Aspirar el sobrenadante por completo. Resuspender las células en 90 l de tampón. Añadir 10 anticuerpo primario anti-Sca1-FITC l. Mezclar bien e incubar durante 10 minutos a 4 ° C en la oscuridad.
- Lavar las células con 1 ml de tampón y centrifugar las células durante 5 minutos a 300 x g. Aspirar el sobrenadante por completo.
- Resuspender las células en 80 l de tampón. Añadir 20 microperlas anti-FITC mu l. Mezclar bien e incubar durante 15 minutos a 4 ° C en la oscuridad.
- Lavar las células con 1 ml de tampón y centrifugar las células durante 5 minutos a 300 x g.
- Retire sobrenadante y el sedimento se vuelve a suspender en 500 l de tampón.
- Colocar la columna en el soporte magnético y enjuagar la columna con 500 l de tampón.
- Añadir suspensión de células a la columna. Evitar las burbujas durante el pipeteado.
- Recoger el Sca1 sin etiqueta - </ Sup> células y lavar la columna 3 veces con 500 l de tampón. Sólo añadir nueva memoria intermedia cuando el depósito está vacío. Evitar las burbujas durante el pipeteado.
- Retirar la columna del soporte magnético y colocar en un tubo cónico de 15 ml.
- Añadir 1 ml de tampón de columna y eluir Sca1 + empujando el émbolo suministrado a través del depósito de la columna.
- Centrifugar fracciones de células durante 5 minutos a 300 x g. Resuspender las células en medios de cultivo de 1 ml.
- Retirar una alícuota de 10 l de las fracciones etiqueta y etiqueta y contar las células usando un hemocitómetro.
- Placa de cada fracción de células en 1 pocillo de una placa de 6 pocillos.
6. Verificación de separación inmunomagnética de Sca1 alta SCA con Citometría de Flujo
- Enjuagar las células dos veces con HBSS (-Ca, Mg) y disociar las células utilizando tripsina al 0,05%.
- centrifugar las células a 300 xg durante 5 min. Resuspender las células en medios de cultivo de 1 mL y un recuento usando un hemocitómetro.
- Obtener> 10 6
- Aspirar el sobrenadante y repita el paso 6.3 dos veces más.
- Resuspender las células con 1 ml de suero de cabra 2% + 2% de BSA y de bloque durante 30 minutos a RT.
- centrifugar las células a 300 xg durante 5 min.
- Retire la solución de bloqueo.
- Añadir rata IgG2a Alexa Fluor 647 (0,25 g, 1: 400) o anti-Sca1 Alexa Fluor 647 (0,25 g, 1: 400), en 100 l de PBS con 2% de suero de cabra y 2% BSA + PBS a 4 ° C durante 30 min en la oscuridad.
- Añadir 1 ml de PBS frío a las células. Centrifugadora 300 xg durante 5 min a 4 ° C.
- Aspirar el sobrenadante y repita el paso 6.9 dos veces más.
- Resuspender las células en 1 ml de PBS. Pasar las suspensiones de células a través de un filtro de células de 100 micras en preparación para análisis de citometría de flujo.
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Representative Results
El enriquecimiento de altos ASC Sca1 de diferentes almohadillas de grasa.
Las células del estroma vascular aisladas de la grasa SQ pantalla similar a fibroblastos, estiran la forma celular, independientemente del nivel de expresión Sca1 (Figura 1A). Células de baja Sca1 alta y Sca1 Por otro lado, VIS (derivados de eWAT) demuestran clara diferencia en su forma de la célula. Como SQ (derivados)-iWAT pilas de gran Sca1, VIS (eWAT-deriva) Sca1 pilas de gran pantalla estirados, la forma celular similar a fibroblastos, mientras que las células bajas VIS Sca1 demuestran la forma epitelioide. Pilas de gran Sca1 aisladas de ratones Sca1-GFP se identifican fácilmente como células GFP-positivas en cultivo de tejidos (Figura 1B). Cuando se evaluaron estas células con citometría de flujo, la mayoría de las células GFP positivas se confirmaron para expresar proteínas Sca1 en la superficie celular tal como se detecta con unaanticuerpo ti-Sca1 (Figura 1C). Pilas de gran SCA1 derivados de la almohadilla de grasa inguinal mantienen una mayor capacidad de diferenciación de los adipocitos mientras que las células derivadas de los altos SCA1 eWAT son más difíciles de diferenciarse en adipocitos con la mezcla adipogénica convencional 10.
