Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Neuroscience

Gelijktijdige detectie van c-Fos Activering van mesolimbic en mesocorticale Dopamine Beloning Sites Na Naive suiker en vet inname bij ratten

doi: 10.3791/53897 Published: August 24, 2016
* These authors contributed equally

Summary

Het doel van deze studie is om op beloning van gedistribueerde hersenprocessen netwerken te identificeren door het afbakenen van een betrouwbare immunohistologische techniek met behulp van mobiele c-fos activering gelijktijdige veranderingen in de dopamine wegen en terminal plaatsen na roman inname van vet en suiker in ratten te meten.

Abstract

Deze studie maakt gebruik van cellulaire c-fos activering effecten van nieuwe inname van vet en suiker op hersenen dopamine (DA) wegen bij ratten te evalueren. Inname van suikers en vetten worden gemedieerd door hun aangeboren attracties, evenals geleerd voorkeuren. Brain dopamine, vooral meso-limbische en meso-corticale projecties van het ventrale tegmentale gebied (VTA), is betrokken bij beide ongeleerde en geleerd reacties. Distributed hersennetwerken, waarbij meerdere sites en zender / peptide elkaar kunnen beïnvloeden, is voorgesteld te bemiddelen smakelijk voedselopname, maar er is weinig bewijs empirisch aantonen van deze acties. Aldus suiker inname uitlokt DA afgifte en verhoogt c-fos-achtige immunoreactiviteit (FLI) individueel VTA DA projectie zones zoals de nucleus accumbens (NAC), amygdala (AMY) en mediale prefrontale cortex (mPFC) en de dorsale striatum. Verder, de centrale administratie van de selectieve DA receptor antagonisten in deze plaatss differentieel verminderen acquisitie en expressie van geconditioneerde smaak voorkeuren opgewekt door suikers of vetten. Eén benadering waarmee te bepalen of deze gebieden interactie als een gedistribueerd hersenen netwerk in antwoord op suiker of vet zou zijn om gelijktijdige beoordelen of de VTA en de belangrijkste mesotelencephalic DA projectie zones (prelimbic en infralimbic mPFC, kern en schil van de NAC, basolaterale en centrale-cortico-mediale AMY) en de dorsale striatum Display 'gecoördineerde en gelijktijdige FLI activatie na orale, onvoorwaardelijk inname maïsolie (3,5%), glucose (8%), fructose (8%) en saccharine (0,2 %) oplossingen. Deze aanpak is een succesvolle eerste stap in het identificeren van de haalbaarheid van het gebruik van mobiele c-fos activering gelijktijdig over relevante hersenen sites om beloning gerelateerd leren in inname van smakelijk voedsel bij knaagdieren te bestuderen.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Brain dopamine (DA) is betrokken bij het ​​centrum reacties op inname van smakelijke suikers door middel voorgesteld hedonische 1,2-inspanning gerelateerde 3 en gewoonte gebaseerde 4,5 werkingsmechanismen. De primaire DA pathway betrokken bij deze effecten zijn oorsprong in het ventrale tegmental gebied (VTA), en projecten om de nucleus accumbens (NAC) kern en schil, de basolaterale en centrale-cortico-mediale amygdala (AMY), en de prelimbic en infralimbic mediale prefrontale cortex (mPFC) (zie reviews 6,7). De VTA is betrokken bij sucrose inname van 8,9 en DA release waargenomen na inname van suiker in het NAC 10-15, AMY 16,17 en mPFC 18-20. Vetinname stimuleert ook DA NAC vrijgeven 21, en ​​een andere DA-rijke projectie zone naar het dorsale striatum (caudatus-putamen) is ook geassocieerd met DA-gemedieerde voeden 22,23. Kelley 24-27 voorgesteld dat deze meerdere projection zones van deze DA-gemedieerde systeem vormde een geïntegreerd en interactief gedistribueerd hersenen netwerk door middel van uitgebreide en intieme interconnecties 28-34.

Naast het vermogen van DA D1 en D2 receptorantagonisten inname van suikers en vetten 35-37 38-40 beperken heeft DA signalering ook betrokken bij het ​​veroorzaken van het vermogen van suikers en vetten geconditioneerde smaak voorkeuren produceren (GVB) 41- 46. Micro-injecties van een DA D1 receptor antagonist in de NAC, AMY of mPFC 47-49 elimineren overname van GVB uitgelokt door de maag glucose. Overwegende dat micro-injecties van ofwel DA D1 en D2 receptor antagonisten in de mPFC elimineert overname van fructose-GVB-50, zijn de verwerving en expressie van fructose-GVB differentieel geblokkeerd door DA antagonisten in het NAC en AMY 51,52.

De c-fos 53,54 techniek is toegepast om neurale activatio onderzoekenn veroorzaakt door smakelijk inname en neurale activering. De term "c-fos activering" wordt overal het manuscript worden gebruikt, en is operationeel gedefinieerd door verhoogde transcriptie van c-Fos in neuronale depolarisatie. Sucrose verhoogde fos-achtige immunoreactiviteit (FLI) in de centrale kern AMY, de VTA en de schaal, maar niet de kern van de NAC 55-57. Overwegende dat sucrose inname in sham-voeden van ratten aanzienlijk toegenomen FLI in de AMY en NAC, maar niet de VTA 58, maag sucrose of glucose infusies aanzienlijk toegenomen FLI in de NAC en de centrale en basolaterale kernen van de AMY 59,60. Herhaalde toevoeging van sucrose aan geplande chow toegang toegenomen FLI in de mPFC evenals de NAC shell en core 61. Een sucrose concentratie terugschakelen paradigma bleek dat de grootste FLI toename opgetreden in de basolaterale AMY en NAC, maar niet het VTA 62. Na conditionering, uitsterven van suiker-gerelateerde natuurlijke reward gedrag toegenomen FLI in de basolaterale AMY en de NAC-63. Bovendien koppelen beschikbaarheid suiker om een toon resulteerde in de toon vervolgens toenemende FLI niveaus in de basolaterale AMY 64. High-vetinname ook toegenomen FLI in NAC en mPFC plaatsen 65-67.

Het grootste deel van de eerder genoemde studies onderzocht suiker en vet effecten op de c-fos activering in enkele sites die geen informatie over identificatie van beloning gerelateerde gedistribueerde hersenen netwerken 24-27 geven wel. Verder zijn veel van de studies ook niet af te bakenen van de relatieve bijdrage van de deelgebieden van de NAC (kern en schil), Amy (basolaterale en centrale-cortico-mediale) en mPFC (prelimbic en infralimbic), die mogelijk door het zou kunnen worden onderzocht voordeel van uitstekende ruimtelijke, eencellige resolutie c-Fos 68 mapping. Ons laboratorium 69 laatstgebruikte c-fos activering gelijktijdig gemeten veranderingen in de VTA DA route en prodrugsprojectie zones (NAC, AMY en mPFC) na nieuwe inname van vetten en suikers in ratten. De huidige studie beschrijft de procedurele en methodologische stappen om gelijktijdig analyseren of acute blootstelling aan zes verschillende oplossingen (maïsolie, glucose, fructose, sacharine, water en een vetemulsie controle) zou differentieel activeren FLI in deelgebieden van het NAC, AMY, mPFC en de dorsale striatum. Deze gelijktijdige detectie van verschillen toegestaan ​​bevestiging van significante effecten op de FLI in elke site en vastberadenheid over de vraag of wijzigingen in een bepaalde site gecorreleerd met veranderingen in de gerelateerde sites, waardoor de steun voor een gedistribueerde hersenen netwerk 24-27 verstrekken. Deze geteste procedures of de VTA, de prelimbic en infralimbic mPFC, de kern en de schil van de NAC en de basolaterale en centrale-cortico-mediale AMY) evenals de dorsale striatum zou vertoning gecoördineerd en gelijktijdig FLI activering na orale, ongeconditioneerd inname glucose (8%), fructose (8%), maïsolie (3,5%) en saccharine (0,2%) oplossing.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Deze experimentele protocollen zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite waaruit blijkt dat de onderwerpen en procedures zijn in overeenstemming met de National Institutes of Health Guide voor Zorg en gebruik van proefdieren.

1. onderwerpen

  1. Aankoop en / of het ras mannelijke Sprague-Dawley ratten (260-300 g).
  2. Huis ratten individueel in gaas kooien. Hen op een 12:12 uur licht / donker cyclus met rat chow en water ad libitum beschikbaar.
  3. Wijs de juiste steekproefomvang (bijvoorbeeld n ≈ 6-8) willekeurig in groepen.

2. testapparatuur en Intake Procedures

  1. Gebruik gekalibreerd centrifuge buizen met een rubberen stop en een hoek van 45 ° metalen sipper buis om nauwkeurige meting te verstrekken (± 0,1 ml) van de gepresenteerde oplossingen. Zet ze vast aan het huis kooien door een strak metalen veer om de zichtbaarheid van de kalibraties mogelijk te maken.
  2. Beperk voedselrantsoenen (~15 / g / dag) van de ratten om gewicht te verminderen tot 85% van hun oorspronkelijke lichaamsgewicht tot motivatie om oplossingen verbruikt. Opmerking: De gewichtsreductie moet tussen 3 nemen - 5 dagen.
  3. Pre-training oplossingen (10 ml) van 0,2% saccharine vier dagen over een 1 uur sessie om de waarschijnlijkheid dat ratten de volgende testoplossingen monster met korte (minder dan 1 min) latentie maximaliseren.
  4. Bevestig stroming door de centrifugebuis door morsen een paar druppels.
  5. Weeg buizen voor en na elke sessie om de inname meting te verkrijgen.
  6. Voer een intake op de vijfde dag subgroepen ontvangen van één van de zes oplossingen (10 ml, 1 uur): a) water, b) nieuwe smaak (0,05% kersensmaak) 0,2% saccharine, c) 8% fructose, d) 8 % glucose, e) 3,5% maïsolie gesuspendeerd in 0,3% xanthaangom en f) 0,3% xanthaangom.
  7. Zorg ervoor dat de voedingsstoffen oplossingen isocalorische; dus de 3,5% mais-olieconcentratie isocalorische de 8% suikeroplossingen.
  8. Zorg ervoor thbij ratten monsteroplossingen met korte vertraging (minder dan 1 minuut). Als niet aan deze eis wordt voldaan, dan gooi het onderwerp van het onderzoek.

3. Tissue Voorbereiding

  1. Verdoven elk dier door een intraperitoneale injectie van pentobarbital 90 min na de eerste blootstelling aan elke testoplossing. Bevestigen dat de dieren goed worden verdoofd door aan te tonen dat het dier niet meer reageren op een dergelijke reflexen als terugtrekking tot teen knijpen, knipperende volgende directe hoornvlies druk of het hoofd schudden tot diep oorschelp stimulatie.
  2. Perfuseren elk dier transcardially zoals eerder 69 beschreven.
    1. Verdoven ratten met een overdosis natriumpentobarbital (65 mg / kg), verwijder de ribbenkast en bloot de borst voor gratis toegang tot het hart 69.
    2. Plaats de naald in de apex van de linker hartklep, en snijd de vena cava. Dien fosfaatbufferoplossing (PBS, ~ 180 ml) gevolgd door een fosfaatgebufferde fixeermiddel containing 4% paraformaldehyde (~ 180 ml).
    3. Zorgen dat het dier inderdaad juist wordt geperfundeerd door te onderzoeken of vloeistof verlaat andere holten, zoals de neus, mond en genitaliën. Opmerking: De juiste fixatie met paraformaldehyde zal gepaard gaan met grote spierbewegingen. Als dit niet gebeurt, opnieuw aan te passen de naald totdat deze reactie optreedt.
  3. Verwijder de hersenen uit de schedel snel door het snijden van bont en huid weg van de schedel. Gebruik rongeurs te kraken en verwijder het bot uit de hersenen zich van achter naar voren. Werk in eerste instantie in het gebied onder en achter de kleine hersenen, ervoor te zorgen dat de rongeur is tussen het bot en meningeale pia mater. Zodra de bovenkant en zijkanten van de schedel verwijderd met een kleine spatel om de hersenen van de basis te tillen en knip craniale zenuwen met kleine scharen. Zorg ervoor dat de hersenen niet beschadigt tijdens een poging om het bot te verwijderen.
  4. Bevestig de hersenen in 4% paraformaldehyde oplossing overnacht bij 4 ° C.Plaats de hersenen in een 30% sucrose / 70% PBS-oplossing bij kamertemperatuur totdat ze bezinken op de bodem van de houder.
  5. Blokkeer de hersenen
    1. Verwijder het rostrale deel van de hersenen snijden dwars caudaal van de bulbus olfactorius.
    2. Verwijder het caudale deel van de hersenen snijden dwars op het niveau van het cerebellum, pons.
  6. Monteer de hersenen coronaalwaarts met het caudale deel van het stadium van een sledemicrotoom vast, en snijd coronale secties (40 pm) door de mPFC (2,86-2,20 mm rostraal van bregma), de NAC kern en schil en dorsale striatum (+ 1,76-1,60 mm rostraal tot bregma), de AMY (-2,12 - -2,92 mm caudaal bregma) en de VTA (-5,20 - -5,60 mm caudaal van bregma). Gebruik een rat brain atlas 70 voor begeleiding.
  7. Verzamel vrij zwevende delen in individuele putjes van een 24-wells plaat gevuld met PBS voor eventuele immunohistochemische analyse 71. Gebruik Parafilm om de 24 die we dichtenll plaat te zorgen dat de PBS niet verdampt in de container en het opdrogen van de hersenen. Bewaar het hersenweefsel bij 4 ° C.

4. c-fos Procedures (Aangepast van 71)

  1. Behandel elke sectie met 5 ml van 5% normaal geitenserum en 0,2% Triton X-100 in PBS gedurende 1 uur.
  2. Incubeer de behandelde secties met primaire antilichamen (konijn anti-c-fos, 1: 5000) bij 4 ° C gedurende 36 uur in putjes die 1 ml PBS.
  3. Spoel secties 3x met PBS (5 ml) gedurende 10 minuten elk.
  4. Incubeer met secundaire antilichamen (gebiotinyleerd geiten anti-konijn, 1: 200) bij kamertemperatuur gedurende 2 uur in putjes die 1 ml PBS.
  5. Spoel elke sectie 3x in PBS (5 ml) gedurende 10 minuten elk.
  6. Incubeer de secties gespoeld gedurende 2 uur in een commercieel verkrijgbaar avidine-mierikswortelperoxidase mengsel dat wordt geleverd in een kit bestaande uit Avadin DH (100 ui) en gebiotinyleerd mierikswortelperoxidase H (100 ui) in 5 ml PBS.
  7. Re-spoel de secties 3x in PBS (5 ml) gedurende 10 minuten elk.
  8. Reageren de secties met 0,05% diaminobenzidine (DAB) bij aanwezigheid van 0,0015% H 2 O 2 gedurende 5-10 minuten, afhankelijk van de reactiviteit van het weefsel in putjes met 5 ml van de DAB oplossing.
  9. Double-label de VTA secties. Incubeer ze een tyrosine hydroxylase (TH) antilichaam (konijn anti-rat TH, 1: 2000) in PBS (5 ml) overnacht bij 4 ° C.
  10. Spoel secties 3x in PBS (5 ml) gedurende 10 minuten elk.
  11. Incubeer met secundaire antilichamen (gebiotinyleerd geiten anti-konijn, 1: 200) in PBS (5 ml) bij kamertemperatuur gedurende 2 uur.
  12. Spoel secties 3x in PBS (5 ml) gedurende 10 minuten elk.
  13. Visualiseren de antilichamen met een secundair antilichaam-peroxidase-complex. Reageren met een combinatie van 0,05% DAB en 0,3% nikkel sulfaatoplossing, voor 5-10 minuten, afhankelijk van de reactie van het weefsel in putjes met 5 ml van de DAB / NiCl oplossing.
  14. Zorg ervoor dat de DAB-oplossing melkachtig licht groen van kleur daaruitreactie van de 0,3% nikkelsulfaat. Indien de oplossing te groen, dan is de reactie te donker.
  15. Monteer alle onderdelen op gelatine gecoate glaasjes. Laat ze drogen 's nachts, en dan bedekken-slip met een paar druppels van een op basis van tolueen Solution (TBS).
  16. Code schuift zodat de experimentele conditie is onbekend bij de waarnemers.

5. Vaststelling van de c-fos Immunoreactieve Counts

  1. paren van onpartijdige waarnemers aan voor Fos-positieve neuronen in deze regio's van belang (ROI) te tellen: prelimbic mPFC, infralimbic mPFC, NAC kern, NAC shell, basolaterale AMY kernen, centrale-cortico-mediale AMY, dorsale striatum, en VTA. Bakenen of c-Fos immunoreactiviteit aanwezig in TH + en TH- cellen in de VTA was. Figuur 1 geeft een scherm gemaakte foto van het NAC van de microscoop.

Figuur 1
Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

  1. Analyseer tenminste drie representatieve plakjes per locatie voor alle dieren in alle testomstandigheden.
  2. Gebruik software en een optische microscoop om het gehele gebied voor elke ROI analyseren door opsporing een overzicht (figuur 1).
    1. Voor een bepaalde site, opent u de toepassing en klik op de overname drop-down menu en klik op "Levende Beeld". Breng de ROI in beeld en klik op het scherm om een ​​referentiepunt vast te stellen. dan trace de gekozen gebied van de hersenen met behulp van het raster als een gids. Zodra het spoor is voltooid, tellen cellen (stappen 5.3.1.1 - 5.3.1.3).
      1. Dubbelklik op het pictogram software. Ga naar de menubalk, klik op "Acquisition" en vervolgens op "Levende Beeld". Breng de ROI in beeld en klik op het scherm om een ​​referentiepunt vast te stellen.
      2. Ga naar de werkbalk raster en klik op "Beeldscherm Grid" en "Use raster labels". Een overzicht van de ROI met een vooraf bepaald spoor.
      3. Tel alle cellen in elk ROI gebied, selecteert u een "+" in de linker zijbalk om telling van c-fos cellen te houden. Klik op elke cel afzonderlijk om tellingen te registreren. Beschouw een cel positief voor c-fos waarbij een specifieke donkerrode cirkel wordt waargenomen (figuur 1).
    2. Herhaal dit proces voor elke site.
    3. Record telt in een lab notebook en op de computer voor toekomstige analyse. Ga naar de menubalk, klik op "File", "Save Data File" tot de opsporing en telt op te slaan.
    4. Zorg ervoor dat de interbeoordelaarsbetrouwbaarheid (met behulp van correlatie van tellingen) van de twee ongeïnformeerde beoordelaars voor elke sectie in elk ROI overschrijdt altijd 0,8.

    6. Statistieken

    1. Evalueer basislijn sacharine inname over de eerste vier dagen met behulp van een herhaalde-maatregelen 1-way variantieanalyse (ANOVA) het vergelijken van de sacharine inname van dag 1, 2, 3 en 4 69.
    2. Vergelijk sacharine inname (Dag 4) met testen intakes (Dag 5) van de zes groepen met behulp van een gerandomiseerde-blok 2-way ANOVA 69.
    3. Gebruik Tukey vergelijkingen (p <0,05) belangrijke afzonderlijke effecten 69 bepalen.
    4. Bepaal interbeoordelaarsbetrouwbaarheid, en gebruik dan telt een gemeenschappelijk waarnemer.
    5. Gemiddeld c-fos geldt voor de drie representatieve plakjes voor elke site 69.
      1. Voer een 1-way ANOVA van c-fos activatie geïnduceerd door opname van de zes oplossingen (3,5% maïsolie, 8% glucose, 8% fructose, 0,2% gearomatiseerde saccharine, xaNthan gom controle en water) voor de perilimbische mPFC 69.
      2. Herhaal parallel analyses van de zes groepen voor infralimbic mPFC, NAC kern, NAC shell, basolaterale AMY, centrale-cortico-mediale AMY, VTA en dorsale striatum. Gebruik Tukey vergelijkingen (p <0,05) belangrijke afzonderlijke effecten 69 te onthullen.
    6. Vergelijk maïsolie intake met zowel water-inname en de inname van de schorsing agent xanthaangom. Vergelijk fructose en glucose inname met zowel wateropname en inname van de caloriearme zoetstof saccharine.
    7. Vaststellen of significante verbanden tussen oplossing inlaten en c-fos activering in elke locatie waargenomen middels Bonferroni r correlaties (p <0,05).
      1. Systematische vergelijking c-fos telt in de perilimbische en infralimbic prefrontale cortex voor elk dier in de 3,5% maïsolie groep.
      2. Herhaal systematisch parallelle analyses van elk paar van de zes plaatsen (VTA, dorsale striatum, infralimbic mPFC, perilimbische mPFC, NAC kern, NAC shell, basolaterale AMY, centrale-cortico-mediale AMY) voor de 3,5% maïsolie.
      3. Herhaal systematisch parallelle analyses van deze zes locaties voor de andere vijf experimentele innameomstandigheden (8% glucose, 8% fructose, 0,2% gearomatiseerde saccharine, xanthaangom controle en water).
    8. Profiteren van het feit dat dezelfde dieren bij een oplossing-omstandigheid werden geëvalueerd voor alle locaties door het bepalen van significante verbanden tussen c-fos activatie over oplossingen en binnen elke oplossing met Bonferroni r correlaties (p <0,05).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alle hierna beschreven representatieve resultaten zijn eerder gepubliceerd 69, en worden hier opnieuw aangeboden aan "proof of concept" ondersteunen waarin de effectiviteit van de techniek.

oplossing Intakes
Significante verschillen in de baseline sacharine inname werden waargenomen gedurende de eerste vier dagen voor alle dieren (F (3,108) = 57,27, p <0,001) met intakes (Dag 1: 1,3 (± 0,2) ml; Dag 2: 3,9 (± 0,4) ml ; Dag 3: 5,9 (± 0,6) ml; Dag 4: 7,1 (± 0,6) ml) significant (p <0,05, Tukey HSD test) geleidelijk toeneemt. Fructose en glucose opname, maar niet maïsolie of saccharine opname op dag 5 significant (p <0,05, Tukey HSD test) verhoogd relatief tot dag 4 sacharine inname (p <0,05, Tukey HSD test) met fructose (9,6 (± 0,4) ml ) en glucose (9,4 (± 0,6) ml) significant hoger dan SACCHarin inname. Verder maïsolie inname (7,4 (± 0,6) ml) significant (p <0,05, Tukey HSD test) lager dan xanthaangom inname.

Deze resultaten de mogelijkheid geopperd dat inname oplossing zodanig verantwoordelijk zouden kunnen zijn voor de waargenomen c-fos activatie in een van de sites. Om dit te onderzoeken werden Bonferroni r correlaties uitgevoerd waarbij de inname van de vijf oplossingen was gerelateerd aan c-fos activering in elk van de zes sites. Significante correlaties niet in acht worden genomen tussen de oplossing intake en c-fos activering in de kern (r (29) = 0,186), shell (r (29) = 0.029) of totaal (r (29) = 0,10), NAC, de prelimbic ( r (29) = 0,23), infralimbic (r (29) = 0,30) of totaal (r (29) = 0,14) mPFC, de VTA (r (29) = 0,10), de dorsale striatum (r (29) = 0,14 ) of de basolaterale (r (29) = 0,47), het Centro-cortico-mediale (r (29) = 0,48) of totaal (r (29) = 0,409) AMY. Gezien de hogere correlatie tussen de inname en AMY c-fos activering, verder correlatiegen werden uitgevoerd voor elke individuele oplossing. Significant (p <0,05, Tukey HSD test) verhoudingen niet worden waargenomen tussen de inname en AMY FLI voor fructose (basolaterale (r = 0,15), centro-cortico-mediale (r = 0,13), totale (r = 0,13)), glucose (basolaterale (r = 0,17), centro-cortico-mediale (r = 0,17), de totale r = 0,13)), saccharine (basolaterale (r = 0,42), centro-cortico-mediale (r = 0,42), totaal (r = 0,42)) of maïsolie (basolaterale (r = 0,54), centro-cortico-mediale (r = 0,59), in totaal (r = 0,64)). Een significante (p <0,05, Tukey HSD test) negatieve correlatie waargenomen tussen xanthaangom hoeveelheden en de totale AMY FLI (r = 0,94).

mPFC c-Fos Activation
Maïsolie significant (p <0,05, Tukey HSD test) verhoogde totale (Figuur 2A), infralimbic (figuur 2B) en prelimbic (figuur 2C) mPFC c-Fos telt opzichte van water (*) of xanthaangom control(#). Fructose significant (p <0,05, Tukey HSD test) verhoogde c-Fos telt in de infralimbic mPFC opzichte van water (*) of saccharine (+) (figuur 2B), maar niet volledige of prelimbic mPFC telt. In tegenstelling tot glucose of saccharine niet totaal, perilimbische of infralimbic mPFC c-Fos telt veranderen. Figuur 3 toont vertegenwoordiger mPFC delen van dieren die verhoogde corn-olie veroorzaakte FLI ten opzichte van water.

Figuur 2
Figuur 2. vet of suiker inname Verhoogt Differentieel c-fos Activering in de mediale prefrontale cortex (mPFC). Veranderingen in de c-fos activering (gemiddelde ± SEM), worden vermeld in het gehele mPFC (Panel A), de infralimbic mPFC gebied (Panel B), en de prelimbic mPFC gebied (Panel C) na verbruik (1 uur) van water, saccharine (0,2%), Xanthaangom (controle voor maïsolie), glucose (8%), fructose (8%) of maïsolie (3,5%). (Eerder verschenen 69.) Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 3
Figuur 3. Feitelijke mPFC c-fos Activering Na vetten en suikers. C-fos activering werd waargenomen bij dieren blootgesteld aan inname van maïsolie (Panels A (4-voudige vergroting) en C (10-voudige vergroting)) die significant groter was dan waterinlaat (panels B (4-voudige vergroting) en D (10-voudige vergroting)). Vertegenwoordiging van de afgebakende deelgebieden van de prelimbische (PL) en infralimbic (IL) mPFC zijn schematisch weergegeven in Panels A (maïsolie) en C (water) net als het deel van tslang panelen (A en C) vergroot tot 10-voudige vergroting in de overeenkomstige panelen (B en D). Pijlen in Panelen C en D geven representatieve c-fos positieve cellen. Alle schaal bars zijn 100 micrometer. (Eerder verschenen 69.) Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

AMY c-Fos Activation
Maïsolie significant (p <0,05, Tukey HSD test) verhoogde totale AMY (figuur 4A), basolaterale (figuur 4B) en centrale cortico-mediale (figuur 4C) subgebied AMY c-Fos telt opzichte van water (*) of de xanthaangom control (#). Glucose ook significant (p <0,05, Tukey HSD test) verhoogde totale (figuur 4A), basolaterale (figuur 4B) en centrale cortico-mediale ( (Figuur 4A) en centrale cortico-mediaal deelgebied (Figuur 4C) van de AMY c-Fos telt opzichte van water (*) of saccharine (+), maar niet in de basolaterale AMY deelgebied. Sacharine niet veranderen totaal, basolaterale of centrale-cortico-mediale AMY c-Fos telt ten opzichte van water. Gedetailleerde analyse van afzonderlijke kernen in de AMY bleek dat de significante veranderingen opgemerkt in het basolaterale oppervlak van de AMY ook geconstateerd in de afzonderlijke basolaterale en laterale AMY kernen. De significante veranderingen opgemerkt in het centraal-cortico-mediale deel van de AMY werden ook opgemerkt in de individuele centrale, corticale en mediale AMY kernen. Figuur 5 toont representatieve AMY sectiesvan dieren die verhoogde maïs olie, glucose en fructose-geïnduceerde FLI ten opzichte van water. (Eerder verschenen 69.)

figuur 4
Figuur 4. vet of suiker inname verhoogt Differentieel c-fos activatie in de amygdala (AMY). Veranderingen in c-fos activatie (gemiddelde ± SEM) worden vermeld in de gehele AMY (Panel A), de basolaterale AMY gebied (Panel B) , en de centrale-cortico-mediale AMY gebied (Panel C) na verbruik (1 uur) van water, sacharine, xanthaangom, glucose, fructose of maïsolie. De significante veranderingen opgemerkt in het basolaterale gebied van de AMY werden ook opgemerkt bij de individuele basolaterale en laterale AMY kernen. De significante veranderingen opgemerkt in het centraal-cortico-mediale deel van de AMY werden ook opgemerkt in de individuele centrale, corticale en mediale AMY kernen. (Eerder verschenen 69.) Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 5
Figuur 5. Effectief AMY c-fos Activering Na vetten en suikers. C-fos activering werd waargenomen bij dieren blootgesteld aan inname maïsolie (Panels A (4-voudige vergroting), D (10-voudige vergroting) en G (60- voudige vergroting)), glucose (panels B (4-voudige vergroting) en E (10-voudige vergroting)) en fructose (panels C (4-voudige vergroting) en F (10-voudig)) die aanzienlijk groter is dan die waren de inname van water (panels H (4-voudige vergroting) en I (10-voudige vergroting)). vertegenwoordiging vanhet afgebakende deelgebieden van de centrale-cortico-mediale (CMC) en de basolaterale (BLA) AMY zijn schematisch weergegeven in Panels A (maïsolie), B (glucose), C (fructose) en H (water) als het deel van die panelen (A, B, C en H) vergroot tot 10-voudige vergroting in de overeenkomstige panelen (D, E, F en I). De afgebakend deelgebied in paneel D (maïsolie, 10-voudige vergroting) vergroot en in 60-voudige vergroting in paneel D. Pijlen in Panelen D, E, F, G en I geven representatieve c-fos positieve cellen. Alle schaal bars zijn 100 micrometer, met uitzondering van de Panel G (50 pm). (Eerder verschenen 69.) Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

NAC c-Fos Activation
Maïsolie significant (p <0,05, Tukey HSD test) verhoogde totale (figuur 6A) en kern ( (figuur 6C). Glucose significant (p <0,05, Tukey HSD test) verhoogde c-Fos telt in de NAc kern (figuur 6B), maar niet in de totale NAc of NAc shell opzichte van saccharine (+) of water (*). Daarentegen fructose en saccharine niet verschillen van water bij het ​​opwekken van c-Fos activatie in de NAC kern en / of shell. Figuur 7 toont representatieve secties in de kern NAc dieren met verhoogde maïs olie of glucose geïnduceerde FLI opzichte van water .

figuur 6
Figuur 6. vet of suiker inname verhoogt Differentieel c-fos activatie in de NAC. Veranderingen in c-fos activatie (gemiddelde ± SEM) in de gehele NAC (Panel A), de NAC kern (Paneel B) en de NAC shell (Panel C) na verbruik (1 uur) van water, sacharine, xanthaangom, glucose, fructose of maïsolie. (Eerder verschenen 69.) Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 7
Figuur 7. Werkelijk NAC Core, maar niet NAC Shell c-fos Activering Na vetten en suikers. C-fos activering werd waargenomen bij dieren blootgesteld aan inname maïsolie (Panels A (4-voudige vergroting), D (10-voudige vergroting ) en G (60-voudige vergroting)) en glucose (panels B (4-voudige vergroting) en E (10-voudige vergroting)) die aanzienlijk groter is dan die van de inname van water waren (panels C (4-voudige vergroting) en F (10-voudig magnificatie)). Weergave van de afgebakende deelgebieden van de NAC kern en de NAC dop worden schematisch weergegeven in Panels A (maïsolie), B (glucose) en C (water) evenals het deel van deze panelen (A, B, C en H) vergroot tot 10-voudige vergroting in de overeenkomstige panelen (D, E en F). De afgebakend deelgebied in paneel D (maïsolie, 10-voudige vergroting) vergroot en in 60-voudige vergroting in paneel G. Pijlen in Panelen D, E, F en G geven representatieve c-fos positieve cellen. Alle schaal bars zijn 100 micrometer. (Eerder verschenen 69.) Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Dorsale striatale c-Fos Activation
Maïsolie significant (p <0,05, Tukey HSD test) verhoogde c-Fos tellingen in het dorsale striatum opzichte van water (*) of xanthaangom (#) (Figure 8A). Glucose of fructose significant (p <0,05, Tukey HSD test) verhoogd dorsale striatale FLI opzichte van saccharine (+) (Figuur 8A). In tegenstelling, sacharine niet afwijken van het water in het uitlokken van dorsale striatum c-Fos activatie. Figuur 9 toont representatieve dorsale striatum delen van dieren die verhoogde graan olie-, glucose of fructose-geïnduceerde FLI ten opzichte van water.

Figuur 8
Figuur 8. vet of suiker inname Differentieel Verhoogt c-fos Activering in het dorsale striatum en ventrale tegmentale Area. Dorsale atriatal (Panel A) en ventrale tegmentale gebied (Panel B) wijzigingen werden genoteerd voor c-fos activering (gemiddelde ± SEM) na verbruik (1 uur) van water, sacharine, xanthaangom, glucose, fructose of maïsolie. (Eerder verschenen 69.)

figuur 9
Figuur 9. Werkelijke dorsale striatum c-fos Activering Na vetten en suikers. C-fos activering werd waargenomen bij dieren blootgesteld aan inname maïsolie (Panels A (4-voudige vergroting), D (10-voudige vergroting) en G (60 voudige vergroting)), glucose (panels B (4-voudige vergroting) en E (10-voudige vergroting)), fructose (Panels C (4-voudige vergroting) en F (10-voudige vergroting)) die aanzienlijk groter is dan die van de inname van water waren (Panels H (4-voudige vergroting) en I (10-voudige vergroting)). Afgebakend sub-areas van de dorsale striatum in panelen A (maïsolie), B (glucose), C (fructose) en H (water) worden aangegeven dat vergroot tot 10-voudige vergroting in de overeenkomstige panelen (D, E, F en I). De afgebakend deelgebied in paneel D (maïsolie, 10-voudige vergroting) vergroot en in 60-voudige vergroting in paneel G. Pijlen in Panelen D, E, F en G geven representatieve c-fos positieve cellen. Alle schaal bars zijn 100 micrometer, met uitzondering van de Panel G (50 pm). (Eerder verschenen 69.) Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

VTA c-Fos activering
Maïsolie significant (p <0,05, Tukey HSD test) verhoogde c-Fos telt in TH + cellen VTA opzichte van de xanthaangom control (#) (Figuur 8B). Daarentegen, glucose, fructose of saccharine niet c-Fos tellingen in de VTA relatieve wijziging te water. Figuur 10 geeft representatieve TH + en TH- en c-Fos-geactiveerde VTA cellen van dieren die verhoogde corn-olie veroorzaakte FLI ten opzichte van water.

figuur 10
Figuur 10. Feitelijke Ventraal tegmentum c-fos Activering Na vetten en suikers. VTA c-fos activering werd waargenomen bij dieren blootgesteld aan maïsolie (Panels A (4-voudig) en C (10-voudig)) en water (Panels B (4-voudig) en D (10-voudig)). Zwarte pijlen geven vertegenwoordiger dubbel-gelabeld TH / c-fos positieve cellen, terwijl de grijze pijlen geven vertegenwoordiger van c-fos alleen cellen. Alle schaal bars zijn 100 micrometer. (Eerder verschenen 69.) Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

ove_content "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Relationships van c-Fos Activering Onder sites en oplossingen
Het patroon van c-Fos tellingen bij dieren blootgesteld aan maïsolie onthulde significant (p <0,05) Positieve correlaties tussen de NAC kern en ofwel de NAC shell (r = 0,971) of hele mPFC (r = 0,670) tussen de prelimbische mPFC en ofwel de infralimbic mPFC (r = 0,940) of dorsale striatum (r = 0,849) tussen de infralimbic mPFC en dorsale striatum (r = 0,749) tussen de basolaterale en centrale-cortico-mediale AMY (r = 0,999), en tussen de dorsale striatum en de VTA (r = 0,723). In tegenstelling, het patroon van c-Fos tellingen bij dieren blootgesteld aan maïsolie onthulde significant (p <0,05) negatieve correlatie tussen de basolaterale AMY en ofwel de NAC kern (r = -0,712) of omhulsel (r = -0,708), en tussen de centrale-cortico-mediale AMY en ofwel de NAC kern (r = -0,712) of shell (r = -0,710) .De patroon van de c-Fos telt bij dieren eXposed geopenbaarde significant (p <0,05) Positieve correlaties tussen de prelimbische en infralimbic mPFC (r = 0,930) glucose, tussen de dorsale striatum en ofwel de VTA (r = 0,821), basolaterale (r = 0,910) of centrale cortico-mediale (r = 0,911) AMY, en tussen de basolaterale en centrale-cortico-mediale (r = 0,999) AMY. Het patroon van c-Fos tellingen bij dieren blootgesteld aan fructose onthulde significant (p <0,05) Positieve correlaties tussen de NAC kern en ofwel de NAC shell (r = 0,969) of prelimbic mPFC (r = 0,740) tussen de NAC reservoir en de prelimbische mPFC (r = 0,733) tussen de prelimbische en infralimbic mPFC (r = 0,959), en tussen de basolaterale en centrale-cortico-mediale AMY (r = 0,996) .De patroon van c-Fos tellingen bij dieren blootgesteld aan sacharine geopenbaard significant (p <0,05) positieve correlaties tussen de kern en NAC NAC shell (r = 0,792) tussen het reservoir en NAC dorsale striatum (r = 0,715), en tussen de prelimbische mPFC eennd infralimbic mPFC (r = 0,999).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Het doel van het onderzoek was te bepalen of de bron (VTA) en voorhersenen uitsteeksel targets (NAC, AMY, mPFC) DA-beloning gerelateerde neuronen tegelijkertijd werden geactiveerd na nieuwe inname van vet en suiker in ratten via het mobiele c-fos techniek . De huidige studie is een gedetailleerde beschrijving van de protocollen van een onderzoek dat eerder 69 gepubliceerd. De hypothese was dat de VTA, de belangrijkste uitsteeksel zones de prelimbische en infralimbic mPFC, de kern en schil van de NAC en basolaterale en centrale-cortico-mediale AMY, evenals de dorsale striatum zou fungeren als een gedistribueerd hersenen netwerk 24 -27 en weer gecoördineerde en gelijktijdige FLI volgende nieuwe opname van glucose (8%), fructose (8%) of maïsolie (3,5%) oplossing opzichte van sacharine (0,2%), water en andere controleoplossingen. Maïsolie, glucose en fructose, maar niet sacharine inname en gaf significante differentiële FLI activering van de VTA, de prelimbische en infralimbic mPFC, de kern en de schil van de NAC, de basolaterale en centrale-cortico-mediale AMY, en de dorsale striatum. Naast de c-fos techniek werden gedragsmetingen suiker, vet en kunstmatige zoetstof inname toegepast.

Een kritische stap inbegrepen tijdige bemonstering van inname zodat zij relatief gelijk zouden zijn, waardoor wordt verzekerd dat eventuele verschillen in c-fos activatie over sites werden door de oplossing in plaats verbruikt het hetzij de patroon of de omvang van de inname. De vier dagen van de uitgangswaarde sacharine inname ervoor gezorgd dat het voedsel beperkt dieren die bemonsterd zijn de oplossingen die snel, en daardoor tot een minimum beperkt non-specifieke effecten. Een tweede belangrijke stap was dat de procedure veroorzaakt minimale stress of nieuwigheid bij de dieren als veranderingen in emotionele valentie onafhankelijk van de inname soort ook kon produceren c-fos activering. De bevindingen geven een overtuigend "proof of concept" voor de effectiviteit van deze benadering en protocollen met betrekking totbepalen of acute blootstelling aan vet (bijvoorbeeld maïsolie), suiker (glucose en fructose) en caloriearme zoetstof (saccharine) oplossingen gelijktijdig activeren DA-gemedieerde ROI in wijze wijzen op een gecoördineerde gedistribueerd hersensysteem 24-27.

Omdat optimale c-Fos activatie vereist tijdgevoelige reacties voorafgaand aan offeren 51,52, eerder gevalideerd 42,44 gemaximaliseerd oplossing bemonstering met korte vertraging in de 1-uur proef. Zo werden voedsel beperkt ratten getraind met 0,2% sacharine oplossingen (10 ml, 1 uur) voor 4 dagen, en gezien de testoplossing op de vijfde dag. Baseline sacharine inname aanzienlijk en progressief toe en fructose en glucose, maar niet maïsolie of saccharine inname op de vijfde dag aanzienlijk hoger dan vierde dag sacharine inname. Daarom oplossingen geassocieerd met verhoogde FLI aanzienlijk toegenomen (glucose, fructose) of niet beïnvloeden (maïsolie) intake retieve naar vorige sacharine training, en leek te worden gemedieerd door middel van een beloning gedragsstoornissen incentive-mechanisme. Zorgvuldige afweging moet worden genomen om de bemonstering en de gelijkheid van gedrag te waarborgen. Andere onderzoekers effectief kan gebruiken deze procedure om andere vormen van nieuwe oplossingen variaties bestuderen of in te voeren in het paradigma mechanismen die verband houden met de aanpassing en leren begrijpen.

Het voordeel van dit protocol is de mogelijkheid om effecten van de goed onderzochte suikers (fructose, glucose) en vetten vergelijk (maïsolie) en vergelijk de c-fos activerende effecten dan belangrijke controles (de niet-voedzame zoetstof, sacharine, een controle-emulgator, xanthaangom, en water), en vervolgens te onderzoeken deze effecten in zes gerelateerde hersenen sites. Hoewel deze aanpak heeft duidelijke voordelen voor het gelijktijdig onderzocht in hersenen locaties van de verschillende smakelijk stoffen heeft het nadeel van het produceren van een potentieel astronomische gegevenssetvan cellen die neuronale expressie. Om dit beter beheersbaar te maken, hebben we de aanpak van het analyseren van drie representatieve coronale plakjes per site voor alle dieren in alle testomstandigheden. Dit is natuurlijk gepaard met het nadeel van het kiezen van de geschikte niveaus van elke ROI in deze drie secties. Gezien de brede rostro-caudale de omvang van de AMY, NAC, mPFC, dorsale striatum en VTA, dit voorbehoud moet niet lichtvaardig worden genomen. Verder is dan de taak van de onderzoekers om consistent nauwkeurig selecteren elk van de drie representatieve secties voor alle dieren in alle sites. Kleine foutjes in deze keuze kan leiden tot een "false positives" en "valse negatieven". Efficiëntie tellen eveneens een relevante variabele. Onze oplossing voor dit potentieel verwarren was om twee ongeïnformeerde beoordelaars toe te wijzen voor elke sectie in elk ROI, en er dan voor zorgen dat de interbeoordelaarsbetrouwbaarheid (met behulp van correlatie van tellingen) steeds hoger dan 0,8. Deze aanpak, terwijl duplicative, gaf ons veel grotere mate van nauwkeurigheid als de interbeoordelaarsbetrouwbaarheid gemakkelijk deze minimale criterium overschreden. Sub-regio's van de NAC (kern vs. shell), Amy (Baso-laterale vs. centrale-cortico-mediale) en mPFC (perilimbische vs. infralimbic) werden geanalyseerd. Deze regio's kunnen verder worden onderverdeeld, met name de individuele AMY kernen, de patch en matrix compartimenten van het dorsale striatum, en de NAC shell (vertex, boog, kegel, intermediaire zone). Omdat de NAC shell niet constant veranderingen in de FLI volgende maïsolie, glucose of fructose te tonen, werd verder sub-analyses van deze structuur niet uitgevoerd. Definitieve onderzoek van de patch en matrix zones van het dorsale striatum vereiste verdere immunohistochemische technieken die niet in dienst zijn in het huidige onderzoek, maar zou een belangrijke follow-up studie. Analyses van de individuele AMY kernen binnen elke sub-regio zou ook een extra toekomstige studie.

Eerdere studies toonden aan dat sucnam verhoogde inname FLI in de centrale kern AMY, de VTA en de schaal, maar niet de kern van de NAC, maar orale of IG saccharine infusies grotendeels ineffectief 55-57, 60-62. Glucose en fructose intake opgewekt suiker-specifieke effecten op FLI met zowel effectief in het centrale cortico-AMY mediale en dorsale striatum, de eerstgenoemde effectief bij de NAC kern en de basolaterale AMY, en deze effectief in de infralimbic mPFC. Sacharine inname geen enkele wijzigingen in de FLI in een site ten opzichte van het water te lokken. Vetinname ook toegenomen FLI in accumbal en mPFC sites in eerdere studies 65-67, en produceerde gelijktijdige significante activatie in de VTA, infralimbic en prelimbic mPFC, dorsale striatum, NAC kern, en de basolaterale en centrale-cortico-mediale AMY.

Hoewel eerdere studies aangetoond dat suiker en vet inname geïnduceerde FLI in voorhersenen meso-corticolimbic en nigro-striatale DA-systemen, de huidige studie systematischgeëvalueerd gelijktijdige FLI activering in de VTA, basolaterale en centrale-cortico-mediale AMY, dorsale striatum, prelimbic en infralimbic mPFC NAC kern en schil na acute opname van maïsolie, fructose, glucose of saccharine. FLI significante verhogingen werden sterk met elkaar verbonden in voorhersenen plaatsen, ondersteunen het idee van gedistribueerde netwerk hersenen activering mediëren suiker en vet. Dergelijke protocollen identificeren van gelijktijdige veranderingen in de hersenen meerdere loci kunnen worden gebruikt in het kader van chronische en binging omstandigheden, alsmede op grond van conditionering en voorkeuren. Deze studies tonen aan dat een sterke anatomische correlaat (c-fos) effectief kunnen worden gebruikt op diverse hersenen plaatsen tegelijkertijd kandidaatstoffen voor het mediëren smakelijk inname en voorkeuren bij dieren die inzicht kunnen geven in menselijke medische aandoeningen gerelateerd aan obesitas, diabetes en andere eetstoornissen .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen.

Acknowledgments

Met dank aan Diana Icaza-Culaki, Cristal Sampson en Theologia Karagiorgis voor hun harde werk aan dit project.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Sprague-Dawley rats Charles River Laboratories CD-1
Wire Mesh Cages Lab Products, Seaford, DE 30-Cage rack
Rat Chow PMI Nutrition International 5001
Taut Metal Spring Lab Products, Seaford, DE n/a
Rat Weighing Scale Fisher Scientific Company n/a
Nalgene Centrifuge Tubes Lab Products, Seaford, DE 10-0501
Rubber Stopper Lab Products, Seaford, DE n/a
Metal Sippers Lab Products, Seaford, DE n/a
Saccharin Sigma Chemical Co 82385-42-0
Kool-Aid, Cherry Kool-Aid Commerical
Kool-Aid, Grape Kool-Aid Commercial
Fructose Sigma Chemical Co F0127
Glucose Sigma Chemical Co G8270
Corn Oil Mazzola Commerical
Xanthan Gum Sigma Chemical Co 11138-66-2
Sliding Microtome Microm International n/a
Neurolucida Camera MBF Bioscience Software application
Gelatin-coated Slides Fisher Scientific Company 12-550-343
Cover glass Fisher Scientific Company 12-545-M
Golden Nylon Brushes Loew-Cornell  2037
Natural Hair Sable  Loew-Cornell  2022
24 Well Plates Fisher Scientific 3527
6 Well Plates Fisher Scientific 3506
1 L Pyrex bottles Fisher Scientific 1395-1L
Tissue insert (tissue strainer) Fisher Scientific 7200214
Eagle pipettes  World Precision Instruments E10 for 1-10μl
Eagle pipettes  World Precision Instruments E100 for 20-100μl
Eagle pipettes  World Precision Instruments E200 for 50-200μl
Eagle pipettes  World Precision Instruments E1000 for 100-1000μl
Eagle pipettes  World Precision Instruments E5000 for 1000-5000μl 
Universal Tips .1-10 μl World Precision Instruments 500192
Universal Tips 5-200 μl World Precision Instruments 500194
Universal Tips 500-5,000 μl World Precision Instruments 500198
Blade Vibroslice 100 World Precision Instruments BLADE
DPX Mounting Medium  Electron Microscopy  13510
15 ml centrifuge tubes Biologix Research Co. 10-0501
Slide Boxes Biologix Research Co. 41-6100
Orbital Shaker  Madell Corporation   ZD-9556
weigh boats  Fisher Scientific 02-202-100
5 ml disposable pipettes Fisher Scientific 13-711-5AM
Stereo Investigator Software Micro Bright Field Software application
Name Company Catalog number Comments
Reagents
Paraformaldehyde Granular Fisher Scientific 19210
NaCl Fisher Scientific S271-1
Sodium Phophate Monobasic Fisher Scientific S468-500
Sodium Phosphate Diphasic Fisher Scientific BP332-500
Hydrogen Peroxide  Fisher Scientific H324-500
SafeClear II  Fisher Scientific 23-044-192
Methanol  Fisher Scientific A412-1
Normal Goat Serum Vector S-1000
Biotinylated Anti-Rabbit IgG (H+L) Vector BA-1000
ABC Kit Peroxidase Standard Vector PK-4000
Anti-cFos (Ab-5) Rabbit EMD chem/Cal Biochem PC38
Triton X 100 SigmaAldrich X-100
3,3' diaminobenzidine tetra hydrochloride  SigmaAldrich D5905
Sodium Hydroxide SigmaAldrich 5881
Primary TH anti body EMD Millipore AB152
Euthosol Virbac AH

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Koob, G. F. Neural mechanisms of drug reinforcement. Ann. N.Y. Acad. Sci. 654, 171-191 (1992).
  2. Wise, R. A. Role of brain dopamine in food reward. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 361, 1149-1158 (2006).
  3. Salamone, J. D., Correa, M. The mysterious motivational functions of mesolimbic dopamine. Neuron. 76, 470-485 (2012).
  4. Horvitz, J. C., Choi, W. Y., Morvan, C., Eyny, Y., Balsam, P. D. A "good parent" function of dopamine: transient modulation of learning and performance during early stages of training. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1104, 270-288 (2007).
  5. Wickens, J. R., Horvitz, J. C., Costa, R. M., Killcross, S. Dopaminergic mechanisms in actions and habits. J. Neurosci. 27, 8181-8183 (2007).
  6. Bjorklund, A., Dunnett, S. B. Dopamine neuron systems in the brain: an update. Trends Neurosci. 30, 194-202 (2007).
  7. Swanson, L. W. The projections of the ventral tegmental area and adjacent regions: a combined fluorescent retrograde tracer and immunofluorescence study in the rat. Brain Res. Bull. 9, 321-353 (1982).
  8. Cacciapaglia, F., Wrightman, R. M., Careli, R. M. Rapid dopamine signaling differentially modulates distinct microcircuits within the nucleus accumbens during sucrose-directed behavior. J. Neurosci. 31, 13860-13869 (2011).
  9. Martinez-Hernandez, J., Lanuza, E., Martinez-Garcia, F. Selective dopaminergic lesions of the ventral tegmental area impair preference for sucrose but not for male sex pheromones in female mice. Eur. J. Neurosci. 24, 885-893 (2006).
  10. Bassareo, V., Di Chiara, G. Differential influence of associative and nonassociative learning mechanisms on the responsiveness of prefrontal and accumbal dopamine transmission to food stimuli in rats fed ad libitum. J. Neurosci. 17, 851-861 (1997).
  11. Bassareo, V., Di Chiara, G. Differential responsiveness of dopamine transmission to food-stimuli in nucleus accumbens shell/core compartments. Neurosci. 89, 637-641 (1999).
  12. Cheng, J., Feenstra, M. G. Individual differences in dopamine efflux in nucleus accumbens shell and core during instrumental conditioning. Learn. Mem. 13, 168-177 (2006).
  13. Genn, R. F., Ahn, S., Phillips, A. G. Attenuated dopamine efflux in the rat nucleus accumbens during successive negative contrast. Behav. Neurosci. 118, 869-873 (2004).
  14. Hajnal, A., Norgren, R. Accumbens dopamine mechanisms in sucrose intake. Brain Res. 904, 76-84 (2001).
  15. Hajnal, A., Smith, G. P., Norgren, R. Oral sucrose stimulation increases accumbens dopamine in the rat. Am. J. Physiol. 286, R31-R37 (2003).
  16. Bassareo, V., Di Chiara, G. Modulation of feeding-induced activation of mesolimbic dopamine transmission by appetitive stimuli and its relation to motivational state. Eur. J. Neurosci. 11, 4389-4397 (1999).
  17. Hajnal, A., Lenard, L. Feeding-related dopamine in the amygdala of freely moving rats. Neuroreport. 8, 2817-2820 (1997).
  18. Bassareo, V., De Luca, M. A., Di Chiara, G. Differential expression of motivational stimulus properties by dopamine in nucleus accumbens shell versus core and prefrontal cortex. J. Neurosci. 22, 4709-4719 (2002).
  19. Feenstra, M., Botterblom, M. Rapid sampling of extracellular dopamine in the rat prefrontal cortex during food consumption, handling, and exposure to novelty. Brain Res. 742, 17-24 (1996).
  20. Hernandez, L., Hoebel, B. G. Feeding can enhance dopamine turnover in the prefrontal cortex. Brain Res. Bull. 25, 975-979 (1990).
  21. Liang, N. C., Hajnal, A., Norgren, R. Sham feeding corn oil increases accumbens dopamine in the rat. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 291, R1236-R1239 (2006).
  22. Dunnett, S. B., Iversen, S. D. Regulatory impairments following selective kainic acid lesions of the neostriatum. Behav. Brain Res. 1, 497-506 (1980).
  23. Salamone, J. D., Zigmond, M. J., Stricker, E. M. Characterization of the impaired feeding behavior in rats given haloperidol or dopamine-depleting brain lesions. Neurosci. 39, 17-24 (1990).
  24. Kelley, A. E. Ventral striatal control of appetitive motivation: role in ingestive behavior and reward-related learning. Neurosci. Biobehav. Rev. 27, 765-776 (2004).
  25. Kelley, A. E. Memory and addiction: shared neural circuitry and molecular mechanisms. Neuron. 44, 161-179 (2004).
  26. Kelley, A. E., Baldo, B. A., Pratt, W. E. A proposed hypothalamic-thalamic-striatal axis for the integration of energy balance, arousal and food reward. J. Comp. Neurol. 493, 72-85 (2005).
  27. Kelley, A. E., Baldo, B. A., Pratt, W. E., Will, M. J. Corticostriatal-hypothalamic circuitry and food motivation: integration of energy, action and reward. Physiol. Behav. 86, 773-795 (2005).
  28. Berendse, H. W., Galis-de-Graaf, Y., Groenewegen, H. J. Topographical organization and relationship with ventral striatal compartments of prefrontal corticostriatal projections in the rat. J. Comp. Neurol. 316, 314-347 (1992).
  29. Brog, J. S., Salyapongse, A., Deutch, A. Y., Zahm, D. S. The patterns of afferent innervation of the core and shell in the "accumbens" part of rat ventral striatum: immunohistochemical detection of retrogradely transported fluoro-gold. J. Comp. Neurol. 338, 255-278 (1993).
  30. McDonald, A. J. Organization of amygdaloid projections to the prefrontal cortex and associated stritum in the rat. Neurosci. 44, 1-14 (1991).
  31. McGeorge, A. J., Faull, R. L. The organization of the projection from the cerebral cortex to the striatum in the rat. Neurosci. 29, 503-537 (1989).
  32. Sesack, S. R., Deutch, A. Y., Roth, R. H., Bunney, B. S. Topographical organization of the efferent projections of the medial prefrontal cortex in the rat: an anterograde tract-tracing study with Phaseolus vulgaris leucoagglutinin. J. Comp. Neurol. 290, 213-242 (1989).
  33. Wright, C. I., Beijer, A. V., Groenewegen, H. J. Basal amygdaloid complex afferents to the rat nucleus accumbens are compartmentally organized. J. Neurosci. 16, 1877-1893 (1996).
  34. Wright, C. I., Groenewegen, H. J. Patterns of convergence and segregation in the medial nucleus accumbens of the rat: relationships of prefrontal cortical, midline thalamic and basal amygdaloid afferents. J. Comp. Neurol. 361, 383-403 (1995).
  35. Geary, N., Smith, G. P. Pimozide decreases the positive reinforcing effect of sham fed sucrose in the rat. Pharmacol. Biochem. Behav. 22, 787-790 (1985).
  36. Muscat, R., Willner, P. Effects of selective dopamine receptor antagonists on sucrose consumption and preference. Psychopharmacol. 99, 98-102 (1989).
  37. Schneider, L. H., Gibbs, J., Smith, G. P. D-2 selective receptor antagonists suppress sucrose sham feeding in the rat. Brain Res. Bull. 17, 605-611 (1986).
  38. Baker, R. W., Osman, J., Bodnar, R. J. Differential actions of dopamine receptor antagonism in rats upon food intake elicited by mercaptoacetate or exposure to a palatable high-fat diet. Pharmacol. Biochem. Behav. 69, 201-208 (2001).
  39. Rao, R. E., Wojnicki, F. H., Coupland, J., Ghosh, S., Corwin, R. L. Baclofen, raclopride and naltrexone differentially reduce solid fat emulsion intake under limited access conditions. Pharmacol. Biochem. Behav. 89, 581-590 (2008).
  40. Weatherford, S. C., Smith, G. P., Melville, L. D. D-1 and D-2 receptor antagonists decrease corn oil sham feeding in rats. Physiol. Behav. 44, 569-572 (1988).
  41. Azzara, A. V., Bodnar, R. J., Delamater, A. R., Sclafani, A. D1 but not D2 dopamine receptor antagonism blocks the acquisition of a flavor preference conditioned by intragastric carbohydrate infusions. Pharmacol. Biochem. Behav. 68, 709-720 (2001).
  42. Baker, R. M., Shah, M. J., Sclafani, A., Bodnar, R. J. Dopamine D1 and D2 antagonists reduce the acquisition and expression of flavor-preferences conditioned by fructose in rats. Pharmacol. Biochem. Behav. 75, 55-65 (2003).
  43. Dela Cruz, J. A., Coke, T., Icaza-Cukali, D., Khalifa, N., Bodnar, R. J. Roles of NMDA and dopamine D1 and D2 receptors in the acquisition and expression of flavor preferences conditioned by oral glucose in rats. Neurobiol. Learn. Mem. 114, 223-230 (2014).
  44. Dela Cruz, J. A., et al. Roles of dopamine D1 and D2 receptors in the acquisition and expression of fat-conditioned flavor preferences in rats. Neurobiol. Learn. Mem. 97, 332-337 (2012).
  45. Yu, W. Z., Silva, R. M., Sclafani, A., Delamater, A. R., Bodnar, R. J. Pharmacology of flavor preference conditioning in sham-feeding rats: effects of dopamine receptor antagonists. Pharmacol. Biochem. Behav. 65, 635-647 (2000).
  46. Yu, W. Z., Silva, R. M., Sclafani, A., Delamater, A. R., Bodnar, R. J. Role of D(1) and D(2) dopamine receptors in the acquisition and expression of flavor-preference conditioning in sham-feeding rats. Pharmacol. Biochem. Behav. 67, (1), 537-544 (2000).
  47. Touzani, K., Bodnar, R. J., Sclafani, A. Activation of dopamine D1-like receptors in nucleus accumbens is critical for the acquisition, but not the expression, of nutrient-conditioned flavor preferences in rats. Eur. J. Neurosci. 27, 1525-1533 (2008).
  48. Touzani, K., Bodnar, R. J., Sclafani, A. Dopamine D1-like receptor antagonism in amygdala impairs the acquisition of glucose-conditioned flavor preference in rats. Eur. J. Neurosci. 30, 289-298 (2009).
  49. Touzani, K., Bodnar, R. J., Sclafani, A. Acquisition of glucose-conditioned flavor preference requires the activation of dopamine D1-like receptors within the medial prefrontal cortex in rats. Neurobiol. Learn. Mem. 94, 214-219 (2010).
  50. Malkusz, D. C., et al. Dopamine signaling in the medial prefrontal cortex and amygdala is required for the acquisition of fructose-conditioned flavor preferences in rats. Behav. Brain Res. 233, 500-507 (2012).
  51. Bernal, S. Y., et al. Role of dopamine D1 and D2 receptors in the nucleus accumbens shell on the acquisition and expression of fructose-conditioned flavor-flavor preferences in rats. Behav. Brain Res. 190, 59-66 (2008).
  52. Bernal, S. Y., et al. Role of amygdala dopamine D1 and D2 receptors in the acquisition and expression of fructose-conditioned flavor preferences in rats. Behav. Brain Res. 205, 183-190 (2009).
  53. Dragunow, M., Faull, R. The use of c-fos as a metabolic marker in neuronal pathway tracing. J. Neurosci. Methods. 29, 261-265 (1989).
  54. VanElzakker, M., Fevurly, R. D., Breindel, T., Spencer, R. L. Environmental novelty is associated with a selective increase in Fos expression in the output elements of the hippocampal formation and the perirhinal cortex. Learn. Mem. 15, 899-908 (2008).
  55. Norgren, R., Hajnal, A., Mungarndee, S. S. Gustatory reward and the nucleus accumbens. Physiol. Behav. 89, 531-535 (2006).
  56. Park, T. H., Carr, K. D. Neuroanatomical patterns of fos-like immunoreactivity induced by a palatable meal and meal-paired environment in saline- and naltrexone-treated rats. Brain Res. 805, 169-180 (1998).
  57. Zhao, X. L., Yan, J. Q., Chen, K., Yang, X. J., Li, J. R., Zhang, Y. Glutaminergic neurons expressing c-Fos in the brainstem and amygdala participate in signal transmission and integration of sweet taste. Nan.Fang Yi.Ke.Da.Xue.Xue.Bao. 31, 1138-1142 (2011).
  58. Mungarndee, S. S., Lundy, R. F., Norgren, R. Expression of Fos during sham sucrose intake in rats with central gustatory lesions. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 295, R751-R763 (2008).
  59. Otsubo, H., Kondoh, T., Shibata, M., Torii, K., Ueta, Y. Induction of Fos expression in the rat forebrain after intragastric administration of monosodium L-glutamate, glucose and NaCl. Neurosci. 196, 97-103 (2011).
  60. Yamamoto, T., Sako, N., Sakai, N., Iwafune, A. Gustatory and visceral inputs to the amygdala of the rat: conditioned taste aversion and induction of c-fos-like immunoreactivity. Neurosci. Lett. 226, 127-130 (1997).
  61. Mitra, A., Lenglos, C., Martin, J., Mbende, N., Gagne, A., Timofeeva, E. Sucrose modifies c-fos mRNA expression in the brain of rats maintained on feeding schedules. Neurosci. 192, 459-474 (2011).
  62. Pecoraro, N., Dallman, M. F. c-Fos after incentive shifts: expectancy, incredulity, and recovery. Behav. Neurosci. 119, 366-387 (2005).
  63. Hamlin, A. S., Blatchford, K. E., McNally, G. P. Renewal of an extinguished instrumental response: Neural correlates and the role of D1 dopamine receptors. Neurosci. 143, 25-38 (2006).
  64. Kerfoot, E. C., Agarwal, I., Lee, H. J., Holland, P. C. Control of appetitive and aversive taste-reactivity responses by an auditory conditioned stimulus in a devaluation task: A FOS and behavioral analysis. Learn. Mem. 14, 581-589 (2007).
  65. Zhang, M., Kelley, A. E. Enhanced intake of high-fat food following striatal mu-opioid stimulation: microinjection mapping and fos expression. Neurosci. 99, 267-277 (2000).
  66. Teegarden, S. L., Scott, A. N., Bale, T. L. Early life exposure to a high fat diet promotes long-term changes in dietary preferences and central reward signaling. Neurosci. 162, 924-932 (2009).
  67. Del Rio, D., et al. Involvement of the dorsomedial prefrontal cortex in high-fat food conditioning in adolescent mice. Behav. Brain Res. 283, 227-232 (2015).
  68. Knapska, E., Radwanska, K., Werka, T., Kaczmarek, L. Functional internal complexity of amygdala: focus on gene activity mapping after behavioral training and drugs of abuse. Physiol. Rev. 87, 1113-1173 (2007).
  69. Dela Cruz, J. A. D., et al. c-Fos induction in mesotelencephalic dopamine pathway projection targets and dorsal striatum following oral intake of sugars and fats in rats. Brain Res. Bull. 111, 9-19 (2015).
  70. Paxinos, G., Watson, C. The rat brain in stereotaxic coordinates. Elsevier. (2006).
  71. Ranaldi, R., et al. The effects of VTA NMDA receptor antagonism on reward-related learning and associated c-fos expression in forebrain. Behav. Brain Res. 216, 424-432 (2011).
Gelijktijdige detectie van c-Fos Activering van mesolimbic en mesocorticale Dopamine Beloning Sites Na Naive suiker en vet inname bij ratten
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dela Cruz, J. A. D., Coke, T., Bodnar, R. J. Simultaneous Detection of c-Fos Activation from Mesolimbic and Mesocortical Dopamine Reward Sites Following Naive Sugar and Fat Ingestion in Rats. J. Vis. Exp. (114), e53897, doi:10.3791/53897 (2016).More

Dela Cruz, J. A. D., Coke, T., Bodnar, R. J. Simultaneous Detection of c-Fos Activation from Mesolimbic and Mesocortical Dopamine Reward Sites Following Naive Sugar and Fat Ingestion in Rats. J. Vis. Exp. (114), e53897, doi:10.3791/53897 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter