Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Neuroscience

Samtidig påvisning af c-Fos Aktivering fra mesolimbiske og mesokortikale Dopamin Reward steder Efter Naiv sukker og fedt Indtagelse i rotter

doi: 10.3791/53897 Published: August 24, 2016
* These authors contributed equally

Summary

Målet med denne undersøgelse er at identificere belønning-relaterede distribuerede hjernenetværk ved afgrænse en pålidelig immunhistologisk teknik under anvendelse cellulære c-fos-aktivering for at måle samtidige ændringer i dopamin veje og terminale steder efter hidtil ukendte indtagelse af fedt og sukker i rotter.

Abstract

Denne undersøgelse anvender cellulære c-fos-aktivering for at vurdere virkningerne af hidtil ukendte indtagelse af fedt og sukker på hjernens dopamin (DA) veje i rotter. Indtag af sukker og fedt er medieret af deres medfødte attraktioner samt lærde præferencer. Hjernedopamin, især meso-limbiske og meso-corticale projektioner fra den ventrale tegmentalområde (VTA), er blevet impliceret i begge disse ulærde og læres responser. Begrebet distribuerede hjerne-netværk, hvor flere steder og sender / peptid-systemer interagerer, er blevet foreslået at mægle velsmagende fødeindtagelse, men der er begrænset evidens empirisk demonstrerer sådanne aktioner. Således sukkerindtag fremkalder dopaminfrigivelsen og øger c-fos-lignende immunoreaktivitet (FLI) fra individuelle VTA DA projektion zoner herunder nucleus accumbens (NAC), amygdala (AMY) og mediale præfrontale cortex (mPFC) samt den dorsale striatum. Endvidere hovedkontor af selektive DA-receptor-antagonister i disse websteds forskelligt reducere erhvervelse og udtryk for betingede smag præferencer fremkaldt af sukker eller fedt. En fremgangsmåde, som at afgøre, om disse sites interageret som et distribueret hjerne netværk som reaktion på sukker eller fedt indtag ville være med samtidig vurdere, om VTA og dets vigtigste mesotelencephalic DA projektion zoner (prelimbic og infralimbic mPFC, kerne og skallen af ​​NAC, basolaterale og central-cortico-mediale AMY) samt den dorsale striatum ville display koordineret og samtidig FLI aktivering efter oral, ubetinget indtagelse af majsolie (3,5%), glucose (8%), fructose (8%) og saccharin (0,2 %) opløsninger. Denne fremgangsmåde er et vellykket første skridt i at identificere muligheden for at benytte cellulære c-fos-aktivering samtidigt tværs relevante hjernen sites for at studere belønning-relaterede læring i indtagelse af spiselig mad i gnavere.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Brain dopamin (DA) har været impliceret i centrale reaktioner på indtagelse af velsmagende sukker gennem foreslået hedoniske 1,2, indsats-relaterede 3 og vane-baserede 4,5 virkningsmekanismer. Den primære DA vej impliceret i disse effekter stammer i ventrale tegmentalområde (VTA), og projekter til nucleus accumbens (NAC) kerne og skal, den basolaterale og centrale-cortico-mediale amygdala (AMY) og prelimbic og infralimbic mediale præfrontale cortex (mPFC) (se anmeldelser 6,7). Den VTA har været impliceret i saccharose indtag 8,9, og DA frigivelse observeret efter indtag af sukker i NAC 10-15, AMY 16,17 og mPFC 18-20. Fedt indtag stimulerer også DA NAC frigive 21, og en anden DA-rige projektion zone til den dorsale striatum (caudatus-putamen) er også blevet forbundet med DA-medieret fodring 22,23. Kelley 24-27 foreslog, at disse multiple projektion zoner af denne DA-medieret systemet dannet en integreret og interaktiv distribueret hjerne netværk gennem omfattende og intime forbindelser 28-34.

Ud over evnen af DA D1 og D2 receptorantagonister at reducere indtaget af sukker 35-37 og fedtstoffer 38-40, har DA signalering også været impliceret i mediering evne sukker og fedt til at producere konditioneret smag præferencer (FFP) 41- 46. Mikroinjektioner af en DA-D1-receptorantagonist i NAC, AMY eller mPFC 47-49 eliminere overtagelse af FFP fremkaldt af intragastrisk glukose. Ud fra følgende betragtninger mikroinjektioner af enten DA D1 eller D2-receptor-antagonister ind i mPFC eliminerer erhvervelse af fruktose-CFP 50, er erhvervelse og ekspressionen af fruktose-FFP forskelligt blokeres af DA-antagonister i NAC og AMY 51,52.

C-fos teknik 53,54 har været ansat til at undersøge neurale activation induceret af spiselig indtag og neural aktivering. Udtrykket "c-fos-aktivering" vil blive brugt i hele manuskriptet, og er operationelt defineret ved øget transkription af c-Fos under neuronal depolarisering. Saccharoseindtagelsen øgede fos immunreaktivitet (FLI) i den centrale AMY kerne, VTA samt skallen, men ikke kerne, af NAC 55-57. Ud fra følgende betragtninger saccharose indtag i skin-fodring rotter signifikant forøget FLI i AMY og NAC, men ikke VTA 58, intragastriske saccharose eller glucose infusioner signifikant forøget FLI i NAC og centrale og basolaterale kerner af AMY 59,60. Gentagen tilsætning af saccharose til planlagt chow adgang steget FLI i mPFC samt NAC skal og kerne 61. En saccharosekoncentrationen nedgearing paradigme afslørede, at de største FLI stigninger indtraf i den basolaterale AMY og NAC, men ikke VTA 62. Efter konditionering, udslettelse af sukker-relaterede naturlige Reward adfærd steg FLI i den basolaterale AMY og NAC 63. Desuden parring sukker tilgængelighed til en tone resulterede i tonen efterfølgende stigende FLI niveauer i den basolaterale AMY 64. High-fedt indtag også steget FLI i NAC og mPFC sites 65-67.

De fleste af de tidligere citerede undersøgelser undersøgt sukker og fedt virkninger på c-fos-aktivering i enkelte websteder, der ikke giver oplysninger om identifikation af belønning-relaterede distribuerede hjerne netværk 24-27. Endvidere er mange af de undersøgelser, heller ikke afgrænse de relative bidrag af delområder af NAC (kerne og skal), AMY (basolaterale og central-cortico-mediale) og mPFC (prelimbic og infralimbic), der potentielt kunne blive undersøgt af fordel af fremragende rumlige, encellede opløsning i c-Fos mapping 68. Vores laboratorium 69 nylig brugt c-fos-aktivering og samtidig målte ændringer i VTA DA sti og dens profremskrivningen zoner (NAC, Amy og mPFC) efter roman indtagelse af fedt og sukker i rotter. Den foreliggende undersøgelse beskriver de proceduremæssige og metodiske skridt til samtidig analysere, om akut udsættelse for seks forskellige løsninger (majsolie, glucose, fructose, saccharin, vand og en fed emulsion kontrol) forskelligt ville aktivere FLI i delområder af NAC, AMY, mPFC samt den dorsale striatum. Denne samtidige detektion af forskelle tilladt bekræftelse af væsentlig indvirkning på FLI i hvert sted og afgørelse om, hvorvidt ændringer i en bestemt websted korreleret med ændringer i relaterede websteder og dermed støtte til et distribueret hjerne netværk 24-27. Disse afprøvede procedurer om VTA, det prelimbic og infralimbic mPFC, kernen og skallen af ​​NAC, og den basolaterale og central-cortico-mediale AMY) samt dorsale striatum ville display koordineret og samtidig FLI aktivering efter oral, ubetinget indtagelse af glucose (8%), fructose (8%), majsolie (3,5%) og saccharin (0,2%) opløsninger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Disse eksperimentelle protokoller er blevet godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg attesterer, at alle fag og procedurer er i overensstemmelse med National Institutes of Health Guide for pasning og anvendelse af forsøgsdyr.

1. emner

  1. Køb og / eller race Sprague-Dawley rotter (260-300 g).
  2. Hus rotter individuelt i trådnet bure. Bevar dem på en 12:12 timers lys / mørke cyklus med rottefoder og vand ad libitum.
  3. Tildel passende stikprøvestørrelser (f.eks n ≈ 6 - 8) tilfældigt i grupper.

2. testapparater og Intake procedurer

  1. Brug kalibrerede centrifugerør med gummipropper og en 45 ° vinkel metal sipper røret for at give nøjagtig måling (± 0,1 ml) af de præsenterede løsninger. Fastgør dem til bure med en stram metal foråret at tillade synligheden af ​​kalibreringer.
  2. Begræns madrationer (~15 / g / dag) af rotterne at reducere vægten til 85% af deres oprindelige kropsvægt at øge motivationen for at forbruge løsningerne. Bemærk: vægttab bør tage mellem 3 - 5 dage.
  3. Giv pre-uddannelse løsninger (10 ml) 0,2% saccharin i fire dage i løbet af en 1 time session for at maksimere sandsynligheden for, at rotterne vil prøve de efterfølgende test løsninger med kort (mindre end 1 min) latenstid.
  4. Bekræft strømning gennem centrifugeglasset ved at spilde et par dråber.
  5. Vejes rør før og efter hver session for at få indtaget måling.
  6. Udfør en indtagelse test på den femte dag på undergrupper, der modtager en af ​​seks opløsninger (10 ml, 1 time): a) vand, b) roman aromatiseret (0,05% kirsebærsmag) 0,2% saccharin, c) 8% fructose, d) 8 % glucose, e) 3,5% majsolie suspenderet i 0,3% xanthangummi, og f) 0,3% xanthangummi.
  7. Sørg for, at næringsstoffer løsninger er isokalorisk; således, koncentration 3,5% majs-olie er isokalorisk til sukkeropløsninger de 8%.
  8. Sørg thpå rotter prøve løsninger med kort latenstid (mindre end 1 min). Hvis dette krav ikke er opfyldt, så kassere emnet fra undersøgelsen.

3. Tissue Forberedelse

  1. Bedøver hvert dyr ved en intraperitoneal injektion af pentobarbital 90 min efter indledende udsættelse for hver testopløsning. Bekræft, at dyrene er korrekt bedøvet ved at demonstrere, at dyret ikke længere reagerer på sådanne reflekser som tilbagetrækning til fods knivspids, blinkende efter direkte hornhinde tryk eller hoved ryster til dyb pinna stimulation.
  2. Perfundere hvert dyr transcardialt som tidligere 69 beskrevet.
    1. Bedøver rotter med en overdosis af natrium pentobarbital (65 mg / kg), fjern brystkassen og eksponere brystet for fri adgang til hjertet 69.
    2. Placer nålen i spidsen af ​​den venstre hjerteklap, og sender en vena cava. Administrere phosphatpufferopløsning (PBS, ~ 180 ml) efterfulgt af en phosphatpufret fiksativ containing 4% paraformaldehyd (~ 180 ml).
    3. Sørg for, at dyret faktisk bliver perfunderet korrekt ved at undersøge, om væske forlader andre hulrum, såsom næse, mund og kønsdele. Bemærk: Korrekt fiksering med paraformaldehyd vil blive ledsaget af store muskelbevægelser. Hvis dette ikke sker ved at ændre nålen indtil denne reaktion forekommer.
  3. Fjern hjernen fra kraniet hurtigt ved at skære pels og hud væk fra kraniet. Brug Rongeurs at knække og fjerne knoglen fra hjernen bevæger sig fra bagsiden til fronten. Arbejdet i første omgang i området under og bagved lillehjernen, at sikre, at rongeur er mellem knoglen og meningeal pia mater. Når toppen og siderne af kraniet fjernes, bruge en lille spatel til at løfte hjernen fra basen, og snip kranienerverne med lille saks. Pas på ikke at skade hjernen, mens du forsøger at fjerne knoglen.
  4. Fix hjernerne i en 4% paraformaldehyd-opløsning natten over ved 4 ° C.Placer hjernerne i en 30% saccharose / 70% PBS-opløsning ved stuetemperatur, indtil de slår sig på bunden af ​​beholderen.
  5. Bloker hjernen
    1. Fjern rostralt del af hjernen skære tværs kaudalt for lugtekolben.
    2. Fjern den caudale del af hjernen skære tværs ved af lillehjernen og pons.
  6. Monter hjernen coronalt med den caudale del fastgjort til den fase af en glidende mikrotom, og skæres kranssektioner (40 um) gennem mPFC (2,86-2,20 mm rostralt til bregma), NAC kerne og shell og dorsale striatum (+ 1,76 - +1,60 mm rostralt bregma), den AMY (-2,12 - -2,92 mm kaudalt for bregma), og VTA (-5,20 - -5,60 mm kaudalt for bregma). Brug en rotte hjerne atlas 70 for vejledning.
  7. Saml frit svævende sektioner i individuelle brønde i en plade med 24 brønde fyldt med PBS til eventuel immunhistokemisk analyse 71. Brug Parafilm at forsegle 24 vill plade til at sørge for, at PBS ikke fordamper i beholderen og tør op i hjernen. Opbevar hjernevæv i 4 ° C.

4. c-fos procedurer (Tilpasset fra 71)

  1. Behandl hver sektion med 5 ml 5% normalt gedeserum og 0,2% Triton X-100 i PBS i 1 time.
  2. Inkuber de behandlede sektioner med primære antistoffer (kanin-anti-c-fos, 1: 5.000) ved 4 ° C i 36 timer i brønde indeholdende 1 ml PBS.
  3. Skyl sektioner 3x med PBS (5 ml) i 10 minutter hver.
  4. Inkuber med sekundære antistoffer (biotinyleret gede-anti-kanin; 1: 200) ved stuetemperatur i 2 timer i brønde indeholdende 1 ml PBS.
  5. Skyl hvert afsnit 3x i PBS (5 ml) i 10 minutter hver.
  6. Inkubér skyllede sektioner for 2 timer i en kommercielt tilgængelig avidin-peberrodsperoxidase-blanding, der kommer i et kit bestående af Avadin DH (100 pi) og biotinyleret peberrodsperoxidase H (100 pi) i 5 ml PBS.
  7. Re-skyl afsnittene 3x i PBS (5 ml) i 10 minutter hver.
  8. Reagere afsnittene med 0,05% diaminobenzidin (DAB) i nærvær af 0,0015% H 2 O 2 til 5 - 10 min, afhængig af reaktiviteten af vævet i brønde indeholdende 5 ml af DAB-opløsning.
  9. Dobbelt-label VTA sektioner. Inkubere dem med en tyrosin hydroxylase (TH) antistof (kanin-anti-rotte TH, 1: 2.000) i PBS (5 ml) natten over ved 4 ° C.
  10. Skyl sektioner 3x i PBS (5 ml) i 10 minutter hver.
  11. Inkuber med sekundære antistoffer (biotinyleret gede-anti-kanin; 1: 200) i PBS (5 ml) ved stuetemperatur i 2 timer.
  12. Skyl sektioner 3x i PBS (5 ml) i 10 minutter hver.
  13. Visualisere antistoffer ved anvendelse af et sekundært antistof-peroxidase-kompleks. Reagere med en kombination af 0,05% DAB og en 0,3% nikkelsulfat opløsning, i 5 - 10 min, afhængig af reaktionen af ​​vævet i brønde indeholdende 5 ml af DAB / NiCl opløsning.
  14. Sørg for, at DAB løsning er mælkeagtig lys grøn farve fra dets reaktion med 0,3% nikkelsulfat. Hvis opløsningen er for grøn, så vil reaktionen være for mørk.
  15. Monter alle sektioner onto gelatine-coatede objektglas. Lad dem tørre natten over, og derefter dække-slip med et par dråber af en toluen-baseret løsning (TBS).
  16. Kode glider så den eksperimentelle tilstand er ukendt for observatørerne.

5. Bestemmelse af c-fos Immunoreaktivt Tæller

  1. Tildel par af uvildige observatører til at tælle Fos-positive neuroner i disse regioner af interesse (ROI): prelimbic mPFC, infralimbic mPFC, NAC kerne, NAC shell, basolaterale AMY kerner, central-cortico-mediale AMY, dorsale striatum, og VTA. Afgrænse hvorvidt c-Fos immunoreaktivitet var til stede i TH + og TH- celler i VTA. Figur 1 tilvejebringer en skærm-fanget billede af NAC fra mikroskopet.

figur 1
Klik her for at se en større version af dette tal.

  1. Analyser mindst tre repræsentative skiver pr stedet fælles for alle dyr i alle de test betingelser.
  2. Anvende software og et optisk mikroskop til at analysere hele regionen for hver ROI ved at spore en skitse (figur 1).
    1. For en given hjemmeside, åbne programmet og klikke på købet rullemenuen og klik på "Live-billede". Bring ROI i fokus, og klik på skærmen for at etablere et referencepunkt. Derefter trace den valgte hjerne region ved hjælp af gitteret som en vejledning. Når spor er afsluttet, tælle celler (trin 5.3.1.1 - 5.3.1.3).
      1. Dobbeltklik på ikonet software. Gå til menulinjen, klik på "Acquisition" og derefter "Levende billede". Bring ROI i fokus, og klik på skærmen for at etablere et referencepunkt.
      2. Gå til elnettet værktøjslinjen, og klik "Display Grid" og "Brug gitter etiketter". Outline ROI med en forudbestemt spor.
      3. Tæl alle celler i hver ROI område, skal du vælge et "+" i venstre sidebar at holde optælling af c-fos celler. Klik på hver celle enkeltvis at registrere tæller. Overvej en celle positive for c-fos, når et defineret mørkerød cirkel observeres (figur 1).
    2. Gentag denne proces for hvert websted.
    3. Optag tæller i et laboratorium notesbog og på computeren til senere analyse. Gå til menulinjen, klik på "File", "Save datafil" for at gemme opsporing og tæller.
    4. Sørg for, at inter-rater pålidelighed (ved hjælp af korrelation af tællinger) af de to uinformerede raters for hvert afsnit i hver ROI altid overstiger 0,8.

    6. Statistik

    1. Vurdere baseline saccharin indtag i løbet af de første fire dage ved hjælp af en gentagen-foranstaltninger 1-vejs variansanalyse (ANOVA) sammenligne saccharin indtag af dag 1, 2, 3 og 4 69.
    2. Undersøg saccharin indtagelse (Dag 4) med test indtag (dag 5) af de seks grupper ved hjælp af et randomiseret blok 2-vejs ANOVA 69.
    3. Brug Tukey sammenligninger (p <0,05) for at bestemme individuelle betydelige virkninger 69.
    4. Bestem inter-rater pålidelighed, og derefter bruge en fælles observatørens tæller.
    5. Gennemsnitlige c-fos tæller for de tre repræsentative udsnit til hvert site 69.
      1. Udfør en 1-vejs ANOVA af c-fos-aktivering induceret af indtagelse af de seks opløsninger (3,5% majsolie, 8% glucose, 8% fructose, 0,2% aromatiseret saccharin, xanthan tyggegummi kontrol og vand) for den perilimbiske mPFC 69.
      2. Gentag parallelle analyser af de seks grupper for infralimbic mPFC, NAC kerne, NAC skal, basolaterale AMY, central-cortico-mediale AMY, VTA og dorsale striatum. Brug Tukey sammenligninger (p <0,05) for at afsløre individuelle betydelige virkninger 69.
    6. Undersøg majsolie indtag med både vand indtag og indtagelse af sin suspension agent, xanthangummi. Sammenlign fruktose og glukose indtag med både vand indtag og indtagelse af det ikke-nærende sødemiddel, saccharin.
    7. Fastslå, om væsentlige sammenhænge mellem løsning indtag og c-fos-aktivering i hvert af de steder blev observeret ved hjælp af Bonferroni r korrelationer (p <0,05).
      1. Systematisk sammenligne c-fos tællinger i perilimbiske og infralimbic præ-frontale cortex for hvert dyr i majsolie gruppe 3,5%.
      2. Gentag systematisk parallelle analyser af hvert par af de seks lokaliteter (VTA, dorsale striatum, infralimbic mPFC, perilimbiske mPFC, NAC kerne, NAC skal, basolaterale AMY, central-cortico-mediale AMY) til 3,5% majsolie.
      3. Gentag systematisk parallelle analyser af disse seks steder for de andre fem eksperimentelle betingelser indtag (8% glucose, 8% fructose, 0,2% aromatiseret saccharin, xanthangummi kontrol og vand).
    8. Udnyt det faktum, at de samme dyr i en løsning tilstand blev evalueret på tværs af alle steder ved at bestemme væsentlige relationer mellem c-fos-aktivering på tværs løsninger og inden for hver løsning med Bonferroni r korrelationer (p <0,05).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Samtlige repræsentative resultater er beskrevet nedenfor, er tidligere blevet offentliggjort 69, og er igen præsenteres her til at understøtte "proof of concept" i angiver effektiviteten af teknikken.

Løsning indtag
Væsentlige forskelle i baseline saccharin indtag blev observeret i løbet af de første fire dage for alle dyr (F (3.108) = 57,27, p <0,001) med indtag (dag 1: 1,3 (± 0,2) ml; Dag 2: 3,9 (± 0,4) ml ; Dag 3: 5,9 (± 0,6) ml; Dag 4: 7,1 (± 0,6) ml) signifikant (p <0,05, Tukey HSD test) og gradvist stigende. Fructose og glucose indtag, men ikke majsolie eller saccharin indtag på dag 5 signifikant (p <0,05, Tukey HSD test) forøget i forhold til dag 4 saccharin indtagelse (p <0,05, Tukey HSD test) med fructose (9,6 (± 0,4) ml ) og glucose (9,4 (± 0,6) ml) signifikant højere end SACCHarin indtagelse. Endvidere majsolie indtag (7,4 (± 0,6) ml) signifikant (p <0,05, Tukey HSD test) højere end xanthangummi indtag.

Disse resultater rejste den mulighed, at opløsningen indtag per se kunne forklare enhver observerede c-fos-aktivering i nogen af ​​de websteder. For at undersøge dette, blev Bonferroni r korrelationer udført ved hvilken indtag af de fem opløsninger var forbundet med c-fos-aktivering i hver af de seks steder. Væsentlige korrelationer ikke skal overholdes mellem løsning indtag og c-fos-aktivering i kernen (r (29) = 0,186), skal (r (29) = 0,029) eller total (r (29) = 0,10) NAC den prelimbic ( R (29) = 0,23), infralimbic (R (29) = 0,30) eller total (r (29) = 0,14) mPFC, VTA (R (29) = 0,10), den dorsale striatum (R (29) = 0,14 ) eller den basolaterale (R (29) = 0,47), Centro-cortico-mediale (r (29) = 0,48) eller total (r (29) = 0,409) AMY. I betragtning af den højere korrelation mellem indtag og AMY c-fos-aktivering, yderligere correlationer blev udført for hver individuel løsning. Signifikant (p <0,05, Tukey HSD test) relationer ikke skal overholdes mellem indtag og AMY FLI for fruktose (basolaterale (r = 0,15), centro-cortico-mediale (r = 0,13), i alt (r = 0,13)), glucose (basolaterale (r = 0,17), centro-cortico-mediale (r = 0,17), total r = 0,13)), saccharin (basolaterale (r = 0,42), centro-cortico-mediale (r = 0,42), alt (r = 0,42)) eller majsolie (basolaterale (r = 0,54), centro-cortico-mediale (r = 0,59), i alt (r = 0,64)). En signifikant (p <0,05, Tukey HSD test) blev negativ korrelation iagttaget mellem xanthangummi indtag og total AMY FLI (r = 0,94).

mPFC c-Fos Activation
Majsolie signifikant (p <0,05, Tukey HSD test) forøgede samlede (figur 2A), infralimbic (figur 2B) og prelimbic (figur 2C) mPFC c-Fos tæller i forhold til vand (*) eller xanthangummi kontrol(#). Fructose signifikant (p <0,05, Tukey HSD test) forøgede c-fos tællinger i infralimbic mPFC forhold til vand (*) eller saccharin (+) (figur 2B), men ikke total eller prelimbic mPFC tæller. I modsætning hertil glucose eller saccharin ikke påvirkede total, perilimbisk eller infralimbic mPFC c-Fos tællinger. Figur 3 viser repræsentative mPFC dele af dyr, som viser øget majsolie-induceret FLI forhold til vand.

Figur 2
Figur 2. Fedt eller sukker indtag Differentielt Øger c-fos aktivering i Medial præfrontal cortex (mPFC). Ændringer i c-fos-aktivering (gennemsnit ± SEM), er angivet i hele mPFC (panel A), det infralimbic mPFC området (panel B), og det prelimbic mPFC området (panel C) efter forbrug (1 time) af vand, saccharin (0,2%), Xanthangummi (kontrol for majsolie), glucose (8%), fructose (8%) eller majsolie (3,5%). (Tidligere offentliggjort 69.) Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3. Faktisk mPFC c-fos-aktivering Efter fedt og sukker. C-fos-aktivering blev observeret i dyr udsat for indtagelse af majsolie (felt A (4-gange forstørrelse) og C (10-gange forstørrelse)), var signifikant større end for indtag af vand (felt B (4-gange forstørrelse) og D (10-gange forstørrelse)). Repræsentation af de afgrænsede delområder af Prelimbic (PL) og infralimbic (IL) mPFC er et diagram i panel A (majsolie) og C (vand) som er den del af those paneler (A og C) forstørret til 10-gange forstørrelse i de tilsvarende paneler (B og D). Pile i paneler C og D angiver repræsentative c-fos-positive celler. Alle skala barer er 100 um. (Tidligere offentliggjort 69.) Klik her for at se en større version af dette tal.

AMY c-Fos Activation
Majsolie signifikant (p <0,05, Tukey HSD test) øget total AMY (figur 4A), basolaterale (figur 4B) og central-cortico-mediale (figur 4C) delområde AMY c-Fos tæller i forhold til vand (*) eller xanthangummi kontrol (#). Glucose også signifikant (p <0,05, Tukey HSD test) øget total (figur 4A), basolaterale (figur 4B) og central-cortico-mediale ( (figur 4A) og central-cortico-mediale underområde (figur 4C) i AMY c-Fos tæller i forhold til vand (*) eller saccharin (+), men ikke i den basolaterale AMY underområde. Saccharin undladt at ændre alt, basolaterale eller central-cortico-mediale AMY c-Fos tæller i forhold til vand. Detaljerede analyser af de enkelte kerner i AMY viste, at de væsentlige ændringer konstateret i den basolaterale område af AMY også blev noteret i de enkelte basolaterale og laterale AMY kerner. De væsentlige ændringer konstateret i den centrale-cortico-mediale område af AMY blev også bemærket i den enkelte centrale, kortikal og mediale AMY kerner. Figur 5 viser repræsentative AMY sektioneraf dyr, som viser øget majs olie-, glucose, fructose og induceret FLI forhold til vand. (Tidligere offentliggjort 69.)

Figur 4
Figur 4. Fedt eller sukkerindtagelse Differentielt Øger c-fos-aktivering i amygdala (AMY). Ændringer i c-fos-aktivering (gennemsnit ± SEM), er angivet i hele AMY (felt A), den basolaterale AMY området (panel B) , og den centrale-cortico-mediale AMY område (Panel C) efter forbrug (1 time) af vand, saccharin, xanthangummi, glucose, fructose eller majsolie. De væsentlige ændringer bemærket i den basolaterale område af AMY blev også bemærket i de enkelte basolaterale og laterale AMY kerner. De væsentlige ændringer konstateret i den centrale-cortico-mediale område af AMY blev også bemærket i de enkelte centrale, kortikal og mediale AMY kerner. (Tidligere offentliggjort 69.) Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5
Figur 5. Faktiske AMY c-fos-aktivering Efter fedt og sukker. C-fos-aktivering blev observeret i dyr udsat for indtag af majsolie (felt A (4-gange forstørrelse), D (10-gange forstørrelse) og G (60- fold forstørrelse)), glucose (felt B (4-gange forstørrelse) og E (10-gange forstørrelse)), og fructose (Paneler C (4-gange forstørrelse) og F (10 gange)), der var signifikant større end af indtag af vand (Paneler H (4-gange forstørrelse) og i (10-gange forstørrelse)). Repræsentationde afgrænsede delområder af den centrale-cortico-mediale (CMC) og den basolaterale (BLA) AMY er et diagram i panel A (majsolie), B (glucose), C (fructose) og H (vand) som er den del af disse paneler (A, B, C og H) forstørrede til 10-gange forstørrelse i de tilsvarende paneler (D, E, F og i). Det afgrænsede delområde i Panel D (majsolie, 10-gange forstørrelse) forstørres til 60 ganges forstørrelse i Panel D. pile i paneler D, E, F, G og I viser repræsentative c-fos-positive celler. Alle skala barer er 100 um, bortset Panel G (50 um). (Tidligere offentliggjort 69.) Klik her for at se en større version af dette tal.

NAC c-Fos Activation
Majsolie signifikant (p <0,05, Tukey HSD test) forøget total (figur 6A) og kerne ( (figur 6C). Glucose signifikant (p <0,05, Tukey HSD test) forøgede c-fos tællinger i NAC kerne (figur 6B), men ikke i den samlede NAc eller NAC shell forhold til saccharin (+) eller vand (*). I modsætning hertil fructose og saccharin ikke afviger fra vand til fremkaldelse c-Fos aktivering i NAC kerne og / eller skallen. Figur 7 viser repræsentative sektioner i NAC kerne af dyr, som viser øget majs olie- eller glucose-induceret FLI forhold til vand .

Figur 6
Figur 6. Fedt eller sukkerindtagelse Differentielt Øger c-fos-aktivering i NAC. Ændringer i c-fos-aktivering (gennemsnit ± SEM) i hele NAC (felt A), NAC kerne (felt B), og NAC skallen (Panel C) efter forbrug (1 time) af vand, saccharin, xanthangummi, glucose, fructose eller majsolie. (Tidligere offentliggjort 69.) Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 7
Figur 7. Faktisk NAC Core, men ikke NAC Shell c-fos-aktivering Efter fedt og sukker. C-fos-aktivering blev observeret i dyr udsat for indtag af majsolie (felt A (4-gange forstørrelse), D (10-gange forstørrelse ) og G (60-gange forstørrelse)) og glucose (felt B (4-gange forstørrelse) og E (10-gange forstørrelse)), der var signifikant større end for indtag af vand (Paneler C (4-gange forstørrelse) og F (10 gange forstørrelsetion)). Repræsentation af de afgrænsede delområder af NAC kerne og NAC yderklædning er et diagram i panel A (majsolie), B (glucose) og C (vand) som er den del af disse paneler (A, B, C og H) forstørret til 10-gange forstørrelse i de tilsvarende paneler (D, E og F). Den afgrænset underområde i Panel D (majsolie, 10-gange forstørrelse) forstørres til 60 ganges forstørrelse i Panel G. pile i Paneler D, E, F og G angiver repræsentative c-fos positive celler. Alle skala barer er 100 um. (Tidligere offentliggjort 69.) Klik her for at se en større version af dette tal.

Dorsal Striatal c-Fos Activation
Majsolie signifikant (p <0,05, Tukey HSD test) forøgede c-fos tællinger i den dorsale striatum i forhold til vand (*) eller xanthangummi (#) (Figure 8A). Glucose eller fructose signifikant (p <0,05, Tukey HSD test) forøgede dorsale striatum FLI forhold til saccharin (+) (figur 8A). Derimod saccharin ikke afviger fra vand til fremkaldelse dorsale striatum c-Fos-aktivering. Figur 9 viser repræsentative dorsale striatale sektioner af dyr, som viser øget majs olie-, glucose eller fructose-inducerede FLI forhold til vand.

Figur 8
Figur 8. Fedt eller sukker indtag Differentielt Øger c-fos aktivering i Dorsal striatum og ventrale tegmentalområde. Dorsal atriatal (panel A) og ventrale tegmentalområde (panel B) ændringer blev noteret for c-fos-aktivering (gennemsnit ± SEM) efter forbrug (1 time) vand, saccharin, xanthangummi, glucose, fructose eller majsolie. (Tidligere offentliggjort 69.)

Figur 9
Figur 9. Den faktiske Dorsal Striatal c-fos-aktivering Efter fedt og sukker. C-fos-aktivering blev observeret i dyr udsat for indtag af majsolie (felt A (4-gange forstørrelse), D (10-gange forstørrelse) og G (60 fold forstørrelse)), glucose (felt B (4-gange forstørrelse) og E (10-gange forstørrelse)), fructose (Paneler C (4-gange forstørrelse) og F (10 gange forstørrelse)), der var signifikant større end for indtag af vand (Paneler H (4-gange forstørrelse) og I (10-gange forstørrelse)). Afgrænset sub-areas af den dorsale striatum i panel A (majsolie), B (glucose), C (fructose) og H (vand) er angivet, at forstørret til 10-gange forstørrelse i de tilsvarende paneler (D, E, F og I). Den afgrænset underområde i Panel D (majsolie, 10-gange forstørrelse) forstørres til 60 ganges forstørrelse i Panel G. pile i Paneler D, E, F og G angiver repræsentative c-fos positive celler. Alle skala barer er 100 um, bortset Panel G (50 um). (Tidligere offentliggjort 69.) Klik her for at se en større version af dette tal.

VTA c-Fos Activation
Majsolie signifikant (p <0,05, Tukey HSD test) forøgede c-fos tællinger i TH + VTA celler i forhold til xanthangummi kontrol (#) (figur 8B). I modsætning, glucose, fructose eller saccharin ikke påvirkede c-Fos tællinger i VTA relative til vand. Figur 10 viser repræsentative TH + og TH- og c-Fos-aktiverede VTA celler fra dyr, som viser øget majsolie-induceret FLI forhold til vand.

Figur 10
Figur 10. Aktuel ventrale tegmentalområde c-fos-aktivering Efter fedt og sukker. VTA c-fos-aktivering blev observeret i dyr udsat for majsolie (felt A (4 gange) og C (10-fold)) og vand (felt B (4 gange) og D (10-fold)). Sorte pile angiver repræsentative dobbelt-mærket TH / c-fos-positive celler, medens grå pile angiver repræsentative c-fos kun celler. Alle skala barer er 100 um. (Tidligere offentliggjort 69.) Klik her for at se en større version af dette tal.

ove_content "fo: holde-together.within-side =" 1 "> Relationships af c-Fos Aktivering Blandt steder og løsninger
Mønsteret af c-fos tællinger i dyr udsat for majsolie afslørede signifikante (p <0,05) positive korrelationer mellem NAC kerne og enten NAC skallen (r = 0,971) eller hele mPFC (r = 0,670) mellem prelimbic mPFC og enten infralimbic mPFC (r = 0,940) eller dorsale striatum (r = 0,849), mellem det infralimbic mPFC og dorsale striatum (r = 0,749), mellem den basolaterale og centrale-cortico-mediale AMY (r = 0,999), og mellem dorsale striatum og VTA (r = 0,723). I modsætning hertil mønster af c-fos tællinger i dyr udsat for majsolie afslørede signifikante (p <0,05) negative korrelationer mellem den basolaterale AMY og enten NAC kerne (r = -0,712) eller skallen (r = -0,708), og mellem den centrale-cortico-mediale AMY og enten NAC kerne (r = -0,712), eller skal (r = -0,710) .Den mønster af c-Fos tæller i dyr exposed til glukose afsløret signifikante (p <0,05) positive korrelationer mellem prelimbic og infralimbic mPFC (r = 0,930), mellem dorsale striatum og enten VTA (r = 0,821), basolaterale (r = 0,910) eller central-cortico-mediale (r = 0,911) AMY, og mellem den basolaterale og centrale-cortico-mediale (r = 0,999) AMY. Mønsteret af c-fos tællinger i dyr udsat for fruktose viste signifikante (p <0,05) positive korrelationer mellem NAC kerne og enten NAC skallen (r = 0,969) eller prelimbic mPFC (r = 0,740), mellem NAC skal og prelimbic mPFC (r = 0,733), mellem prelimbic og infralimbic mPFC (r = 0,959), og mellem den basolaterale og centrale-cortico-mediale AMY (r = 0,996) .Den mønster af c-Fos tællinger i dyr udsat for saccharin afsløret signifikant (p <0,05) positive korrelationer mellem NAC kerne og NAc skallen (r = 0,792), mellem NAC skallen og dorsale striatum (r = 0,715), og mellem prelimbic mPFC ennd infralimbic mPFC (r = 0,999).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Målet med undersøgelsen var at bestemme, om kilden (VTA) og forhjernen projection mål (NAC, Amy, mPFC) af DA-belønning-relaterede neuroner samtidigt blev aktiveret efter hidtil ukendte indtagelse af fedt og sukker i rotter ved hjælp af den cellulære c-fos teknik . Nærværende undersøgelse er en detaljeret beskrivelse af de protokoller af en undersøgelse tidligere 69 offentliggjort. Det blev en hypotese, at VTA, ville dets vigtigste projektion zoner til prelimbic og infralimbic mPFC, kernen og skallen af NAC og den basolaterale og central-cortico-mediale AMY, samt dorsale striatum fungere som et distribueret hjerne netværk 24 -27, og vise koordineret og samtidig FLI efter hidtil ukendte indtag af glucose (8%), fructose (8%) eller majsolie (3,5%) opløsninger i forhold til saccharin (0,2%), vand og andre control løsninger. Majsolie, glucose og fructose, men ikke saccharin indtag produceret væsentlig og differentieret FLI aktivering af VTA, den prelimbic og infralimbic mPFC, kernen og skallen af ​​NAC, den basolaterale og centrale-cortico-mediale AMY, og den dorsale striatum. Ud over den c-fos-teknik, blev adfærdsmæssige foranstaltninger af sukker, fedt og kunstige sødemiddel indtag anvendes.

Et afgørende skridt inkluderet rettidig prøvetagning af indtagelse, således at de ville være forholdsvis ens og dermed sikre, at eventuelle forskelle i c-fos-aktivering på tværs af websteder skyldtes løsningen bliver forbrugt snarere enten mønster eller størrelsen af ​​indtag. De fire dages baseline saccharin indtag sikres, at dyrene mad-begrænset hurtigt stikprøven løsninger, og derved minimeres ikke-specifikke effekter. Et andet afgørende skridt var, at proceduren forårsagede minimal stress eller nyhed til dyrene som ændringer i følelsesmæssige valens uafhængigt af indtagelse typen også kunne producere c-fos-aktivering. Undersøgelsesresultaterne giver et overbevisende "proof of concept" for effektiviteten af ​​denne metode, og protokoller relateret tilidentificere, om akut udsættelse for fedt (f.eks majsolie), sukker (glucose og fructose) og ikke-nærende sødemiddel (saccharin) løsninger samtidigt aktivere DA-medierede ROI'er i måde antyder en koordineret distribueret hjerne systemet 24-27.

Fordi optimal c-Fos-aktivering kræver tidsfølsomme svar inden aflivning 51,52, tidligere validerede procedurer 42,44 maksimeret løsning sampling med kort ventetid i 1-timers test. Således blev fødevarer begrænset rotter trænet med 0,2% saccharin løsninger (10 ml, 1 time) i 4 dage, og i betragtning af prøveopløsningen på femtedagen. Baseline saccharin indtag betydeligt og progressivt, og fruktose og glukose, men ikke majsolie eller saccharin indtag på den femte dag var betydeligt højere end fjerde dag saccharin indtag. Derfor løsninger forbundet med øget FLI væsentligt forøget (glukose, fruktose) eller undladt at påvirke (majsolie) indtag regivningsmæssige til forrige saccharin uddannelse, og syntes at være medieret gennem en belønning-relaterede adfærdsmæssige incitamenter. Omhyggelig overvejelse skal træffes for at sikre prøveudtagning og lige adfærd. Andre forskere effektivt kan bruge denne fremgangsmåde til at studere andre typer af nye løsninger eller indføre variationer i paradigme for at forstå mekanismerne i forbindelse med tilpasning og læring.

Fordelen ved denne protokol er evnen til at sammenligne effekten af ​​velundersøgte sukker (fruktose, glukose) og fedtstoffer (majsolie) og sammenligne deres c-fos aktivering effekter med end vigtige kontroller (det ikke-nærende sødemiddel, saccharin, en kontrol emulgator, xanthangummi, og vand), og derefter undersøge disse effekter på tværs seks relaterede hjernen sites. Selvom dette har nogle fordele i at tillade samtidig behandling tværs hjernen steder af de forskellige velsmagende stoffer, det har den ulempe at producere en potentielt astronomisk datasætaf celler, som viser neuronal ekspression. For at gøre dette mere overskueligt, tog vi tilgang med at analysere tre repræsentative koronale skiver pr stedet fælles for alle dyr i alle de test betingelser. Dette er naturligvis ledsages af det forbehold for at vælge de passende niveauer af hver ROI i disse tre sektioner. I betragtning af den brede Rostro-caudale udstrækning af AMY, NAC, mPFC, dorsale striatum og VTA, bør denne advarsel ikke tages let på. Endvidere er det derefter påhviler efterforskerne at være konsekvent i nøjagtigt vælge hvert af de tre repræsentative sektioner på tværs af alle dyr på tværs af alle websteder. Mindre fejl i dette valg kan føre til "falske positiver" og "falsk negative". Effektivitet af optælling også er en relevant variabel. Vores løsning for denne potentielle forvirre var at tildele to uvidende bedømmere for hvert afsnit i hver ROI, og derefter sikre, at inter-rater pålidelighed (ved hjælp af korrelation af tællinger) altid oversteg 0,8. Denne tilgang, mens duplicative, gav os langt større sikkerhed for præcision, som den inter-rater pålidelighed nemt oversteg dette minimum kriterium. Sub-regioner i NAC (kerne vs. shell), AMY (baso-lateral vs central-cortico-mediale) og mPFC (perilimbiske vs. infralimbic) blev analyseret. Disse regioner kan opdeles yderligere, især de enkelte AMY kerner, patch og matrix rum i dorsale striatum, og NAC skal (vertex, bue, kegle, mellemliggende zone). Fordi NAC shell undladt at konsekvent vise ændringer i FLI følgende majsolie, glucose eller fructose, blev yderligere sub-analyser af denne struktur ikke udført. Endelig undersøgelse af patch og matrix zoner i dorsale striatum krævede yderligere immunhistokemiske teknikker, der ikke blev anvendt i den foreliggende undersøgelse, men ville være et vigtigt opfølgende undersøgelse. Analyser af de enkelte AMY kerner inden for hver sub-region vil også være en ekstra fremtidig undersøgelse.

Tidligere undersøgelser har vist, at sucrose indtag steg FLI i den centrale AMY kerne, VTA samt skallen, men ikke kerne, af NAC, men orale eller IG saccharin infusioner er stort set ineffektive 55-57, 60-62. Glucose og fructose indtagelse fremkaldte sukker-specifikke effekter på FLI med både effektive i den centrale-cortico-mediale AMY og dorsale striatum, den tidligere effektive i NAC kerne og den basolaterale AMY, og sidstnævnte effektive i infralimbic mPFC. Saccharin indtag undladt at fremkalde ændringer i FLI i ethvert websted i forhold til vand. Fat indtag også steget FLI i accumbal og mPFC sites i tidligere undersøgelser 65-67, og producerede samtidig signifikant aktivering i VTA, infralimbic og prelimbic mPFC, dorsale striatum, NAC kerne, og den basolaterale og central-cortico-mediale AMY.

Selvom tidligere undersøgelser vist, at sukker og fedt indtag induceret FLI i forhjernen meso-corticolimbic og nigro-striatale DA-systemer, nærværende undersøgelse systematiskevalueret samtidig FLI aktivering i VTA, basolaterale og central-cortico-mediale AMY, dorsale striatum, prelimbic og infralimbic mPFC NAC kerne og kappe efter akut indtagelse af majsolie, fruktose, glukose eller saccharin. Væsentlige FLI stigninger blev stærkt knyttet til hinanden på tværs af forhjernen sites, støtter tanken om distribuerede hjerne netværk aktivering medierende sukker og fedt indtag. Sådanne protokoller identificerer samtidige ændringer i multiple hjernen loci kan udnyttes under kroniske og binging betingelser samt under condition og præferencer. Disse undersøgelser viser, at en stærk anatomisk korrelat (c-fos) effektivt kan bruges i flere hjernen sites samtidigt at identificere kandidater til at mediere spiselig indtag og præferencer hos dyr, der kan give indsigt i menneskelige medicinske tilstande relateret til fedme, diabetes og andre spiseforstyrrelser .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Takket være Diana Icaza-Culaki, Cristal Sampson og Theologia Karagiorgis for deres hårde arbejde på dette projekt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Sprague-Dawley rats Charles River Laboratories CD-1
Wire Mesh Cages Lab Products, Seaford, DE 30-Cage rack
Rat Chow PMI Nutrition International 5001
Taut Metal Spring Lab Products, Seaford, DE n/a
Rat Weighing Scale Fisher Scientific Company n/a
Nalgene Centrifuge Tubes Lab Products, Seaford, DE 10-0501
Rubber Stopper Lab Products, Seaford, DE n/a
Metal Sippers Lab Products, Seaford, DE n/a
Saccharin Sigma Chemical Co 82385-42-0
Kool-Aid, Cherry Kool-Aid Commerical
Kool-Aid, Grape Kool-Aid Commercial
Fructose Sigma Chemical Co F0127
Glucose Sigma Chemical Co G8270
Corn Oil Mazzola Commerical
Xanthan Gum Sigma Chemical Co 11138-66-2
Sliding Microtome Microm International n/a
Neurolucida Camera MBF Bioscience Software application
Gelatin-coated Slides Fisher Scientific Company 12-550-343
Cover glass Fisher Scientific Company 12-545-M
Golden Nylon Brushes Loew-Cornell  2037
Natural Hair Sable  Loew-Cornell  2022
24 Well Plates Fisher Scientific 3527
6 Well Plates Fisher Scientific 3506
1 L Pyrex bottles Fisher Scientific 1395-1L
Tissue insert (tissue strainer) Fisher Scientific 7200214
Eagle pipettes  World Precision Instruments E10 for 1-10μl
Eagle pipettes  World Precision Instruments E100 for 20-100μl
Eagle pipettes  World Precision Instruments E200 for 50-200μl
Eagle pipettes  World Precision Instruments E1000 for 100-1000μl
Eagle pipettes  World Precision Instruments E5000 for 1000-5000μl 
Universal Tips .1-10 μl World Precision Instruments 500192
Universal Tips 5-200 μl World Precision Instruments 500194
Universal Tips 500-5,000 μl World Precision Instruments 500198
Blade Vibroslice 100 World Precision Instruments BLADE
DPX Mounting Medium  Electron Microscopy  13510
15 ml centrifuge tubes Biologix Research Co. 10-0501
Slide Boxes Biologix Research Co. 41-6100
Orbital Shaker  Madell Corporation   ZD-9556
weigh boats  Fisher Scientific 02-202-100
5 ml disposable pipettes Fisher Scientific 13-711-5AM
Stereo Investigator Software Micro Bright Field Software application
Name Company Catalog number Comments
Reagents
Paraformaldehyde Granular Fisher Scientific 19210
NaCl Fisher Scientific S271-1
Sodium Phophate Monobasic Fisher Scientific S468-500
Sodium Phosphate Diphasic Fisher Scientific BP332-500
Hydrogen Peroxide  Fisher Scientific H324-500
SafeClear II  Fisher Scientific 23-044-192
Methanol  Fisher Scientific A412-1
Normal Goat Serum Vector S-1000
Biotinylated Anti-Rabbit IgG (H+L) Vector BA-1000
ABC Kit Peroxidase Standard Vector PK-4000
Anti-cFos (Ab-5) Rabbit EMD chem/Cal Biochem PC38
Triton X 100 SigmaAldrich X-100
3,3' diaminobenzidine tetra hydrochloride  SigmaAldrich D5905
Sodium Hydroxide SigmaAldrich 5881
Primary TH anti body EMD Millipore AB152
Euthosol Virbac AH

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Koob, G. F. Neural mechanisms of drug reinforcement. Ann. N.Y. Acad. Sci. 654, 171-191 (1992).
  2. Wise, R. A. Role of brain dopamine in food reward. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 361, 1149-1158 (2006).
  3. Salamone, J. D., Correa, M. The mysterious motivational functions of mesolimbic dopamine. Neuron. 76, 470-485 (2012).
  4. Horvitz, J. C., Choi, W. Y., Morvan, C., Eyny, Y., Balsam, P. D. A "good parent" function of dopamine: transient modulation of learning and performance during early stages of training. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1104, 270-288 (2007).
  5. Wickens, J. R., Horvitz, J. C., Costa, R. M., Killcross, S. Dopaminergic mechanisms in actions and habits. J. Neurosci. 27, 8181-8183 (2007).
  6. Bjorklund, A., Dunnett, S. B. Dopamine neuron systems in the brain: an update. Trends Neurosci. 30, 194-202 (2007).
  7. Swanson, L. W. The projections of the ventral tegmental area and adjacent regions: a combined fluorescent retrograde tracer and immunofluorescence study in the rat. Brain Res. Bull. 9, 321-353 (1982).
  8. Cacciapaglia, F., Wrightman, R. M., Careli, R. M. Rapid dopamine signaling differentially modulates distinct microcircuits within the nucleus accumbens during sucrose-directed behavior. J. Neurosci. 31, 13860-13869 (2011).
  9. Martinez-Hernandez, J., Lanuza, E., Martinez-Garcia, F. Selective dopaminergic lesions of the ventral tegmental area impair preference for sucrose but not for male sex pheromones in female mice. Eur. J. Neurosci. 24, 885-893 (2006).
  10. Bassareo, V., Di Chiara, G. Differential influence of associative and nonassociative learning mechanisms on the responsiveness of prefrontal and accumbal dopamine transmission to food stimuli in rats fed ad libitum. J. Neurosci. 17, 851-861 (1997).
  11. Bassareo, V., Di Chiara, G. Differential responsiveness of dopamine transmission to food-stimuli in nucleus accumbens shell/core compartments. Neurosci. 89, 637-641 (1999).
  12. Cheng, J., Feenstra, M. G. Individual differences in dopamine efflux in nucleus accumbens shell and core during instrumental conditioning. Learn. Mem. 13, 168-177 (2006).
  13. Genn, R. F., Ahn, S., Phillips, A. G. Attenuated dopamine efflux in the rat nucleus accumbens during successive negative contrast. Behav. Neurosci. 118, 869-873 (2004).
  14. Hajnal, A., Norgren, R. Accumbens dopamine mechanisms in sucrose intake. Brain Res. 904, 76-84 (2001).
  15. Hajnal, A., Smith, G. P., Norgren, R. Oral sucrose stimulation increases accumbens dopamine in the rat. Am. J. Physiol. 286, R31-R37 (2003).
  16. Bassareo, V., Di Chiara, G. Modulation of feeding-induced activation of mesolimbic dopamine transmission by appetitive stimuli and its relation to motivational state. Eur. J. Neurosci. 11, 4389-4397 (1999).
  17. Hajnal, A., Lenard, L. Feeding-related dopamine in the amygdala of freely moving rats. Neuroreport. 8, 2817-2820 (1997).
  18. Bassareo, V., De Luca, M. A., Di Chiara, G. Differential expression of motivational stimulus properties by dopamine in nucleus accumbens shell versus core and prefrontal cortex. J. Neurosci. 22, 4709-4719 (2002).
  19. Feenstra, M., Botterblom, M. Rapid sampling of extracellular dopamine in the rat prefrontal cortex during food consumption, handling, and exposure to novelty. Brain Res. 742, 17-24 (1996).
  20. Hernandez, L., Hoebel, B. G. Feeding can enhance dopamine turnover in the prefrontal cortex. Brain Res. Bull. 25, 975-979 (1990).
  21. Liang, N. C., Hajnal, A., Norgren, R. Sham feeding corn oil increases accumbens dopamine in the rat. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 291, R1236-R1239 (2006).
  22. Dunnett, S. B., Iversen, S. D. Regulatory impairments following selective kainic acid lesions of the neostriatum. Behav. Brain Res. 1, 497-506 (1980).
  23. Salamone, J. D., Zigmond, M. J., Stricker, E. M. Characterization of the impaired feeding behavior in rats given haloperidol or dopamine-depleting brain lesions. Neurosci. 39, 17-24 (1990).
  24. Kelley, A. E. Ventral striatal control of appetitive motivation: role in ingestive behavior and reward-related learning. Neurosci. Biobehav. Rev. 27, 765-776 (2004).
  25. Kelley, A. E. Memory and addiction: shared neural circuitry and molecular mechanisms. Neuron. 44, 161-179 (2004).
  26. Kelley, A. E., Baldo, B. A., Pratt, W. E. A proposed hypothalamic-thalamic-striatal axis for the integration of energy balance, arousal and food reward. J. Comp. Neurol. 493, 72-85 (2005).
  27. Kelley, A. E., Baldo, B. A., Pratt, W. E., Will, M. J. Corticostriatal-hypothalamic circuitry and food motivation: integration of energy, action and reward. Physiol. Behav. 86, 773-795 (2005).
  28. Berendse, H. W., Galis-de-Graaf, Y., Groenewegen, H. J. Topographical organization and relationship with ventral striatal compartments of prefrontal corticostriatal projections in the rat. J. Comp. Neurol. 316, 314-347 (1992).
  29. Brog, J. S., Salyapongse, A., Deutch, A. Y., Zahm, D. S. The patterns of afferent innervation of the core and shell in the "accumbens" part of rat ventral striatum: immunohistochemical detection of retrogradely transported fluoro-gold. J. Comp. Neurol. 338, 255-278 (1993).
  30. McDonald, A. J. Organization of amygdaloid projections to the prefrontal cortex and associated stritum in the rat. Neurosci. 44, 1-14 (1991).
  31. McGeorge, A. J., Faull, R. L. The organization of the projection from the cerebral cortex to the striatum in the rat. Neurosci. 29, 503-537 (1989).
  32. Sesack, S. R., Deutch, A. Y., Roth, R. H., Bunney, B. S. Topographical organization of the efferent projections of the medial prefrontal cortex in the rat: an anterograde tract-tracing study with Phaseolus vulgaris leucoagglutinin. J. Comp. Neurol. 290, 213-242 (1989).
  33. Wright, C. I., Beijer, A. V., Groenewegen, H. J. Basal amygdaloid complex afferents to the rat nucleus accumbens are compartmentally organized. J. Neurosci. 16, 1877-1893 (1996).
  34. Wright, C. I., Groenewegen, H. J. Patterns of convergence and segregation in the medial nucleus accumbens of the rat: relationships of prefrontal cortical, midline thalamic and basal amygdaloid afferents. J. Comp. Neurol. 361, 383-403 (1995).
  35. Geary, N., Smith, G. P. Pimozide decreases the positive reinforcing effect of sham fed sucrose in the rat. Pharmacol. Biochem. Behav. 22, 787-790 (1985).
  36. Muscat, R., Willner, P. Effects of selective dopamine receptor antagonists on sucrose consumption and preference. Psychopharmacol. 99, 98-102 (1989).
  37. Schneider, L. H., Gibbs, J., Smith, G. P. D-2 selective receptor antagonists suppress sucrose sham feeding in the rat. Brain Res. Bull. 17, 605-611 (1986).
  38. Baker, R. W., Osman, J., Bodnar, R. J. Differential actions of dopamine receptor antagonism in rats upon food intake elicited by mercaptoacetate or exposure to a palatable high-fat diet. Pharmacol. Biochem. Behav. 69, 201-208 (2001).
  39. Rao, R. E., Wojnicki, F. H., Coupland, J., Ghosh, S., Corwin, R. L. Baclofen, raclopride and naltrexone differentially reduce solid fat emulsion intake under limited access conditions. Pharmacol. Biochem. Behav. 89, 581-590 (2008).
  40. Weatherford, S. C., Smith, G. P., Melville, L. D. D-1 and D-2 receptor antagonists decrease corn oil sham feeding in rats. Physiol. Behav. 44, 569-572 (1988).
  41. Azzara, A. V., Bodnar, R. J., Delamater, A. R., Sclafani, A. D1 but not D2 dopamine receptor antagonism blocks the acquisition of a flavor preference conditioned by intragastric carbohydrate infusions. Pharmacol. Biochem. Behav. 68, 709-720 (2001).
  42. Baker, R. M., Shah, M. J., Sclafani, A., Bodnar, R. J. Dopamine D1 and D2 antagonists reduce the acquisition and expression of flavor-preferences conditioned by fructose in rats. Pharmacol. Biochem. Behav. 75, 55-65 (2003).
  43. Dela Cruz, J. A., Coke, T., Icaza-Cukali, D., Khalifa, N., Bodnar, R. J. Roles of NMDA and dopamine D1 and D2 receptors in the acquisition and expression of flavor preferences conditioned by oral glucose in rats. Neurobiol. Learn. Mem. 114, 223-230 (2014).
  44. Dela Cruz, J. A., et al. Roles of dopamine D1 and D2 receptors in the acquisition and expression of fat-conditioned flavor preferences in rats. Neurobiol. Learn. Mem. 97, 332-337 (2012).
  45. Yu, W. Z., Silva, R. M., Sclafani, A., Delamater, A. R., Bodnar, R. J. Pharmacology of flavor preference conditioning in sham-feeding rats: effects of dopamine receptor antagonists. Pharmacol. Biochem. Behav. 65, 635-647 (2000).
  46. Yu, W. Z., Silva, R. M., Sclafani, A., Delamater, A. R., Bodnar, R. J. Role of D(1) and D(2) dopamine receptors in the acquisition and expression of flavor-preference conditioning in sham-feeding rats. Pharmacol. Biochem. Behav. 67, (1), 537-544 (2000).
  47. Touzani, K., Bodnar, R. J., Sclafani, A. Activation of dopamine D1-like receptors in nucleus accumbens is critical for the acquisition, but not the expression, of nutrient-conditioned flavor preferences in rats. Eur. J. Neurosci. 27, 1525-1533 (2008).
  48. Touzani, K., Bodnar, R. J., Sclafani, A. Dopamine D1-like receptor antagonism in amygdala impairs the acquisition of glucose-conditioned flavor preference in rats. Eur. J. Neurosci. 30, 289-298 (2009).
  49. Touzani, K., Bodnar, R. J., Sclafani, A. Acquisition of glucose-conditioned flavor preference requires the activation of dopamine D1-like receptors within the medial prefrontal cortex in rats. Neurobiol. Learn. Mem. 94, 214-219 (2010).
  50. Malkusz, D. C., et al. Dopamine signaling in the medial prefrontal cortex and amygdala is required for the acquisition of fructose-conditioned flavor preferences in rats. Behav. Brain Res. 233, 500-507 (2012).
  51. Bernal, S. Y., et al. Role of dopamine D1 and D2 receptors in the nucleus accumbens shell on the acquisition and expression of fructose-conditioned flavor-flavor preferences in rats. Behav. Brain Res. 190, 59-66 (2008).
  52. Bernal, S. Y., et al. Role of amygdala dopamine D1 and D2 receptors in the acquisition and expression of fructose-conditioned flavor preferences in rats. Behav. Brain Res. 205, 183-190 (2009).
  53. Dragunow, M., Faull, R. The use of c-fos as a metabolic marker in neuronal pathway tracing. J. Neurosci. Methods. 29, 261-265 (1989).
  54. VanElzakker, M., Fevurly, R. D., Breindel, T., Spencer, R. L. Environmental novelty is associated with a selective increase in Fos expression in the output elements of the hippocampal formation and the perirhinal cortex. Learn. Mem. 15, 899-908 (2008).
  55. Norgren, R., Hajnal, A., Mungarndee, S. S. Gustatory reward and the nucleus accumbens. Physiol. Behav. 89, 531-535 (2006).
  56. Park, T. H., Carr, K. D. Neuroanatomical patterns of fos-like immunoreactivity induced by a palatable meal and meal-paired environment in saline- and naltrexone-treated rats. Brain Res. 805, 169-180 (1998).
  57. Zhao, X. L., Yan, J. Q., Chen, K., Yang, X. J., Li, J. R., Zhang, Y. Glutaminergic neurons expressing c-Fos in the brainstem and amygdala participate in signal transmission and integration of sweet taste. Nan.Fang Yi.Ke.Da.Xue.Xue.Bao. 31, 1138-1142 (2011).
  58. Mungarndee, S. S., Lundy, R. F., Norgren, R. Expression of Fos during sham sucrose intake in rats with central gustatory lesions. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 295, R751-R763 (2008).
  59. Otsubo, H., Kondoh, T., Shibata, M., Torii, K., Ueta, Y. Induction of Fos expression in the rat forebrain after intragastric administration of monosodium L-glutamate, glucose and NaCl. Neurosci. 196, 97-103 (2011).
  60. Yamamoto, T., Sako, N., Sakai, N., Iwafune, A. Gustatory and visceral inputs to the amygdala of the rat: conditioned taste aversion and induction of c-fos-like immunoreactivity. Neurosci. Lett. 226, 127-130 (1997).
  61. Mitra, A., Lenglos, C., Martin, J., Mbende, N., Gagne, A., Timofeeva, E. Sucrose modifies c-fos mRNA expression in the brain of rats maintained on feeding schedules. Neurosci. 192, 459-474 (2011).
  62. Pecoraro, N., Dallman, M. F. c-Fos after incentive shifts: expectancy, incredulity, and recovery. Behav. Neurosci. 119, 366-387 (2005).
  63. Hamlin, A. S., Blatchford, K. E., McNally, G. P. Renewal of an extinguished instrumental response: Neural correlates and the role of D1 dopamine receptors. Neurosci. 143, 25-38 (2006).
  64. Kerfoot, E. C., Agarwal, I., Lee, H. J., Holland, P. C. Control of appetitive and aversive taste-reactivity responses by an auditory conditioned stimulus in a devaluation task: A FOS and behavioral analysis. Learn. Mem. 14, 581-589 (2007).
  65. Zhang, M., Kelley, A. E. Enhanced intake of high-fat food following striatal mu-opioid stimulation: microinjection mapping and fos expression. Neurosci. 99, 267-277 (2000).
  66. Teegarden, S. L., Scott, A. N., Bale, T. L. Early life exposure to a high fat diet promotes long-term changes in dietary preferences and central reward signaling. Neurosci. 162, 924-932 (2009).
  67. Del Rio, D., et al. Involvement of the dorsomedial prefrontal cortex in high-fat food conditioning in adolescent mice. Behav. Brain Res. 283, 227-232 (2015).
  68. Knapska, E., Radwanska, K., Werka, T., Kaczmarek, L. Functional internal complexity of amygdala: focus on gene activity mapping after behavioral training and drugs of abuse. Physiol. Rev. 87, 1113-1173 (2007).
  69. Dela Cruz, J. A. D., et al. c-Fos induction in mesotelencephalic dopamine pathway projection targets and dorsal striatum following oral intake of sugars and fats in rats. Brain Res. Bull. 111, 9-19 (2015).
  70. Paxinos, G., Watson, C. The rat brain in stereotaxic coordinates. Elsevier. (2006).
  71. Ranaldi, R., et al. The effects of VTA NMDA receptor antagonism on reward-related learning and associated c-fos expression in forebrain. Behav. Brain Res. 216, 424-432 (2011).
Samtidig påvisning af c-Fos Aktivering fra mesolimbiske og mesokortikale Dopamin Reward steder Efter Naiv sukker og fedt Indtagelse i rotter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dela Cruz, J. A. D., Coke, T., Bodnar, R. J. Simultaneous Detection of c-Fos Activation from Mesolimbic and Mesocortical Dopamine Reward Sites Following Naive Sugar and Fat Ingestion in Rats. J. Vis. Exp. (114), e53897, doi:10.3791/53897 (2016).More

Dela Cruz, J. A. D., Coke, T., Bodnar, R. J. Simultaneous Detection of c-Fos Activation from Mesolimbic and Mesocortical Dopamine Reward Sites Following Naive Sugar and Fat Ingestion in Rats. J. Vis. Exp. (114), e53897, doi:10.3791/53897 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter