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Neuroscience

ラットにおけるナイーブ砂糖と脂肪の摂取後の中脳辺縁系と中間皮質ドーパミン報酬サイトからのc-Fosの活性化の同時検出

Published: August 24, 2016
doi:
10.3791/53897
, ,
1Behavioral and Cognitive Neuroscience Cluster, Psychology Doctoral Program, The Graduate Center,CUNY, New York, NY, 2Department of Psychology, Queens College,CUNY, Flushing, NY, 3Behavioral and Cognitive Neuroscience Cluster, Psychology Doctoral Program, The Graduate Center,CUNY, Flushing, NY

Summary

本研究の目的は、ラットの脂肪と砂糖の新規摂取後のドーパミン経路と端末サイトにおける同時変化を測定するために、携帯のc-fosの活性化を使用して、信頼性の高い免疫組織学的手法を描くことで報酬関連の分散型の脳のネットワークを識別することです。

Abstract

この研究は、ラットにおける脳内のドーパミン（DA）経路上の脂肪と砂糖の新規摂取の効果を評価するための細胞のc-fosの活性化を使用しています。糖や脂肪の摂取量は、その生来の観光スポットだけでなく、学んだ嗜好によって媒介されます。脳ドーパミン、特にメソ大脳辺縁系と腹側被蓋野（VTA）からメソ – 皮質突起が、これらの未学習と学習した応答の両方に関与しています。いくつかのサイトと送信機/ペプチドシステムが対話前記分散脳ネットワークの概念は、口当たりのよい食物摂取を媒介することが提案されているが、経験的に、そのような行動を示す限られた証拠があります。したがって、砂糖の摂取は、DA放出を誘発し、側坐核を含む個別VTA DA投影ゾーンからのc-fosの様免疫反応性（FLI）（NAC）、扁桃体（AMY）を増加させ、前頭前皮質（のmPFC）だけでなく、背側線条体を内側。これらのサイトへの選択的DA受容体拮抗薬のさらに、集中管理糖または脂肪によって誘発さ条件付け味の好みの取得と発現を低下させる差別的です。これらのサイトは砂糖や脂肪の摂取量に応じて、分散脳のネットワークとして相互作用するかどうかを確認することにより、一つのアプローチは、VTAとその主要mesotelencephalic DA投影ゾーン（NACの縁前方のとinfralimbicのmPFC、コアとシェル、かどうかを評価連立することであろう基底外側および中央皮質内側AMY）だけでなく、背側線条体はコーン油（3.5％）、グルコース（8％）、フルクトース（8％）とサッカリン（0.2の経口、無条件摂取した後に調整され、同時FLIの活性化を表示するであろう％）ソリューション。このアプローチは、げっ歯類で口当たりの良い食物の摂取に報酬関連の学習を研究するために、関連する脳部位で同時に携帯のc-fosの活性化を使用することの実現可能性を同定することに成功した最初のステップです。

Introduction

脳ドーパミン（DA）が提案されたヘドニック1,2、努力関連の3と行動の習慣ベース4,5のメカニズムを通じて、口当たりのよい糖の摂取に中央応答に関与しています。これらの効果に関与する主要なDA経路は、腹側被蓋野（VTA）に由来し、側坐核（NAC）コアとシェル、基底外側および中央皮質内側扁桃体（AMY）、および縁前方のとinfralimbic内側へプロジェクト前頭前皮質（のmPFC）（レビュー6,7を参照）。 VTAは、ショ糖摂取8,9に関与している、とDA放出はNAC 10-15、AMY 16,17とのmPFC 18-20で砂糖の摂取後に観察されます。脂肪の摂取量はまた、DA NACは21を解放刺激し、背側線条体（尾状核被殻）への別のDA-豊富な投影ゾーンはまた、DA媒介送り22,23と関連していました。ケリー24-27は 、これらの複数のプロジェクトと提案しこのDA媒介システムのイオンゾーンは広範かつ緊密な相互接続28-34を介して統合された、インタラクティブな分散型の脳のネットワークを形成しました。

糖35-37および脂肪38-40の摂取量を減らすためにDA D1およびD2受容体アンタゴニストの能力に加えて、DAシグナリングはまた、コンディショニングフレーバーの嗜好（CFP）を生成する糖および脂肪の能力を媒介に関与しています41- 46。 NAC、AMYかのmPFC 47-49にDA D1受容体拮抗薬のマイクロインジェクションは、胃内グルコースによって誘発されたCFPの取得をなくします。 mPFCにDA D1またはD2受容体拮抗薬のいずれかの微量注入は、フルクトース-CFP 50の買収を排除するのに対し、フルクトース-CFPの取得及び発現が示差NACとAMY 51,52にDA拮抗薬によってブロックされています。

C-fosの技術53,54は、神経activatioを調査するために採用されていますnは、口当たりの良い摂取と神経の活性化によって誘導されます。用語「C-fosの活性化」とは、原稿全体で使用され、かつ作動ニューロンの脱分極中のc-Fosタンパク質の増加した転写により定義されます。ショ糖の摂取量は、NAC 55-57で、コア中央AMY核、VTAだけでなく、シェルでFOS様免疫反応性（FLI）を増加したが、ありません。偽摂食ラットにおけるショ糖摂取量は有意AMYとNACにFLIを増加ではなく、VTA 58、胃内スクロースまたはグルコース注入が大幅にNACとAMY 59,60の中央部と基底外側核においてFLIを増加させました。スケジュールされた飼料のアクセスにショ糖の繰り返し添加はNACシェルとコア61と同様のmPFCにFLIを増加させました。スクロース濃度のダウンシフトパラダイムが最大のFLIの増加は基底外側AMYとNACで発生したことを明らかにではなく、VTA 62。以下のコンディショニング、砂糖関連の自然REWAの絶滅目の行動は基底外側AMYとNAC 63にFLIを増加させました。また、トーンにペアリング砂糖の可用性は、その後側底AMY 64にFLIレベルを増加させるトーンをもたらしました。高脂肪の摂取量も、NACとのmPFCサイト65-67でFLIを増加させました。

以前に引用された研究のほとんどは、報酬に関連した分散型の脳のネットワーク24-27の識別に関する情報を提供していない単一のサイトにおけるc-fosの活性化に砂糖と脂肪の効果を調べました。また、研究の多くはまた、潜在的により調べることができたNAC（コアとシェル）、AMY（基底外側および中央皮質内側）とのmPFC（縁前方のとinfralimbic）のサブ領域の相対的な寄与を描写しませんでしたc-Fosのマッピング68に優れた空間、単一セルの解像度の利点。当研究室で69最近使用されたのc-fosの活性化と同時にVTA DA経路における測定の変化とそのプロジェクションゾーン（NAC、AMYとのmPFC）ラットにおける脂肪と糖の新規摂取後。本研究では、AMY、同時に6異なる溶液（コーン油、ブドウ糖、果糖、サッカリン、水及び脂肪乳剤コントロール）への急性曝露は差動でNACのサブエリアにFLIを活性化するかどうかを分析するための手続きと方法論的な手順を説明しますmPFCだけでなく、背側線条体。関連サイトでの変化と相関1の特定の部位の変化は、それによって、分散脳のネットワーク24-27のためのサポートを提供するか否かの各サイトと決意でFLIに重大な影響の確認を許可された差異のこの同時検出。試験されたこれらの手順は、VTA、縁前方のとinfralimbicのmPFC、NACのコアとシェル、および基底外側および中央皮質内側AMY）だけでなく、背側線条体whetherコーディネート表示していましたし、経口、無条件摂取後同時FLIの活性化グルコース（8％）、フルクトース（8％）、コーン油（3.5％）およびサッカリン（0.2％）溶液。

Protocol

これらの実験プロトコルは、すべての被験者と手順は、ナショナルケアのための健康ガイドの研究所や実験動物の使用に適合していることを証明制度動物実験委員会によって承認されています。 1.被験者購入および/または血統の雄Sprague-Dawleyラット（260〜300グラム）。 金網ケージで個別ハウスラット。ラット飼料と水を自由に摂取させて12時12時間の?…

Representative Results

以下に記載されている全ての代表的な結果は、以前に69を公表されており、および技術の有効性を示すには「コンセプトの証明」をサポートするために、ここに再提示されています。 ソリューション摂取 ベースラインサッカリン摂取量の有意差は、全ての動物（F（3,108）= 57.27、P <0.001）摂取量…

Discussion

研究の目的は、DAの報酬関連のニューロンのソース（VTA）と前脳投影ターゲット（NAC、AMY、のmPFC）は同時に携帯のc-fosの技術を用いて、ラットの脂肪と砂糖の新規摂取後に活性化されたかどうかを判断することでした。本研究は、これまで69発表された研究のプロトコルの詳細な説明です。これは、VTAは、縁前方のとinfralimbicのmPFC、NACのコアとシェルと基底外側および中央皮質内側AMY?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

