Summary
本研究の目的は、ラットの脂肪と砂糖の新規摂取後のドーパミン経路と端末サイトにおける同時変化を測定するために、携帯のc-fosの活性化を使用して、信頼性の高い免疫組織学的手法を描くことで報酬関連の分散型の脳のネットワークを識別することです。
Abstract
この研究は、ラットにおける脳内のドーパミン（DA）経路上の脂肪と砂糖の新規摂取の効果を評価するための細胞のc-fosの活性化を使用しています。糖や脂肪の摂取量は、その生来の観光スポットだけでなく、学んだ嗜好によって媒介されます。脳ドーパミン、特にメソ大脳辺縁系と腹側被蓋野（VTA）からメソ - 皮質突起が、これらの未学習と学習した応答の両方に関与しています。いくつかのサイトと送信機/ペプチドシステムが対話前記分散脳ネットワークの概念は、口当たりのよい食物摂取を媒介することが提案されているが、経験的に、そのような行動を示す限られた証拠があります。したがって、砂糖の摂取は、DA放出を誘発し、側坐核を含む個別VTA DA投影ゾーンからのc-fosの様免疫反応性（FLI）（NAC）、扁桃体（AMY）を増加させ、前頭前皮質（のmPFC）だけでなく、背側線条体を内側。これらのサイトへの選択的DA受容体拮抗薬のさらに、集中管理糖または脂肪によって誘発さ条件付け味の好みの取得と発現を低下させる差別的です。これらのサイトは砂糖や脂肪の摂取量に応じて、分散脳のネットワークとして相互作用するかどうかを確認することにより、一つのアプローチは、VTAとその主要mesotelencephalic DA投影ゾーン（NACの縁前方のとinfralimbicのmPFC、コアとシェル、かどうかを評価連立することであろう基底外側および中央皮質内側AMY）だけでなく、背側線条体はコーン油（3.5％）、グルコース（8％）、フルクトース（8％）とサッカリン（0.2の経口、無条件摂取した後に調整され、同時FLIの活性化を表示するであろう％）ソリューション。このアプローチは、げっ歯類で口当たりの良い食物の摂取に報酬関連の学習を研究するために、関連する脳部位で同時に携帯のc-fosの活性化を使用することの実現可能性を同定することに成功した最初のステップです。
Introduction
脳ドーパミン（DA）が提案されたヘドニック1,2、努力関連の3と行動の習慣ベース4,5のメカニズムを通じて、口当たりのよい糖の摂取に中央応答に関与しています。これらの効果に関与する主要なDA経路は、腹側被蓋野（VTA）に由来し、側坐核（NAC）コアとシェル、基底外側および中央皮質内側扁桃体（AMY）、および縁前方のとinfralimbic内側へプロジェクト前頭前皮質（のmPFC）（レビュー6,7を参照）。 VTAは、ショ糖摂取8,9に関与している、とDA放出はNAC 10-15、AMY 16,17とのmPFC 18-20で砂糖の摂取後に観察されます。脂肪の摂取量はまた、DA NACは21を解放刺激し、背側線条体（尾状核被殻）への別のDA-豊富な投影ゾーンはまた、DA媒介送り22,23と関連していました。ケリー24-27は 、これらの複数のプロジェクトと提案しこのDA媒介システムのイオンゾーンは広範かつ緊密な相互接続28-34を介して統合された、インタラクティブな分散型の脳のネットワークを形成しました。
糖35-37および脂肪38-40の摂取量を減らすためにDA D1およびD2受容体アンタゴニストの能力に加えて、DAシグナリングはまた、コンディショニングフレーバーの嗜好（CFP）を生成する糖および脂肪の能力を媒介に関与しています41- 46。 NAC、AMYかのmPFC 47-49にDA D1受容体拮抗薬のマイクロインジェクションは、胃内グルコースによって誘発されたCFPの取得をなくします。 mPFCにDA D1またはD2受容体拮抗薬のいずれかの微量注入は、フルクトース-CFP 50の買収を排除するのに対し、フルクトース-CFPの取得及び発現が示差NACとAMY 51,52にDA拮抗薬によってブロックされています。
C-fosの技術53,54は、神経activatioを調査するために採用されていますnは、口当たりの良い摂取と神経の活性化によって誘導されます。用語「C-fosの活性化」とは、原稿全体で使用され、かつ作動ニューロンの脱分極中のc-Fosタンパク質の増加した転写により定義されます。ショ糖の摂取量は、NAC 55-57で、コア中央AMY核、VTAだけでなく、シェルでFOS様免疫反応性（FLI）を増加したが、ありません。偽摂食ラットにおけるショ糖摂取量は有意AMYとNACにFLIを増加ではなく、VTA 58、胃内スクロースまたはグルコース注入が大幅にNACとAMY 59,60の中央部と基底外側核においてFLIを増加させました。スケジュールされた飼料のアクセスにショ糖の繰り返し添加はNACシェルとコア61と同様のmPFCにFLIを増加させました。スクロース濃度のダウンシフトパラダイムが最大のFLIの増加は基底外側AMYとNACで発生したことを明らかにではなく、VTA 62。以下のコンディショニング、砂糖関連の自然REWAの絶滅目の行動は基底外側AMYとNAC 63にFLIを増加させました。また、トーンにペアリング砂糖の可用性は、その後側底AMY 64にFLIレベルを増加させるトーンをもたらしました。高脂肪の摂取量も、NACとのmPFCサイト65-67でFLIを増加させました。
以前に引用された研究のほとんどは、報酬に関連した分散型の脳のネットワーク24-27の識別に関する情報を提供していない単一のサイトにおけるc-fosの活性化に砂糖と脂肪の効果を調べました。また、研究の多くはまた、潜在的により調べることができたNAC（コアとシェル）、AMY（基底外側および中央皮質内側）とのmPFC（縁前方のとinfralimbic）のサブ領域の相対的な寄与を描写しませんでしたc-Fosのマッピング68に優れた空間、単一セルの解像度の利点。当研究室で69最近使用されたのc-fosの活性化と同時にVTA DA経路における測定の変化とそのプロジェクションゾーン（NAC、AMYとのmPFC）ラットにおける脂肪と糖の新規摂取後。本研究では、AMY、同時に6異なる溶液（コーン油、ブドウ糖、果糖、サッカリン、水及び脂肪乳剤コントロール）への急性曝露は差動でNACのサブエリアにFLIを活性化するかどうかを分析するための手続きと方法論的な手順を説明しますmPFCだけでなく、背側線条体。関連サイトでの変化と相関1の特定の部位の変化は、それによって、分散脳のネットワーク24-27のためのサポートを提供するか否かの各サイトと決意でFLIに重大な影響の確認を許可された差異のこの同時検出。試験されたこれらの手順は、VTA、縁前方のとinfralimbicのmPFC、NACのコアとシェル、および基底外側および中央皮質内側AMY）だけでなく、背側線条体whetherコーディネート表示していましたし、経口、無条件摂取後同時FLIの活性化グルコース（8％）、フルクトース（8％）、コーン油（3.5％）およびサッカリン（0.2％）溶液。
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Protocol
これらの実験プロトコルは、すべての被験者と手順は、ナショナルケアのための健康ガイドの研究所や実験動物の使用に適合していることを証明制度動物実験委員会によって承認されています。
1.被験者
- 購入および/または血統の雄Sprague-Dawleyラット（260〜300グラム）。
- 金網ケージで個別ハウスラット。ラット飼料と水を自由に摂取させて12時12時間の明/暗サイクルでそれらを維持します。
- 適切なサンプルサイズを割り当てます（例えば n≈6から8）ランダムにグループに。
2.試験装置とインテーク手順
- ゴム栓で較正遠心管を使用して、45°の角度金属シッパーチューブを提示溶液（0.1 mlの±）正確な測定を提供します。キャリブレーションの可視性を可能にするために、ピンと張った金属バネによりホームケージに固定します。
- 〜（食糧配給を制限溶液を消費する意欲を高めるために、元の体重の85％までの重量を低減するために、ラットの15 / G /日）。注： - 5日体重減少は3間取る必要があります。
- ラットは（1分未満）短い待ち時間で、その後のテストソリューションをサンプリングする確率を最大化するために、1時間のセッションで4日間0.2％サッカリンの事前トレーニングソリューション（10ミリリットル）を提供します。
- 数滴をこぼしことにより、遠心管を通る流れを確認してください。
- 摂取量測定値を得るために、各セッションの前と後の管を秤量します。
- A）水、b）の小説風味（0.05％チェリーフレーバー）0.2％サッカリン、c）は8％のフルクトース、D）8：6ソリューション（10ミリリットル、1時間）のいずれかを受けたサブグループに5日目吸気テストを実行します％グルコース、E）0.3％キサンタンガム中に懸濁し、3.5％のコーン油、およびf）0.3％キサンタンガム。
- 栄養溶液は等カロリーであることを確認します。このように、3.5％コーン油の濃度が8％糖液に等カロリーのです。
- 目を確認してください短い待ち時間（1分未満）を有するラットの試料溶液に。この要件が満たされない場合、その後の研究から被写体を捨てます。
3.組織標本
- 各試験溶液への最初の曝露後にペントバルビタール90分の腹腔内注射によって各動物を麻酔。動物が適切に深い耳介刺激に揺れ直接角膜の圧力や頭以下の点滅、動物はもはや足のピンチに撤退などの反射神経に応答することを実証しないことにより、麻酔されていることを確認。
- 以前69記載されているように経各動物を灌流。
- ペントバルビタールナトリウム（65 mgの/ kg）を過剰投与によりラットを麻酔、胸郭を削除し、心臓69への自由なアクセスのための胸を露出させます。
- 左の心臓弁の頂点に針を置き、大静脈を切りました。リン酸緩衝固定コ続いてリン酸緩衝液（PBS、~180 ml）を投与します4％パラホルムアルデヒド（~180 ml）をntaining。
- 動物が実際に液体は、鼻、口、および生殖器領域などの他の空洞を残しているかどうかを調べることによって正確に灌流されていることを確認してください。注：パラホルムアルデヒドで適切な固定は、大きな筋肉の動きを伴うことになります。これが発生しない場合には、この反応が起こるまで、針を再調整します。
- すぐに離れて頭蓋骨から毛や皮膚を切断して頭蓋骨から脳を削除してください。後方から前方に移動する脳から骨をクラックし、除去するために、骨鉗子を使用してください。骨鉗子、骨や髄膜軟膜の間にあることを確認して、小脳以下と背後の領域で最初に動作します。頭蓋骨の上部と側面が削除されると、ベースから脳を持ち上げるために、小さなへらを使用し、小さなハサミで脳神経を切り取ります。骨を削除しようとしたときに、脳に損傷を与えないように注意してください。
- 4℃で一晩4％パラホルムアルデヒド溶液中で脳を修正しました。彼らは容器の底に沈降するまで、室温で30％スクロース/ 70％PBS溶液中で脳を置きます。
- 脳をブロック
- 嗅球に対して横方向に尾を切断、脳の吻側部分を削除してください。
- 小脳や橋のレベルで横方向に切断し、脳の尾の部分を削除してください。
- + - （ブレグマに2.20ミリメートル吻側2.86）、NACのコアとシェルと背側線条体（スライディングミクロトームのステージに固定された尾部を冠状脳をマウントし、のmPFCを通じて冠状切片（40μm）をカット1.76 - ブレグマに1.60ミリメートル吻側）、AMY（-2.12 - ブレグマ-2.92ミリメートルの尾）、およびVTA（-5.20 - ブレグマ-5.60ミリメートルの尾）。指導のためのラット脳アトラス70を使用してください。
- 最終的な免疫組織化学的分析71のためにPBSで満たされた24ウェルプレートの個々のウェルに自由に浮遊セクションを収集します。 24私たちをシールするためにパラフィルムを使用して、LLプレートをPBSは、容器内に蒸発し、脳を乾燥しないことを確認します。 4℃で脳組織を保管してください。
（71から適応）4のc-fosの手順
- 5％正常ヤギ血清の5ミリリットルと0.2％トリトンX-100をPBS中で1時間で各セクションを扱います。
- 1mlのPBSを含むウェルで36時間4℃で：一次抗体で処理した切片（5,000ウサギ抗c-FOS、1）インキュベート。
- リンスのセクションでは、10分間、PBS（5ml）で3倍。
- 二次抗体とインキュベートする（ビオチン化ヤギ抗ウサギ; 1：200）を室温で2時間、1mlのPBSを含むウェルに。
- 10分ごとに、PBS中の各セクションの3倍（5ミリリットル）をすすぎます。
- 5mlのPBSでAvadin DH（100μL）およびビオチン化西洋ワサビペルオキシダーゼH（100μlの）で構成キットに付属市販のアビジン - 西洋ワサビペルオキシダーゼ混合物中で2時間すすぎセクションをインキュベートします。
- 再すすぎのセクションでは、PBで3倍10分間、S（5ml）中。
- DAB溶液5mlを含有するウェル中の組織の反応性に応じて、10分- 5用0.0015％のH 2 O 2の存在下で、0.05％ジアミノベンジジン（DAB）を用いて切片を反応させます。
- ダブルラベルVTAセクション。 4℃で一晩、PBS（5ml）溶液：チロシンヒドロキシラーゼ（TH）抗体（2,000ウサギ抗ラットTH、1）でそれらをインキュベートします。
- リンス切片は10分間ごとに、PBS（5ml）に3倍。
- 二次抗体とインキュベートする（ビオチン化ヤギ抗ウサギ; 1：200）、PBS（5ml）中に室温で2時間。
- リンス切片は10分間ごとに、PBS（5ml）に3倍。
- 二次抗体 - ペルオキシダーゼ複合体を用いて、抗体を可視化します。 DAB /のNiCl溶液5mlを含有するウェル中の組織の反応に応じて、10分 - 5ため、0.05％DABおよび0.3％硫酸ニッケル溶液の組み合わせと反応します。
- DAB溶液は、それから色が乳白色薄緑色であることを確認してください0.3％の硫酸ニッケルとの反応。解決策があまりにも緑である場合、反応は暗すぎるとなります。
- ゼラチン被覆スライド上のすべてのセクションをマウントします。トルエン系溶液（TBS）の数滴でスリップをカバーし、それらを一晩乾燥してみましょう、と。
- 実験条件は、観察者に知られていないようにコードがスライドします。
c-fosの免疫反応性カウントの5決意
- 縁前方ののmPFC、infralimbicのmPFC、NACコア、NACシェル、側底AMY核、中央皮質内側AMY、背側線条体、およびVTA：これらの関心領域（ROI）内のFos陽性ニューロンをカウントするために公平な観察者のペアを割り当てます。 c-Fosの免疫反応性は、TH +とVTAにおけるTH-細胞に存在したかどうか。 図1は、顕微鏡からNACのスクリーンキャプチャした画像を提供して区切ります。
- 試験条件のすべてにすべての動物に共通するサイトごとに少なくとも3つの代表的なスライスを分析します。
- アウトライン（ 図1）をトレースすることで、各ROIのための領域全体を分析するためのソフトウェアおよび光学顕微鏡を使用してください。
- 指定されたサイトでは、アプリケーションを開き、買収ドロップダウンメニューをクリックし、「ライブ映像」をクリックします。焦点にROIを持参し、基準点を確立するために、画面をクリックします。そして、TRガイドとしてグリッドを使用して、選択された脳領域をエース。トレースが完了した後、細胞を（ - 5.3.1.3 5.3.1.1ステップ）数えます。
- ソフトウェアのアイコンをダブルクリックします。 「取得」し、「ライブ映像」をクリックして、メニューバーに移動します。焦点にROIを持参し、基準点を確立するために、画面をクリックします。
- グリッドツールバーに移動し、「表示グリッド "と"使用グリッドラベル」をクリックします。所定のトレースとROIの概要を説明します。
- c-fosの細胞の数を維持するために左側のサイドバーにある「+」を選択し、各ROIエリア内のすべてのセルを数えます。カウントを登録するために単独で各セルをクリックします。定義された暗赤色の円は（ 図1）が観察されたときのc-fosのための陽性細胞を考えてみましょう。
- サイトごとにこの手順を繰り返します。
- レコードは、実験ノートにし、将来の分析のためにコンピュータ上でカウントされます。トレースとカウントを保存するには、「セーブデータファイル」「ファイル」をクリックして、メニューバーに移動します。
- 各ROI内の各セクションのための2つの無知な評価者の（カウントの相関関係を使用して）評価者間信頼性が常に0.8を超えていることを確認してください。
6.統計
- 1日目、2、3、4 69のサッカリン摂取量を比較した分散の反復測定1ウェイ分析（ANOVA）を使用して、最初の4日間にわたり、ベースラインサッカリンの摂取量を評価します。
- ランダム化されたブロック2ウェイANOVA 69を使用して、6つのグループのテスト摂取量（5日目）とサッカリン摂取量（4日目）を比較。
- 個々の有意な効果69を決定するために、テューキー比較した（p <0.05）を使用します。
- 評価者間信頼性を決定し、一般的な観察者のカウントを使用しています。
- 各サイト69のための3つの代表スライスの平均のc-fosのカウント。
- 6ソリューション（3.5％コーン油、8％グルコース、8％のフルクトース、0.2％風味のサッカリン、XAの摂取により誘導されるのc-fosの活性化の1方向ANOVAを実行しますperilimbicのmPFC 69用nthanガム制御および水）。
- infralimbicのmPFCのための6つのグループの繰り返し平行分析、NACコア、NACシェル、基底外側AMY、中央皮質内側AMY、VTAと背側線条体。個々の有意な効果69を明らかにするためにテューキー比較した（p <0.05）を使用します。
- その懸濁剤の水の摂取量と摂取の両方でコーン油の摂取量を比較し、キサンタンガム。非栄養甘味料、サッカリンの水の摂取量と摂取量の両方と果糖とブドウ糖摂取量を比較してください。
- 各サイト内の溶液の摂取量およびc-fosの活性化との間に有意な関係はボンフェローニrの相関（P <0.05）を用いて観察したかどうかを確立します。
- 体系的に3.5％コーン油グループの各動物についてperilimbicとinfralimbic前前頭皮質におけるc-fosの数を比較します。
- 6サイトの各ペアの系統的に平行分析を繰り返して（VTA、背側線条体、infralim3.5％のコーン油のためのBICのmPFC、perilimbicのmPFC、NACコア、NACシェル、基底外側AMY、中央皮質内側AMY）。
- 他の5つの実験吸気条件（8％グルコース、8％のフルクトース、0.2％風味のサッカリン、キサンタンガム制御および水）のために、これらの6サイトの体系平行分析を繰り返します。
- 溶液条件内の同じ動物をボンフェローニrの相関（P <0.05）を使用して、ソリューション全体でのc-fosの活性化の間、各ソリューション内の重要な関係を決定することによって、すべてのサイトで評価されたという事実を利用します。
- 指定されたサイトでは、アプリケーションを開き、買収ドロップダウンメニューをクリックし、「ライブ映像」をクリックします。焦点にROIを持参し、基準点を確立するために、画面をクリックします。そして、TRガイドとしてグリッドを使用して、選択された脳領域をエース。トレースが完了した後、細胞を（ - 5.3.1.3 5.3.1.1ステップ）数えます。
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Representative Results
以下に記載されている全ての代表的な結果は、以前に69を公表されており、および技術の有効性を示すには「コンセプトの証明」をサポートするために、ここに再提示されています。
ソリューション摂取
ベースラインサッカリン摂取量の有意差は、全ての動物（F（3,108）= 57.27、P <0.001）摂取量と（1日目のための最初の4日間にわたって観察された：1.3（0.2±）ミリリットル; 2日目：3.9（0.4±）ミリリットル; 3日目：5.9ミリリットル（0.6±）; 4日目：7.1（0.6±）ミリリットル）大幅に（p <0.05、TukeyのHSD検定）と次第に増加。大幅に5日目に果糖とブドウ糖の摂取量ではなく、コーン油またはサッカリン摂取した（p <0.05、TukeyのHSD検定）は4日目サッカリン摂取量に比べて増加した（p <0.05、TukeyのHSD検定）フルクトース（9.6（0.4±）mlの）とSACCよりも有意に高いグルコース（9.4（0.6±）ミリリットル）harin摂取。さらに、コーン油摂取量（7.4（±0.6）ml）を有意に（p <0.05、TukeyのHSD検定）キサンタンガムの摂取よりも高いです。
これらの結果は、それ自体がソリューション摂取がサイトのいずれかの任意の観察のc-fosの活性化を占めるかもしれないという可能性を提起しました。これを調べるために、ボンフェローニR相関は、5つの溶液の摂取量は、6の各サイトにおけるc-fosの活性化に関連した中で行いました。有意な相関がコア中の溶液の摂取量およびc-fosの活性化との間で観察することができませんでした（R（29）= 0.186）、シェル（R（29）= 0.029）または合計（R（29）= 0.10）側坐核、縁前方の（ R（29）= 0.23）、infralimbic（R（29）= 0.30）または合計（R（29）= 0.14）のmPFC、VTA（R（29）= 0.10）、背側線条体（R（29）= 0.14 ）または基底外側（R（29）= 0.47）、セントロ皮質内側（R（29）= 0.48）または合計（R（29）= 0.409）AMY。摂取とAMYのC-fosの活性化との間に高い相関関係を考えると、さらにcorrelaションは、個々のソリューションを実施しました。有意な（P <0.05、TukeyのHSD検定）の関係は、（基底外側（R = 0.15）、セントロ皮質内側（R = 0.13）、合計（R = 0.13））フルクトースのための摂取量とAMY FLIの間で観察することに失敗し、グルコース（基底外側（R = 0.17）、セントロ皮質内側（R = 0.17）、合計はr = 0.13））、サッカリン（基底外側（R = 0.42）、セントロ皮質内側（R = 0.42）、合計（R = 0.42））、またはコーン油（基底外側（R = 0.54）、セントロ皮質内側（R = 0.59）、合計（R = 0.64））。有意な（P <0.05、TukeyのHSD検定）負の相関がキサンタンガム摂取および総AMY FLI（R = 0.94）との間で観察されました。
mPFCのC-Fosのアクティベーション
コーン油有意に（p <0.05、TukeyのHSD検定）増加し、合計（ 図2A）、infralimbic（ 図2B）と縁前方の（ 図2C）のmPFCのC-Fosのは水（*）またはキサンタンガムコントロールに対する相対的なカウント（＃）。大幅フルクトースた（p <0.05、TukeyのHSD検定）増加のc-FosのはinfralimbicのmPFCの水に対する相対（*）またはサッカリン（+）（ 図2B）ではなく、合計や縁前方ののmPFC数でカウントします。これとは対照的に、グルコースまたはサッカリンは合計、perilimbicまたはinfralimbicのmPFCのc-Fosの数を変更することができませんでした。3ディスプレイを水に増加コーン油誘発性FLIの相対を示した動物の代表のmPFC切片を図 。
図2. 脂肪や砂糖の摂取は、示差内側側前頭前野（のmPFC）におけるc-fosの活性化を増加する c-fosの活性化の変化（平均±SEM）は全体のmPFC（ パネルA）、infralimbicのmPFCエリア（ パネルに記載されていますB）、および縁前方ののmPFCエリア（ パネルC）水の消費量（1時間）以下、サッカリン（0.2％）、キサンタンガム（コーン油の制御）、グルコース（8％）、フルクトース（8％）、またはコーン油（3.5％）。 （以前は69を発表した 。） この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3. 脂肪および糖の後、実際のmPFCのC-fosの活性化は、C-fosの活性化は、コーン油の摂取量（ パネル （4倍の倍率）とC（10倍の倍率））に曝露された動物で観察された有意に大きかったです水の摂取量（ パネルB（4倍の倍率）及びD（10倍の倍率））に比べ。トンの一部であるとして、縁前方の（PL）とinfralimbic（IL）のmPFCの線引きサブ領域の表現は、パネルA（コーン油）とC（水）に図解されていますホースパネル（A及びC）は、対応するパネル（B及びD）で10倍の倍率に拡大します。パネルCおよびDにおける矢印は、代表のc-fosの陽性細胞を示しています。すべてのスケールバーは100μmです。 （以前は69を発表した 。） この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
AMYのc-Fosのアクティベーション
大幅コーン油（P <0.05、TukeyのHSD検定）が合計AMY（ 図4A）、基底外側（ 図4B）および中央皮質内側を増加させた（ 図4C）サブエリアAMYのc-Fosのは、水に対する相対カウント（*）またはキサンタンガム制御（＃）。グルコースも大幅に（p <0.05、TukeyのHSD検定）増加し、合計（ 図 4A）、基底外側（ 図4B）および中央皮質内側（
図4. 脂肪や砂糖の摂取は、示差扁桃体（AMY）でのc-fosの活性化を増加する c-fosの活性化の変化（平均±SEM）全体AMY（ パネルA）に記載されています、側底AMYエリア（ パネルB） 、および水、サッカリン、キサンタンガム、グルコース、フルクトース、またはコーン油の消費量（1時間）以下の中央皮質内側AMYエリア（ パネルC）。 AMYの基底外側の領域で注意重要な変更は、個々の側底と横AMY核に認められました。 AMYの中央皮質内側の領域に注意重要な変更は、個々の皮質、中央および内側AMY核に認められました。 （以前は69を発表した 。） この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図5.脂肪および糖の後、実際のAMYのC-fosの活性化C-fosの活性化は、コーン油（ パネル （4倍の倍率）の摂取に暴露した動物で観察された、D（10倍の倍率）とG（60-倍の倍率））、グルコース（ パネルBよりも有意に大きかった（4倍の倍率）及びE（10倍の倍率））、フルクトース（ パネルC（4倍の倍率）及びF（10倍））水（ パネルH（4倍の倍率）とI（10倍の倍率））の摂取。の表現一部であるように、中央-皮質内側（CMC）の線引きサブエリアと基底外側（BLA）AMYはパネルA（コーン油）、B（グルコース）、C（果糖）とH（水）に図解されていますこれらのパネル（A、B、CおよびH）の対応するパネル（D、E、FおよびI）で〜10倍の倍率に拡大。パネルDで線引きサブエリア（コーン油、10倍の倍率）は、パネルD、E、F、GにパネルD.矢印で60倍の倍率に拡大されて、私は代表のc-fosの陽性細胞を示しています。すべてのスケールバーは、パネルG（50ミクロン）を除いて、100μmです。 （以前は69を発表した 。） この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
NACのc-Fosのアクティベーション
コーン油有意に（p <0.05、TukeyのHSD検定）増加合計（ 図6A）とコア（
図6.脂肪や砂糖の摂取は、示差NACでのc-fosの活性化を増加させます。全体NAC（ パネルA）におけるc-fosの活性化（平均±SEM）、NACコア（ パネルB）、およびNACシェル（の変更水、サッカリン、キサンタンガム、グルコース、フルクトース、またはコーン油の消費量（1時間）以下のパネルC）。 （以前は69を発表した 。） この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図7.実際のNACコアではなく、NACシェル脂肪と糖の後のc-fosの活性化を。C-fosの活性化はコーン油（ パネルA（4倍の倍率）、D（10倍の倍率の摂取量に暴露した動物で観察されました）とG（60倍の倍率））およびグルコース（ パネルB（4倍の倍率）と水の摂取量よりも有意に大きかったE（10倍の倍率））（ パネルC（4倍の倍率）とF（10倍マニフィカション））。側坐核コア及び側坐核シェルの描写サブ領域の表現はパネルA（トウモロコシ油）に図解されている、B（グルコース）およびC（水）それらのパネル（A、B、CおよびH）の一部であるとして対応するパネル（D、E及びF）で〜10倍の倍率拡大。パネルD（コーン油、10倍の倍率）で描かれたサブ領域はD、E、F及びGは、代表的なC-FOS陽性細胞を示すパネルにパネルG.矢印で60倍の倍率に拡大されています。すべてのスケールバーは100μmです。 （以前は69を発表した 。） この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
背側線条体のc-Fosのアクティベーション
有意コーン油（P <0.05、TukeyのHSD検定）を水（*）またはキサンタンガム（＃）（Figurに背側線条体の相対におけるc-Fosの数を増加させEの8A）。ブドウ糖や果糖大幅サッカリンにした（p <0.05、TukeyのHSD検定）増加し、背側線条体FLIの相対的な（+）（ 図8A）。これとは対照的に、サッカリンは、背側線条体のc-Fosの活性化を誘発中の水とは異なることができませんでした。増加したトウモロコシの撥油、水にグルコースまたはフルクトース誘発性FLIの相対を示す動物の9ディスプレイ代表背側線条体のセクション図 。
VTAのC-Fosのアクティベーション 
図8.脂肪や砂糖の摂取は、示差背側線条体と腹側被蓋野エリアでのc-fosの活性化を増加させます。背atriatal（ パネルA）および腹側被蓋野（ パネルB）の変化は、C-fosの活性化のために認められた（平均±SEM）以下水、サッカリン、キサンタンガム、グルコース、フルクトース、またはコーン油の消費量（1時間）。 （以前は69を発表しました 。） 
図9脂肪および糖の後、実際の背側線条体のc-fosの活性化は、C-fosの活性化は、コーン油（ パネル （4倍の倍率）の摂取に暴露した動物で観察された、D（10倍の倍率）とG（60倍の倍率））、グルコース（ パネルB（4倍の倍率）及びE（10倍の倍率））、フルクトース 水の摂取量よりも有意に大きかった（ パネルH（4倍の倍率）とI（10倍の倍率））（ パネルC（4倍の倍率）及びF（10倍の倍率））。線引きサブAパネルにおける背側線条体（コーン油）のREASは、B（グルコース）、C（フルクトース）およびH（水）は、対応するパネル（D、E、FおよびI）で〜10倍の倍率に拡大することを示しています。パネルD（コーン油、10倍の倍率）で描かれたサブ領域はD、E、F及びGは、代表的なC-FOS陽性細胞を示すパネルにパネルG.矢印で60倍の倍率に拡大されています。すべてのスケールバーは、パネルG（50ミクロン）を除いて、100μmです。 （以前は69を発表した 。） この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
有意コーン油（P <0.05、TukeyのHSD検定）は、C-Fosのがキサンタンガム制御（＃）（ 図8B）に対するTH + VTA細胞においてカウント増加しました。対照的に、グルコース、フルクトースまたはサッカリンはVTAの相対におけるc-Fosの数を変えることができませんでした水に10ディスプレイに代表TH +とTH- 図や水に増加コーン油誘発性FLIの相対を示す動物のc Fosの活性化VTA細胞。 
脂肪と糖に続いて、図10の実際の腹側被蓋領域C-fosの活性化は。VTAは、c-fosの活性化は、コーン油（ パネルA（4倍）とC（10倍））と水（ パネルBに暴露された動物で観察されました（4倍）及びD（10倍））。灰色の矢印は、代表のc-fosの細胞のみを示しながら、黒矢印は、代表的な二重標識TH / C-fosの陽性細胞を示しています。すべてのスケールバーは100μmです。 （以前は69を発表した 。） この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
縁前方ののmPFCとの間にコーン油にさらされた動物におけるc-Fosのカウントのパターンは側坐核コアおよびNACシェルのいずれかの間に有意な（p <0.05）正の相関を明らかにした（r = 0.971）または全体のmPFC（R = 0.670）、基底外側および中央皮質内側AMY間infralimbicのmPFCと背側線条体との間のいずれかinfralimbicのmPFC（R = 0.940）または背側線条体（R = 0.849）、（R = 0.749）、（R = 0.999）との間背側線条体とVTA（rは= 0.723）。対照的に、 コーン油に暴露された動物におけるc-Fosの数のパターンが基底AMYとNACのコアのいずれかの間に有意な（p <0.05）負の相関を明らかにした（r = -0.712）またはシェル（R = -0.708）、および中央皮質内側AMYおよびNACのコアのいずれかの間（R = -0.712）またはシェル（R = -0.710）のc-Fosのの選択図パターンは、動物e。でカウント背側線条体とVTA（R = 0.821）、基底外側（R = 0.910）または中央皮質内側のいずれかの間に縁前方のとinfralimbicのmPFCた（r = 0.930）との間に明らかに有意な（P <0.05）正の相関を、 グルコースにxposed （R = 0.911）AMY、および基底外側および中央皮質内側の間（R = 0.999）AMY。側坐核シェルとの間のフルクトースに暴露された動物におけるc-Fosのカウントのパターンは側坐核コアおよびNACシェルのいずれかの間に有意な（p <0.05）正の相関を明らかにした（r = 0.969）または縁前方ののmPFC（R = 0.740）、縁前方ののmPFC（R = 0.733）、縁前方のとinfralimbicのmPFCた（r = 0.959）の間、および基底外側および中央皮質内側AMY（R = 0.996）との間でのc-Fosのの選択図パターンが明らかにしたサッカリンに暴露された動物でカウント側坐核シェルと背側線条体との間に有意な（p <0.05）側坐核コアとNACシェルとの間に正の相関関係（R = 0.792）、（R = 0.715）、および縁前方ののmPFC Aとの間ND infralimbicのmPFCた（r = 0.999）。
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Discussion
研究の目的は、DAの報酬関連のニューロンのソース（VTA）と前脳投影ターゲット（NAC、AMY、のmPFC）は同時に携帯のc-fosの技術を用いて、ラットの脂肪と砂糖の新規摂取後に活性化されたかどうかを判断することでした。本研究は、これまで69発表された研究のプロトコルの詳細な説明です。これは、VTAは、縁前方のとinfralimbicのmPFC、NACのコアとシェルと基底外側および中央皮質内側AMYだけでなく、背側線条体への主要な投影ゾーンは、分散脳のネットワーク24として作用すると仮定されました-27、および、フルクトース（8％）やコーン油サッカリンに対する相対（3.5％）ソリューション（0.2％）、グルコースの新規摂取（8％）以下の水および他の制御ソリューションをコーディネートし、同時FLIを表示します。コーン油、ブドウ糖と果糖ではなく、サッカリン摂取量は、VTA、縁前方のとinfralimbic mPでの重要かつ差動FLIの活性化をもたらしましたFC、NAC、基底外側および中央皮質内側AMY、および背側線条体のコアとシェル。 C-fosの技術に加えて、糖、脂肪および人工甘味料の摂取の行動尺度を用いました。
1つの重要なステップは、それによって、サイト間でのc-fosの活性化の違いは、溶液ではなく、吸気のパターンや大きさのいずれかを消費している原因にあったことを確認して、彼らは比較的等しくなるように摂取量のタイムリーなサンプリングが含まれています。ベースラインサッカリン摂取量の4日間は、食品制限動物は迅速にソリューションをサンプリングし、それによって非特異的効果を最小化することを確実にしました。第二の重要なステップは、吸気タイプの感情価とは無関係の変化はまた、C-fosの活性化を作り出すことができるような手順は、動物に最小限のストレスや新規性を引き起こしたということでした。そのため、調査結果はに関連し、このアプローチやプロトコルの有効性について説得力」コンセプトの証明」を提供します急性脂肪への曝露（ 例えば、トウモロコシ油）、砂糖（ブドウ糖と果糖）および非栄養甘味料（サッカリン）ソリューションを同時に整合分散脳システム24-27を示唆する方法で、DA媒介のROIのをアクティブにするかどうかを識別します。
最適のc-Fosの活性化が時間に敏感な反応を必要とするための前1時間のテストで短い待ち時間で検証済みの手順、42,44最大化ソリューションのサンプリングを51,52を犠牲にします。したがって、食物制限ラットを4日間、0.2％サッカリン溶液（10 mlで1時間）を訓練され、5日目の試験溶液を与えました。ベースラインサッカリンの摂取量は有意にかつ漸進的に増加し、5日目果糖とブドウ糖ではなく、コーン油またはサッカリン摂取量が四日サッカリン摂取量よりも有意に高かったです。したがって、増加したFLI有意に増加した（グルコース、フルクトース）に関連付けられているか（コーン油）摂取再に影響を与えることができなかったのソリューション前のサッカリンの訓練にlative、および報酬関連行動のインセンティブメカニズムを介して媒介されると思われました。慎重に検討をサンプリングし、行動の平等を確保するために注意する必要があります。他の研究者は、効果的に、新規ソリューションの他の種類を勉強したり、適応や学習に関連するメカニズムを理解するためのパラダイムの変化を導入するには、この手順を使用することができます。
現在のプロトコルの利点は、よく研究糖の効果（果糖、ブドウ糖）や脂肪（コーン油）を比較し、重要なコントロールのよりと効果を活性化するそれらのC-FOS（非栄養甘味料、サッカリンを比較する機能です制御乳化剤、キサンタンガム、および水）、およびその後6関連脳サイト間でこれらの効果を調べます。このアプローチは、異なる味の良い物質の脳のサイト間の同時検査を可能にすることで明らかな利点を有するが、それは潜在的に天文データセットを生成するという欠点を有しますニューロンの発現を示す細胞の。これは、管理しやすくするために、我々は試験条件のすべてにすべての動物に共通するサイトごとに3つの代表的な冠状スライスを分析するアプローチを取りました。もちろん、これは、これら三つのセクションで各ROIの適切なレベルを選択することの警告を伴っています。 AMY、NAC、のmPFC、背側線条体とVTAの広い吻側 - 尾側広がりを考えると、この警告は軽く取られるべきではありません。さらに、その後、正確にすべてのサイトですべての動物全体で3つの代表的なセクションのそれぞれを選択する際の一貫性を研究者の責務です。この選択でマイナーミスは「偽陽性」と「偽陰性」につながることができます。カウントの効率も関連する変数です。この潜在的な交絡のための当社のソリューションは、各ROI内の各セクションのための2つの無知な評価者を割り当て、その後、（カウントの相関関係を使用して）評価者間信頼性が常に0.8を超えていることを確認することでした。このアプローチは、しばらくDUPL評価者間信頼性は簡単にこの最小基準を超えたとしてicative、私たちの正確性についてはるかに大きな保証を与えました。 NACのサブ領域（シェル対コア）、AMY（中央皮質内側対BASO-横）とのmPFC（perilimbic対infralimbic）を分析しました。これらの領域は、特に個々のAMY核、背側線条体のパッチとマトリックスのコンパートメント、およびNACシェル（頂点、アーチ、コーン、中間ゾーン）、さらに分割することができました。 NACシェルは一貫コーン油、ブドウ糖や果糖以下FLIの変化を表示するために失敗したため、この構造の更なるサブ解析は実行されませんでした。背側線条体のパッチおよびマトリックスゾーンの決定的な検査は、本研究で採用されなかったさらなる免疫組織化学的技術を必要とするが、重要なフォローアップ研究であろう。各サブ領域内の個々のAMY核の分析はまた、追加の将来の研究であろう。
以前の研究では、そのSUCを示しましたバラの摂取量は、NACの、VTAと同様に、シェルではなく、コア、中央AMY核にFLIを増加し、まだ口頭またはIGサッカリンの注入には、55-57、60-62大部分は無効です。中央皮質内側AMYと背側線条体、側坐核コアおよび側底AMYの元に有効で効果的、かつinfralimbicのmPFCにおける後者の効果的なの両方でグルコースと果糖の摂取量はFLI時に砂糖特異的効果を誘発しました。サッカリンの摂取量は、水に任意のサイトに相対FLIの変更を誘発することができませんでした。脂肪の摂取量も以前の研究65-67でaccumbalとのmPFCサイトにFLIを増加し、VTA、infralimbicと縁前方ののmPFC、背側線条体、NACのコアで同時有意な活性化をもたらした、と基底外側および中央皮質内側AMY。
以前の研究は、砂糖と脂肪の摂取量が体系的に、本研究を前脳メソcorticolimbicと黒質線条体DAシステムでFLIを誘導したことを実証したが、コーン油、果糖、ブドウ糖またはサッカリンの急性摂取以下VTA、基底外側および中央皮質内側AMY、背側線条体、縁前方のとinfralimbicのmPFC、側坐核コアとシェルで同時FLIの活性化を評価しました。重要なFLIの増加が非常に砂糖と脂肪摂取を媒介する分散型脳ネットワークの活性化のアイデアをサポートする、前脳のサイト間で相互に関連していました。複数の脳の遺伝子座における同時変化を特定するようなプロトコルは、慢性と一気飲みの条件下だけでなく、エアコンや嗜好の下で利用することができます。これらの研究は、強力な解剖学的相関（C-FOS）は効果的に人間の医療の肥満に関連する状態、糖尿病および他の摂食障害への洞察を提供することができる動物で口当たりの良い摂取や嗜好を媒介するための候補者を識別するために、同時に複数の脳部位に使用することができることを示します。
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Disclosures
著者には、競合する金融利害関係を持っていません。
Acknowledgments
このプロジェクトの彼らのハードワークのためのダイアナIcaza氏-Culaki、クリスタルサンプソンとTheologia Karagiorgisに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Sprague-Dawley rats | Charles River Laboratories | CD-1 | |
| Wire Mesh Cages | Lab Products, Seaford, DE | 30-Cage rack | |
| Rat Chow | PMI Nutrition International | 5001 | |
| Taut Metal Spring | Lab Products, Seaford, DE | n/a | |
| Rat Weighing Scale | Fisher Scientific Company | n/a | |
| Nalgene Centrifuge Tubes | Lab Products, Seaford, DE | 10-0501 | |
| Rubber Stopper | Lab Products, Seaford, DE | n/a | |
| Metal Sippers | Lab Products, Seaford, DE | n/a | |
| Saccharin | Sigma Chemical Co | 82385-42-0 | |
| Kool-Aid, Cherry | Kool-Aid | Commerical | |
| Kool-Aid, Grape | Kool-Aid | Commercial | |
| Fructose | Sigma Chemical Co | F0127 | |
| Glucose | Sigma Chemical Co | G8270 | |
| Corn Oil | Mazzola | Commerical | |
| Xanthan Gum | Sigma Chemical Co | 11138-66-2 | |
| Sliding Microtome | Microm International | n/a | |
| Neurolucida Camera | MBF Bioscience | Software application | |
| Gelatin-coated Slides | Fisher Scientific Company | 12-550-343 | |
| Cover glass | Fisher Scientific Company | 12-545-M | |
| Golden Nylon Brushes | Loew-Cornell | 2037 | |
| Natural Hair Sable | Loew-Cornell | 2022 | |
| 24 Well Plates | Fisher Scientific | 3527 | |
| 6 Well Plates | Fisher Scientific | 3506 | |
| 1 L Pyrex bottles | Fisher Scientific | 1395-1L | |
| Tissue insert (tissue strainer) | Fisher Scientific | 7200214 | |
| Eagle pipettes | World Precision Instruments | E10 for 1-10μl | |
| Eagle pipettes | World Precision Instruments | E100 for 20-100μl | |
| Eagle pipettes | World Precision Instruments | E200 for 50-200μl | |
| Eagle pipettes | World Precision Instruments | E1000 for 100-1000μl | |
| Eagle pipettes | World Precision Instruments | E5000 for 1000-5000μl | |
| Universal Tips .1-10 μl | World Precision Instruments | 500192 | |
| Universal Tips 5-200 μl | World Precision Instruments | 500194 | |
| Universal Tips 500-5,000 μl | World Precision Instruments | 500198 | |
| Blade Vibroslice 100 | World Precision Instruments | BLADE | |
| DPX Mounting Medium | Electron Microscopy | 13510 | |
| 15 ml centrifuge tubes | Biologix Research Co. | 10-0501 | |
| Slide Boxes | Biologix Research Co. | 41-6100 | |
| Orbital Shaker | Madell Corporation | ZD-9556 | |
| weigh boats | Fisher Scientific | 02-202-100 | |
| 5 ml disposable pipettes | Fisher Scientific | 13-711-5AM | |
| Stereo Investigator Software | Micro Bright Field | Software application | |
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| Reagents | |||
| Paraformaldehyde Granular | Fisher Scientific | 19210 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-1 | |
| Sodium Phophate Monobasic | Fisher Scientific | S468-500 | |
| Sodium Phosphate Diphasic | Fisher Scientific | BP332-500 | |
| Hydrogen Peroxide | Fisher Scientific | H324-500 | |
| SafeClear II | Fisher Scientific | 23-044-192 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A412-1 | |
| Normal Goat Serum | Vector | S-1000 | |
| Biotinylated Anti-Rabbit IgG (H+L) | Vector | BA-1000 | |
| ABC Kit Peroxidase Standard | Vector | PK-4000 | |
| Anti-cFos (Ab-5) Rabbit | EMD chem/Cal Biochem | PC38 | |
| Triton X 100 | SigmaAldrich | X-100 | |
| 3,3' diaminobenzidine tetra hydrochloride | SigmaAldrich | D5905 | |
| Sodium Hydroxide | SigmaAldrich | 5881 | |
| Primary TH anti body | EMD Millipore | AB152 | |
| Euthosol | Virbac AH |
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