La grasa de la Expresión Génica Depot dependiente de Sca1 altos ASC (Figura 2).
Transcriptoma en todo el genoma análisis con la secuenciación del ARN demostrado el enriquecimiento de los genes relacionados con las proteínas de la matriz extracelular y modificadores (GO: 0031012, GO: 0005578) en esos altos ASC Sca1 10. Junto con análisis en tiempo real PCR, hemos sido capaces de demostrar la expresión diferencial de las MMP colagenolıticas (MMP2, MMP8, MMP13, MMP14) Sca1 derivado de eWAT entre iWAT- y altas ASC. Cuando marcado con fluoresceína colágeno tipo I geles se utilizaron t o evaluar la actividad de la degradación pericellular, se observó la actividad de remodelación del colágeno marcado aumento mediado por VIS Sca1 altos ASC 10.
Figura 1: Separación inmunomagnética de murino Sca1 altos ASC de diferentes depósitos de grasa ASC bajas y altas Sca1 (A) Sca1 aisladas de SQ (iWAT) y el VIS (eWAT).. Escala = 100 micras. (B) células Sca1-GFP aisladas de ratones Sca iWAT de-GFP. Escala = 100 micras. Expresión en la superficie (C) de la célula de Sca1 en las células Sca1-GFP-positivas evaluadas con citometría de flujo. (Izquierda) de IgG de rata de control (derecha) anticuerpo anti-Sca1. Eje X, la intensidad de GFP. Eje Y, Alexa-Fluor 647. El panel A se muestra anteriormente en Tokunaga, M. et al., (2014).ig1large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2:. Expresión depósitos de grasa dependiente de colagenolítica MMPs, TIMPs, y colágenos (A) La expresión génica diferencial de ECM y modificadores de ECM en Sca1 altos ASC aisladas de diferentes depósitos de grasa. (B) El aumento de la actividad de la degradación del colágeno de VIS (eWAT-ASC) deriva altos Sca1. La degradación de colágeno se muestra como la desaparición de las señales fluorescentes (flechas y puntas de flecha). El recuadro es una imagen ampliada de la degradación del colágeno centrado mediada por células individuales de ASC SQ. Las células se cultivaron durante 72 hr. Los datos mostrados anteriormente en Tokunaga, M. et al., (2014). Por favor, haga clic aquí para vIEW una versión más grande de esta figura.
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Discussion
En este documento se demuestra el aislamiento y separación de células inmunomagnética de ASC murinos de diferentes almohadillas de grasa y su uso para experimentos in vitro. El método presentado es eficaz para el aislamiento rápido de gran número de ASC Sca1-positivo, que es ventajoso con respecto a los técnicamente complejo y costoso aislamiento FACS mediada de ASC 9,14. A diferencia de FACS, separación celular inmunomagnética no permite el uso de antígeno múltiple para la identificación de una población de células diana. Sin embargo, si está bien caracterizado el antígeno de superficie, el uso de separación inmunomagnética aumenta el número de células para ser analizado sin confiar en el uso de equipo de FACS 15, que todavía no es fácilmente accesible a muchos investigadores biológicos a pequeña institutos sin instalaciones básicas .
