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Neuroscience

Detección simultánea de c-Fos activación de sitios de recompensa dopaminérgico mesolímbico y mesocortical Siguiendo Naive La ingestión de azúcar y grasa en ratas

doi: 10.3791/53897 Published: August 24, 2016
* These authors contributed equally

Summary

El objetivo de este estudio es identificar las redes cerebrales relacionadas con la recompensa distribuidos por delinear una técnica fiable inmunohistoquímico mediante la activación celular de c-fos para medir los cambios simultáneos en las vías de la dopamina y sitios de terminal después de la novela de la ingestión de grasa y azúcar en ratas.

Abstract

Este estudio utiliza la activación celular de c-fos para evaluar los efectos de la novela de la ingestión de grasa y azúcar en las vías de la dopamina del cerebro (DA) en ratas. La ingesta de azúcares y grasas están mediadas por sus atracciones innatas, así como las preferencias aprendidas. dopamina en el cerebro, especialmente meso-límbico y proyecciones meso-cortical desde el área tegmental ventral (ATV), ha sido implicado en estas dos respuestas sin letras y aprendido. El concepto de las redes cerebrales distribuidas, en la que varios sitios y sistemas emisor / péptidos interaccionan, se ha propuesto para mediar en la ingesta de alimentos sabrosos, pero no hay evidencia limitada que demuestra empíricamente este tipo de acciones. Por lo tanto, el consumo de azúcar provoca inmunorreactividad DA de liberación y aumenta c-fos-como (FLI) de las zonas individuales de proyección VTA DA incluyendo el núcleo accumbens (NAC), la amígdala (AMY) y la corteza prefrontal medial (mPFC), así como el cuerpo estriado dorsal. Además, la administración central de antagonistas de los receptores DA selectivos en estos sitioss diferencialmente reducir la adquisición y expresión de las preferencias de sabor acondicionado provocados por azúcares o grasas. Un método por el cual, para determinar si estos sitios interactuaron como una red cerebral distribuida en respuesta a la ingesta de azúcar o grasa sería simultánea evaluar si el VTA y sus principales zonas de proyección mesotelencefálica DA (prelimbic y infralímbica córtex prefrontal medial, núcleo y la cubierta de la NAC, basolateral y centro-cortico-medial AMY), así como el cuerpo estriado dorsal mostraría coordinado y la activación FLI simultánea después de la ingesta oral, no condicionado de aceite de maíz (3,5%), glucosa (8%), fructosa (8%) y sacarina (0,2 %) soluciones. Este enfoque es un exitoso primer paso para identificar la viabilidad de utilizar la activación celular c-fos simultáneamente a través de los sitios relevantes del cerebro para estudiar el aprendizaje relacionado con la recompensa en la ingestión de alimentos palatable en roedores.

Introduction

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Dopamina en el cerebro (DA) se ha implicado en respuestas centrales a la ingesta de azúcares de sabor agradable a través propuesto hedónica de 1,2, esfuerzo-relacionadas 3 y el hábito de base 4,5 mecanismos de acción. La vía DA primaria implicados en estos efectos se origina en el área tegmental ventral (ATV), y proyectos a la accumbens (NAC) núcleo y la cubierta, la amígdala basolateral y centro-cortico-medial (AMY), núcleo y el prelimbic y medial infralímbica corteza prefrontal (córtex prefrontal medial) (ver comentarios 6,7). El VTA ha sido implicada en la ingesta de sacarosa 8,9, y la liberación de DA es observado después de la ingesta de azúcar en el NAC 10-15, AMY 16,17 y mPFC 18-20. El consumo de grasas también estimula la liberación de DA NAC 21, y otro DA-rica zona de proyección con el cuerpo estriado dorsal (caudado-putamen) también se ha asociado con la alimentación mediada por DA 22,23. Kelley 24-27 propuso que estos proyectos múltipleszonas de iones de este sistema mediada por DA formaron una red cerebral distribuido integrado e interactivo a través de amplias e íntimas interconexiones 28-34.

Además de la capacidad de los antagonistas de los receptores DA D1 y D2 para reducir la ingesta de azúcares y grasas 35-37 38-40, la señalización de DA también se ha implicado en la mediación de la capacidad de los azúcares y las grasas para producir las preferencias de sabor acondicionado (PPC) 41- 46. La microinyección de un antagonista de los receptores D1 DA en el NAC, AMY o mPFC 47-49 eliminan adquisición de PPC provocada por la glucosa intragástrico. Mientras que microinyecciones de antagonistas de los receptores DA ya sea D1 o D2 en el córtex prefrontal medial elimina la adquisición de la fructosa-PPC 50, la adquisición y expresión de la fructosa-PPC están diferencialmente bloqueados por los antagonistas de DA en el NAC y AMY 51,52.

La técnica 53,54 c-fos se ha empleado para investigar activatio neuraln inducida por la ingesta de palatable y la activación neural. El término "activación de c-fos" se utiliza en todo el manuscrito, y se define operacionalmente por el aumento de la transcripción de c-Fos durante la despolarización neuronal. La ingesta de sacarosa aumentó fos-como inmunoreactividad (FLI) en el núcleo central AMY, el VTA, así como la cáscara, pero no del núcleo, de la NAC 55-57. Mientras que la ingesta de sacarosa en ratas sham-alimentación aumentado significativamente FLI en el AMY y la NAC, pero no el VTA 58, intragástrica de sacarosa o glucosa infusiones aumentaron significativamente FLI en el NAC y núcleos centrales y basolateral de la AMY 59,60. Además repetida de sacarosa para el acceso Chow programada aumentó FLI en el córtex prefrontal medial, así como la cáscara NAC y el núcleo 61. Un paradigma de reducción de marcha concentración de sacarosa reveló que los mayores incrementos FLI se produjeron en el AMY basolateral y NAC, pero no el VTA 62. Después del acondicionamiento, la extinción de rewa naturales relacionadas con el azúcarcomportamientos rd aumentaron FLI en el AMY basolateral y la NAC 63. Por otra parte, el emparejamiento de la disponibilidad de azúcar a un tono resultó en el tono, posteriormente, aumentar los niveles de FLI en el AMY basolateral 64. Ingesta alta en grasas también aumentó FLI en el NAC y mPFC sitios 65-67.

La mayoría de los estudios anteriormente citados examinaron los efectos de azúcar y grasa en la activación de c-fos en sitios individuales que no proporcionan información sobre la identificación de las redes cerebrales relacionadas con la recompensa distribuidos 24-27. Además, muchos de los estudios tampoco delinear las contribuciones relativas de las sub-áreas de la NAC (núcleo y la cubierta), AMY (basolateral y cortico-medial central) y el córtex prefrontal medial (prelimbic y infralímbica) que potencialmente podrían ser examinado por el ventaja de excelente, la resolución de una sola célula espacial en c-Fos mapeo 68. Nuestro laboratorio 69 utilizado recientemente la activación de c-fos y alteraciones medidos simultáneamente en la vía VTA DA y su prozonas Jection (NAC, Amy y mPFC) después de la novela de la ingestión de grasas y azúcares en ratas. El presente estudio describe los pasos procedimentales y metodológicos para analizar simultáneamente si la exposición aguda a seis soluciones diferentes (el aceite de maíz, glucosa, fructosa, sacarina, agua y un control de la emulsión de grasa) se diferencialmente activar FLI en sub-áreas de la NAC, AMY, mPFC así como el cuerpo estriado dorsal. Esta detección simultánea de diferencias permite la confirmación de efectos significativos en FLI en cada sitio y determinación en cuanto a si los cambios en un sitio particular, correlacionados con los cambios en los sitios relacionados, proporcionando de ese modo soporte para una red cerebral distribuido 24-27. Estos procedimientos probados si el VTA, el prelimbic y infralímbica córtex prefrontal medial, el núcleo y la cubierta de la NAC y el AMY basolateral y centro-cortico-medial), así como el cuerpo estriado dorsal exhibiría coordinada y activación FLI simultánea después de la ingesta oral, no condicionado de glucosa (8%), fructosa (8%), aceite de maíz (3,5%) y las soluciones de sacarina (0,2%).

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Protocol

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Estos protocolos experimentales fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales institucional que certifique que todas las materias y los procedimientos están de acuerdo con los Institutos Nacionales de Salud de Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio.

1. Los sujetos

  1. Compra y / o raza ratas Sprague-Dawley (260 - 300 g,).
  2. Casa ratas individualmente en jaulas de malla de alambre. Su mantenimiento y su ciclo de 12:12 horas de luz / oscuridad con comida para ratas y agua disponible ad libitum.
  3. Asignar los tamaños de muestra apropiados (por ejemplo, n ≈ 6-8) aleatoriamente en grupos.

2. Aparatos y aceptación de las pruebas Procedimientos

  1. Utilice tubos de centrífuga calibrados con tapones de goma y un tubo de metal para sorber ángulo de 45 ° para proporcionar una medición precisa (± 0,1 ml) de las soluciones presentadas. Asegurarlas a las jaulas por un resorte metálico tenso para permitir la visibilidad de las calibraciones.
  2. Restringir las raciones de alimentos (~15 / g / día) de las ratas para reducir el peso a 85% de su peso corporal original para aumentar la motivación para consumir las soluciones. Nota: La reducción de peso debe tener entre 3 - 5 días.
  3. Proporcionar soluciones pre-formación (10 ml) de 0,2% sacarina durante cuatro días durante una sesión de 1 hora para maximizar la probabilidad de que las ratas tomarán muestras de las soluciones de ensayo posteriores con una latencia corta (menos de 1 min).
  4. Confirmar flujo a través del tubo de centrífuga derramando unas gotas.
  5. Pesar tubos antes y después de cada sesión de medición para obtener la ingesta.
  6. Realizar una prueba de admisión en el quinto día en los subgrupos que recibieron una de las seis soluciones (10 ml, 1 hr): a) agua, b) novela sabor (0,05% de aroma de cereza) 0,2% sacarina, c) 8% de fructosa, d) 8 % de glucosa, e) 3,5% de aceite de maíz en suspensión en 0,3% de goma de xantano, y f) 0,3% de goma de xantano.
  7. Asegúrese de que las soluciones nutritivas son isocalórico; Por lo tanto, la concentración de aceite de maíz 3,5% es isocalóricas a las soluciones de azúcar 8%.
  8. garantizar THen ratas soluciones de muestra con una latencia corta (menos de 1 min). Si no se cumple este requisito, entonces descartar el objeto del estudio.

3. Preparación del tejido

  1. Anestesiar a cada animal mediante una inyección intraperitoneal de pentobarbital 90 min después de la exposición inicial a cada solución de ensayo. Confirman que los animales estén correctamente anestesiados por lo que demuestra que el animal ya no es sensible a los reflejos tales como la retirada de pellizco pie, parpadeando tras la presión de la córnea directa o sacudir la cabeza a la estimulación del pabellón auricular profunda.
  2. Perfundir cada animal transcardially como se describió anteriormente 69.
    1. Anestesiar las ratas con una sobredosis de pentobarbital sódico (65 mg / kg), retire la caja torácica y exponer el pecho para el libre acceso al corazón 69.
    2. Coloque la aguja en el ápice de la válvula del corazón izquierdo, y cortar la vena cava. Administrar solución de tampón fosfato (PBS, ~ 180 ml) seguido de un co fijador tamponada con fosfatontaining 4% de paraformaldehído (~ 180 ml).
    3. Asegúrese de que el animal es en realidad ser perfundido correctamente examinando si el líquido está dejando otras cavidades, como la nariz, la boca y áreas genitales. Nota: la fijación adecuada con paraformaldehído estará acompañado por movimientos musculares grandes. Si esto no ocurre, vuelva a ajustar la aguja hasta que se produzca esta reacción.
  3. Retire el cerebro del cráneo rápidamente cortando la piel y la piel lejos del cráneo. Utilice unas pinzas para romper y retirar el hueso del cerebro se mueve de atrás hacia delante. El trabajo inicialmente en el área debajo y detrás del cerebelo, asegurando que la gubia es entre el hueso y la piamadre meníngea. Una vez que la parte superior y los lados del cráneo se eliminan, utilizar una pequeña espátula para levantar el cerebro de la base, y cortar los nervios craneales con unas tijeras pequeñas. Tenga cuidado de no dañar el cerebro al intentar retirar el hueso.
  4. Fijar los cerebros en una solución de paraformaldehído al 4% durante la noche a 4 ° C.Coloque los cerebros en una solución de sacarosa al 30% / 70% de PBS a temperatura ambiente hasta que se asientan en la parte inferior del recipiente.
  5. Bloquear el cerebro
    1. Retire la parte rostral del cerebro corte caudal transversalmente al bulbo olfatorio.
    2. Retire la parte caudal del cerebro cortar transversalmente a nivel del cerebelo y la protuberancia.
  6. Monte el cerebro coronal con la parte caudal fijo a la etapa de un micrótomo de deslizamiento, y cortaron secciones coronales (40 micras) a través del córtex prefrontal medial (2,86-2,20 mm rostral al bregma), el núcleo y la cáscara NAC y el cuerpo estriado dorsal (+ 1,76-1,60 mm rostral al bregma), el AMY (-2,12 a -2,92 mm caudal a bregma), y el VTA (-5,20 a -5,60 mm caudal a bregma). Use un atlas del cerebro de rata 70 para recibir orientación.
  7. Recoger las secciones que flotan libremente en los pocillos individuales de una placa de 24 pocillos lleno de PBS para el análisis inmunohistoquímico eventual 71. Use Parafilm para sellar la 24 nosll placa para asegurarse de que el sistema de cartilla no se evapora en el contenedor y secar el cerebro. Almacenar el tejido cerebral en 4 ° C.

4. Procedimientos c-fos (Adaptado de 71)

  1. Tratar a cada sección con 5 ml de 5% suero de cabra normal y 0,2% de Triton X-100 en PBS durante 1 hr.
  2. Incubar las secciones tratadas con anticuerpos primarios (conejo anti-c-fos, 1: 5000) a 4 ° C durante 36 horas en pocillos que contenían 1 ml de PBS.
  3. secciones de enjuague 3 veces con PBS (5 ml) durante 10 min cada uno.
  4. Incubar con anticuerpos secundarios (de cabra anti-conejo biotinilado; 1: 200) a TA durante 2 h en pocillos que contenían 1 ml de PBS.
  5. Enjuague cada sección 3x en PBS (5 ml) durante 10 min cada uno.
  6. Incubar las secciones enjuagaron durante 2 h en una mezcla avidina-peroxidasa de rábano picante disponible en el mercado que viene en un kit compuesto de avidina DH (100 l) y peroxidasa de rábano picante biotinilada H (100 l) en 5 ml de PBS.
  7. Vuelva a enjuagar las secciones 3 veces en PBS (5 ml) durante 10 min cada uno.
  8. Reaccionar las secciones con 0,05% de diaminobencidina (DAB) en presencia de 0,0015% H 2 O 2 5 - 10 min, dependiendo de la reactividad del tejido en los pocillos que contenían 5 ml de la solución de DAB.
  9. Haga doble etiqueta las secciones de VTA. Incubar con un anticuerpo tirosina hidroxilasa (TH) (conejo anti-rata TH, 1: 2000) en PBS (5 ml) durante la noche a 4 ° C.
  10. Enjuague secciones 3 veces en PBS (5 ml) durante 10 min cada uno.
  11. Incubar con anticuerpos secundarios (de cabra biotinilado anti-conejo; 1: 200) en PBS (5 ml) a temperatura ambiente durante 2 hr.
  12. Enjuague secciones 3 veces en PBS (5 ml) durante 10 min cada uno.
  13. Visualizar los anticuerpos mediante el uso de un complejo anticuerpo-peroxidasa secundaria. Reaccionar con una combinación de 0,05% DAB y una solución de sulfato de níquel 0,3%, el 5 - 10 min, dependiendo de la reacción del tejido en los pocillos que contenían 5 ml de la solución de DAB / NiCl.
  14. Asegúrese de que la solución DAB es de color verde claro de color lechoso de ellas reacción con el sulfato de níquel 0,3%. Si la solución es demasiado verde, a continuación, la reacción será demasiado oscuro.
  15. Montar todas las secciones en portaobjetos recubiertos de gelatina. dejarlos secar durante la noche y, a continuación, los cubres con unas pocas gotas de una solución de tolueno-base (TBS).
  16. Código desliza de modo que la condición experimental es desconocido para los observadores.

5. Determinación de c-fos Inmunorreactiva Counts

  1. Asignar pares de observadores imparciales para contar las neuronas Fos-positivas en estas regiones de interés (ROI): prelimbic córtex prefrontal medial, infralímbica córtex prefrontal medial, núcleo NAC, NAC cáscara, núcleos AMY basolateral, AMY centro-cortico-medial, estriado dorsal, y VTA. Delinear si c-Fos inmunoreactividad estuvo presente en TH TH + y células en el VTA. La figura 1 proporciona una imagen de pantalla capturada de la NAC del microscopio.

Figura 1
Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

  1. Analizar al menos tres rebanadas representativos por sitio común a todos los animales en todas las condiciones de prueba.
  2. Utilizar software y un microscopio óptico para analizar toda la región para cada ROI mediante el trazado de un esquema (Figura 1).
    1. Para un determinado lugar, abrir la aplicación y haga clic en el menú desplegable de adquisición y haga clic en "Imagen en directo". Llevar el retorno de la inversión en el foco y haga clic en la pantalla para establecer un punto de referencia. A continuación, tras de la región del cerebro elegido utilizando la red como una guía. Una vez que se ha completado la traza, contar las células (pasos 5.3.1.1 - 5.3.1.3).
      1. Haga doble clic en el icono del software. Ir a la barra de menús, haga clic en "Adquisición" y luego "Imagen en directo". Llevar el retorno de la inversión en el foco y haga clic en la pantalla para establecer un punto de referencia.
      2. Ir a la barra de herramientas de red y haga clic en "Mostrar cuadrícula" y "etiquetas" Uso de la rejilla. Delinear el retorno de la inversión con una traza predeterminada.
      3. Contar todas las células en cada área ROI, seleccione un "+" en la barra lateral izquierda para mantener el recuento de células c-fos. Haga clic en cada celda por separado para registrar los cargos. Considere una célula positiva para c-fos cuando un círculo rojo oscuro definido se observó (Figura 1).
    2. Repita este procedimiento para cada sitio.
    3. Registro de cuenta en un cuaderno de laboratorio y en el equipo para futuros análisis. Ir a la barra de menús, haga clic en "Archivo", "Guardar archivo de datos" para guardar la localización y recuentos.
    4. Asegúrese de que la confiabilidad entre calificadores (usando correlación de cuentas) de los dos evaluadores no informados para cada sección en cada ROI siempre supera 0,8.

    6. Estadísticas

    1. Evaluar la ingesta de sacarina de línea de base durante los primeros cuatro días usando un análisis de medidas repetidas de 1 vía de la varianza (ANOVA) comparar la ingesta de sacarina de los Días 1, 2, 3 y 4 69.
    2. Comparación de la ingesta de sacarina (día 4) con tomas de prueba (día 5) de los seis grupos que utilizan un bloque al azar ANOVA de 2 vías 69.
    3. Utilizar comparaciones de Tukey (p <0.05) para determinar los efectos significativos individuales 69.
    4. Determinar la confiabilidad entre calificadores, y luego usar el recuento de un observador común.
    5. Los recuentos de c-fos promedio para los tres rebanadas representativos para cada sitio 69.
      1. Realizar un ANOVA de 1 vía de la activación de c-fos inducida por la ingesta de las seis soluciones de (aceite de 3,5% de maíz, 8% de glucosa, 8% de fructosa, 0,2% de sacarina con sabor, xaNthan control de goma y agua) para el perilímbica mPFC 69.
      2. análisis paralelos de la repetición de los seis grupos de infralímbica córtex prefrontal medial, núcleo NAC, cáscara NAC, basolateral AMY, AMY centro-cortico-medial, VTA y el cuerpo estriado dorsal. Utilizar comparaciones de Tukey (p <0,05) para revelar efectos significativos individuales 69.
    6. Comparación de la ingesta de aceite de maíz con tanto ingestión de agua y de su agente de suspensión, goma xantana. Comparación de la ingesta de fructosa y glucosa con tanto la ingesta de agua y el consumo del edulcorante no nutritivo, sacarina.
    7. Establecer si se observaron relaciones significativas entre la ingesta de soluciones y la activación de c-fos en cada uno de los sitios usando correlaciones r Bonferroni (p <0,05).
      1. Sistemáticamente comparar los recuentos de c-fos en el perilímbica y la corteza prefrontal infralímbica para cada animal en el grupo de aceite de maíz 3,5%.
      2. Repetir análisis sistemáticamente paralelas de cada par de los seis sitios (VTA, el cuerpo estriado dorsal, infralimbic córtex prefrontal medial, perilímbica córtex prefrontal medial, núcleo NAC, cáscara NAC, basolateral AMY, centro-cortico-medial AMY) para el aceite de maíz 3,5%.
      3. Repetir análisis sistemáticamente paralelas de estos seis sitios para los otros cinco condiciones de admisión experimentales (8% de glucosa, 8% de fructosa, 0,2% de sacarina con sabor, de control de la goma de xantano y agua).
    8. Aprovechar el hecho de que los mismos animales dentro de una condición solución se evaluaron en todos los sitios mediante la determinación de las relaciones significativas entre la activación de c-fos en todas las soluciones y dentro de cada solución utilizando Bonferroni r correlaciones (p <0,05).

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Representative Results

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Todos los resultados representativos se describen a continuación se han publicado previamente 69, y se re-presentado aquí para apoyar a "prueba de concepto" en la indicación de la eficacia de la técnica.

ingesta de solución
No se observaron diferencias significativas en la ingesta de sacarina de línea de base durante los primeros cuatro días para todos los animales (F (3,108) = 57,27, p <0,001) con entradas de aire (Día 1: 1,3 (± 0,2) ml; Día 2: 3,9 (± 0,4) ml ; Día 3: 5,9 (± 0,6) ml; Día 4: 7,1 (± 0,6) ml) significativamente (p <0,05, Tukey HSD prueba) y aumentando progresivamente. La fructosa y la ingesta de glucosa, pero no el aceite de maíz o sacarina de admisión en el día 5 de forma significativa (p <0,05, prueba de Tukey HSD) aumentó en relación con el Día 4 ingesta de sacarina (p <0.05, Tukey HSD prueba) con fructosa (9,6 (± 0,4) ml ) y glucosa (9,4 (± 0,6) ml) significativamente mayor que saccharin ingesta. Además, la ingesta de aceite de maíz (7,4 (± 0,6) ml) fue significativamente (p <0,05, prueba de Tukey HSD) más alta que la ingesta de goma de xantano.

Estos resultados plantean la posibilidad de que la ingesta de solución per se podría tener en cuenta cualquier activación de c-fos observada en cualquiera de los sitios. Para examinar esto, se realizaron correlaciones r de Bonferroni en el que la ingesta de las cinco soluciones se relacionó con la activación de c-fos en cada uno de los seis sitios. correlaciones significativas no pudieron ser observadas entre la ingesta de solución y la activación de c-fos en el núcleo (r (29) = 0,186), la cáscara (r (29) = 0,029) o total (r (29) = 0,10) NAC, la prelimbic ( r (29) = 0,23), infralimbic (r (29) = 0,30) o total (r (29) = 0,14) mPFC, el VTA (r (29) = 0,10), el cuerpo estriado dorsal (r (29) = 0,14 ) o la basolateral (r (29) = 0,47), el centro-cortico-medial (r (29) = 0,48) o total (r (29) = 0,409) AMY. Dada la alta correlación entre la ingesta y la activación de c-fos AMY, además correlaciónciones se realizaron para cada solución individual. Significativa (p <0,05, prueba de Tukey HSD) no pudo ser observada entre la ingesta y Amy FLI para la fructosa relaciones (basolateral (r = 0,15), Centro-cortico-medial (r = 0,13), total (r = 0,13)), glucosa (basolateral (r = 0,17), Centro-cortico-medial (r = 0,17), r Total = 0.13)), sacarina (basolateral (r = 0,42), Centro-cortico-medial (r = 0,42), total (r = 0,42)) o aceite de maíz (basolateral (r = 0,54), Centro-cortico-medial (r = 0,59), total (r = 0,64)). Una significativa (p <0,05, prueba de Tukey HSD) correlación negativa se observó entre la ingesta total de goma xantana y AMY FLI (r = 0,94).

mPFC c-Fos activación
El aceite de maíz significativamente (p <0,05, prueba de Tukey HSD) aumento total (figura 2A), infralimbic (Figura 2B) y prelimbic (Figura 2C) mPFC c-Fos cuenta en relación con el agua (*) o el control de la goma de xantano(#). Fructosa significativamente (p <0,05, prueba de Tukey HSD) aumentaron el número de c-Fos en el córtex prefrontal medial infralímbica relación con el agua (*) o sacarina (+) (Figura 2B), pero no el recuento total o prelimbic mPFC. Por el contrario, la glucosa o la sacarina no lograron alterar el recuento total, perilímbica o infralimbic mPFC c-fos. La Figura 3 muestra secciones mPFC representativas de animales que muestran el aumento de maíz inducido por aceite de FLI en relación con el agua.

