Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Одновременное обнаружение с-Fos активации от мезолимбическом и мезокортикальных Награда сайты Допамин После Наивное сахара и жира При приеме внутрь в Rats

Published: August 24, 2016 doi: 10.3791/53897
Automatic Translation
*1, *2, 2,3
1Behavioral and Cognitive Neuroscience Cluster, Psychology Doctoral Program, The Graduate Center, CUNY, New York, NY, 2Department of Psychology, Queens College, CUNY, Flushing, NY, 3Behavioral and Cognitive Neuroscience Cluster, Psychology Doctoral Program, The Graduate Center, CUNY, Flushing, NY
* These authors contributed equally

Summary

Цель данного исследования заключается в определении вознаграждения, связанных распределенных сетей мозга путем очерчивания надежного иммуногистохимического технику с помощью мобильного с-ФОС активации для измерения одновременных изменений в дофаминовых путей и терминальных участков после нового приема жира и сахара у крыс.

Abstract

Это исследование использует сотовую с-ФОС активации для оценки влияния нового употребления жира и сахара на мозг допамина (DA) путей у крыс. Воздухозаборники сахаров и жиров опосредованы их врожденными аттракционами, а также узнали предпочтения. Мозг допамин, особенно мезо-лимбической и мезо-кортикальной проекции из вентральной области покрышки (VTA), участвует в обоих этих необразованных и рефлексами. Концепция распределенных сетей мозга, в котором несколько сайтов, и передатчик / пептидные системы взаимодействуют между собой, было предложено, чтобы посредничать вкусную потребление пищи, но есть ограниченные доказательства эмпирически демонстрируют такие действия. Таким образом, потребление сахара вызывает DA релиз и увеличивает с-ФОС-подобной иммунореактивности (FLI) из отдельных проекционных зон VTA DA включая прилежащем ядре (NAC), миндалины (Amy) и медиальной префронтальной коры головного мозга (MPFC), а также спинной полосатого тела. Кроме того, центральное управление селективных антагонистов рецепторов DA в эти сайтS дифференцированно уменьшить приобретение и экспрессию условных вкусовых предпочтений, вызываемых сахаров или жиров. Один из подходов, с помощью которого можно определить, взаимодействовал ли эти сайты в качестве распределенной сети мозга в ответ на сахар или потребление жиров будет одновременному оценить ли VTA и ее основные зоны проекции mesotelencephalic DA (прелимбальной и infralimbic MPFC, ядро ​​и оболочка NAC, базолатеральная и центрально-кортико-медиальное ЭМИ), а также спинной стриатуме будет отображать скоординированы и одновременное срабатывание FLI после перорального, некондиционной потребление кукурузного масла (3,5%), глюкозы (8%), фруктозу (8%) и сахарина (0,2 %) решений. Такой подход является успешным первым шагом в определении возможности использования сотовой связи с-ФОС активацию одновременно на соответствующих участках мозга для изучения вознаграждения, связанных с обучения в проглатывания аппетитную пищу у грызунов.

Introduction

Мозг допамин (DA) , участвует в центральных реакции на прием аппетитных сахаров через предложенный гедоническая 1,2, усилий , связанных с 3 и привычки на основе 4,5 механизмы действия. Первичный DA путь замешан в этих эффектов берет свое начало в районе вентральной тегментальной (VTA), а также проекты в прилежащем ядре (NAC) ядра и оболочки, базолатеральный и центрально-кортико-медиальное миндалины (ЭМИ), и прелимбальной и infralimbic медиальной префронтальной коры (MPFC) (см отзывы 6,7). ВТА участвует в потреблении сахарозы 8,9, и DA - релиз наблюдается следующее потребление сахара в NAC 10-15, AMY 16,17 и MPFC 18-20. Жир также стимулирует потребление DA NAC выпуск 21, а другой DA-богатая проекционная зона на дорсальную стриатума (хвостатое-скорлупа) был также связан с DA-опосредованной подачи 22,23. Kelley 24-27 предположил , что эти многочисленные проектаионные зоны этого DA-опосредованной системы формируется интегрированный и интерактивный распределенной сети мозга через обширные и интимных соединений 28-34.

В дополнение к способности антагонистов рецепторов DA D1 и D2 , чтобы уменьшить потребление сахаров и жиров 35-37 38-40, сигнализации DA также участвует в опосредовании способности сахаров и жиров для производства вкусовых предпочтений обусловленные (CFP) 41- 46. Микроинъекции антагониста DA D1 рецепторов в NAC, Светы или MPFC 47-49 исключить приобретение CFP , вызванную внутрижелудочного глюкозы. В то время как микроинъекции антагонистов рецепторов либо DA D1 или D2 в в MPFC исключает приобретение фруктозы-CFP 50, приобретение и экспрессия фруктозы-CFP дифференцированно блокируются антагонистами дофамина в NAC и AMY 51,52.

C-FOS метод 53,54 был применен для исследования нейронных activatioп, индуцированный приемом и вкусной нейронной активации. Термин "C-FOS активации" будет использоваться по всей рукописи, и операционно определяется повышенной транскрипцией с-Fos во время нейрональной деполяризации. Сахароза потребление увеличилось FOS-подобной иммунореактивности (FLI) в центральном ядре AMY, ВТА, а также оболочка, но не ядро, из NAC 55-57. В то время как потребление сахарозы в имитацией кормления крыс значительно увеличилось FLI в AMY и NAC, но не ВТА 58, внутрижелудочной сахароза или глюкоза настои значительно увеличилось FLI в NAC и центральных и базолатеральной ядер AMY 59,60. Повторное добавление сахарозы к запланированной чау доступа увеличилось FLI в MPFC, а также оболочки NAC и сердечник 61. Сахарозы концентрация понижающей передачи парадигма показала , что наибольший рост FLI произошло в базолатеральной AMY и NAC, но не ВТА 62. После кондиционирования, исчезновение сахара, связанных с естественной Реваго поведения увеличилась FLI в базолатеральной AMY и NAC 63. Кроме того, спаривания сахара наличие на тон привел в тон последующего повышения уровней FLI в базолатеральной AMY 64. Высокое потребление жиров также увеличилось FLI в NAC и MPFC сайтов 65-67.

Большинство из ранее приведенных исследований исследовали сахара и жира эффекты на С-FOS активации в отдельных сайтах , которые не предоставляют информацию об идентификации вознаграждения , связанных с распределенными сетями мозга 24-27. Кроме того, многие из этих исследований также не разграничить относительный вклад подобластей НКС (ядра и оболочки), Ами (базолатеральной и центрально-кортико-медиальной) и MPFC (прелимбальной и infralimbic), которые потенциально могут быть рассмотрены преимущество, отличной пространственной разрешением одноклеточного в с-Fos 68 отображения. Наша лаборатория 69 недавно использовали с-ФОС активации и одновременно измеренные изменения в пути VTA DA и его прозоны проекция (NAC, AMY и MPFC) после нового приема жиров и сахаров у крыс. Настоящее исследование описывает процедурные и методологические шаги одновременно анализировать ли острое воздействие шести различных растворов (кукурузное масло, глюкоза, фруктоза, сахарин, вода и контроль эмульсии жира) будет дифференцированно активировать FLI в подзонах НКС AMY, MPFC, а также спинной стриатуме. Это одновременное обнаружение различий позволило подтверждение значительных эффектов на FLI в каждом месте и определения того , являются ли изменения в одном конкретном месте коррелируют с изменениями в соответствующих сайтов, обеспечивая тем самым поддержку распределенной сети мозга 24-27. Эти процедуры проверяли, действительно ли ВТА, прелимбальной и infralimbic MPFC, ядром и оболочкой НКС и базолатеральной и центральной кортико-медиальной AMY), а также спинной стриатуме дисплей скоординированы бы и одновременное срабатывание FLI после перорального, безусловный прием глюкозы (8%), фруктоза (8%), кукурузное масло (3,5%) и сахарина (0,2%) растворы.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Эти экспериментальные протоколы были одобрены по уходу и использованию комитета Institutional Animal заверив, что все предметы и процедуры в соответствии с национальными институтами Руководство здравоохранения по уходу и использованию лабораторных животных.