Hay algunos aspectos críticos del procedimiento que debe observarse para asegurar un resultado exitoso. La adquisición de ADIPLas células madre ose-deriva requiere el aislamiento quirúrgico de los depósitos de tejido adiposo del ratón. Por lo tanto, la velocidad y la precisión de la recuperación de tejido es imprescindible para producir un alto número de células viables. Además, el mantenimiento de las áreas quirúrgicas limpias y los instrumentos son de vital importancia para el resultado del procedimiento mediante la prevención de la contaminación microbiana de las muestras de células y tejidos. tejidos adiposos disecados deben ser disociados enzimáticamente en una solución de colagenasa tipo II. Composición de la MEC difiere entre SQ y VIS almohadillas de grasa 10,16, donde VIS contiene menos colágenos que SQ. Por lo tanto, la duración de la digestión VIS almohadilla de grasa requiere aproximadamente la mitad de la cantidad de tiempo que SQ. Es aceptable para detener la digestión del tejido después de que el periodo de incubación indicado, incluso si las pequeñas partículas de tejido están todavía presentes en la solución de colagenasa. Estas piezas pueden ser disociadas mecánicamente con pipeteo una vez que los medios de cultivo se ha añadido para inhibir la actividad de la colagenasa. Si bien es posible procederdirectamente a la clasificación inmunomagnética después del aislamiento SVF, nuestras semillas del grupo 1 x 10 6 células no clasificadas en las placas de plástico de aproximadamente 4 a 6 horas antes de continuar con la clasificación de células. A pesar de múltiples etapas de filtración durante el aislamiento SVF, escombros todavía estará presente en la suspensión celular. En placas las células antes de proceder a la separación celular inmunomagnética proporciona una oportunidad para lavar los desechos y células no unidas de distancia, permitiendo así la clasificación magnética que sólo se aplica a las células adherentes que contienen células progenitoras adipogénicos.
Mientras Sca1 no se encuentra en el genoma humano, la identificación y validación de los antígenos de superficie celular alternativas expresadas en las células madre adiposo humano de depósito dependiente de grasa 17, cuando va asociado a esta técnica de separación de células, pueden ayudar a definir la biología de las células madre adiposas humanas.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo es apoyado por el NIH DK095137 (THC). Agradecemos a los miembros del laboratorio actuales y anteriores que han contribuido al desarrollo y sofisticación de los métodos descritos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Type 3 Collagenase | Worthington Biochemical | LS004182 | Tissue digestion |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | High-glucose culture medium |
| Pen/Strep/Glutamine (100x) | Gibco | 10378-016 | Media antibiotic |
| Anti-anti (100x) | Gibco | 15240-062 | Media antifungal |
| FBS | Gibco | 16000-044 | |
| PBS (1x, pH 7.4) | Gibco | 10010-023 | |
| Trypsin (0.05%) | Gibco | 25300-054 | |
| Cell strainer | BD Bioscience | 352360 | 100-μm cell strainer |
| 60 mm plates | BD Falcon | 353004 | |
| Scissors | FST | 14001-12 | Large |
| Scissors | FST | 14091-11 | Fine, curved tip |
| Large Forceps | FST | 11000-12 | |
| Fine Forceps | Any vendor | ||
| 25G 5/8” needles | BD | 305122 | |
| 22G 1.5” needles | BD | 305159 | |
| 15 ml conical tubes | BD Falcon | 352097 | |
| 50 ml conical tubes | BD Falcon | 352098 | |
| MACS separation columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Anti-Sca1 microbead kit (FITC) | Miltenyi Biotec | 130-092-529 | FITC-anti-Sca1 1ºAb and anti-FITC microbeads 2ºAb |
| AutoMACS running buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| MiniMACS separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| Blue chux pads | Fisher | 276-12424 | |
| Absorbent pads | Fisher | 19-165-621 | |
| Styrofoam board | Use from 50 ml tubes | ||
| 70% ethanol | |||
| Isoflurane | Any vendor | ||
| Rat IgG2a Alexa Fluor 647 | Invitrogen | R2a21 | |
| Rat IgG2a anti-mouse Sca1 Alexa Fluor 647 | Invitrogen | MSCA21 | |
| Rat IgG2a R-PE | Invitrogen | R2a04 | |
| Rat IgG2a anti-mouse F4/80 R-PE | Invitrogen | MF48004 | |
| Round-bottom tube | BD Falcon | 352058 | |
| HBSS (–Ca, –Mg) | Gibco | 14175-095 | |
| HBSS (+Ca, +Mg) | Gibco | 14025-092 | For collagenase solution |
| Type I collagen (2.7 mg/ml in 37mm acetic acid | Prepare in house12 | ||
| 10x MEM | Gibco | 11430-030 | |
| 1 M HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| 0.34 N NaOH | Prepare in house | ||
| Cover slips | Corning | 2870-22 | |
| Alexa Fluor 594 carboxylic acid, succinimidyl ester, mixed isomers | Invitrogen | A-20004 | |
| 0.89 M NaHCO3 | Gibco | 25080-094 |
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