Figura 2
Figura 2. grasa o azúcar de admisión Aumenta diferencialmente activación de c-fos en la corteza prefrontal medial (córtex prefrontal medial). Los cambios en la activación de c-fos (media ± SEM) se observan en todo el córtex prefrontal medial (Grupo A), el área mPFC infralímbica (Panel B), y el área de prelimbic córtex prefrontal medial (Grupo C) después del consumo (1 hora) de agua, sacarina (0,2%), Goma de xantano (control de aceite de maíz), glucosa (8%), fructosa (8%) o el aceite de maíz (3,5%). (Anteriormente publicado 69.) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figura 3
Figura 3. Actual mPFC c-fos activación Siguiendo grasas y azúcares. Se observó la activación de c-fos en los animales expuestos a la ingesta de aceite de maíz (paneles A (aumento de 4 veces) y C (ampliación 10 veces)) que fue significativamente mayor que la de la ingesta de agua (Paneles B (aumento de 4 veces) y D (ampliación 10 veces)). Representación de las sub-áreas delimitadas del prelimbic (PL) y infralímbica (IL) mPFC se esquematiza en los paneles A (aceite de maíz) y C (agua) al igual que la parte de tpaneles de manguera (A y C) magnificados a la ampliación de 10 veces en los paneles correspondientes (B y D). Las flechas en los paneles C y D indican las células positivas de c-fos representativos. Todas las barras de escala son 100 micras. (Anteriormente publicado 69.) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

AMY c-Fos activación
El aceite de maíz significativamente (p <0,05, prueba de Tukey HSD) aumentó AMY totales (Figura 4A), basolateral (Figura 4B) y cortico-medial central (Figura 4C) subzona AMY c-Fos cuenta en relación con el agua (*) o el control de la goma de xantano (#). La glucosa también significativamente (p <0,05, prueba de Tukey HSD) total incrementada (Figura 4A), basolateral (Figura 4B) y centro-cortico-medial ( (Figura 4A) y centro-cortico-medial subzona (Figura 4C) del AMY c-Fos recuentos en relación con el agua (*) o sacarina (+), pero no en la subzona AMY basolateral. La sacarina no logró alterar total o basolateral centro-cortico-medial AMY c-Fos cuenta en relación con el agua. Los análisis detallados de los núcleos individuales dentro del AMY revelaron que también se observaron los cambios significativos observados en la zona basolateral de la AMY AMY en los núcleos basolateral y laterales individuales. Los cambios significativos observados en la zona centro-cortico-medial de la AMY también se observaron en el individuo central, cortical y medial AMY núcleos. La figura 5 muestra las secciones representativas del AMYde animales que muestran el aumento de aceite de maíz, glucosa, y fructosa inducida FLI en relación con el agua. (Anteriormente publicado 69).

Figura 4
Figura 4. grasa o azúcar de admisión Aumenta diferencialmente c-fos activación en la amígdala (AMY). Los cambios en la activación de c-fos (media ± SEM) se observan en todo el AMY (Grupo A), el área AMY basolateral (Grupo B) , y la zona central de AMY-cortico-medial (Panel C) después del consumo (1 hr) de agua, la sacarina, la goma de xantano, glucosa, fructosa o aceite de maíz. Los cambios significativos observados en la zona basolateral de la AMY también se observaron en los núcleos AMY basolateral y laterales individuales. Los cambios significativos observados en la zona centro-cortico-medial de la AMY también se observaron en los distintos núcleos centrales del AMY, cortical y medial. (Anteriormente publicado 69.) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5
Figura 5. AMY real de activación de c-fos Después de grasas y azúcares. Se observó la activación de c-fos en los animales expuestos a la ingesta de aceite de maíz (paneles A (de 4 aumentos), D (magnificación de 10 veces) y G (60- doblar aumentos)), glucosa (Paneles B (aumento de 4 veces) y e (ampliación 10 veces)), y la fructosa (paneles C (aumento de 4 veces) y F (10 veces)) que eran significativamente mayor que la de la ingesta de agua (H paneles (4 aumentos) y I (magnificación de 10 veces)). Representacion delas sub-áreas delimitadas del-cortico-medial central (CMC) y el AMY basolateral (BLA) se diagramar en los paneles A (aceite de maíz), B (glucosa), C (fructosa) y H (agua) al igual que la parte de esos paneles (a, B, C y H) magnificados ampliación a 10 veces en los paneles correspondientes (D, e, F e I). El sub-área delineada en el panel D (aceite de maíz, magnificación de 10 veces) se magnifica con magnificación de 60 veces en el Grupo D. Las flechas en los paneles D, E, F, G e I indican células positivas c-fos representativos. Todas las barras de escala son 100 micras, con excepción de Grupo G (50 micras). (Anteriormente publicado 69.) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

NAC c-Fos activación
El aceite de maíz significativamente (p <0,05, prueba de Tukey HSD) aumentó totales (Figura 6A) y el núcleo ( (Figura 6C). Glucosa significativamente (p <0,05, prueba de Tukey HSD) aumentaron el número de c-Fos en el núcleo NAC (Figura 6B), pero no en el NAC, total o la cáscara NAC en relación con la sacarina (+) o agua (*). En contraste, la fructosa y la sacarina no pudieron diferir de agua en la obtención de la activación de c-Fos en el núcleo y / o la cáscara NAc. La figura 7 muestra secciones representativas en el núcleo NAc de animales que muestran el aumento de aceite de maíz o glucosa inducida FLI relación al agua .

Figura 6
Figura 6. grasa o azúcar de admisión Aumenta diferencialmente c-fos de activación en el NAC. Los cambios en la activación de c-fos (media ± SEM) en todo el NAC (Panel A), el núcleo NAC (Panel B), y la cáscara NAC (Panel C) después del consumo (1 hr) de agua, la sacarina, la goma de xantano, glucosa, fructosa o aceite de maíz. (Anteriormente publicado 69.) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7
Figura 7. real NAC Core, pero no NAC Shell activación de c-fos Siguiendo grasas y azúcares. Se observó la activación de c-fos en los animales expuestos a la ingesta de aceite de maíz (paneles A (de 4 aumentos), D (magnificación de 10 veces ) y G (ampliación 60 veces)) y glucosa (Paneles B (aumento de 4 veces) y e (ampliación 10 veces)) que eran significativamente mayor que la de la ingesta de agua (Paneles C (aumento de 4 veces) y F (magnifica 10 vecesla)). Representación de las sub-áreas delimitadas del núcleo NAC y la cáscara NAC se esquematiza en los paneles A (aceite de maíz), B (glucosa) y C (agua) al igual que la parte de esos paneles (A, B, C y H) magnificada ampliación a 10 veces en los paneles correspondientes (D, e y F). El sub-área delineada en el panel D (aceite de maíz, magnificación de 10 veces) se magnifica con magnificación de 60 veces en el Panel G. Las flechas en los paneles D, E, F y G indican células positivas c-fos representativos. Todas las barras de escala son 100 micras. (Anteriormente publicado 69.) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Dorsal estriado c-Fos activación
El aceite de maíz significativamente (p <0,05, prueba de Tukey HSD) aumentaron el número de c-Fos en el cuerpo estriado dorsal en relación con el agua (*) o la goma xantana (#) (Figure 8A). Glucosa o fructosa significativamente (p <0,05, prueba de Tukey HSD) aumentaron dorsal estriatal FLI en relación con la sacarina (+) (Figura 8A). Por el contrario, la sacarina no pudo diferir de agua en la obtención de dorsal estriatal activación de c-Fos. La figura 9 muestra dorsales representante secciones del cuerpo estriado de animales que muestran el aumento de aceite de maíz, glucosa o fructosa inducida FLI en relación con agua.

Figura 8
Figura 8. grasa o azúcar de admisión Aumenta diferencialmente activación de c-fos en el cuerpo estriado y dorsal tegmental ventral de la zona. Atriatal dorsal (panel A) y el área tegmental ventral (Grupo B) se observaron alteraciones de la activación de c-fos (media ± SEM) siguiente consumo (1 hr) de agua, la sacarina, la goma de xantano, glucosa, fructosa o aceite de maíz. (Anteriormente publicado 69).

Figura 9
Se observó la Figura 9. Actual Dorsal estriatal c-fos activación Siguiendo grasas y azúcares. C-fos de activación en los animales expuestos a la ingesta de aceite de maíz (paneles A (aumento de 4 veces), D (ampliación 10 veces) y G (60 magnificación -fold)), glucosa (Paneles B (aumento de 4 veces) y e (ampliación 10 veces)), fructosa (Paneles C (aumento de 4 veces) y F (ampliación 10 veces)) que eran significativamente mayor que la de la ingesta de agua (Paneles H (aumento de 4 veces) y I (ampliación 10 veces)). Delineado sub-areas del cuerpo estriado dorsal en los paneles A (aceite de maíz), B (glucosa), C (fructosa) y H (agua) se indican que magnifica la ampliación a 10 veces mayor en los paneles correspondientes (D, E, F e I). El sub-área delineada en el panel D (aceite de maíz, magnificación de 10 veces) se magnifica con magnificación de 60 veces en el Panel G. Las flechas en los paneles D, E, F y G indican células positivas c-fos representativos. Todas las barras de escala son 100 micras, con excepción de Grupo G (50 micras). (Anteriormente publicado 69.) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

VTA c-Fos activación
El aceite de maíz significativamente (p <0,05, prueba de Tukey HSD) aumentaron el número de c-fos en células TH + VTA en relación con el control de la goma xantana (#) (Figura 8B). En contraste, la glucosa, la fructosa o sacarina fallaron para alterar los recuentos de c-fos en el VTA relativa de agua. La figura 10 muestra representativa TH + y TH y las células activadas VTA-c-Fos de animales que muestran el aumento de maíz inducido por aceite de FLI en relación con el agua.

Figura 10
Figura 10. Actual tegmental ventral área de activación de c-fos Después de grasas y azúcares. VTA se observó la activación de c-fos en animales expuestos a aceite de maíz (Paneles A (4 veces) y C (10 veces)) y agua (Paneles B (4 veces) y D (10 veces)). Las flechas negras indican células representativas doble etiquetado TH / c-fos positivas, mientras que las flechas grises indican c-fos representativos sólo las células. Todas las barras de escala son 100 micras. (Anteriormente publicado 69.) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

ove_content "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Relaciones de c-Fos activación entre los sitios y soluciones
El patrón de los recuentos de c-Fos en animales expuestos a aceite de maíz reveló significativas (p <0,05) correlaciones positivas entre el núcleo NAC y, o bien la cáscara NAC (r = 0,971) o todo el córtex prefrontal medial (r = 0,670), entre el prelimbic córtex prefrontal medial y ya sea el infralimbic mPFC (r = 0,940) o el cuerpo estriado dorsal (r = 0,849), entre el infralimbic mPFC y dorsal cuerpo estriado (r = 0,749), entre el AMY basolateral y centro-cortico-medial (r = 0,999), y entre la estriado dorsal y el VTA (r = 0,723). En contraste, el patrón de los recuentos de c-fos en animales expuestos a aceite de maíz reveló significativas (p <0,05) correlaciones negativas entre el AMY basolateral y, o bien el núcleo NAC (r = -0,712) o de shell (r = -0,708), y AMY entre el centro-cortico-medial y, o bien el núcleo NAC (r = -0,712) o de shell (r = -0,710) .El patrón de c-Fos cuenta en animales eXposed a la glucosa (p <0,05) correlaciones positivas significativas observadas entre el prelimbic y infralímbica córtex prefrontal medial (r = 0,930), entre el estriado dorsal y, o bien el VTA (r = 0,821), basolateral (r = 0,910) o cortico-medial centro (r = 0,911) AMY, y entre la basolateral y centro-cortico-medial (r = 0,999) AMY. El patrón de los recuentos de c-Fos en los animales expuestos a la fructosa reveló significativas (p <0,05) correlaciones positivas entre el núcleo NAC y, o bien la cáscara NAC (r = 0,969) o prelimbic córtex prefrontal medial (r = 0,740), entre la cáscara y el NAC del prelimbic córtex prefrontal medial (r = 0,733), y entre el prelimbic infralímbica córtex prefrontal medial (r = 0,959), y entre el AMY basolateral y centro-cortico-medial (r = 0,996) .El patrón de recuento c-fos en los animales expuestos a la sacarina reveló significativa (p <0,05) correlaciones positivas entre el núcleo y la cáscara NAC NAC (r = 0,792), entre el depósito y el cuerpo estriado dorsal NAC (r = 0,715), y entre el córtex prefrontal medial prelimbic unand infralímbica córtex prefrontal medial (r = 0,999).

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Discussion

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El objetivo del estudio fue determinar si la fuente (VTA) y los objetivos de proyección del cerebro anterior (NAC, Amy, córtex prefrontal medial) de DA neuronas relacionadas con la recompensa se activan simultáneamente después de la novela de la ingestión de grasa y azúcar en ratas mediante la técnica celular de c-fos . El presente estudio es una descripción detallada de los protocolos de un estudio publicado previamente 69. Se planteó la hipótesis de que el VTA, sus principales zonas de proyección a la prelimbic y infralimbic mPFC, el núcleo y la cáscara de la NAC y el AMY basolateral y centro-cortico-medial, así como el cuerpo estriado dorsal actuaría como una red cerebral distribuido 24 -27, y mostrar coordinada y simultánea FLI siguiente novela ingesta de glucosa (8%), fructosa (8%) o el aceite de maíz (3,5%) en relación con las soluciones de sacarina (0,2%), agua y otras soluciones de control. El aceite de maíz, glucosa y fructosa, pero no sacarina ingesta producido una activación significativa y diferencial FLI del VTA, la prelimbic y infralimbic mPFC, el núcleo y la cubierta de la NAC, la basolateral y cortico-medial central de AMY, y el cuerpo estriado dorsal. Además de la técnica de c-fos, se emplearon medidas de comportamiento de azúcar, grasa y la ingesta de edulcorante artificial.

Un paso crítico incluido el muestreo puntual de la ingesta tales que serían comparativamente igual, garantizando así que las diferencias en la activación de c-fos en todos los sitios se debieron a la solución que se consumen en lugar del ya sea el patrón o la magnitud de la ingesta. Los cuatro días de ingesta de sacarina línea de base se aseguraron de que los animales con restricción alimenticia muestrean las soluciones de forma rápida, y por lo tanto reducen al mínimo los efectos no específicos. Un segundo paso crítico fue que el procedimiento causó el estrés o la novedad mínimo para los animales como los cambios en la valencia emocional independiente del tipo de ingesta también podrían producir la activación de c-fos. Por lo tanto, los resultados proporcionan una "prueba de concepto" convincente de la eficacia de este enfoque y protocolos relacionados conidentificar si la exposición aguda a la grasa (por ejemplo, aceite de maíz), azúcar (glucosa y fructosa) y soluciones de edulcorante no nutritivo (sacarina) se activan simultáneamente mediadas por DA de retorno de la inversión de manera sugestiva de un sistema cerebral distribuidas coordinadas 24-27.

Debido a la óptima activación de c-Fos requiere respuestas sensibles al tiempo antes del sacrificio 51,52, 42,44 procedimientos previamente validados de muestreo solución maximizado con poca latencia en la prueba de 1 hora. Por lo tanto, las ratas fueron entrenados restringida de alimentos con soluciones sacarina 0,2% (10 ml, 1 hr) durante 4 días, y se les da la solución de ensayo en el quinto día. tomas de sacarina de línea de base de manera significativa y progresiva aumentaron, y las tomas de fructosa y glucosa, pero no aceite de maíz o sacarina en el quinto día fueron significativamente mayores que la ingesta de sacarina cuarto día. Por lo tanto, las soluciones asociados con el aumento FLI aumentado significativamente (glucosa, fructosa) o dejado de afectar (aceite de maíz) re ingestalative a la formación sacarina anterior, y parecía estar mediado a través de un mecanismo de incentivos del comportamiento relacionado con la recompensa. La consideración cuidadosa debe ser tomado para garantizar la igualdad de muestreo y de comportamiento. Otros investigadores pueden utilizar con eficacia este procedimiento para estudiar otro tipo de soluciones novedosas o de introducir variaciones en el paradigma para entender los mecanismos relacionados con la adaptación y el aprendizaje.

La ventaja de la presente protocolo es la posibilidad de comparar los efectos de los azúcares bien estudiados (fructosa, glucosa) y grasas (aceite de maíz) y comparar sus c-fos efectos de activar con que de los controles importantes (el edulcorante no nutritivo, sacarina, un emulsionante de control, goma xantana, y el agua), y luego examinar estos efectos a través de seis zonas cerebrales relacionadas. Aunque este enfoque tiene beneficios obvios en permitiendo examen simultáneo en todos los sitios del cerebro de las diferentes sustancias de sabor agradable, que tiene el inconveniente de producir un conjunto de datos potencialmente astronómicode células que muestran expresión neuronal. Para que esto sea más manejable, tomamos el enfoque del análisis de tres cortes coronales representativas de cada sitio común a todos los animales en todas las condiciones de prueba. Por supuesto, esto se acompaña de la advertencia de la elección de los niveles apropiados de cada ROI en estas tres secciones. Dado el amplio alcance rostro-caudal del AMY, NAC, córtex prefrontal medial, el cuerpo estriado dorsal y VTA, esta advertencia no debe tomarse a la ligera. Además, es entonces que incumben a los investigadores para ser coherente con precisión en la selección de cada una de las tres secciones representativas en todos los animales en todos los sitios. errores de menor importancia en esta elección puede llevar a "falsos positivos" y "falsos negativos". La eficiencia de recuento también es una variable relevante. Nuestra solución para este potencial factor de confusión fue asignar dos evaluadores no informados para cada sección en cada retorno de la inversión, y luego asegurarse de que la confiabilidad entre calificadores (usando la correlación de los recuentos) siempre superado 0,8. Este enfoque, aunque DUPLicative, nos dio mucho más garantías respecto de la precisión como la fiabilidad entre evaluadores fácilmente supera este criterio mínimo. Se analizaron las subregiones de la NAC (núcleo vs. shell), AMY (baso-lateral contra el centro-cortico-medial) y el córtex prefrontal medial (perilímbica vs. infralímbica). Estas regiones podrían dividirse aún más, particularmente los núcleos individuales amy, los compartimentos de parche y de la matriz del cuerpo estriado dorsal, y la cáscara NAC (vértice, arco, cono, zona intermedia). Debido a que la cáscara NAC no pudo mostrar constantemente cambios en la FLI siguientes aceite de maíz, glucosa o fructosa, no se llevó a cabo otras sub-análisis de esta estructura. examen definitivo de las zonas de parche y de la matriz del cuerpo estriado dorsal requiere técnicas inmunohistoquímicas más que no fueron empleados en el presente estudio, pero sería un importante estudio de seguimiento. Los análisis de los núcleos AMY individuales dentro de cada subregión también serían un estudio adicional futuro.

Estudios anteriores mostraron que sucingesta de rosa aumentó FLI en el núcleo central AMY, el VTA, así como la cáscara, pero no del núcleo, de la NAC, sin embargo, las infusiones de sacarina orales o IG son en gran medida ineficaces 55-57, 60-62. la ingesta de glucosa y la fructosa provocó efectos de azúcar específica sobre FLI con tanto eficaz en el AMY centro-cortico-medial y el cuerpo estriado dorsal, la antigua eficaz en el núcleo NAc y la basolateral AMY, y el segundo eficaz en el infralimbic mPFC. ingesta de sacarina no obtuvo ningún cambio en FLI en cualquier sitio en relación con el agua. El consumo de grasas también aumentó FLI en sitios accumbal y mPFC en estudios previos 65-67, y produjo una activación significativa simultánea en el VTA, infralímbica y prelimbic córtex prefrontal medial, estriado dorsal, el núcleo de la NAC y el AMY basolateral y centro-cortico-medial.

Aunque estudios previos han demostrado que la ingesta de azúcar y grasa en los sistemas de FLI DA cerebro anterior meso-corticolímbica y nigroestriatal inducido, el presente estudio sistemáticoevaluó la activación simultánea de FLI en el VTA, y basolateral AMY centro-cortico-medial, estriado dorsal, el núcleo córtex prefrontal medial, NAc prelimbic y infralímbica y la cáscara después de la ingesta aguda de aceite de maíz, fructosa, glucosa o sacarina. Un aumento significativo de FLI estaban altamente relacionados entre sí a través de sitios del cerebro anterior, el apoyo a la idea de la activación cerebral red distribuida mediación consumo de azúcar y grasa. Tales protocolos que identifican cambios simultáneos en múltiples loci cerebro pueden ser utilizados en condiciones crónicas y atracones, así como bajo acondicionado y preferencias. Estos estudios muestran que una fuerte correlación anatómica (c-fos) se puede utilizar con eficacia en varios sitios del cerebro simultáneamente para identificar candidatos para mediar la ingesta apetecible y preferencias en los animales que pueden proporcionar información sobre condiciones médicas humanos relacionados con la obesidad, diabetes y otros trastornos de la alimentación .

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Disclosures

Los autores no tienen intereses financieros en competencia.

Acknowledgments

Gracias a Diana Icaza-Culaki, Cristal Sampson y Theologia Karagiorgis por su arduo trabajo en este proyecto.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Sprague-Dawley rats Charles River Laboratories CD-1
Wire Mesh Cages Lab Products, Seaford, DE 30-Cage rack
Rat Chow PMI Nutrition International 5001
Taut Metal Spring Lab Products, Seaford, DE n/a
Rat Weighing Scale Fisher Scientific Company n/a
Nalgene Centrifuge Tubes Lab Products, Seaford, DE 10-0501
Rubber Stopper Lab Products, Seaford, DE n/a
Metal Sippers Lab Products, Seaford, DE n/a
Saccharin Sigma Chemical Co 82385-42-0
Kool-Aid, Cherry Kool-Aid Commerical
Kool-Aid, Grape Kool-Aid Commercial
Fructose Sigma Chemical Co F0127
Glucose Sigma Chemical Co G8270
Corn Oil Mazzola Commerical
Xanthan Gum Sigma Chemical Co 11138-66-2
Sliding Microtome Microm International n/a
Neurolucida Camera MBF Bioscience Software application
Gelatin-coated Slides Fisher Scientific Company 12-550-343
Cover glass Fisher Scientific Company 12-545-M
Golden Nylon Brushes Loew-Cornell  2037
Natural Hair Sable  Loew-Cornell  2022
24 Well Plates Fisher Scientific 3527
6 Well Plates Fisher Scientific 3506
1 L Pyrex bottles Fisher Scientific 1395-1L
Tissue insert (tissue strainer) Fisher Scientific 7200214
Eagle pipettes  World Precision Instruments E10 for 1-10μl
Eagle pipettes  World Precision Instruments E100 for 20-100μl
Eagle pipettes  World Precision Instruments E200 for 50-200μl
Eagle pipettes  World Precision Instruments E1000 for 100-1000μl
Eagle pipettes  World Precision Instruments E5000 for 1000-5000μl 
Universal Tips .1-10 μl World Precision Instruments 500192
Universal Tips 5-200 μl World Precision Instruments 500194
Universal Tips 500-5,000 μl World Precision Instruments 500198
Blade Vibroslice 100 World Precision Instruments BLADE
DPX Mounting Medium  Electron Microscopy  13510
15 ml centrifuge tubes Biologix Research Co. 10-0501
Slide Boxes Biologix Research Co. 41-6100
Orbital Shaker  Madell Corporation   ZD-9556
weigh boats  Fisher Scientific 02-202-100
5 ml disposable pipettes Fisher Scientific 13-711-5AM
Stereo Investigator Software Micro Bright Field Software application
Name Company Catalog number Comments
Reagents
Paraformaldehyde Granular Fisher Scientific 19210
NaCl Fisher Scientific S271-1
Sodium Phophate Monobasic Fisher Scientific S468-500
Sodium Phosphate Diphasic Fisher Scientific BP332-500
Hydrogen Peroxide  Fisher Scientific H324-500
SafeClear II  Fisher Scientific 23-044-192
Methanol  Fisher Scientific A412-1
Normal Goat Serum Vector S-1000
Biotinylated Anti-Rabbit IgG (H+L) Vector BA-1000
ABC Kit Peroxidase Standard Vector PK-4000
Anti-cFos (Ab-5) Rabbit EMD chem/Cal Biochem PC38
Triton X 100 SigmaAldrich X-100
3,3' diaminobenzidine tetra hydrochloride  SigmaAldrich D5905
Sodium Hydroxide SigmaAldrich 5881
Primary TH anti body EMD Millipore AB152
Euthosol Virbac AH

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References

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Detección simultánea de c-Fos activación de sitios de recompensa dopaminérgico mesolímbico y mesocortical Siguiendo Naive La ingestión de azúcar y grasa en ratas
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Dela Cruz, J. A. D., Coke, T., Bodnar, R. J. Simultaneous Detection of c-Fos Activation from Mesolimbic and Mesocortical Dopamine Reward Sites Following Naive Sugar and Fat Ingestion in Rats. J. Vis. Exp. (114), e53897, doi:10.3791/53897 (2016).More

Dela Cruz, J. A. D., Coke, T., Bodnar, R. J. Simultaneous Detection of c-Fos Activation from Mesolimbic and Mesocortical Dopamine Reward Sites Following Naive Sugar and Fat Ingestion in Rats. J. Vis. Exp. (114), e53897, doi:10.3791/53897 (2016).

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