このプロジェクトの彼らのハードワークのためのダイアナIcaza氏-Culaki、クリスタルサンプソンとTheologia Karagiorgisに感謝します。

Materials

Equipment
Sprague-Dawley rats Charles River Laboratories CD-1
Wire Mesh Cages Lab Products, Seaford, DE 30-Cage rack
Rat Chow PMI Nutrition International 5001
Taut Metal Spring Lab Products, Seaford, DE n/a
Rat Weighing Scale Fisher Scientific Company n/a
Nalgene Centrifuge Tubes Lab Products, Seaford, DE 10-0501
Rubber Stopper Lab Products, Seaford, DE n/a
Metal Sippers Lab Products, Seaford, DE n/a
Saccharin Sigma Chemical Co 82385-42-0
Kool-Aid, Cherry Kool-Aid Commerical
Kool-Aid, Grape Kool-Aid Commercial
Fructose Sigma Chemical Co F0127
Glucose Sigma Chemical Co G8270
Corn Oil Mazzola Commerical
Xanthan Gum Sigma Chemical Co 11138-66-2
Sliding Microtome Microm International n/a
Neurolucida Camera MBF Bioscience Software application
Gelatin-coated Slides Fisher Scientific Company 12-550-343
Cover glass Fisher Scientific Company 12-545-M
Golden Nylon Brushes Loew-Cornell  2037
Natural Hair Sable  Loew-Cornell  2022
24 Well Plates Fisher Scientific 3527
6 Well Plates Fisher Scientific 3506
1L Pyrex bottles Fisher Scientific 1395-1L
Tissue insert (tissue strainer) Fisher Scientific 7200214
Eagle pipettes  World Precision Instruments E10 for 1-10ul 
Eagle pipettes  World Precision Instruments E100 for 20-100ul
Eagle pipettes  World Precision Instruments E200 for 50-200ul
Eagle pipettes  World Precision Instruments E1000 for 100-1000ul
Eagle pipettes  World Precision Instruments E5000 for 1000-5000ul 
Universal Tips .1-10ul World Precision Instruments 500192
Universal Tips 5-200ul World Precision Instruments 500194
Universal Tips 500-5000ul World Precision Instruments 500198
Blade Vibroslice 100 World Precision Instruments BLADE
DPX Mounting Medium  Electron Microscopy  13510
15mL centrifuge tubes Biologix Research Co. 10-0501
Slide Boxes Biologix Research Co. 41-6100
Orbital Shaker  Madell Corporation   ZD-9556
weigh boats  Fisher Scientific 02-202-100
5mL disposable pipettes Fisher Scientific 13-711-5AM
Stereo Investigator Software Micro Bright Field Software application
Name Company Catalog number Comments
Reagents
Paraformaldehyde Granular Fisher Scientific 19210
NaCl Fisher Scientific S271-1
Sodium Phophate Monobasic Fisher Scientific S468-500
Sodium Phosphate Diphasic Fisher Scientific BP332-500
Hydrogen Peroxide  Fisher Scientific H324-500
SafeClear II  Fisher Scientific 23-044-192
Methanol  Fisher Scientific A412-1
Normal Goat Serum Vector S-1000
Biotinylated Anti-Rabbit IgG (H+L) Vector BA-1000
ABC Kit Peroxidase Standard Vector PK-4000
Anti-cFos (Ab-5) Rabbit EMD chem/Cal Biochem PC38
Triton X 100 SigmaAldrich X-100
3,3' diaminobenzidine tetra hydrochloride  SigmaAldrich D5905
Sodium Hydroxide SigmaAldrich 5881
Primary TH anti body EMD Millipore AB152
Euthosol Virbac AH
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C-Fos ActivationMesolimbicMesocorticalDopamineRewardSugarFatIngestionVTABrainMotivationPalatable StimuliBehavioral AssaysCellular ActivationStatistical AnalysisFood RestrictionSaccharineIntake TestBrain DissectionParaformaldehydeSucrose SolutionOlfactory Bulb

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Dela Cruz, J. A. D., Coke, T., Bodnar, R. J. Simultaneous Detection of c-Fos Activation from Mesolimbic and Mesocortical Dopamine Reward Sites Following Naive Sugar and Fat Ingestion in Rats. J. Vis. Exp. (114), e53897, doi:10.3791/53897 (2016).
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