1. Субъекты

  1. Покупка и / или породы самцов Sprague-Dawley крыс (260 - 300 г).
  2. Дом крыс индивидуально в проволочные клетки. Поддерживать их на 12:12 час цикле свет / темнота с корму для крыс и водой , доступными по желанию.
  3. Назначают соответствующие размеры выборки (например, п ≈ 6 - 8) случайным образом по группам.

2. испытательная аппаратура и впускным Процедуры

  1. Используйте калиброванные центрифужные пробирки с резиновыми пробками и под углом 45 ° металла Sipper трубки, чтобы обеспечить точное измерение (± 0,1 мл) представленных решений. Закрепите их в домашних клетках с помощью тугой пружины металла, чтобы обеспечить видимость калибровок.
  2. Ограничить рационы питания (~15 / г / день) у крыс, чтобы уменьшить вес до 85% от их первоначальной массы тела, чтобы увеличить мотивацию к потреблению решений. Примечание: снижение веса должно занять от 3 - 5 дней.
  3. Обеспечение предварительной подготовки растворы (10 мл) 0,2% -ного сахарина в течение четырех дней, в течение 1 ч сессии, чтобы максимизировать вероятность того, что у крыс попробуют последующие тестовые растворы с короткой (менее 1 мин) латентности.
  4. Подтвердите поток через центрифугу трубку путем обливания несколько капель.
  5. Взвесьте трубы до и после каждой сессии, чтобы получить всасываемого измерения.
  6. Провести тест всасываемого на пятый день на подгруппы, получающих одну из шести решений (10 мл, 1 час): а) вода, б) роман со вкусом (0,05% вишневый вкус) 0,2% сахарин, с) 8% фруктозы, д) 8 % глюкозы, е) 3,5% масла кукурузы суспендировали в 0,3% ксантан-гама, а также е) 0,3% ксантановой камеди.
  7. Убедитесь в том, что питательные растворы являются изокалорийных; Таким образом, концентрация кукурузное масло 3,5% является изокалорийных в растворы сахара 8%.
  8. Обеспечить тысу крыс растворов образцов с коротким временем ожидания (менее 1 мин). Если это требование не выполняется, то выбросьте эту тему из исследования.

3. Подготовка ткани

  1. Обезболить каждое животное с помощью внутрибрюшинной инъекции пентобарбитала через 90 мин после первоначального воздействия каждого испытуемого раствора. Убедитесь, что животные должным образом обезболивание не демонстрируя, что животное больше не реагирует на такие рефлексы, как снятие с ног крайнем случае, моргая после непосредственного роговице давления или тряски головой к глубокой стимуляции ушной раковины.
  2. Заливать каждое животное транскардиальную , как описано выше 69.
    1. Обезболить крыс с передозировкой пентобарбитала натрия (65 мг / кг), удалите грудную клетку и обнажить грудь для свободного доступа к сердцу 69.
    2. Поместите иглу в верхушке левого клапана сердца, а также сократить полая. Администрируйте фосфатный буферный раствор (PBS, ~ 180 мл) с последующим добавлением фосфатно-буферном закрепителя соntaining 4% параформальдегида (~ 180 мл).
    3. Убедитесь, что животное на самом деле в настоящее время перфузию правильно, исследуя жидкость покидает ли другие полости, такие как нос, рот, и области гениталий. Примечание: Правильное крепление с параформальдегидом будет сопровождаться большими движениями мышц. Если это не происходит, то подрегулировать иглу до тех пор, пока происходит эта реакция.
  3. Удалите мозг из черепа быстро, сокращая мех и кожу от черепа. Используйте кусачек, чтобы взломать и удалить кости из мозга, движущегося от задней к передней. Работа первоначально в области ниже и позади мозжечка, гарантируя, что костные кусачки находится между костью и менингеальной мягкой мозговой оболочки. После того, как верхняя и боковые части черепа удалены, используйте маленькую лопаточку, чтобы поднять мозг от основания, и надрез черепно-мозговых нервов с маленькими ножницами. Будьте осторожны, чтобы не повредить мозг при попытке удалить кости.
  4. Закрепить мозги в 4% растворе параформальдегида в течение ночи при 4 ° С.Поместите мозги в 30% сахарозы 70% раствора / PBS при комнатной температуре, пока они не оседают на дне контейнера.
  5. Блок мозг
    1. Удалите ростральной часть мозга резки поперечно каудально к обонятельной луковице.
    2. Удалить хвостовую часть мозга резки в поперечном направлении на уровне мозжечка и мосте.
  6. Смонтировать мозг коронковой с каудальной части, закрепленной на стадии скользящего микротома, и вырезанные корональных секций (40 мкм) через MPFC (2,86 - 2,20 мм ростральной до темени), ядро ​​NAC и оболочки и спинной стриатуме (+ 1,76 - 1,60 мм ростральной до темени), то ЭМИ (-2,12 - -2,92 мм каудально по отношению к темени) и VTA (-5,20 - -5,60 мм каудально брегмы). Используйте мозг атласом 70 крысы для руководства.
  7. Собирают свободно плавающие секций в отдельных лунках 24-луночного планшета , заполненную PBS для последующего иммуногистохимического анализа 71. Используйте парафином, чтобы запечатать 24 мыЛ.Л. пластины, чтобы убедиться, что PBS не испаряется в контейнере и высушить мозг. Хранить мозговой ткани в 4 ° С.

4. C-FOS Процедуры (адаптировано из 71)

  1. Обрабатывать каждую секцию с 5 мл 5% нормальной козьей сывороткой и 0,2% Тритон Х-100 в PBS в течение 1 часа.
  2. Выдержите обработанные участки с первичными антителами (кроличьими анти-C-FOS, 1: 5000) при температуре 4 ° С в течение 36 ч в лунках, содержащих 1 мл PBS.
  3. Полоскание секции 3x с PBS (5 мл) в течение 10 минут каждый.
  4. Инкубируйте с вторичными антителами (биотинилированным козьим анти-кроличий; 1: 200) при комнатной температуре в течение 2 ч в лунках, содержащих 1 мл PBS.
  5. Промыть каждую секцию 3 раза в PBS (5 мл) в течение 10 минут каждый.
  6. Выдержите промытых секции в течение 2 ч в коммерчески доступной смеси пероксидазой авидин-хреном, который входит в комплект, состоящий из Avadin DH (100 мкл) и биотинилированного пероксидазы хрена H (100 мкл) в 5 мл PBS.
  7. Повторно промойте участки в 3 раза PBS (5 мл) в течение 10 минут каждый.
  8. React участки с 0,05% диаминобензидино (DAB) в присутствии 0,0015% H 2 O 2 в течение 5 - 10 мин, в зависимости от реакционной способности ткани в лунках , содержащих 5 мл раствора DAB.
  9. Дважды этикетки секции ВТА. Выдержите их с тирозин-гидроксилазы (TH) антитело (кроличье анти-крысиным TH, 1: 2000) в PBS (5 мл) в течение ночи при 4 ° C.
  10. Ополосните секции 3x в PBS (5 мл) в течение 10 минут каждый.
  11. Инкубируйте с вторичными антителами (биотинилированным козьим анти-кроличий; 1: 200) в PBS (5 мл) при комнатной температуре в течение 2 часов.
  12. Ополосните секции 3x в PBS (5 мл) в течение 10 минут каждый.
  13. Визуализируйте антител с помощью вторичного антитела-пероксидаза комплекс. React с комбинацией 0,05% ДАБ и 0,3% -ного раствора сульфата никеля, в течение 5 - 10 мин, в зависимости от реакции ткани в лунках, содержащих 5 мл / NiCl раствора DAB.
  14. Убедиться, что решение DAB молочно-светло-зеленый цвет от негоs реакции с 0,3% сульфата никеля. Если раствор слишком зеленый, то реакция будет слишком темным.
  15. Установите все разделы на покрытых желатином горками. Дайте им высохнуть в течение ночи, а затем покрывают скольжению с несколькими каплями толуольного раствора на основе (TBS).
  16. Код скользит так, что экспериментальное условие неизвестно наблюдателей.

5. Определение с-ФОС иммунореактивного Считает

  1. Назначают пары непредвзятым наблюдателям считать Fos-позитивных нейронов в этих регионах, представляющих интерес (ROI): прелимбальной MPFC, infralimbic MPFC, NAC ядро, NAC оболочки, базолатеральной ядер AMY, центрально-кортико-медиальное AMY, спинной стриатуме и ВТА. Очертить ли с-Fos иммунореактивность присутствует в TH + и th- клеток в ВТА. На рисунке 1 представлен экран захваченное изображение в НАК от микроскопа.

