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Neuroscience

Rilevazione simultanea di c-Fos attivazione da mesolimbico e mesocorticali Siti Reward dopamina seguito Ingenuo zuccheri e grassi ingestione in Rats

doi: 10.3791/53897 Published: August 24, 2016
* These authors contributed equally

Summary

L'obiettivo di questo studio è quello di individuare le reti del cervello distribuite ricompensa legati delineando una tecnica immunoistologiche affidabile utilizzando attivazione cellulare c-fos per misurare le variazioni simultanee nei percorsi della dopamina e siti terminale dopo romanzo ingestione di grassi e zuccheri nei ratti.

Abstract

Questo studio utilizza l'attivazione cellulare c-fos per valutare gli effetti del romanzo ingestione di grassi e zucchero sul cervello della dopamina (DA) percorsi nei ratti. L'assunzione di zuccheri e grassi sono mediati dai loro attrazioni innate nonché le preferenze imparato. Cervello dopamina, soprattutto meso-limbico e proiezioni meso-corticale dalla zona ventrale tegmentale (VTA), è stato implicato in entrambe queste risposte ignoranti e apprese. Il concetto di reti del cervello distribuite, in cui diversi siti e sistemi di trasmettitore / peptidi interagiscono, è stato proposto di mediare l'assunzione di cibo appetibile, ma non vi sono prove limitate empiricamente che dimostrano tali azioni. Così, l'assunzione di zucchero suscita immunoreattività DA rilascio e aumenta c-fos-like (FLI) da singole zone di proiezione VTA DA tra cui nucleo accumbens (NAC), amigdala (Amy) e corteccia prefrontale mediale (mPFC), così come lo striato dorsale. Inoltre, l'amministrazione centrale di selettivi antagonisti dei recettori DA in questi sitos differenziale ridurre l'acquisizione e l'espressione delle preferenze sapore condizionati indotte da zuccheri o grassi. Un approccio con il quale per determinare se questi siti hanno interagito come una rete cerebrale distribuita in risposta allo zucchero o di assunzione di grassi sarebbe quello di simultanea valutare se il VTA e le sue principali zone di proiezione mesotelencephalic DA (prelimbic e infralimbica mPFC, core e shell del NAc, basolaterale e centro-cortico-mediale AMY) nonché striato dorsale visualizzerebbe coordinato ed attivazione FLI simultanea dopo orale, assunzione incondizionata di olio di mais (3,5%), glucosio (8%), fruttosio (8%) e la saccarina (0,2 %) soluzioni. Questo approccio è un primo passo di successo per identificare la possibilità di utilizzare attivazione cellulare c-fos simultaneamente attraverso importanti siti del cervello per studiare l'apprendimento ricompensa legati a ingestione di cibo appetibile nei roditori.

Introduction

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Cervello dopamina (DA) è stato implicato nelle risposte centrali per l'assunzione di zuccheri appetibili attraverso proposto edonistico 1,2, sforzo legate 3 e l'abitudine a base di 4,5 meccanismi di azione. Il percorso principale DA implicati in questi effetti ha origine nella zona ventrale tegmentale (VTA), e progetti al accumbens (NAC) core e shell, l'amigdala basolaterale e centrale-cortico-mediale (AMY), nucleo e la prelimbic e mediale infralimbica corteccia prefrontale (mPFC) (vedi recensioni 6,7). Il VTA è stato implicato in assunzione di saccarosio 8,9, e il rilascio di DA è osservato dopo l'assunzione di zucchero nel NAC 10-15, AMY 16,17 e mPFC 18-20. L'assunzione di grassi stimola anche DA NAC rilasciare 21, e un altro DA-ricca zona di proiezione di striato dorsale (caudato-putamen) è stato anche associato con l'alimentazione DA-mediata 22,23. Kelley 24-27 proposto che questi progetti multiplazone di ioni di questo sistema DA-mediata formano una rete distribuita del cervello integrato e interattivo attraverso ampie e intime interconnessioni 28-34.

Oltre alla capacità di DA D1 e D2 antagonisti dei recettori per ridurre l'assunzione di zuccheri e grassi 35-37 38-40, DA segnalazione è stata anche coinvolta nel mediare la capacità di zuccheri e grassi per produrre preferenze di gusto condizionata (PCP) 41- 46. Microiniezioni di un antagonista del recettore DA D1 nel NAC, AMY o mPFC 47-49 eliminare acquisizione di CFP suscitato dal glucosio intragastrico. Mentre microiniezioni di entrambi DA D1 o D2 antagonisti dei recettori nel mPFC elimina acquisizione di fruttosio-CFP 50, l'acquisizione e l'espressione di fruttosio-PCP sono differenziale bloccati da antagonisti Da nel NAC e AMY 51,52.

Il c-fos tecnica 53,54 è stata impiegata per indagare activatio neuralen indotta da assunzione gradevole al palato e l'attivazione neurale. Il termine "attivazione di c-fos" verrà utilizzato in tutto il manoscritto, ed è operativamente definita da un aumento della trascrizione di c-Fos durante la depolarizzazione neuronale. Assunzione di saccarosio aumentato fos-come immunoreattività (Fli) nel nucleo AMY centrale, nucleo VTA, nonche la shell, ma non, della NAC 55-57. Mentre l'assunzione di saccarosio in ratti sham-alimentazione significativamente aumentato FLI nel AMY e NAC, ma non il VTA 58, intragastrici saccarosio o glucosio infusioni aumentato significativamente FLI nel NAC e nuclei centrali e basolaterale del AMY 59,60. Ripetuta aggiunta di saccarosio all'accesso chow di linea aumentata FLI nel mPFC nonché il guscio NAC e nucleo 61. Un saccarosio concentrazione scalata paradigma ha rivelato che i maggiori incrementi si sono verificati nel FLI AMY basolaterale e NAC, ma non il VTA 62. A seguito di condizionamento, l'estinzione di zucchero legate rewa naturalecomportamenti rd aumentato FLI nel AMY basolaterale e il NAC 63. Inoltre, l'associazione disponibilità di zucchero a un tono provocato il tono successivamente aumentando i livelli di FLI nel AMY basolaterale 64. L'assunzione di alto contenuto di grassi è aumentato anche FLI in NAC e mPFC siti 65-67.

Zucchero e grassi effetti la maggior parte degli studi precedentemente citati esaminato sull'attivazione c-fos in singoli siti che non forniscono le informazioni relative all'identificazione delle reti cerebrali distribuite ricompensa legati 24-27. Inoltre, molti degli studi, inoltre, non ha delineare i contributi relativi sub-aree del NAC (core e shell), AMY (basolaterale e centro-cortico-mediale) e mPFC (prelimbic e infralimbica) che potrebbero potenzialmente essere esaminata dal vantaggio di eccellenti, risoluzione di una singola cellula spaziale c-Fos mappatura 68. Il nostro laboratorio ha recentemente usato 69 attivazione di c-fos e alterazioni misurate simultaneamente nella via VTA DA e la sua prozone di iniezione (NAC, Amy e mPFC) dopo romanzo ingestione di grassi e zuccheri nei ratti. Il presente studio descrive le fasi procedurali e metodologici per analizzare simultaneamente se l'esposizione acuta a sei diverse soluzioni (olio di mais, glucosio, fruttosio, saccarina, acqua e un controllo emulsione di grasso) sarebbe differenziale attivare FLI in sotto-aree del NAC, AMY, mPFC nonché striato dorsale. Questa rilevazione simultanea di differenze ha permesso la conferma degli effetti significativi sulla FLI in ciascun sito e decidere se sia i cambiamenti in un determinato sito correlato con cambiamenti di siti correlati, fornendo in tal modo il supporto per una rete cerebrale distribuita 24-27. Queste procedure collaudate se il VTA, il prelimbic e infralimbica mPFC, il nucleo e guscio della NAC, e la AMY basolaterale e centrale-cortico-mediale), così come striato dorsale visualizzerebbe coordinato e l'attivazione FLI simultanea dopo orale, l'assunzione incondizionato di glucosio (8%), fruttosio (8%), olio di mais (3,5%) e le soluzioni saccarina (0,2%).

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Protocol

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Questi protocolli sperimentali sono stati approvati dal Comitato di Cura e uso istituzionale animali attestante che tutti i soggetti e le procedure sono in conformità con il National Institutes of Health Guide per cura e l'uso di animali da laboratorio.

1. Soggetti

  1. Acquisto e / o razza maschile ratti Sprague-Dawley (260-300 g).
  2. ratti Casa singolarmente in gabbie di rete metallica. A mantenere su un / buio ciclo 12:12 ore di luce con ratto chow e acqua ad libitum.
  3. Assegnare le dimensioni del campione appropriate (ad esempio, n ≈ 6-8) in modo casuale in gruppi.

2. Le apparecchiature e procedure di test di aspirazione

  1. Utilizzare provette da centrifuga calibrate con tappi di gomma e un tubo metallico sipper angolo di 45 ° per fornire una misurazione precisa (± 0,1 ml) delle soluzioni presentate. fissarli alle gabbie a casa da una molla metallica tesa a consentire la visibilità delle calibrazioni.
  2. Limitare razioni di cibo (~15 / g / giorno) dei ratti per ridurre il peso al 85% del loro peso corporeo originale per aumentare la motivazione per consumare le soluzioni. Nota: La riduzione di peso dovrebbe prendere tra 3-5 giorni.
  3. Fornire soluzioni di pre-formazione (10 ml) di 0,2% saccarina per quattro giorni su una sessione di 1 ora per massimizzare la probabilità che i ratti potranno gustare le successive soluzioni di prova con una latenza breve (meno di 1 minuto).
  4. Confermare il flusso attraverso il tubo di centrifuga per versare qualche goccia.
  5. Pesare i tubi prima e dopo ogni sessione per ottenere la misura di aspirazione.
  6. Eseguire un test di aspirazione al quinto giorno sottogruppi trattati con uno dei sei soluzioni (10 ml, 1 hr): a) acqua, b) novel aromatizzato (0,05% sapore di ciliegia) 0,2% saccarina, c) 8% di fruttosio, d) 8 % di glucosio, e) 3,5% olio di mais sospesi in 0,3% di xanthan gum ed f) 0,3% di xanthan gum.
  7. Assicurarsi che le soluzioni nutritive sono isocalorica; pertanto, la concentrazione di mais olio 3,5% è isocalorica alle soluzioni zuccherine 8%.
  8. garantire °a ratti soluzioni campione con una latenza breve (meno di 1 minuto). Se questo requisito non è soddisfatto, poi scarta il soggetto dallo studio.

3. Preparazione del tessuto

  1. Anestetizzare ciascun animale un'iniezione intraperitoneale di pentobarbital 90 min dopo l'esposizione iniziale a ciascuna soluzione di prova. Verificare che gli animali siano adeguatamente anestetizzati dimostrando che l'animale non è più sensibile a tali riflessi, come il ritiro a pizzico piedi, lampeggianti in seguito alle pressioni della cornea diretta o scuotendo la testa alla stimolazione pinna profondo.
  2. Profumato ogni animale transcardially come descritto in precedenza 69.
    1. Anestetizzare i topi con una dose eccessiva di sodio pentobarbital (65 mg / kg), rimuovere la gabbia toracica ed esporre il petto per il libero accesso al cuore 69.
    2. Inserire l'ago nel vertice della valvola cuore sinistro, e tagliare la vena cava. Somministrare soluzione tampone fosfato (PBS, ~ 180 ml) seguito da un co fissativo tampone fosfatontaining 4% paraformaldeide (~ 180 ml).
    3. Assicurarsi che l'animale effettivamente viene perfuso correttamente esaminando se il liquido lascia altre cavità, come il naso, la bocca, e zone genitali. Nota: la fissazione corretta con paraformaldeide sarà accompagnata da grandi movimenti muscolari. Se ciò non si verifica, regolare nuovamente l'ago finché si verifica questa reazione.
  3. Rimuovere il cervello dal cranio rapidamente tagliando pelliccia e la pelle dal cranio. Utilizzare rongeurs per rompere e rimuovere l'osso dal cervello in movimento da dietro in avanti. Il lavoro inizialmente nell'area sotto e dietro il cervelletto, assicurandosi che la rongeur è tra l'osso e meningeo pia madre. Una volta che i lati superiore e del cranio vengono rimossi, utilizzare una piccola spatola per sollevare il cervello dalla base, e tagliare nervi cranici con piccole forbici. Fare attenzione a non danneggiare il cervello durante il tentativo di rimuovere il tessuto osseo.
  4. Fissare il cervello in una soluzione di paraformaldeide al 4% notte a 4 ° C.Posizionare il cervello in saccarosio / 70% soluzione al 30% PBS a temperatura ambiente fino a che si depositano sul fondo del contenitore.
  5. Bloccare il cervello
    1. Rimuovere la parte rostrale del taglio caudale trasversalmente al bulbo olfattivo del cervello.
    2. Rimuovere la parte caudale del taglio trasversalmente a livello del cervelletto e il ponte cervello.
  6. Montare il cervello coronale con la parte caudale fissato allo stadio di un microtomo scorrevole, e tagliare sezioni coronali (40 micron) attraverso il mPFC (2,86-2,20 mm rostrale al bregma), il nucleo NAC e le coperture e dorsale striato (+ 1,76-1,60 mm rostrale al bregma), il AMY (-2.12 - -2.92 mm caudale al bregma), e il VTA (-5,20 - -5,60 mm caudale a bregma). Utilizzare un cervello di ratto atlante 70 per la guida.
  7. Raccogliere sezioni free-floating in singoli pozzetti di una piastra da 24 pozzetti riempiti con PBS per eventuali analisi immunoistochimica 71. Utilizzare Parafilm per sigillare il 24 ciPiastra ll per assicurarsi che il PBS non evapora nel contenitore e asciugare il cervello. Conservare il tessuto cerebrale a 4 ° C.

4. Procedure c-fos (Adattato da 71)

  1. Trattare ogni sezione con 5 ml di 5% Normal Goat Serum e 0,2% Triton X-100 in PBS per 1 ora.
  2. Incubare le sezioni trattate con anticorpi primari (coniglio anti-c-fos, 1: 5000) a 4 ° C per 36 ore in pozzetti contenenti 1 ml di PBS.
  3. sezioni Sciacquare 3x con PBS (5 ml) per 10 minuti ciascuno.
  4. Incubare con anticorpi secondari (biotinilato di capra anti-coniglio; 1: 200) a temperatura ambiente per 2 ore in pozzetti contenenti 1 ml di PBS.
  5. Lavare 3x ciascuna sezione in PBS (5 ml) per 10 minuti ciascuno.
  6. Incubare sezioni risciacquati per 2 ore in una miscela perossidasi avidina-rafano disponibile in commercio che viene fornito in un kit composto da Avadin DH (100 microlitri) e biotinilato perossidasi di rafano H (100 ml) in 5 ml di PBS.
  7. Re-risciacquo sezioni 3x in PBS (5 ml) per 10 minuti ciascuno.
  8. React sezioni con 0,05% diaminobenzidina (DAB) in presenza di 0,0015% H 2 O 2 per 5 - 10 min, a seconda della reattività del tessuto in pozzetti contenenti 5 ml della soluzione DAB.
  9. Doppio-label sezioni VTA. li Incubare con anticorpo tirosina idrossilasi (TH) (coniglio anti-topo TH, 1: 2.000) in PBS (5 ml) notte a 4 ° C.
  10. Sciacquare le sezioni 3x in PBS (5 ml) per 10 minuti ciascuno.
  11. Incubare con anticorpi secondari (capra biotinilato anti-coniglio; 1: 200) in PBS (5 ml) a temperatura ambiente per 2 ore.
  12. Sciacquare le sezioni 3x in PBS (5 ml) per 10 minuti ciascuno.
  13. Visualizzare gli anticorpi utilizzando un complesso anticorpo-perossidasi secondario. Reagire con una combinazione di 0,05% DAB e una soluzione di nichel solfato 0,3%, per 5 - 10 minuti, a seconda della reazione del tessuto in pozzetti contenenti 5 ml di / soluzione NiCl DAB.
  14. Assicurarsi che la soluzione DAB è lattiginosa di colore verde chiaro da essoreazione s con il solfato di nichel 0,3%. Se la soluzione è troppo verde, allora la reazione sarà troppo scura.
  15. Montare tutte le sezioni su vetrini gelatina rivestite. Lasciateli asciugare durante la notte, e poi coprire antiscivolo con alcune gocce di una soluzione a base di toluene (TBS).
  16. Codice scorre in modo che la condizione sperimentale è sconosciuta agli osservatori.

5. Determinazione del c-fos immunoreattiva Conti

  1. Assegnare coppie di osservatori imparziali di contare i neuroni Fos-positivi in ​​queste regioni di interesse (ROI): prelimbic mPFC, infralimbica mPFC, nucleo NAC, NAC conchiglia, nuclei AMY basolaterale, AMY centro-cortico-mediale, dorsale striato, e VTA. Delineano se c-Fos immunoreattività era presente in TH + e th- cellule del VTA. Figura 1 fornisce un quadro acquisito dallo schermo del NAC dal microscopio.

Figura 1
Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

  1. Analizzare almeno tre fette rappresentante per luogo comune a tutti gli animali in tutte le condizioni di prova.
  2. Utilizzare software e un microscopio ottico per analizzare l'intera regione per ogni ROI tracciando un contorno (Figura 1).
    1. Per un determinato sito, aprire l'applicazione e fare clic sul menu a discesa acquisizione e fare clic su "Live Immagine". Portare il ROI a fuoco e fare clic sullo schermo per stabilire un punto di riferimento. poi TRace la regione del cervello scelta usando la griglia come guida. Una volta che la traccia è stata completata, contare le celle (passi 5.3.1.1 - 5.3.1.3).
      1. Fare doppio clic sull'icona del software. Vai alla barra dei menu, cliccare su "Acquisizione" e poi "Immagine diretta". Portare il ROI a fuoco e fare clic sullo schermo per stabilire un punto di riferimento.
      2. Vai alla barra degli strumenti di rete e fare clic su "Visualizza griglia" e "etichette Usa griglia". Delineare il ROI con una traccia prestabilita.
      3. Contare tutte le cellule in ogni area del ROI, selezionare un "+" nella barra laterale di sinistra per tenere il conto delle cellule c-fos. Fare clic su ciascuna cella singolarmente per registrare i conteggi. Si consideri una cellula positiva per c-fos quando un cerchio rosso scuro definito è osservato (Figura 1).
    2. Ripetere questa procedura per ogni sito.
    3. Record risiedono in un quaderno di laboratorio e sul computer per analisi future. Vai alla barra dei menu, cliccare su "File", "Salva file di dati" per salvare il tracciato e conta.
    4. Assicurarsi che l'affidabilità inter-rater (utilizzando la correlazione di conteggi) dei due valutatori disinformati per ogni sezione in ogni ROI supera sempre 0.8.

    6. Statistiche

    1. Valutare prese saccarina di base nel corso dei primi quattro giorni utilizzando un ripetute misure di analisi 1 della varianza (ANOVA) confrontando le prese saccarina di giorni 1, 2, 3 e 4 69.
    2. Confrontare l'assunzione di saccarina (4 ° giorno) con prese di prova (giorno 5) dei sei gruppi utilizzando un blocco randomizzato a 2 vie ANOVA 69.
    3. Utilizzare i confronti Tukey (p <0.05) per determinare i singoli effetti significativi 69.
    4. Determinare l'affidabilità inter-rater, e quindi utilizzare i conteggi di un osservatore comune.
    5. Conta media c-fos per i tre fette di rappresentanza per ogni sito 69.
      1. Eseguire 1 ANOVA dell'attivazione c-fos indotta da assunzione dei sei soluzioni (olio 3,5% di mais, 8% di glucosio, fruttosio 8%, 0,2% saccarina aromatizzato, xaControllo Nthan gomma e acqua) per la perilimbic mPFC 69.
      2. analisi parallele Ripetere dei sei gruppi per infralimbica mPFC, nucleo NAC, NAC guscio, basolaterale AMY, AMY centro-cortico-mediale, VTA e dorsale striato. Utilizzare i confronti Tukey (p <0.05) per rivelare i singoli effetti significativi 69.
    6. Confrontare l'assunzione di olio di mais sia con l'assunzione di acqua e l'assunzione di suo agente sospensioni, gomma xantano. Confronta fruttosio e glucosio prese sia con l'assunzione di acqua e l'assunzione del dolcificante non nutritivo, la saccarina.
    7. Stabilire se le relazioni significative tra le prese di soluzioni e l'attivazione di c-fos in ciascuno dei siti sono state osservate correlazioni con r Bonferroni (p <0.05).
      1. confrontare sistematicamente conta c-fos nella perilimbic e infralimbica corteccia pre-frontale per ogni animale nel gruppo olio di mais 3,5%.
      2. Ripetere le analisi sistematicamente paralleli di ogni coppia di sei siti (VTA, striato dorsale, infralimbic mPFC, perilimbic mPFC, nucleo NAC, NAC guscio, basolaterale AMY, centrale-cortico-mediale AMY) per l'olio di mais 3,5%.
      3. Ripetere le analisi sistematica parallele di questi sei siti per gli altri cinque condizioni di assunzione sperimentali (8% di glucosio, fruttosio 8%, 0,2% saccarina aromatizzato, di controllo gomma di xantano e acqua).
    8. Approfitta del fatto che gli stessi animali all'interno di una condizione di soluzione sono stati valutati in tutti i siti determinando relazioni significative tra l'attivazione di c-fos attraverso soluzioni e all'interno di ogni soluzione utilizzando Bonferroni r correlazioni (p <0.05).

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Representative Results

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Tutti i risultati rappresentativi descritti di seguito sono stati pubblicati in precedenza 69, e sono nuovamente qui presentata a supporto della "prova di concetto" nell'indicare l'efficacia della tecnica.

Soluzione Prese
sono state osservate differenze significative negli apporti saccarina di base nel corso dei primi quattro giorni per tutti gli animali (F (3.108) = 57.27, p <0.001) con prese (1 ° giorno: 1.3 (± 0.2) ml; 2 ° giorno: 3.9 (± 0.4) ml ; 3 ° giorno: 5.9 (± 0.6) ml; 4 ° giorno: 7.1 (± 0.6) ml) in modo significativo (p <0,05, Tukey HSD test) e progressivamente crescenti. Fruttosio e l'assunzione di glucosio, ma non olio di mais o saccarina assunzione al giorno 5 significativamente (p <0.05, Tukey HSD test) aumentata rispetto al 4 ° giorno di aspirazione saccarina (p <0.05, Tukey HSD test) con fruttosio (9,6 (± 0,4) ml ) e glucosio (9.4 (± 0,6) ml) significativamente superiore SACCassunzione harin. Inoltre, l'assunzione di olio di mais (7,4 (± 0,6) ml) è stata significativamente (p <0.05, Tukey HSD test) superiore assunzione gomma xantano.

Questi risultati aumentato la possibilità che la soluzione assunzione per sé potrebbe spiegare alcuna attivazione c-fos osservata in uno qualsiasi dei siti. Per esaminare questo, Bonferroni correlazioni r sono state eseguite in cui l'assunzione dei cinque soluzioni era correlata all'attivazione c-fos in ciascuno dei sei siti. correlazioni significative non sono riusciti a essere osservato tra l'assunzione di soluzione e l'attivazione di c-fos nel nucleo (r (29) = 0.186), le coperture (r (29) = 0.029) o totale (r (29) = 0,10) NAc, il prelimbic ( r (29) = 0.23), infralimbica (r (29) = 0.30) o totale (r (29) = 0.14) mPFC, VTA (r (29) = 0.10), striato dorsale (r (29) = 0,14 ) o il basolaterale (r (29) = 0.47), il centro-cortico-mediale (r (29) = 0.48) o totale (r (29) = 0,409) AMY. Data la più alta correlazione tra l'assunzione e AMY attivazione di c-fos, ulteriormente correlazionezioni sono state eseguite per ogni singola soluzione. Significativa (p <0.05, Tukey HSD test) i rapporti non è riuscito a essere osservato tra l'assunzione e AMY FLI per il fruttosio (basolaterale (r = 0.15), centro-cortico-mediale (r = 0,13), totale (r = 0,13)), il glucosio (basolaterale (r = 0.17), centro-cortico-mediale (r = 0.17), R totale = 0,13)), la saccarina (basolaterale (r = 0.42), centro-cortico-mediale (r = 0.42), totale (r = 0.42)) o olio di mais (basolaterale (r = 0.54), centro-cortico-mediale (r = 0.59), totale (r = 0.64)). Una significativa (p <0.05, Tukey HSD test) correlazione negativa è stata osservata tra l'assunzione di gomma di xantano e totale AMY FLI (r = 0,94).

mPFC c-Fos Attivazione
Olio di mais significativamente (p <0,05, test di Tukey HSD) aumento totale (Figura 2A), infralimbica (Figura 2B) e prelimbic (Figura 2C) mPFC c-Fos risiedono relativa all'acqua (*) o il controllo gomma di xantano(#). Fruttosio in modo significativo (p <0,05, Tukey HSD test) ha aumentato la conta c-Fos nel infralimbica mPFC relativo all'acqua (*) o la saccarina (+) (Figura 2B), ma non i conteggi totali o prelimbic mPFC. Al contrario, glucosio o la saccarina non sono riusciti ad alterare totali, perilimbic o infralimbica conta mPFC c-Fos. Figura 3 mostra rappresentative sezioni mPFC di animali che mostrano un aumento di mais olio indotta FLI relativi all'acqua.

figura 2
Figura 2. grassi o di zucchero assunzione Aumenta differenzialmente attivazione di c-fos nella corteccia prefrontale mediale (mPFC). Le variazioni di attivazione c-fos (media ± SEM), sono noti in tutta la mPFC (Pannello A), l'area mPFC infralimbica (Pannello B), e la zona prelimbic mPFC (pannello C) dopo il consumo (1 ora) di acqua, saccarina (0,2%), Gomma di xantano (controllo per l'olio di mais), glucosio (8%), fruttosio (8%) o olio di mais (3,5%). (Precedentemente pubblicato 69.) Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3. effettiva mPFC c-fos attivazione Dopo grassi e zuccheri. Attivazione C-fos è stata osservata in animali esposti a l'assunzione di olio di mais (Pannelli A (ingrandimento di 4 volte) e C (ingrandimento di 10 volte)), che era significativamente maggiore di quella di assunzione di acqua (pannelli B (4 volte ingrandimento) e D (ingrandimento di 10 volte)). Rappresentazione delle sub-aree delimitate del Prelimbic (PL) e infralimbica (IL) mPFC sono diagramed a Pannelli A (olio di mais) e C (acqua) come lo sono la parte di tPannelli flessibile (A e C) ingranditi di ingrandimento di 10 volte nei pannelli corrispondenti (B e D). Frecce in pannelli C e D indicano cellule positive rappresentativi c-fos. Tutte le barre di scala sono 100 micron. (Precedentemente pubblicato 69.) Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

AMY c-Fos Attivazione
Olio di mais in modo significativo (p <0,05, Tukey HSD test) è aumentato AMY totale (Figura 4A), basolaterale (Figura 4B) e centro-cortico-mediale (Figura 4C) sottozona AMY c-Fos conta relativi all'acqua (*) o il controllo xantano (#). Glucosio anche in modo significativo (p <0,05, Tukey HSD test) un aumento totale (Figura 4A), basolaterale (Figura 4B) e centro-cortico-mediale ( (Figura 4A) e centro-cortico-mediale sottozona (Figura 4C) del AMY c-Fos conta relativa all'acqua (*) o la saccarina (+), ma non nella sottozona basolaterale AMY. Saccarina non è riuscito a modificare la totale, basolaterale o centrale-cortico-mediale AMY c-Fos conta relativa all'acqua. Analisi dettagliate dei singoli nuclei all'interno del AMY rivelato che i cambiamenti significativi rilevati nella zona basolaterale del AMY sono stati anche notati nei singoli nuclei AMY basolaterale e laterali. I cambiamenti significativi rilevati nella zona centrale-cortico-mediale della AMY sono stati notati nel singolo centro, corticale e mediale AMY nuclei. Figura 5 mostra sezioni rappresentative AMYdi animali che presentano una maggiore all'olio di mais, glucosio, fruttosio indotta FLI relativi all'acqua. (Precedentemente pubblicato 69).

Figura 4
Figura 4. grassi o di zucchero assunzione Aumenta differenzialmente attivazione di c-fos nell'amigdala (AMY). Le variazioni di attivazione c-fos (media ± SEM), sono noti in tutta la AMY (Pannello A), l'area AMY basolaterale (Pannello B) , e la zona centrale AMY-cortico-mediale (pannello C) dopo il consumo (1 ora) di acqua, saccarina, gomma xantano, glucosio, fruttosio o olio di mais. I cambiamenti significativi rilevati nella zona basolaterale del AMY sono stati anche notati nei singoli nuclei AMY basolaterale e laterali. I cambiamenti significativi rilevati nella zona centrale-cortico-mediale della AMY sono stati anche notati nei singoli nuclei centrali, corticale e mediale AMY. (Precedentemente pubblicato 69.) Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 5
Figura 5. effettivo AMY attivazione c-fos Dopo grassi e zuccheri. Attivazione C-fos è stata osservata in animali esposti ad assunzioni di olio di mais (Pannelli A (ingrandimento di 4 volte), D (ingrandimento 10 volte) e G (60- piegare ingrandimento)), glucosio (pannelli B (ingrandimento di 4 volte) ed e (ingrandimento di 10 volte)), e il fruttosio (pannelli C (ingrandimento di 4 volte) e 10 volte F ()) che erano significativamente superiore a quello di assunzione di acqua (pannelli H (ingrandimento di 4 volte) e I (ingrandimento di 10 volte)). rappresentazione dellale sub-aree delimitate del centro-cortico-mediale (CMC) e il basolaterale AMY (BLA) sono diagramed a Pannelli A (olio di mais), B (glucosio), C (fruttosio) e H (acqua) come lo sono la parte tali pannelli (a, B, C e H) ingranditi ingrandimento a10 volte nei pannelli corrispondenti (D, e, F e i). Il sotto-area delineata nel Pannello di D (olio di mais, l'ingrandimento di 10 volte) è amplificato a un ingrandimento di 60 volte nel Pannello di D. Le frecce in pannelli D, E, F, G e I indicano cellule positive rappresentativi c-fos. Tutte le barre di scala sono 100 micron, tranne Panel G (50 micron). (Precedentemente pubblicato 69.) Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

NAC c-Fos Attivazione
Olio di mais significativamente (p <0.05, Tukey HSD test) aumento totale (Figura 6A) e il rullo ( (Figura 6C). Glucosio significativamente (p <0.05, Tukey HSD test) aumentata conteggi c-Fos nel nucleo NAc (figura 6B), ma non nel totale NAc o guscio NAc rispetto alla saccarina (+) o acqua (*). Al contrario, il fruttosio e la saccarina non sono riusciti a essere diverso dal acqua nel suscitare attivazione di c-Fos nel nucleo NAC e / o la shell. Figura 7 mostra sezioni rappresentative nel nucleo NAc di animali che presentano una maggiore all'olio di mais o glucosio-indotta FLI relativi all'acqua .

Figura 6
Figura 6. grassi o di zucchero assunzione Aumenta differenzialmente attivazione di c-fos nella NAC. Le variazioni di attivazione c-fos (media ± SEM) in tutta la NAC (Pannello A), il nucleo NAC (pannello B), e il guscio NAC (Pannello C) dopo il consumo (1 ora) di acqua, saccarina, gomma xantano, glucosio, fruttosio o olio di mais. (Precedentemente pubblicato 69.) Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 7
Figura 7. effettivo NAC Nucleo, ma non NAC Shell attivazione c-fos Dopo grassi e zuccheri. Attivazione C-fos è stata osservata in animali esposti ad assunzioni di olio di mais (Pannelli A (ingrandimento di 4 volte), D (ingrandimento 10 volte ) e G (ingrandimento di 60 volte)) e glucosio (pannelli B (ingrandimento di 4 volte) ed e (ingrandimento di 10 volte)) che erano significativamente maggiore di quella di assunzione di acqua (Pannelli C (ingrandimento di 4 volte) e F (Magnifica 10 voltezione)). Rappresentazione delle sub-aree delimitate del nucleo NAC e il guscio NAc sono diagramed a Pannelli A (olio di mais), B (glucosio) e C (acqua) come lo sono la parte di quei pannelli (A, B, C e H) ingrandita ingrandimento a10 volte nei pannelli corrispondenti (D, e e F). Il sotto-area delineata nel Pannello di D (olio di mais, l'ingrandimento di 10 volte) è amplificato a un ingrandimento di 60 volte nel Pannello di G. frecce in pannelli D, E, F e G indicano cellule positive rappresentativi c-fos. Tutte le barre di scala sono 100 micron. (Precedentemente pubblicato 69.) Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Dorsale striatale c-Fos Attivazione
Olio di mais significativamente (p <0.05, Tukey HSD test) aumentata conteggi c-Fos nel dorsale striato relativa all'acqua (*) o la gomma xantano (#) (Figure 8A). Glucosio o fruttosio significativamente (p <0.05, Tukey HSD test) aumentati dorsale striatale FLI rispetto alla saccarina (+) (Figura 8A). Al contrario, la saccarina è riuscito a essere diverso dal acqua nel suscitare dorsale striato di attivazione c-Fos. Figura 9 mostra dorsali rappresentante sezioni striatali di animali che mostrano un aumento d'olio di mais, glucosio o il fruttosio indotta FLI relativi all'acqua.

Figura 8
Figura 8. grassi o di zucchero assunzione Aumenta differenzialmente attivazione di c-fos nella striato dorsale e ventrale tegmentale Area. Dorsale atriatal (Pannello A) e ventrale tegmentale (pannello B) alterazioni sono stati notati per l'attivazione di c-fos (media ± SEM) a seguito consumo (1 ora) di acqua, saccarina, gomma xantano, glucosio, fruttosio o olio di mais. (Precedentemente pubblicato 69).

Figura 9
Figura 9. effettiva attivazione di c-fos dorsale striatale Dopo grassi e zuccheri. C-fos attivazione è stata osservata in animali esposti ad assunzioni di olio di mais (Pannelli A (ingrandimento di 4 volte), D (ingrandimento 10 volte) e G (60 ingrandimento fold)), glucosio (pannelli B (ingrandimento di 4 volte) ed e (ingrandimento di 10 volte)), fruttosio (Pannelli C (ingrandimento di 4 volte) e F (ingrandimento di 10 volte)) che erano significativamente maggiore di quella di assunzione di acqua (Pannelli H (ingrandimento di 4 volte) e I (ingrandimento di 10 volte)). Delineate sub-aReas di striato dorsale in Pannelli A (olio di mais), B (glucosio), C (fruttosio) e H (acqua) sono indicati che ingrandita ingrandimento a 10 volte nei pannelli corrispondenti (D, E, F e I). Il sotto-area delineata nel Pannello di D (olio di mais, l'ingrandimento di 10 volte) è amplificato a un ingrandimento di 60 volte nel Pannello di G. frecce in pannelli D, E, F e G indicano cellule positive rappresentativi c-fos. Tutte le barre di scala sono 100 micron, tranne Panel G (50 micron). (Precedentemente pubblicato 69.) Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

VTA c-Fos Attivazione
Olio di mais significativamente (p <0.05, Tukey HSD test) aumentati conteggi c-Fos in cellule TH + VTA relativi al controllo xantano (#) (Figura 8B). Al contrario, glucosio, fruttosio o saccarina riuscito ad alterare conteggi c-Fos nel relativo VTA per l'acqua. Figura 10 display TH rappresentante cellule VTA c-Fos-attivati ​​di animali che mostrano un aumento di mais olio indotta FLI relativi all'acqua + e TH e.

Figura 10
Figura 10. Actual c-fos attivazione tegmentale ventrale Area seguito grassi e zuccheri. VTA attivazione c-fos è stata osservata in animali esposti a olio di mais (Pannelli A (4 volte) e C (10 volte)) e acqua (pannelli B (4 volte) e D (10 volte)). frecce nere indicano rappresentante / cellule positive c-fos doppio marcato TH, mentre le frecce grigie indicano rappresentativi c-fos solo le cellule. Tutte le barre di scala sono 100 micron. (Precedentemente pubblicato 69.) Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

ove_content "fo: keep-together.within-page =" 1 "> I rapporti di c-Fos attivazione tra i siti e soluzioni
Il modello di conteggi c-Fos in animali esposti a olio di mais ha rivelato significative (p <0,05) correlazioni positive tra il nucleo NAC e sia il guscio NAc (r = 0,971) o l'intero mPFC (r = 0.670), tra il prelimbic mPFC e sia il infralimbica mPFC (r = 0,940) o dorsale striato (r = 0,849), tra la infralimbica mPFC e dorsale striato (r = 0,749), tra la AMY basolaterale e centrale-cortico-mediale (r = 0,999), e tra il striato dorsale e il VTA (r = 0,723). Al contrario, il modello di conteggi c-Fos in animali esposti a olio di mais rivelato significative (p <0,05) correlazioni negative tra il AMY basolaterale e sia il nucleo NAc (r = -0,712) o guscio (r = -0,708), e tra il AMY centro-cortico-mediale e sia il nucleo NAc (r = -0,712) o shell (r = -0,710) .Il modello di c-Fos conta negli animali eXposed al glucosio rivelate significative (p <0,05) correlazioni positive tra il prelimbic e infralimbica mPFC (r = 0.930), tra lo striato dorsale e sia il VTA (r = 0,821), basolaterale (r = 0,910) o centrale-cortico-mediale (r = 0,911) AMY, e tra il basolaterale e centrale-cortico-mediale (r = 0,999) AMY. Il modello di conteggi c-Fos in animali esposti a fruttosio ha rivelato significative (p <0,05) correlazioni positive tra il nucleo NAC e sia il guscio NAc (r = 0.969) o prelimbic mPFC (r = 0.740), tra il guscio NAC e la prelimbic mPFC (r = 0,733), tra il prelimbic e infralimbica mPFC (r = 0,959), e tra il AMY basolaterale e centrale-cortico-mediale (r = 0.996) .Il modello di conteggi c-Fos in animali esposti a saccarina rivelato significativa (p <0.05) correlazioni positive tra il nucleo NAc e shell NAc (r = 0,792), tra il NAc shell e dorsale striato (r = 0,715), e tra il prelimbic mPFC unND infralimbica mPFC (r = 0,999).

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Discussion

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L'obiettivo dello studio era quello di determinare se la fonte (VTA) e gli obiettivi di proiezione prosencefalo (NAC, Amy, mPFC) di DA neuroni ricompensa legati sono stati attivati ​​contemporaneamente dopo romanzo ingestione di grassi e zuccheri nei ratti con la tecnica del cellulare, c-fos . Il presente studio è una descrizione dettagliata dei protocolli di uno studio pubblicato in precedenza 69. E 'stato ipotizzato che il VTA, i suoi principali zone di proiezione al prelimbic e infralimbica mPFC, il nucleo e guscio della NAC e la AMY basolaterale e centrale-cortico-mediale, così come striato dorsale fungerebbe da rete cerebrale distribuito 24 -27, e potrai coordinato e simultaneo FLI seguente romanzo assunzione di glucosio (8%), fruttosio (8%) o olio di mais (3,5%) rispetto a soluzioni saccarina (0,2%), acqua e altre soluzioni di controllo. olio di mais, glucosio e fruttosio, ma non saccarina aspirazione prodotta significativa e differenziato FLI attivazione del VTA, il prelimbic e infralimbica mPFC, il nucleo e guscio della NAC, la basolaterale e centrale-cortico-mediale AMY, e lo striato dorsale. Oltre alla tecnica c-fos, sono stati impiegati misure comportamentali di zucchero, grasso e assunzione dolcificante artificiale.

Un passo fondamentale incluso puntuale campionamento di assunzione in modo tale che essi sarebbero stati relativamente uguali, assicurando in tal modo che eventuali differenze di attivazione c-fos tra i siti erano dovuti alla soluzione consumata piuttosto il sia il modello o la grandezza di assunzione. I quattro giorni di assunzione saccarina di base assicurato che gli animali alimentare ristretto campionati le soluzioni in modo rapido, e quindi ridurre al minimo gli effetti non specifici. Un secondo passo fondamentale è che la procedura ha causato stress minimo o novità per gli animali come i cambiamenti nel emotivo valenza indipendente dal tipo di assunzione potrebbe anche produrre attivazione c-fos. Pertanto, i risultati forniscono un "proof of concept" convincente per l'efficacia di questo approccio e protocolli relativi aidentificare se l'esposizione acuta a grasso (ad esempio, olio di mais), zucchero (glucosio e fruttosio) e le soluzioni dolcificante non nutritivo (saccarina) contemporaneamente attivano DA-mediate ROI in maniera suggestiva di un sistema cerebrale distribuito coordinato 24-27.

Perché attivazione ottimale c-Fos richiede risposte time-sensitive prima del sacrificio 51,52, le procedure precedentemente validate 42,44 campionamento soluzione massimizzata con una latenza breve nella prova 1-hr. Così, i ratti sono stati addestrati alimentari ristretta con soluzioni saccarina 0,2% (10 ml, 1 ora) per 4 giorni, e data la soluzione di test il quinto giorno. prese d'saccarina Baseline significativamente e progressivamente aumentate, e prese d'fruttosio e glucosio, ma non olio di mais o saccarina sul quinto giorno erano significativamente superiori quarto giorno l'assunzione di saccarina. Quindi, le soluzioni associata ad un aumento significativo aumento FLI (glucosio, fruttosio) o mancato di influenzare (olio di mais) ri assunzionealizzazione dei precedenti formazione saccarina, e sembrava essere mediata attraverso un meccanismo di incentivazione del comportamento ricompensa legati. Una particolare attenzione deve essere presa per garantire il campionamento e l'uguaglianza di comportamento. Altri ricercatori possono utilizzare in modo efficace questa procedura per studiare altri tipi di soluzioni innovative o introdurre variazioni nel paradigma per comprendere i meccanismi legati alla adattamento e di apprendimento.

Il vantaggio del presente protocollo è la possibilità di confrontare gli effetti di zuccheri ben studiato (fruttosio, glucosio) e grassi (olio di mais) e confrontare i loro c-fos attivando effetti con quello dei controlli importanti (il dolcificante non nutritivo, la saccarina, un emulsionante di controllo, gomma xantano, e acqua) e quindi esaminare questi effetti in sei siti cerebrali correlati. Sebbene questo approccio ha evidenti vantaggi nel permettere esame simultaneo di tutti i siti cerebrali delle diverse sostanze appetibili, ha lo svantaggio di produrre una serie di dati potenzialmente astronomicidi cellule che mostrano espressione neuronale. Per rendere questo più gestibile, abbiamo preso l'approccio di analizzare tre fette coronali rappresentante per luogo comune a tutti gli animali in tutte le condizioni di prova. Questo naturalmente si accompagna l'avvertimento di scegliere gli adeguati livelli di ogni ROI in queste tre sezioni. Data l'ampia portata rostro-caudale del AMY, NAC, mPFC, striato dorsale e VTA, questo avvertimento non deve essere presa alla leggera. Inoltre, è poi incombe agli investigatori di essere coerenti nella scelta accuratamente ciascuna delle tre sezioni rappresentative in tutti gli animali in tutti i siti. piccoli errori in questa scelta può portare a "falsi positivi" e "falsi negativi". Efficienza di conteggio è anche una variabile rilevante. La nostra soluzione per questo potenziale confondente è stato quello di assegnare due valutatori disinformati per ogni sezione in ogni ROI, e quindi garantire che l'affidabilità inter-rater (utilizzando la correlazione di conteggi) sempre superato 0,8. Questo approccio, mentre DUPLicative, ci ha dato di gran lunga maggiore garanzia sulla precisione, come l'affidabilità inter-rater facilmente superato questo criterio minimo. sono stati analizzati sotto-regioni del NAC (nucleo vs shell), AMY (baso-laterale vs centro-cortico-mediale) e mPFC (perilimbic vs. infralimbica). Queste regioni possono essere suddivisi ulteriormente, in particolare i singoli nuclei AMY, la patch e matrice compartimenti della striato dorsale, e il guscio NAC (vertice, arco, cono, zona intermedia). Poiché il guscio NAC non è riuscito a visualizzare costantemente i cambiamenti in Fli seguenti olio di mais, glucosio o fruttosio, ulteriori sotto-analisi di questa struttura non è stata eseguita. esame definitivo del cerotto e della matrice zone del striato dorsale richiesto tecniche di immunoistochimica inoltre che non sono stati impiegati nel presente studio, ma sarebbe un importante studio di follow-up. L'analisi dei singoli nuclei AMY all'interno di ogni sub-regione sarebbe anche un ulteriore studio futuro.

Studi precedenti hanno mostrato che sucassunzione aumentato aumentato FLI nel nucleo AMY centrale, nucleo VTA, nonche la shell, ma non, della NAC, eppure infusi saccarina orali o IG sono ampiamente inefficace 55-57, 60-62. Glucosio e fruttosio assunzione suscitato effetti specifici zucchero upon FLI sia efficace nel AMY centro-cortico-mediale e dorsale striato, ex efficace nel nucleo NAc e basolaterale AMY, e quest'ultimo efficace nel infralimbica mPFC. l'assunzione di saccarina non è riuscito a suscitare eventuali modifiche di FLI in qualsiasi sito relativo all'acqua. L'assunzione di grassi è aumentato anche FLI in siti accumbal e mPFC in studi precedenti 65-67, e ha prodotto una significativa attivazione simultanea nella VTA, infralimbica e prelimbic mPFC, striato dorsale, nucleo NAC, e la AMY basolaterale e centrale-cortico-mediale.

Anche se gli studi precedenti hanno dimostrato che l'assunzione di zuccheri e grassi FLI in sistemi DA forebrain meso-corticolimbiche e Nigro-striatali indotta, il presente studio sistematicoattivazione simultanea valutato FLI nella VTA, basolaterale e AMY centro-cortico-mediale, dorsale striato, il nucleo mPFC, NAc prelimbic e infralimbica e Shell dopo l'assunzione acuta di olio di mais, fruttosio, glucosio o la saccarina. aumenti significativi sono stati FLI altamente correlate tra loro attraverso i luoghi del prosencefalo, sostenendo l'idea di attivazione distribuita rete cerebrale di mediazione di zucchero e di grassi. Tali protocolli identificare cambiamenti simultanei in diversi loci del cervello possono essere utilizzati in condizioni croniche e binging così come sotto condizionata e le preferenze. Questi studi dimostrano che una forte correlato anatomico (c-fos) può essere efficacemente utilizzato in più siti cerebrali contemporaneamente per identificare i candidati per mediare l'assunzione appetibile e le preferenze in animali che possono fornire intuizioni in condizioni mediche umane legate a obesità, diabete e altri disturbi alimentari .

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Disclosures

Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti.

Acknowledgments

Grazie a Diana Icaza-Culaki, Cristal Sampson e Theologia Karagiorgis per il loro duro lavoro su questo progetto.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Sprague-Dawley rats Charles River Laboratories CD-1
Wire Mesh Cages Lab Products, Seaford, DE 30-Cage rack
Rat Chow PMI Nutrition International 5001
Taut Metal Spring Lab Products, Seaford, DE n/a
Rat Weighing Scale Fisher Scientific Company n/a
Nalgene Centrifuge Tubes Lab Products, Seaford, DE 10-0501
Rubber Stopper Lab Products, Seaford, DE n/a
Metal Sippers Lab Products, Seaford, DE n/a
Saccharin Sigma Chemical Co 82385-42-0
Kool-Aid, Cherry Kool-Aid Commerical
Kool-Aid, Grape Kool-Aid Commercial
Fructose Sigma Chemical Co F0127
Glucose Sigma Chemical Co G8270
Corn Oil Mazzola Commerical
Xanthan Gum Sigma Chemical Co 11138-66-2
Sliding Microtome Microm International n/a
Neurolucida Camera MBF Bioscience Software application
Gelatin-coated Slides Fisher Scientific Company 12-550-343
Cover glass Fisher Scientific Company 12-545-M
Golden Nylon Brushes Loew-Cornell  2037
Natural Hair Sable  Loew-Cornell  2022
24 Well Plates Fisher Scientific 3527
6 Well Plates Fisher Scientific 3506
1 L Pyrex bottles Fisher Scientific 1395-1L
Tissue insert (tissue strainer) Fisher Scientific 7200214
Eagle pipettes  World Precision Instruments E10 for 1-10μl
Eagle pipettes  World Precision Instruments E100 for 20-100μl
Eagle pipettes  World Precision Instruments E200 for 50-200μl
Eagle pipettes  World Precision Instruments E1000 for 100-1000μl
Eagle pipettes  World Precision Instruments E5000 for 1000-5000μl 
Universal Tips .1-10 μl World Precision Instruments 500192
Universal Tips 5-200 μl World Precision Instruments 500194
Universal Tips 500-5,000 μl World Precision Instruments 500198
Blade Vibroslice 100 World Precision Instruments BLADE
DPX Mounting Medium  Electron Microscopy  13510
15 ml centrifuge tubes Biologix Research Co. 10-0501
Slide Boxes Biologix Research Co. 41-6100
Orbital Shaker  Madell Corporation   ZD-9556
weigh boats  Fisher Scientific 02-202-100
5 ml disposable pipettes Fisher Scientific 13-711-5AM
Stereo Investigator Software Micro Bright Field Software application
Name Company Catalog number Comments
Reagents
Paraformaldehyde Granular Fisher Scientific 19210
NaCl Fisher Scientific S271-1
Sodium Phophate Monobasic Fisher Scientific S468-500
Sodium Phosphate Diphasic Fisher Scientific BP332-500
Hydrogen Peroxide  Fisher Scientific H324-500
SafeClear II  Fisher Scientific 23-044-192
Methanol  Fisher Scientific A412-1
Normal Goat Serum Vector S-1000
Biotinylated Anti-Rabbit IgG (H+L) Vector BA-1000
ABC Kit Peroxidase Standard Vector PK-4000
Anti-cFos (Ab-5) Rabbit EMD chem/Cal Biochem PC38
Triton X 100 SigmaAldrich X-100
3,3' diaminobenzidine tetra hydrochloride  SigmaAldrich D5905
Sodium Hydroxide SigmaAldrich 5881
Primary TH anti body EMD Millipore AB152
Euthosol Virbac AH

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References

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Rilevazione simultanea di c-Fos attivazione da mesolimbico e mesocorticali Siti Reward dopamina seguito Ingenuo zuccheri e grassi ingestione in Rats
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Dela Cruz, J. A. D., Coke, T., Bodnar, R. J. Simultaneous Detection of c-Fos Activation from Mesolimbic and Mesocortical Dopamine Reward Sites Following Naive Sugar and Fat Ingestion in Rats. J. Vis. Exp. (114), e53897, doi:10.3791/53897 (2016).More

Dela Cruz, J. A. D., Coke, T., Bodnar, R. J. Simultaneous Detection of c-Fos Activation from Mesolimbic and Mesocortical Dopamine Reward Sites Following Naive Sugar and Fat Ingestion in Rats. J. Vis. Exp. (114), e53897, doi:10.3791/53897 (2016).

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