Рисунок 1
Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

  1. Анализ по меньшей мере, три представительных срезов для каждого сайта, общего для всех животных во всех условиях тестирования.
  2. Используйте программное обеспечение и оптический микроскоп , чтобы проанализировать весь регион для каждого ROI путем отслеживания контур (рисунок 1).
    1. На данном сайте, откройте приложение и нажать на раскрывающемся меню приобретения и нажмите "Живое изображение". Доведите ROI в фокус и нажмите на экран, чтобы установить точку отсчета. Тогда тртуз выбранный область мозга с помощью сетки в качестве ориентира. После того, как след закончен, подсчет клеток (шаги 5.3.1.1 - 5.3.1.3).
      1. Дважды щелкните значок программного обеспечения. Перейти к строке меню, нажмите на "приобретение", а затем "Live Image". Доведите ROI в фокус и нажмите на экран, чтобы установить точку отсчета.
      2. Перейдите на панель инструментов сетки и нажмите кнопку "Показать сетку" и "Использовать сетки этикетки". Обрисовать ROI с заданной трассы.
      3. Подсчет всех клеток в каждом районе ROI, выберите "+" в левой боковой панели, чтобы сохранить количество С-FOS клеток. Нажмите каждую ячейку по отдельности, чтобы зарегистрировать счетчики. Рассмотрим ячейку положительного для с-ФОС , когда определено темно - красный круг наблюдается (рисунок 1).
    2. Повторите эту процедуру для каждого сайта.
    3. Запись подсчитывает в лабораторной тетради и на компьютере для дальнейшего анализа. Перейти к строке меню, нажмите на кнопку "Файл", "Файл Сохранить данные", чтобы сохранить трассировку и рассчитывает.
    4. Убедитесь, что надежность между оценщик (с использованием корреляции отсчетов) двух неинформированными оценщиками для каждой секции в каждом ROI всегда превышает 0,8.

    6. Статистика

    1. Оценка исходных сахарина воздухозаборники в течение первых четырех дней с помощью повторных измерений 1-дисперсионный анализ (ANOVA) сравнение сахарина воздухозаборники дней 1, 2, 3 и 4 69.
    2. Сравнить потребление сахарина (День 4) с тест - водозаборах (5 -й день) из шести групп , использующих рандомизированные-блок 2-полосная ANOVA 69.
    3. Используйте Тьюки сравнения (р <0,05) , чтобы определить отдельные значимые эффекты 69.
    4. Определить надежность между оценщик, а затем использовать счетчики общую наблюдателя.
    5. Средние с-ФОС рассчитывает на трех представительных срезов для каждого участка 69.
      1. Выполните 1-дисперсионного анализа С-FOS активации, вызванной приемом шести растворов (3,5% масла кукурузы, 8% глюкозы, 8% фруктозы, 0,2% ароматизированные сахарина, XaNthan контроль камеди и воды) для perilimbic MPFC 69.
      2. Повторите параллельные анализы шести групп для infralimbic MPFC, NAC ядро, NAC оболочки, базолатеральные AMY, центрально-кортико-медиальное AMY, ВТА и спинной стриатуме. Используйте Тьюки сравнения (р <0,05) , чтобы выявить отдельные значимые эффекты 69.
    6. Сравнить кукурузы потребление масла как с водозабором и потреблением его суспензии агента, ксантановая камедь. Сравните фруктоза и глюкоза воздухозаборники с обоими водозаборных и потребление некалорийного подсластителя, сахарин.
    7. Установить наблюдались ли существенные отношения между раствором водозаборах и С-FOS активации в каждом из сайтов с использованием Бонферрони корреляции R (p <0,05).
      1. Систематически сравнить с-ФОС отсчетов в perilimbic и infralimbic предварительно лобной коры для каждого животного в группе 3,5% кукурузного масла.
      2. Повторите систематически параллельные анализы каждой пары из шести участков (VTA, спинной стриатуме, infralimБИК MPFC, perilimbic MPFC, NAC ядро, оболочка NAC, базолатеральная ЭМИ, центрально-кортико-медиальное ЭМИ) для кукурузного масла 3,5%.
      3. Повторите систематически параллельные анализы этих шести участков для пяти других экспериментальных условиях потребления (8% глюкозы, 8% фруктозы, 0,2% ароматизированные сахарина, ксантановая камедь и контроля воды).
    8. Воспользуйтесь тем, что одни и те же животные в пределах состояния раствора были оценены на всех участках, определяя значимые отношения между С-FOS активации через решений и в рамках каждого решения с использованием Бонферрони г корреляции (р <0,05).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Все показательные результаты , описанные ниже, были опубликованы ранее 69, и повторно представлены здесь , чтобы поддержать "доказательство концепции" в указании эффективности методики.

Решение Потребления
Значительные различия в исходных сахарина водозаборах наблюдались в течение первых четырех дней для всех видов животных (F (3,108) = 57,27, p <0,001) с водозаборов (1-й день: 1,3 (± 0,2) мл; 2-й день: 3,9 (± 0,4) мл ; 3-й день: 5,9 (± 0,6) мл; День 4: 7,1 (± 0,6) мл) достоверно (р <0,05, Таки HSD тест) и постепенно увеличивается. Фруктоза и потребление глюкозы, но не кукурузное масло или сахарин потребление на 5 день значительно (р <0,05, Таки HSD тест) увеличился по отношению к День 4 приема сахарин (р <0,05, Таки HSD тест) с фруктозой (9,6 (± 0,4) мл ) и глюкозы (9,4 (± 0,6) мл) значительно выше, чем SACCприем Харин. Кроме того, потребление кукурузного масла (7,4 (± 0,6) мл) была достоверно (р <0,05, Таки HSD тест) выше, чем ксантановая камедь потребления.

Эти результаты подняли вероятность того, что потребление решение само по себе может объяснить для любого наблюдаемого с-ФОС активации в любом из сайтов. Чтобы проверить это, Бонферрони г корреляции были выполнены, в которых потребление пяти решений было связано с с-FOS активации в каждом из шести участков. Значительные корреляции не удалось наблюдать между потреблением раствора и с-ФОС активации в ядре (г (29) = 0,186), оболочка (г (29) = 0,029) или полное (г (29) = 0,10) NAC, прелимбальной ( г (29) = 0,23), infralimbic (г (29) = 0,30) или полное (г (29) = 0,14) MPFC, ВТА (г (29) = 0,10), спинной стриатуме (г (29) = 0,14 ) или базолатеральный (г (29) = 0,47), то центро-кортико-медиальной (г (29) = 0,48) или полное (г (29) = 0,409) ЭМИ. Учитывая высокую корреляцию между потреблением и AMY с-ФОС активации, далее корреляционнойции были выполнены для каждого отдельного решения. Достоверны (р <0,05, Таки HSD тест) отношения не удалось наблюдать между потреблением и AMY FLI для фруктозы (базолатеральная (г = 0,15), центро-кортико-медиальной (г = 0,13), всего (г = 0,13)), глюкоза (базолатеральная (г = 0,17), Центро-кортико-медиальное (г = 0,17), общая г = 0,13)), сахарин (базолатеральная (г = 0,42), Центро-кортико-медиальное (г = 0,42), всего (г = 0,42)) или кукурузное масло (базолатеральная (г = 0,54), центро-кортико-медиальной (г = 0,59), всего (г = 0,64)). Значительное (р <0,05, Таки HSD тест) отрицательная корреляция наблюдалась между ксантановая потребления жевательной резинки и общей AMY FLI (г = 0,94).

MPFC с-Fos активации
Кукурузное масло значительно (р <0,05, Таки HSD тест) увеличение общего (рис 2А), infralimbic (Фигура 2В) и прелимбальной (рис 2С) MPFC с-Fos считается по отношению к воде (*) или контроль ксантановая камедь(#). Значительно фруктоза (р <0,05, Таки HSD тест) увеличился рассчитывает с-Fos в infralimbic MPFC по отношению к воде (*) или сахарин (+) (рис 2В), но не полные или прелимбальной счетчики MPFC. В противоположность этому , глюкоза или сахарин не в состоянии изменить общее, perilimbic или infralimbic рассчитывает MPFC с-Fos. Рисунок 3 показывает типичные секции MPFC животных , показывая повышенную кукурузного масла индуцированное-FLI по отношению к воде.

фигура 2
Рисунок 2. жира или сахара Потребление Дифференциально Увеличивает с-ФОС активации в медиальной префронтальной коры (MPFC). Изменения в с-ФОС активации (среднее ± SEM) отмечены во всем MPFC (Группа A), в infralimbic области MPFC (Панель в), а прелимбальной площадь MPFC (Панель С) после потребления (1 час) воды, сахарин (0,2%), Ксантановая камедь (контроль за кукурузного масла), глюкоза (8%), фруктозу (8%) или кукурузное масло (3,5%). (Ранее опубликованные 69.) Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3. Фактическое MPFC C-FOS Активация После жирах и сахарами. С-FOS активация наблюдалась у животных , подвергнутых потребление кукурузного масла (панели A (4-кратное увеличение) и С (10-кратное увеличение)) , что было значительно больше , чем потребление воды (панели в (4-кратное увеличение) и D (10-кратное увеличение)). Представление очерченных подобластей прелимбальной (PL) и infralimbic (IL) MPFC являются в Панели схематически А (кукурузное масло) и C (вода), а являются частью тшлангов панели (А и С) увеличенных до 10-кратным увеличением в соответствующих панелей (B и D). Стрелки в панелях C и D показывают репрезентативные с-ФОС положительных клеток. Все масштабные линейки 100 мкм. (Ранее опубликованные 69.) Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

ЭМИ с-Fos активации
Кукурузное масло значительно (р <0,05, Таки HSD тест) увеличение общего AMY (рис 4A), базолатеральная (рис 4б) и центрально-кортико-медиальное (рис 4C) подобласть ЭМИ с-Fos считает по отношению к воде (*) или управление ксантановая камедь (#). Глюкоза также значительно (р <0,05, Таки HSD тест) увеличение общего (рис 4A), базолатеральная (4В) и центрально-кортико-медиальное ( (рис 4A) и центрально-кортико-медиальное подобласть (рис 4С) из AMY с-Fos считается по отношению к воде (*) или сахарин (+), но не в базолатеральная AMY подзоны. Сахарин не в состоянии изменить общее, базолатеральная или центрально-кортико-медиальное ЭМИ с-Fos считает по отношению к воде. Подробный анализ отдельных ядер в пределах AMY показало, что значительные изменения, отмеченные в базолатеральной области AMY были также отмечены в отдельных базолатеральных и боковых ядер Amy. Существенные изменения , отмеченные в центрально-кортико-медиальной области AMY были также отмечены в отдельных центральных, коркового и медиальной AMY ядер. На рисунке 5 представлены типичные секции AMYживотных, показывающих увеличение кукурузы, эксплуатации нефтяных глюкозой, фруктозой и индуцированный FLI по отношению к воде. (Ранее опубликованные 69.)

Рисунок 4
Рисунок 4. жира или сахара Потребление Дифференциально Увеличивает с-ФОС активации в миндалине (Amy). Изменения в с-ФОС активации (среднее ± SEM) отмечены во всем AMY (Группа А), базолатеральный площадь ЭМИ (панель B) , а центральный-кортико-медиальное область ЭМИ (Панель с) после потребления (1 час) воды, сахарин, ксантановая камедь, глюкоза, фруктоза или кукурузное масло. Существенные изменения, отмеченные в базолатеральной области AMY были также отмечены в отдельных базолатеральных и боковых ядер Amy. Существенные изменения, отмеченные в центрально-кортико-медиальной области AMY были также отмечены в отдельных центральных, коры головного мозга и медиальных ядер Amy. (Ранее опубликованные 69.) Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 5
Рисунок 5. Фактическая ЭМИ с-ФОС Активация После жирам и сахарами. C-FOS активации наблюдалась у животных , подвергнутых водозаборах кукурузного масла (панели А (4-кратное увеличение), D (10-кратное увеличение) и G (60- кратным увеличением)), глюкоза (панели В (4-кратное увеличение) и Е (10-кратное увеличение)), и фруктозу (панели C (4-кратное увеличение) и F (10-кратное)) , которые были значительно выше , чем у забора воды (панели H (4-кратное увеличение) и I (10-кратное увеличение)). представительствочетко определенная подобласти Центрально-кортико-медиальной (CMC) и базолатеральный (БЛА) AMY являются схематически в панели A (кукурузное масло), B (глюкоза), C ​​(фруктоза) и Н (вода), а являются частью из этих панелей (а, в, с и Н) увеличенными до 10-кратное увеличение в соответствующих панелях (D, E, F и I). Очерчены подобласть в панели D (кукурузное масло, 10-кратное увеличение) увеличивается до 60-кратным увеличением в панели D. Стрелки в панелях D, E, F, G и I показывают репрезентативные с-ФОС положительных клеток. Все масштабные линейки 100 мкм, для панели G (50 мкм), за исключением. (Ранее опубликованные 69.) Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

NAC с-Fos активации
Кукурузное масло значительно (р <0,05, Таки HSD тест) увеличение общего (6А) и ядро ( (фиг.6С). Значительно Глюкоза (р <0,05, Таки HSD тест) увеличился рассчитывает с-Fos в ядре NAC (рис 6б), но не в общей НСС или НСС оболочки по отношению к сахарин (+) или воды (*). В противоположность этому , фруктоза и сахарин не в состоянии отличаться от воды в выявляя активации с-Fos в ядре НСС и / или оболочки. На рисунке 7 показано репрезентативные участки в ядре NAc животных , показывающих увеличение кукурузы или эксплуатации нефтяных вызываемую глюкозой FLI по отношению к воде ,

Рисунок 6
Рисунок 6. жира или сахара Потребление Дифференциально Увеличивает с-FOS активации в NAC. Изменения в с-ФОС активации (среднее ± SEM) во всем NAC (панель А), ядро NAC (панель B), и оболочки NAC (Панель С) после потребления (1 час) воды, сахарин, ксантановая камедь, глюкоза, фруктоза или кукурузное масло. (Ранее опубликованные 69.) Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 7
Рисунок 7. Фактическая НСС ядро, но не NAC оболочка С-FOS Activation Вслед жиров и сахаров. С-FOS активация наблюдалась у животных , подвергнутых потреблениями кукурузного масла (панели A (4-кратное увеличение), D (10-кратное увеличение ) и G (60-кратное увеличение)) и глюкоза (панели в (4-кратное увеличение) и Е (10-кратное увеличение)) , что было значительно больше , чем у забора воды (панели с (4-кратное увеличение) и F (10-кратный Magnificaции)). Представление очерченных подобластей ядра НСС и оболочки NAc являются схематически в панели A (кукурузное масло), B (глюкоза) и С (вода), а являются частью этих панелей (A, B, C и H) увеличено до 10-кратное увеличение в соответствующих панелей (D, Е и F). Очерчены подобласть в панели D (кукурузное масло, 10-кратное увеличение) увеличивается до 60-кратным увеличением в панели G. Стрелки в панелях D, E, F и G указывают на репрезентативные с-ФОС положительных клеток. Все масштабные линейки 100 мкм. (Ранее опубликованные 69.) Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Спинной Стриатальные с-Fos активации
Кукурузное масло значительно (р <0,05, Таки HSD тест) увеличился рассчитывает с-Fos в спинной стриатуме по отношению к воде (*) или ксантановая камедь (#) (Figurе 8А). Глюкоза или значительно фруктозы (р <0,05, Таки HSD тест) увеличился спинной полосатой FLI относительно сахарин (+) (рис 8а). В противоположность этому , сахарин не в состоянии отличаться от воды в выявляя спинные полосатой с-Fos активации. На рисунке 9 представитель спинные стриарные участки животных с повышенной кукурузы, эксплуатации нефтяных глюкозой или фруктозой-индуцированной FLI по отношению к воде.

Рисунок 8
Рисунок 8. жира или сахара Потребление Дифференциально Увеличивает с-ФОС активации в дорсальном стриатуме и брюшные тегментальной района. Спинной atriatal (группа А) и вентральной области покрышки (Группа B) изменения были отмечены на с-ФОС активации (среднее ± SEM) после расход (1 час) воды, сахарин, ксантановая камедь, глюкоза, фруктоза или кукурузное масло. (Ранее опубликованные 69.)

Рисунок 9
Рисунок 9. Фактическая Спинной Стриатальные C-FOS Активация После жирам и сахарами. C-FOS активации наблюдалась у животных , подвергнутых водозаборах кукурузного масла (панели А (4-кратное увеличение), D (10-кратное увеличение) и G (60 -кратно увеличение)), глюкоза (панели В (4-кратное увеличение) и Е (10-кратное увеличение)), фруктоза (Панели С (4-кратное увеличение) и F (10-кратное увеличение)) , что было значительно больше , чем у потребление воды (панели Н (4-кратное увеличение) и I (10-кратное увеличение)). Очерчены суб-аReas дорсальной стриатуме в Панели А (кукурузное масло), В (глюкоза), С (фруктоза) и Н (воды) показали, что увеличенное до 10-кратное увеличение в соответствующих панелей (D, E, F и I). Очерчены подобласть в панели D (кукурузное масло, 10-кратное увеличение) увеличивается до 60-кратным увеличением в панели G. Стрелки в панелях D, E, F и G указывают на репрезентативные с-ФОС положительных клеток. Все масштабные линейки 100 мкм, для панели G (50 мкм), за исключением. (Ранее опубликованные 69.) Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

ВТА C-Fos активации
Кукурузное масло значительно (р <0,05, Таки HSD тест) увеличился рассчитывает с-Fos в TH + VTA клеток по отношению к ксантановая камеди контроля (#) (рис 8b). В отличие от этого, глюкоза, фруктоза или сахарин не в состоянии изменять с-Fos отсчетов в ВТА по отношению к воде. На рисунке 10 репрезентативную TH + и th- и с-Fos-активированные клетки ВТА животных с повышенной кукурузного масла индуцированное-FLI по отношению к воде.

Рисунок 10
Рисунок 10. Фактическая Брюшной тегментальной Область C-FOS Активация После жирам и сахарами. ВТА C-FOS активации наблюдалась у животных , подвергшихся воздействию кукурузного масла (панели А (4-кратный) и С (10-кратное)) и воды (Панели B (4 раза) и D (10-кратное)). Черные стрелки указывают на типичные двойные меченных TH / C-FOS положительных клеток, в то время как серые стрелки показывают репрезентативные с-ФОС только клетки. Все масштабные линейки 100 мкм. (Ранее опубликованные 69.) Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

ove_content "ВОК: Keep-together.within-странице =" 1 "> Отношения с-Fos активации Среди сайтов и решений
Структура графов с-Fos у животных , подвергшихся воздействию кукурузного масла были выявлены значительные (р <0,05) положительная корреляция между ядром НСС и либо оболочки NAC (г = 0,971) или вся MPFC (г = 0,670), между прелимбальной MPFC и либо infralimbic MPFC (г = 0,940) или спинной стриатуме (г = 0,849), между infralimbic MPFC и спинной стриатуме (г = 0,749), между базолатеральной и центрально-кортико-медиальное AMY (г = 0,999), а также между спинной стриатуме и VTA (г = 0,723). В отличие от этого , структура графов с-Fos у животных , подвергшихся воздействию кукурузного масла были выявлены значительные (р <0,05) отрицательные корреляции между базолатеральной AMY и либо ядро NAC (г = -0,712) или оболочки (г = -0,708), а также между центрально-кортико-медиальное AMY и либо ядро ​​NAC (г = -0,712) или оболочки (г = -0,710) .The картина с-Fos подсчитывает в животных еXposed до глюкозы выявил значительные (р <0,05) положительная корреляция между прелимбальной и infralimbic MPFC (г = 0,930), между спинным стриатуме и ни ВТА (г = 0,821), базолатеральная (г = 0,910) или центрально-кортико-медиальная (г = 0,911) ЭМИ, а также между базолатеральной и центральной-кортико-медиальной (г = 0,999) ЭМИ. Структура графов с-Fos у животных , подвергшихся воздействию фруктозы были выявлены значительные (р <0,05) положительная корреляция между ядром НСС и либо оболочки NAC (г = 0,969) или прелимбальной MPFC (г = 0,740), между Североатлантическим оболочкой и прелимбальной MPFC (г = 0,733), между прелимбальной и infralimbic MPFC (г = 0,959), а также между базолатеральной и центрально-кортико-медиальное AMY (г = 0,996) .The структура графов с-Fos у животных , подвергшихся воздействию сахарином выявлено значимым (р <0,05) положительная корреляция между ядром НСС и NAc оболочки (г = 0,792), между оболочкой и спинным стриатуме NAC (г = 0,715), а также между прелимбальной MPFC ай infralimbic MPFC (г = 0,999).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Цель исследования состояла в том, чтобы определить, является ли источник (ВТА) и переднего мозга цели проекции (NAC, AMY, MPFC) ДА вознаграждение связанных нейронов одновременно активируется после нового приема жира и сахара у крыс с помощью клеточного с-ФОС технику , Настоящее исследование представляет собой подробное описание протоколов исследования , опубликованного ранее 69. Была выдвинута гипотеза о том , что VTA, его основные зоны проекции к прелимбальной и infralimbic MPFC, ядра и оболочки NAC и базолатеральная и центрально-кортико-медиальной AMY, а также спинной стриатуме будет выступать в качестве распределенной сети мозга 24 -27, а также отображать скоординированы и одновременное FLI следующее новое потребление глюкозы (8%), фруктоза (8%) или кукурузное масло (3,5%) растворов относительно сахарина (0,2%), вода и другие решения управления. Кукурузное масло, глюкоза и фруктоза, а не сахарин всасываемого произвел активацию значительной и дифференциальный FLI из ВТА, прелимбальной и infralimbic MpFC, ядро ​​и оболочка NAC, базолатеральной и центрально-кортико-медиальной AMY, а спинной стриатуме. В дополнение к С-FOS техники, были использованы поведенческие показатели сахара, жира и искусственного потребления подсластителей.

Одним из наиболее важных этап включал своевременный отбор проб потребления таким образом, чтобы они были бы сравнительно равных условиях, тем самым гарантируя, что любые различия в с-ФОС активации через сайты были обусловлены решением потребляются скорее либо образец или величину потребления. Четыре дня исходных показателей потребления сахарина гарантировал, что пищевые ограничением животных образцы решения быстро, и тем самым свести к минимуму неспецифические эффекты. Вторым важным шагом было то, что процедура вызвала минимальный стресс или новизны к животным, как изменения в эмоциональной валентности не зависит от приема типа также может производить с-ФОС активации. Таким образом, результаты обеспечивают убедительное "доказательство концепции" для эффективности такого подхода и протоколов, касающихсяопределить , является ли острое воздействие жира (например, кукурузное масло), сахар (глюкоза и фруктоза) и растворы без калорийным подсластителем (сахарин) одновременно активировать DA-опосредованных ROI'S в манере наводит на мысль о скоординированной распределенной системы мозга 24-27.

Поскольку активация оптимальной с-Fos требует чувствительных ко времени реакции перед умерщвлением 51,52, ранее утвержденные процедуры 42,44 развернутое образцов раствора с короткой задержкой в тесте на 1-час. Таким образом, продукты питания ограничены крысы были обучены с 0,2% -ного раствора сахарина (10 мл, 1 час) в течение 4-х дней, и дал испытуемый раствор на пятый день. Базовые сахарин и воздухозаборники значительно прогрессивно увеличивается, а фруктоза и глюкоза, но не кукурузное масло или сахарин воздухозаборники на пятый день были значительно выше, чем четвертый день сахарин потребления. Следовательно, решения, связанные с увеличением FLI значительно увеличился (глюкоза, фруктоза), либо не влияет (кукурузное масло) всасываемого повторнонигиляционными к предыдущей тренировки сахарин, и, как представляется, опосредовано через поведенческого механизма стимулирования вознаграждения, связанных с. Особое внимание необходимо принять, чтобы обеспечить отбор проб и равенство поведения. Другие исследователи могут эффективно использовать эту процедуру для изучения других типов новых решений или внести изменения в парадигме, чтобы понять механизмы, связанные с адаптацией и обучением.

Преимуществом настоящего протокола является возможность сравнить эффекты хорошо изученных сахаров (фруктоза, глюкоза) и жиров (кукурузное масло) и сравнить их с-ФОС активации эффектов с чем важных элементов управления (не-калорийный подсластитель, сахарин, контрольный эмульгатор, ксантановая камедь, и вода), а затем изучить эти эффекты через шесть смежных участков мозга. Хотя такой подход имеет очевидные преимущества в позволять одновременное обследование через мозговые участки различных приятных на вкус веществ, он имеет недостаток, заключающийся в производстве потенциально астрономический набор данныхиз клеток, воспроизводящих нейронную экспрессию. Для того, чтобы сделать это более управляемым, мы приняли подход анализа трех представительных корональных срезов для каждого сайта, общего для всех животных во всех условиях тестирования. Это, конечно, сопровождается оговоркой выбора соответствующих уровней каждого ROI в этих трех разделах. Учитывая широкий ростро-хвостового степень ЭМИ, NAC, MPFC, спинной стриатуме и ВТА, это предостережение не следует принимать всерьез. Кроме того, именно тогда возложено на следователей быть последовательными в выборе точно каждый из трех репрезентативных участков во всех животных на всех сайтах. Незначительные ошибки в таком выборе может привести к "ложных срабатываний" и "ложноотрицательных". Эффективность подсчета также является актуальной переменной. Наше решение для этого потенциала посрамить было назначить два неосведомленных для каждого оценщиков секции в каждом ROI, а затем обеспечить надежность между оценщик (с использованием корреляции отсчетов) всегда превышал 0,8. Такой подход, в то время как DUPLicative, дал нам гораздо большую уверенность в точности, как надежность между рейтер легко превысили этот минимальный критерий. Были проанализированы субрегионов НКС (ядро по сравнению с оболочкой), ЭМИ (BaSO-латеральной против центрально-кортико-медиальной) и MPFC (perilimbic против infralimbic). Эти регионы можно разделить дальше, в частности, отдельные ядра AMY, патч и матричных отсеков спинного стриатума, и NAC оболочки (вершина, дуга, конус, промежуточная зона). Поскольку НКС оболочка не в состоянии последовательно отображать изменения в FLI следующие кукурузное масло, глюкоза или фруктоза, далее подразделены анализ этой структуры не была выполнена. Окончательное рассмотрение накладными и матричных зон спинного стриатума требует дальнейшего иммуногистохимических методов, которые не были заняты в настоящем исследовании, но было бы важным последующие исследования. Анализ отдельных ядер Amy внутри каждого субрегиона также будет дополнительное исследование в будущем.

Предыдущие исследования показали, что SUCвыросли потребление увеличилось FLI в центральном ядре AMY, ВТА, а также оболочка, но не ядро, из NAC, но устные или IG сахарин настои являются в основном неэффективными 55-57, 60-62. Глюкоза и фруктоза потребление сахара вызвало специфические эффекты на FLI с эффективными в центрально-кортико-медиальной AMY и спинной стриатуме, бывший эффективным в ядре НСС и базолатеральной AMY, а последний эффективен в infralimbic MPFC. потребление сахарина не вызывали каких-либо изменений в FLI в любом месте по отношению к воде. Жир потребление также увеличилось FLI в accumbal и MPFC сайтов в предыдущих исследованиях 65-67, и произвел одновременное значительное активацию в VTA, infralimbic и прелимбальной MPFC, спинной стриатуме, ядром NAC и базолатеральный и центрально-кортико-медиальное ЭМИ.

Хотя предыдущие исследования показали, что сахар и жир потребление индуцированных FLI в отношении переднего мозга мезо-корково и Nigro-полосатого системах ПДР, настоящее исследование систематическиоценивали одновременное срабатывание FLI в ВТА, базолатеральная и центрально-кортико-медиальное ЭМИ, спинной стриатуме, прелимбальной и infralimbic ядро ​​MPFC, НСС и оболочки после острого потребления кукурузного масла, фруктоза, глюкоза или сахарин. Значительное увеличение FLI были высоко связаны друг с другом через сайты переднего мозга, поддерживая идею распределенной сети активации мозга, опосредующего сахара и жиров. Такие протоколы, идентифицирующие одновременных изменений в нескольких локусах мозга могут быть использованы при хронических и дребезжание условиях, а также в соответствии с кондиционерами и предпочтений. Эти исследования показывают, что сильный анатомический коррелируют (C-FOS) могут быть эффективно использованы в нескольких местах мозга одновременно, чтобы определить кандидатов на посредническую вкусную потребления и предпочтения у животных, которые могут дать представление о медицинских условий человека, связанных с ожирением, диабетом и другими расстройствами пищевого поведения ,

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют конкурирующих финансовых интересов.

Acknowledgments

Благодаря Diana Икаса-Culaki, Cristal Sampson и Theologia Karagiorgis за их напряженную работу над этим проектом.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Sprague-Dawley rats Charles River Laboratories CD-1
Wire Mesh Cages Lab Products, Seaford, DE 30-Cage rack
Rat Chow PMI Nutrition International 5001
Taut Metal Spring Lab Products, Seaford, DE n/a
Rat Weighing Scale Fisher Scientific Company n/a
Nalgene Centrifuge Tubes Lab Products, Seaford, DE 10-0501
Rubber Stopper Lab Products, Seaford, DE n/a
Metal Sippers Lab Products, Seaford, DE n/a
Saccharin Sigma Chemical Co 82385-42-0
Kool-Aid, Cherry Kool-Aid Commerical
Kool-Aid, Grape Kool-Aid Commercial
Fructose Sigma Chemical Co F0127
Glucose Sigma Chemical Co G8270
Corn Oil Mazzola Commerical
Xanthan Gum Sigma Chemical Co 11138-66-2
Sliding Microtome Microm International n/a
Neurolucida Camera MBF Bioscience Software application
Gelatin-coated Slides Fisher Scientific Company 12-550-343
Cover glass Fisher Scientific Company 12-545-M
Golden Nylon Brushes Loew-Cornell  2037
Natural Hair Sable  Loew-Cornell  2022
24 Well Plates Fisher Scientific 3527
6 Well Plates Fisher Scientific 3506
1 L Pyrex bottles Fisher Scientific 1395-1L
Tissue insert (tissue strainer) Fisher Scientific 7200214
Eagle pipettes  World Precision Instruments E10 for 1-10μl
Eagle pipettes  World Precision Instruments E100 for 20-100μl
Eagle pipettes  World Precision Instruments E200 for 50-200μl
Eagle pipettes  World Precision Instruments E1000 for 100-1000μl
Eagle pipettes  World Precision Instruments E5000 for 1000-5000μl 
Universal Tips .1-10 μl World Precision Instruments 500192
Universal Tips 5-200 μl World Precision Instruments 500194
Universal Tips 500-5,000 μl World Precision Instruments 500198
Blade Vibroslice 100 World Precision Instruments BLADE
DPX Mounting Medium  Electron Microscopy  13510
15 ml centrifuge tubes Biologix Research Co. 10-0501
Slide Boxes Biologix Research Co. 41-6100
Orbital Shaker  Madell Corporation   ZD-9556
weigh boats  Fisher Scientific 02-202-100
5 ml disposable pipettes Fisher Scientific 13-711-5AM
Stereo Investigator Software Micro Bright Field Software application
Name Company Catalog number Comments
Reagents
Paraformaldehyde Granular Fisher Scientific 19210
NaCl Fisher Scientific S271-1
Sodium Phophate Monobasic Fisher Scientific S468-500
Sodium Phosphate Diphasic Fisher Scientific BP332-500
Hydrogen Peroxide  Fisher Scientific H324-500
SafeClear II  Fisher Scientific 23-044-192
Methanol  Fisher Scientific A412-1
Normal Goat Serum Vector S-1000
Biotinylated Anti-Rabbit IgG (H+L) Vector BA-1000
ABC Kit Peroxidase Standard Vector PK-4000
Anti-cFos (Ab-5) Rabbit EMD chem/Cal Biochem PC38
Triton X 100 SigmaAldrich X-100
3,3' diaminobenzidine tetra hydrochloride  SigmaAldrich D5905
Sodium Hydroxide SigmaAldrich 5881
Primary TH anti body EMD Millipore AB152
Euthosol Virbac AH

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Koob, G. F. Neural mechanisms of drug reinforcement. Ann. N.Y. Acad. Sci. 654, 171-191 (1992).
  2. Wise, R. A. Role of brain dopamine in food reward. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 361, 1149-1158 (2006).
  3. Salamone, J. D., Correa, M. The mysterious motivational functions of mesolimbic dopamine. Neuron. 76, 470-485 (2012).
  4. Horvitz, J. C., Choi, W. Y., Morvan, C., Eyny, Y., Balsam, P. D. A "good parent" function of dopamine: transient modulation of learning and performance during early stages of training. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1104, 270-288 (2007).
  5. Wickens, J. R., Horvitz, J. C., Costa, R. M., Killcross, S. Dopaminergic mechanisms in actions and habits. J. Neurosci. 27, 8181-8183 (2007).
  6. Bjorklund, A., Dunnett, S. B. Dopamine neuron systems in the brain: an update. Trends Neurosci. 30, 194-202 (2007).
  7. Swanson, L. W. The projections of the ventral tegmental area and adjacent regions: a combined fluorescent retrograde tracer and immunofluorescence study in the rat. Brain Res. Bull. 9, 321-353 (1982).
  8. Cacciapaglia, F., Wrightman, R. M., Careli, R. M. Rapid dopamine signaling differentially modulates distinct microcircuits within the nucleus accumbens during sucrose-directed behavior. J. Neurosci. 31, 13860-13869 (2011).
  9. Martinez-Hernandez, J., Lanuza, E., Martinez-Garcia, F. Selective dopaminergic lesions of the ventral tegmental area impair preference for sucrose but not for male sex pheromones in female mice. Eur. J. Neurosci. 24, 885-893 (2006).
  10. Bassareo, V., Di Chiara, G. Differential influence of associative and nonassociative learning mechanisms on the responsiveness of prefrontal and accumbal dopamine transmission to food stimuli in rats fed ad libitum. J. Neurosci. 17, 851-861 (1997).
  11. Bassareo, V., Di Chiara, G. Differential responsiveness of dopamine transmission to food-stimuli in nucleus accumbens shell/core compartments. Neurosci. 89, 637-641 (1999).
  12. Cheng, J., Feenstra, M. G. Individual differences in dopamine efflux in nucleus accumbens shell and core during instrumental conditioning. Learn. Mem. 13, 168-177 (2006).
  13. Genn, R. F., Ahn, S., Phillips, A. G. Attenuated dopamine efflux in the rat nucleus accumbens during successive negative contrast. Behav. Neurosci. 118, 869-873 (2004).
  14. Hajnal, A., Norgren, R. Accumbens dopamine mechanisms in sucrose intake. Brain Res. 904, 76-84 (2001).
  15. Hajnal, A., Smith, G. P., Norgren, R. Oral sucrose stimulation increases accumbens dopamine in the rat. Am. J. Physiol. 286, R31-R37 (2003).
  16. Bassareo, V., Di Chiara, G. Modulation of feeding-induced activation of mesolimbic dopamine transmission by appetitive stimuli and its relation to motivational state. Eur. J. Neurosci. 11, 4389-4397 (1999).
  17. Hajnal, A., Lenard, L. Feeding-related dopamine in the amygdala of freely moving rats. Neuroreport. 8, 2817-2820 (1997).
  18. Bassareo, V., De Luca, M. A., Di Chiara, G. Differential expression of motivational stimulus properties by dopamine in nucleus accumbens shell versus core and prefrontal cortex. J. Neurosci. 22, 4709-4719 (2002).
  19. Feenstra, M., Botterblom, M. Rapid sampling of extracellular dopamine in the rat prefrontal cortex during food consumption, handling, and exposure to novelty. Brain Res. 742, 17-24 (1996).
  20. Hernandez, L., Hoebel, B. G. Feeding can enhance dopamine turnover in the prefrontal cortex. Brain Res. Bull. 25, 975-979 (1990).
  21. Liang, N. C., Hajnal, A., Norgren, R. Sham feeding corn oil increases accumbens dopamine in the rat. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 291, R1236-R1239 (2006).
  22. Dunnett, S. B., Iversen, S. D. Regulatory impairments following selective kainic acid lesions of the neostriatum. Behav. Brain Res. 1, 497-506 (1980).
  23. Salamone, J. D., Zigmond, M. J., Stricker, E. M. Characterization of the impaired feeding behavior in rats given haloperidol or dopamine-depleting brain lesions. Neurosci. 39, 17-24 (1990).
  24. Kelley, A. E. Ventral striatal control of appetitive motivation: role in ingestive behavior and reward-related learning. Neurosci. Biobehav. Rev. 27, 765-776 (2004).
  25. Kelley, A. E. Memory and addiction: shared neural circuitry and molecular mechanisms. Neuron. 44, 161-179 (2004).
  26. Kelley, A. E., Baldo, B. A., Pratt, W. E. A proposed hypothalamic-thalamic-striatal axis for the integration of energy balance, arousal and food reward. J. Comp. Neurol. 493, 72-85 (2005).
  27. Kelley, A. E., Baldo, B. A., Pratt, W. E., Will, M. J. Corticostriatal-hypothalamic circuitry and food motivation: integration of energy, action and reward. Physiol. Behav. 86, 773-795 (2005).
  28. Berendse, H. W., Galis-de-Graaf, Y., Groenewegen, H. J. Topographical organization and relationship with ventral striatal compartments of prefrontal corticostriatal projections in the rat. J. Comp. Neurol. 316, 314-347 (1992).
  29. Brog, J. S., Salyapongse, A., Deutch, A. Y., Zahm, D. S. The patterns of afferent innervation of the core and shell in the "accumbens" part of rat ventral striatum: immunohistochemical detection of retrogradely transported fluoro-gold. J. Comp. Neurol. 338, 255-278 (1993).
  30. McDonald, A. J. Organization of amygdaloid projections to the prefrontal cortex and associated stritum in the rat. Neurosci. 44, 1-14 (1991).
  31. McGeorge, A. J., Faull, R. L. The organization of the projection from the cerebral cortex to the striatum in the rat. Neurosci. 29, 503-537 (1989).
  32. Sesack, S. R., Deutch, A. Y., Roth, R. H., Bunney, B. S. Topographical organization of the efferent projections of the medial prefrontal cortex in the rat: an anterograde tract-tracing study with Phaseolus vulgaris leucoagglutinin. J. Comp. Neurol. 290, 213-242 (1989).
  33. Wright, C. I., Beijer, A. V., Groenewegen, H. J. Basal amygdaloid complex afferents to the rat nucleus accumbens are compartmentally organized. J. Neurosci. 16, 1877-1893 (1996).
  34. Wright, C. I., Groenewegen, H. J. Patterns of convergence and segregation in the medial nucleus accumbens of the rat: relationships of prefrontal cortical, midline thalamic and basal amygdaloid afferents. J. Comp. Neurol. 361, 383-403 (1995).
  35. Geary, N., Smith, G. P. Pimozide decreases the positive reinforcing effect of sham fed sucrose in the rat. Pharmacol. Biochem. Behav. 22, 787-790 (1985).
  36. Muscat, R., Willner, P. Effects of selective dopamine receptor antagonists on sucrose consumption and preference. Psychopharmacol. 99, 98-102 (1989).
  37. Schneider, L. H., Gibbs, J., Smith, G. P. D-2 selective receptor antagonists suppress sucrose sham feeding in the rat. Brain Res. Bull. 17, 605-611 (1986).
  38. Baker, R. W., Osman, J., Bodnar, R. J. Differential actions of dopamine receptor antagonism in rats upon food intake elicited by mercaptoacetate or exposure to a palatable high-fat diet. Pharmacol. Biochem. Behav. 69, 201-208 (2001).
  39. Rao, R. E., Wojnicki, F. H., Coupland, J., Ghosh, S., Corwin, R. L. Baclofen, raclopride and naltrexone differentially reduce solid fat emulsion intake under limited access conditions. Pharmacol. Biochem. Behav. 89, 581-590 (2008).
  40. Weatherford, S. C., Smith, G. P., Melville, L. D. D-1 and D-2 receptor antagonists decrease corn oil sham feeding in rats. Physiol. Behav. 44, 569-572 (1988).
  41. Azzara, A. V., Bodnar, R. J., Delamater, A. R., Sclafani, A. D1 but not D2 dopamine receptor antagonism blocks the acquisition of a flavor preference conditioned by intragastric carbohydrate infusions. Pharmacol. Biochem. Behav. 68, 709-720 (2001).
  42. Baker, R. M., Shah, M. J., Sclafani, A., Bodnar, R. J. Dopamine D1 and D2 antagonists reduce the acquisition and expression of flavor-preferences conditioned by fructose in rats. Pharmacol. Biochem. Behav. 75, 55-65 (2003).
  43. Dela Cruz, J. A., Coke, T., Icaza-Cukali, D., Khalifa, N., Bodnar, R. J. Roles of NMDA and dopamine D1 and D2 receptors in the acquisition and expression of flavor preferences conditioned by oral glucose in rats. Neurobiol. Learn. Mem. 114, 223-230 (2014).
  44. Dela Cruz, J. A., et al. Roles of dopamine D1 and D2 receptors in the acquisition and expression of fat-conditioned flavor preferences in rats. Neurobiol. Learn. Mem. 97, 332-337 (2012).
  45. Yu, W. Z., Silva, R. M., Sclafani, A., Delamater, A. R., Bodnar, R. J. Pharmacology of flavor preference conditioning in sham-feeding rats: effects of dopamine receptor antagonists. Pharmacol. Biochem. Behav. 65, 635-647 (2000).
  46. Yu, W. Z., Silva, R. M., Sclafani, A., Delamater, A. R., Bodnar, R. J. Role of D(1) and D(2) dopamine receptors in the acquisition and expression of flavor-preference conditioning in sham-feeding rats. Pharmacol. Biochem. Behav. 67 (1), 537-544 (2000).
  47. Touzani, K., Bodnar, R. J., Sclafani, A. Activation of dopamine D1-like receptors in nucleus accumbens is critical for the acquisition, but not the expression, of nutrient-conditioned flavor preferences in rats. Eur. J. Neurosci. 27, 1525-1533 (2008).
  48. Touzani, K., Bodnar, R. J., Sclafani, A. Dopamine D1-like receptor antagonism in amygdala impairs the acquisition of glucose-conditioned flavor preference in rats. Eur. J. Neurosci. 30, 289-298 (2009).
  49. Touzani, K., Bodnar, R. J., Sclafani, A. Acquisition of glucose-conditioned flavor preference requires the activation of dopamine D1-like receptors within the medial prefrontal cortex in rats. Neurobiol. Learn. Mem. 94, 214-219 (2010).
  50. Malkusz, D. C., et al. Dopamine signaling in the medial prefrontal cortex and amygdala is required for the acquisition of fructose-conditioned flavor preferences in rats. Behav. Brain Res. 233, 500-507 (2012).
  51. Bernal, S. Y., et al. Role of dopamine D1 and D2 receptors in the nucleus accumbens shell on the acquisition and expression of fructose-conditioned flavor-flavor preferences in rats. Behav. Brain Res. 190, 59-66 (2008).
  52. Bernal, S. Y., et al. Role of amygdala dopamine D1 and D2 receptors in the acquisition and expression of fructose-conditioned flavor preferences in rats. Behav. Brain Res. 205, 183-190 (2009).
  53. Dragunow, M., Faull, R. The use of c-fos as a metabolic marker in neuronal pathway tracing. J. Neurosci. Methods. 29, 261-265 (1989).
  54. VanElzakker, M., Fevurly, R. D., Breindel, T., Spencer, R. L. Environmental novelty is associated with a selective increase in Fos expression in the output elements of the hippocampal formation and the perirhinal cortex. Learn. Mem. 15, 899-908 (2008).
  55. Norgren, R., Hajnal, A., Mungarndee, S. S. Gustatory reward and the nucleus accumbens. Physiol. Behav. 89, 531-535 (2006).
  56. Park, T. H., Carr, K. D. Neuroanatomical patterns of fos-like immunoreactivity induced by a palatable meal and meal-paired environment in saline- and naltrexone-treated rats. Brain Res. 805, 169-180 (1998).
  57. Zhao, X. L., Yan, J. Q., Chen, K., Yang, X. J., Li, J. R., Zhang, Y. Glutaminergic neurons expressing c-Fos in the brainstem and amygdala participate in signal transmission and integration of sweet taste. Nan.Fang Yi.Ke.Da.Xue.Xue.Bao. 31, 1138-1142 (2011).
  58. Mungarndee, S. S., Lundy, R. F., Norgren, R. Expression of Fos during sham sucrose intake in rats with central gustatory lesions. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 295, R751-R763 (2008).
  59. Otsubo, H., Kondoh, T., Shibata, M., Torii, K., Ueta, Y. Induction of Fos expression in the rat forebrain after intragastric administration of monosodium L-glutamate, glucose and NaCl. Neurosci. 196, 97-103 (2011).
  60. Yamamoto, T., Sako, N., Sakai, N., Iwafune, A. Gustatory and visceral inputs to the amygdala of the rat: conditioned taste aversion and induction of c-fos-like immunoreactivity. Neurosci. Lett. 226, 127-130 (1997).
  61. Mitra, A., Lenglos, C., Martin, J., Mbende, N., Gagne, A., Timofeeva, E. Sucrose modifies c-fos mRNA expression in the brain of rats maintained on feeding schedules. Neurosci. 192, 459-474 (2011).
  62. Pecoraro, N., Dallman, M. F. c-Fos after incentive shifts: expectancy, incredulity, and recovery. Behav. Neurosci. 119, 366-387 (2005).
  63. Hamlin, A. S., Blatchford, K. E., McNally, G. P. Renewal of an extinguished instrumental response: Neural correlates and the role of D1 dopamine receptors. Neurosci. 143, 25-38 (2006).
  64. Kerfoot, E. C., Agarwal, I., Lee, H. J., Holland, P. C. Control of appetitive and aversive taste-reactivity responses by an auditory conditioned stimulus in a devaluation task: A FOS and behavioral analysis. Learn. Mem. 14, 581-589 (2007).
  65. Zhang, M., Kelley, A. E. Enhanced intake of high-fat food following striatal mu-opioid stimulation: microinjection mapping and fos expression. Neurosci. 99, 267-277 (2000).
  66. Teegarden, S. L., Scott, A. N., Bale, T. L. Early life exposure to a high fat diet promotes long-term changes in dietary preferences and central reward signaling. Neurosci. 162, 924-932 (2009).
  67. Del Rio, D., et al. Involvement of the dorsomedial prefrontal cortex in high-fat food conditioning in adolescent mice. Behav. Brain Res. 283, 227-232 (2015).
  68. Knapska, E., Radwanska, K., Werka, T., Kaczmarek, L. Functional internal complexity of amygdala: focus on gene activity mapping after behavioral training and drugs of abuse. Physiol. Rev. 87, 1113-1173 (2007).
  69. Dela Cruz, J. A. D., et al. c-Fos induction in mesotelencephalic dopamine pathway projection targets and dorsal striatum following oral intake of sugars and fats in rats. Brain Res. Bull. 111, 9-19 (2015).
  70. Paxinos, G., Watson, C. The rat brain in stereotaxic coordinates. , Elsevier. (2006).
  71. Ranaldi, R., et al. The effects of VTA NMDA receptor antagonism on reward-related learning and associated c-fos expression in forebrain. Behav. Brain Res. 216, 424-432 (2011).

Tags

Neuroscience выпуск 114 биологическая психология C-FOS иммунореактивности потребление сахара потребление жира Награда Вкусовые Amygdala медиальная префронтальная кора головного мозга прилежащего ядра хвостатого / скорлупа вентральная область покрышки распределенной сети мозга
Одновременное обнаружение с-Fos активации от мезолимбическом и мезокортикальных Награда сайты Допамин После Наивное сахара и жира При приеме внутрь в Rats
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dela Cruz, J. A. D., Coke, T.,… More

Dela Cruz, J. A. D., Coke, T., Bodnar, R. J. Simultaneous Detection of c-Fos Activation from Mesolimbic and Mesocortical Dopamine Reward Sites Following Naive Sugar and Fat Ingestion in Rats. J. Vis. Exp. (114), e53897, doi:10.3791/53897 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter