Измерение флуктуаций кальция в пределах саркоплазматического ретикулума культивируемых клеток гладкой мышцы с использованием FRET на основе конфокальной микроскопии

Introduction

Ca ²⁺ является очень важным ионов в изобилии содержится в каждой клетке организма. Она имеет значительную роль во многих различных клеточных функций, в том числе роста, пролиферации, миграции и апоптоза ^1-4. Хорошо известно , что Ca ²⁺ может влиять на эти процессы с помощью прямых и косвенных действий, и , следовательно, изменения в нормальных внутриклеточной концентрации этого иона может легко привести к негативным последствиям для пораженных клеток. SR рассматривается в качестве крупнейшего внутриклеточного Ca ²⁺ магазина в клетке ^5. Устойчивые уровни Са ²⁺ в обоих SR и цитоплазмы , как правило , обеспечивается за счет постоянного потока в и из Са ²⁺ -transporting каналах этой органеллы. Стрессовые условия , наложенные на клетках из - за какой - либо форме травмы или болезни, как правило , связаны со значительными изменениями в SR Ca ²⁺ , которые идут дальше иметь долгосрочные последствия по маршруту онALTH клетки. В наиболее тяжелых случаев, неспособность напряженном клетки для восстановления и поддержания устойчивого состояния SR Ca ²⁺ уровни могут даже высшей точки в смерти путем апоптоза ^6-8.

Современные исследования в клеточной динамики Ca ²⁺ ограничена тем фактом , что несколько исследований тест органельных Ca ²⁺ содержание магазина непосредственно ^9-11. Наиболее распространенной практикой , а не включает в себя измерение цитоплазматических уровней Ca ²⁺ в качестве косвенных измерений изменений в SR содержание ^12-14 Ca ^2+. В этих экспериментах, Ca ²⁺ обычно индуцируется быть освобожден от SR посредством использования фармакологических агентов , вызывающих истощение органеллы (например , тапсигаргин). Выводы затем вытягивают с учетом изменений в SR Ca ²⁺ на основе колебаний в цитоплазматической концентрации Ca ^2+. Несмотря на способность оставшихся для исследователей сделать такие выводы окольным маnner, этот метод SR Ca ²⁺ измерения, несомненно , является косвенным способом почерпнуть такую ​​информацию, со многими ограничениями , касающихся интерпретации собранных данных. Для того чтобы обойти это ограничение четкого, необходимо измерить количество Ca ²⁺ находится непосредственно внутри SR полостной сети.

Жизненно важное значение для окончательного результата имея возможности напрямую записывать внутрипросветное SR уровни Ca ²⁺ являются инструментами для культивирования клеток и индикатор Ca ²⁺ используется. Для данных, упоминаемых в текущей рукописи, важно отметить, что VSMCs используемые происходил из замороженной клеточной линии. Клетки культивировали в среде Игла в модификации Игла (DMEM) + 10% сыворотки новорожденного теленка (NCS) над проходами 22-26 для экспериментов , описанных, инкубирование при постоянной температуре 37 ° С с 5% CO ₂ питания. Используя метод текущего, например, клетки, которые были очень успешно выращивают на белковой смеси, имитирующим внеклеточнойсреда из многих различных типов тканей ^15. Важное значение для успеха вдоль вены SR Ca ²⁺ исследование является тип белковой смеси , используемой; В этом случае, разнообразие низкий фактор роста было необходимо , чтобы избежать компонентов этого инструмента от воздействия на регулярную передачу сигналов Ca ²⁺ и движения постоянно происходят в исследуемом клетках. После успешного роста тестируемых клеток, индикатор Са ²⁺ должен также быть эффективно введены в этих культивированных клеток. Это стало возможным с помощью аденовирусного вектора , который несет SR-проживания Ca ²⁺ индикатор D1SR. Для достижения высокой эффективности трансфекции, клетки должны быть инкубировали с вирусными векторами, по крайней мере 36-48 часов до начала обработки изображений. Этот препарат обеспечивает надежный инструмент для измерения Са ²⁺ в пределах SR просвета с высокой точностью и воспроизводимостью.

D1SR индикатор , используемый в данном протоколе представляет собой модифицированный вариант D1ER Ca ²⁺ яndicator , которая первоначально была создана лаборатория доктора Тсиен в Университете Калифорнии, Сан - Диего, США ^9,16. Оригинальный D1ER принадлежит ко второму поколению генетически кодируемых показателей Ca ²⁺ называемых cameleons , которые показывают чувствительность Ca ²⁺ на гораздо более широкий диапазон (0.5-160 мкм) по сравнению с предыдущими показателями Ca ^{2+ 9,16.} Новый вариант D1SR, своего рода подарок от доктора Уэйна Чен (Университет Альберты, Канада), однако, несет мутантный последовательность calsequestrin (вместо последовательности калретикулин как в оригинале D1ER). Мутант calsequestrin имеет уменьшенное связывание с Са ²⁺ , что устраняет проблему конкуренции с эндогенными calsequestrin связывания с Са ²⁺ в пределах SR просветом ^11. Индикатор D1SR несет усеченный расширение голубого цвета флуоресцентный белок (CFP) и желтый флуоресцентный белок (YFP), которые связываются с линкерной белком, содержащим модифицированный кальмодулин (CAM) и М13 (тон 26-остаток пептид миозина легкой цепи киназы, который связывается с КУЛАК) последовательностей. Последовательность распредвала M13 была изменена, чтобы предотвратить M13 от связывания с эндогенным кальмодулин. Кроме того , чтобы обеспечить Ретенционный, последовательность calsequestrin была добавлена ​​на конец 5'из CFP ^11. Когда привязан к Са ^2+, домен распредвала М13 проходит через конформационных изменений , которые приводят к увеличению переноса энергии между фланкирующих CFP и YFP, которое регистрируется как увеличение интенсивности сигнала разъедать. С другой стороны, когда концентрация SR полостной Ca ²⁺ падает, домен распредвала М13 проходит через обратные конформационных изменений, что приводит к уменьшению передачи энергии между фланкирующих CFP и YFP, а также значительное падение интенсивности сигнала FRET ,

Protocol

Заявление по этике: Все эксперименты и процедуры были проведены в соответствии с руководящими принципами по биологической безопасности лабораторий Университета Британской Колумбии, Ванкувер, Канада.

1. Подготовка 35 мм со стеклянным дном блюда культуры для FRET основе конфокальной микроскопией

1. Подготовьте пластины с использованием ч перед экспериментами следующую процедуру 36-48.
2. Получить выбранный желеобразную смесь белка и 0,25% трипсин-EDTA от -20 ° C хранения и держать их в бане со льдом мобильного до использования.
   Примечание: Смесь белка покрытия следует подвергать воздействию только до комнатной температуры в течение короткого периода времени, чтобы предотвратить затвердевание смеси перед использованием. Трипсин решение также следует держать охлажденным до тех пор, пока это необходимо; В качестве альтернативы, трипсин может быть извлечена из хранилища -20 ° C после завершения стадии 1.5.
3. Приготовьте 1:25 разбавление смеси белков: DMEM (без добавления сыворотки, охлажденные). Перенести соответствующий объем белковой смеси / DMEM каждой пластины подготавливается, Для 35 мм со стеклянным дном тарелки, добавить примерно 200 мкл, чтобы полностью покрыть внутренний стеклянный круг на нижней пластине.
4. Оставьте плиты, чтобы сидеть в течение по крайней мере 30 минут внутри шкафа безопасности и при комнатной температуре. Теплый DMEM с добавлением 10% NCS до 37 ° С в водяной бане в течение этого периода времени.
5. Теплый трипсина в водяной бане до 37 ° С, непосредственно перед следующим шагам.
6. Удалить DMEM, что в настоящее время в культуральной колбе с помощью стеклянной пипетки и всасывания. Вымойте пол колбы с теплой стерильной PBS для удаления оставшейся DMEM остатка.
7. Выбить ранее культивируемые клетки гладкой мускулатуры из колбы дна:
   Примечание: колба была создана дней на этот шаг, чтобы позволить клеткам достичь желаемого слитности (примерно 80%) перед приготовлением пластины. Клетки первоначально суспендировали в колбе в 20 мл DMEM с добавлением 10% NCS и инкубировали при 37 ° С с 5% CO ₂ подачи в течение 24 ч, после чего подача DMEM , обновляли и клетки были возвращены в инкубатор. DMEM обновляли наканунегу 48 ч после этих первоначальных шагов, пока клетки не достигали сплошности.
   1. Промыть быстро колбу с 1 мл трипсина, а затем удалить 1 мл трипсина с помощью всасывания.
   2. Добавить в еще 1 мл трипсина и оставить на более длительный период (примерно 30-60 сек), рассекая колбу, чтобы обеспечить фермент вступает в контакт со всей нижней части колбы.
   3. Обратите внимание, сколько клетки отдельностоящий под микроскопом, пока не удовлетворены отделения от колбы. Альтернативное решение свистящий трипсина и проверка открепления клеток до удовлетворены доли клеток, выделенных из колбы.
      Примечание: Колба может быть возвращен в инкубаторе в течение примерно 30-60 сек, чтобы ускорить этот процесс при 37 ° С.
   4. После того, как клетки выдавливаются с помощью трипсина, добавить свежую среду DMEM с добавлением 10% NCS в колбу , чтобы остановить реакцию трипсина (достаточный объем так , что трипсин составляет ^1/8 от общего объема в колбе).
      Примечание: Например, при использовании культуральный флакон объемом 250 мл, это будетбыть 7 мл DMEM, добавляли к 1 мл трипсина, чтобы привести в 8 мл раствора клеток.
8. Передача в результате чего раствор клеток из колбы в чистую (маркированные) 50 мл коническую трубку.
9. Добавьте 1 мл свежей DMEM плюс 10% NCS к каждой пластине подготавливается (достаточная среда для последних 24 ч).
10. Аккуратно инвертировать трубку, содержащую раствор клеток несколько раз, чтобы разрушить любые гранулы, которые могли образоваться.
11. Пипетка требуемого объема мягко смешанного раствора клеток в каждую тарелку.
    Примечание: Рекомендуемое количество SMCs высевают для этого протокола 0,5-0,8 х 10 ⁶ на 35 мм чашки для культивирования. Эти цифры могут варьироваться в зависимости от типа клеток и должны быть проверены и изменены каждой лабораторией.
12. Вихревой каждую пластину тщательно по часовой стрелке / против часовой стрелки, чтобы обеспечить равномерное распределение клеток через стеклянным дном.

2. Переходный Трансфекция с аденовирусные вектора , несущего D1SR Ca ²⁺ индикатор

1. После добавления меняDIUM и раствор клеток к каждой пластине, оставьте пластины для инкубирования при 37 ° С с 5% СО ₂ для подачи по меньшей мере , 1 часа , чтобы позволить клеткам надлежащим образом прикрепить к стеклу на дно посуды. Проверьте пластины под микроскопом с интервалом 15 мин, пока клетки не будут четко прикреплены.
2. Получение аденовирус-D1SR Порцию хранения -80 ° C и держать в бане со льдом мобильного транспорта в кабинете биологической безопасности.
3. Пипетка Требуемую дозу (множественность инфекции 100) охлажденного D1SR к каждой пластине.
   Примечание: Расчет по объему аденовирусной раствора, необходимого на пластины зависит от титра вируса в исходном маточном растворе, который представлен как бляшкообразующих единицы (БОЕ). Исходя из нашего опыта, мы рекомендуем множественности инфекции (MOI) 100, которая интерпретируется как число или вирусных частиц, необходимых для заражения одной клеток гладких мышц (SMC) в культуральной пластине.
4. Инкубируйте инфицированных клеток при температуре 37 ° С с 5% СО ₂ подачи O / N.
5. На следующий день, пополнить клетки с 1 мл свежей DMEM плюс 10% NCS.
6. Инкубируйте пластины в увлажненном инкубаторе при температуре 37 ° С в 5% СО ₂ O / N.

3. Измерение SR просветными Ca ²⁺ Использование FRET на основе конфокальной микроскопии

1. После O / N инкубации удалить культуральной среды из пластины.
2. Промыть культуральный планшет с 1 мл теплого буфера физиологических HEPES-PSS , содержащий (в mmol·L ^{- 1)} NaCl 140, глюкоза 10, KCl 5, HEPES 5, CaCl ₂ 1,5 и MgCl ₂ 1 (рН 7,4) три раза.
3. Добавить 1 мл свежей теплой HEPES-ПСС буферу непосредственно перед началом записи.
4. Выполните начальную визуализацию с помощью приложения FRET SE (Сенсибилизированная выбросов) (или аналогичные функции) на соответствующее программное обеспечение конфокальной микроскопа.
   1. После того, как приложение открыто, нажмите на вкладку "Настройка", чтобы настроить параметры для достижения желаемых условий эксперимента.
   <LI> Вручную изменить настройки каналов таким образом, что клетки возбуждаются в последовательности при 440 нм (для донора и FRET каналов) и 513 нм (для акцепторного канала). Сбор длины волн излучения при длине волны 488 нм (для донора) и 535 нм (для FRET и акцептор).
   2. Установите интенсивность света при передаче 15%, с 150 мс возбуждения временем экспозиции клеток (время записи для трех последовательных CFP донора, лада и акцепторных каналов YFP) и 10-секундными интервалами между экспозициями.
5. Стабилизировать пластину на столик микроскопа.
6. С помощью кнопки "Live", чтобы проверить разрешение изображения. Tweak настройки дальше, пока требуемое разрешение не будет достигнуто.
7. Тем не менее на вкладке "Настройка", сделайте снимок образца с помощью кнопки "Захват изображения".
8. Переходя к закладке «Оценка», выбрать подходящий метод для расчета эффективности FRET для экспериментов делается. Метод 3, с использованием Логометрический расчета [Е _А (I) = B / A], Рекомендуется для экспериментов с участием cameleons, таких как индикатор D1SR.
9. Переключение на вкладку "График", чтобы иметь возможность наблюдать значения интенсивности записывается в виде графиков в ходе эксперимента.
10. Нарисуйте ROI в средстве просмотра изображений для наблюдения за соответствующий средней интенсивности этой области интереса на графике как эксперимент продолжается.
    Примечание: Следователь может также выбрать нарисовать несколько трансформирования и имеют соответствующие интенсивности быть записаны и отображаются одновременно на графике. В качестве альтернативы, исследователи могут выделить одну ROI для первоначальной записи, и перейти к очертить несколько трансформирования в более позднее время, открыв файл эксперимента по анализу ориентированной на версии данных программного обеспечения.
    Примечание: Более подробная информация о мерах, необходимых для установки FRET на основе экспериментов можно найти в руководствах FRET мастера приложений. Если микроскоп не оснащен мастером FRET, следующий протокол может быть использован для настройки параметровзапись вручную.
11. Начало записи и позволяют сбор данных, по крайней мере, 3 мин, чтобы обеспечить постоянную базальную запись сигнала перед введением агента интерес.
12. Введение Ca ²⁺ -moving агента (например , 2 мкМ тапсигаргин; 100 нм эндотелин-1) в качестве инструмента для разрушающих SR Ca ^2+, вручную пипеткой заранее заданную дозу непосредственно в пластину на месте как можно ближе к интересующей области существа записан, как это возможно. Продолжить запись в течение требуемого времени лечения по месту службы.
13. Захват ратиометрический FRET последовательных изображений (512 х 512 пикселей) с нефтью погружения цели 63x конфокальной перевернутой микроскопа с помощью приложения FRET SE.
14. Сбор данных в результате обработки изображений из кластера 5-10 SMCs в каждой области интереса (ROI), а затем отформатировать и анализировать с помощью программного обеспечения на основе статистики.
    1. Для сохранения данных для последующего использования, щелкните правой кнопкой мыши записанный след и выберите опцию "Экспорт" для SAVе таблица с записанными средней интенсивности сигнала на выбранном диске следователя.
    2. Нормализовать данные из каждого отдельного эксперимента путем деления каждой из точек данных по исходному значению интенсивности наблюдаемого в момент времени 0 сек.
    3. Импорт нормированные данные из таблицы в статистическом файле проекта программы вручную путем копирования и вставки соответствующих строк данных из их исходной таблицы / сек.
    4. Автоматически создавать графики, соответствующие наборы данных, вставленных в программу.
       Примечание: настройки по умолчанию в рамках этой программы генерируют линейные графики из импортируемых данных. Тип графика отображения можно изменить, нажав на кнопку "Выбрать другой тип графа" под "Изменить" заголовок найденной в главной панели инструментов.
    5. Данные бассейн, представляющие несколько независимых испытаний в рамках большой группы идентичных экспериментов на одном листе данных для получения средней трассировки для конкретного теста, выполненного.
4. Получение цитоплазматической Ca ²⁺ Индикатор
1. Растворите 0,0125 г Pluronic кислоты (PA) в 1 мл диметилсульфоксида (ДМСО) в черной микроцентрифужных трубки (возможно, чтобы нагреть трубу в ванне подвижной воды, чтобы поможет растворить PA).
2. Извлечь трубку (50 мкг) цитоплазматического Ca ²⁺ индикаторный краситель (Fluo-4 AM) от хранения -20 ° C.
3. Обертка трубку красителя в фольгу, чтобы защитить его в максимально возможной степени от контакта со светом.
4. Пипетка 45 мкл раствора ДМСО + ПА в пробирку, содержащую краситель. Итоговое решение ДМСО + PA в фольгу и хранить при комнатной температуре.
5. Смешайте содержимое пробирки тщательно с помощью пипетки раствор вверх и вниз несколько раз. В качестве альтернативы, разрушать ультразвуком трубку красителем в течение 10 мин.
   Примечание: Любой способ тщательно распределяя краску по всей растворе ДМСО + ПА будет достаточно; это просто вопрос предпочтений исследователя. Если следователь выбирает решение разрушать ультразвуком, егодолжно быть сделано в изолированной области / комнате, где другие будут не подвержены влиянию шума. Следователь должен также использовать тяжелые глушителей для защиты ушей.
   1. Если раствор обрабатывали ультразвуком, вставьте обернутого фольгой пробирку , содержащую краситель внутри держателя пены трубки и место внутри 2/3 полной (с дН ₂ O) ультразвуковом ванны.
   2. Место Sonicator ванны в изолированной области / комнате и питание машины (убедитесь, что защитный головной убор на месте до начала процесса обработки ультразвуком). Оставьте номер и оставить работающую машину в течение 10 минут перед выключением его и извлечения трубки (держать завернуты в фольгу для защиты от света до тех пор, пока это возможно).
6. Алиготе в настоящее время тщательно перемешанную смесь раствора в темных микропробирок (5 мкл на пробирку, должны быть в состоянии сделать общей сложности 10 трубок).
7. Оберните каждую аликвоту трубку в фольгу. Этикетка пробирки и хранить в осушителя при -20 ° C условиях до использования.

5. Измерение цитоплазматического Ca ²⁺

1. Следуйте инструкциям, приведенным в 1.1-1.12 для подготовки культуры пластины аорты крыс SMCs.
2. Удалите культуральную среду, из пластины на 48 ч после культуры.
3. Удалить ранее подготовленный аликвоты цитоплазматической индикатора Са ²⁺ (5 мкл) от хранения -20 ° C и не поддерживать в бане со льдом до мобильного использования.
4. Промыть культуральный планшет с 1 мл теплого буфера физиологических HEPES-PSS , содержащий (в mmol·L ^{- 1)} NaCl 140, глюкоза 10, KCl 5, HEPES 5, CaCl ₂ 1,5 и MgCl ₂ 1 (рН 7,4) три раза.
5. Смешайте индикатор с 1 мл теплого HEPES-PSS и загрузить ее на культуральную пластину.
6. Выдержите СМЦ с индикатором в течение 1 ч при комнатной температуре (24 ° C).
7. Удалить индикатор из культуральной пластины и промывают 1 мл теплого физиологического HEPES-PSS буфера в три раза.
8. Добавить 1 мл свежей теплой HEPES-ПСС буферу непосредственно перед началом записи.
9. Захват последовательных изображений (512 х 512 пикселей) с 63x OИл-погружение цель конфокальной перевернутой микроскопа.
   1. Ручное изменение параметров таким образом, что клетки возбуждаются на длине волны 488 нм, а длины волн излучения собирают при 555 нм со скоростью развертки 700 Гц.
   2. Установите интенсивность света при передаче 15%, с 150 мс время экспозиции возбуждения клеток (количество времени, что клетки подвергаются воздействию света с заданными интервалами времени во время записи) и 5-секундными интервалами между экспозициями.
10. Стабилизировать пластину на столик микроскопа и начать запись.
11. Запись в течение по крайней мере 3 мин, чтобы обеспечить постоянную базальную запись сигнала перед введением агента интерес.
12. Введение Ca ²⁺ -moving агента (например , 2 мкМ тапсигаргин) в качестве инструмента для разрушающих SR Ca ²⁺ (как описано в пункте 3.16) и продолжить запись на нужное количество времени лечения по месту службы .
13. интенсивность сигнала записи с помощью микроскопа специального программного обеспечения путем усреднения флуоресценции сиgnals (F / F ₀₎ из кластера 5-10 SMCs в каждой области интереса (ROI). Сбор, формат и анализировать данные, полученные из изображений с помощью программного обеспечения для анализа данных. См шаги 3.18.1-3.18.5 для описания сбора и анализа данных с помощью этого программного обеспечения.

Representative Results

В этом разделе приведены примеры результатов , которые могут быть получены с помощью описанного метода для захвата SR Ca ²⁺ просвета концентрации данных, по сравнению с обычно применяемым способом косвенного измерения изменения органелл Ca ²⁺ концентрации магазинов, наблюдая колебания в цитоплазматического Ca ²⁺ ,

На фиг.1А показан снимок области интереса (ROI) культуры SMC трансфицированных D1SR аденовируса в канале YFP (514 нм возбуждения / 535 нм излучение). Как показала практика , хотя все SMCs положительны для выражения D1SR, то очевидно , что уровни экспрессии для индикатора D1SR меняться в зависимости от различных ячеек в пределах той же ROI. На рисунке 1В показана 2-D проекции флуоресцентным изображением SMC трансфецировали D1SR аденовирус (YFP канал), который представляет собой четкую картину распределения Ca ²⁺в экспансивной SR полостной сети. Рисунок 1C представляет D1SR распределение индикатора в SMC с использованием CFP (440/488 нм), лада (440/535 нм) и YFP (514/535 нм) полосовых фильтров.

Мы также покажем примеры следов сигнала Ca ²⁺ , полученных в результате мониторинга движения этого целевого иона в СР, используя четкий тест острого облучения клеток к SR опорожнение агента тапсигаргин (2 мкМ) (рисунок 2). Как показано на фигуре 2А и 2В, тапсигаргин индуцирует снижение SR содержание Са ²⁺ ([Ca ^2+] _SR).

На фигуре 3А, мы показали , репрезентативные образы культивируемых SMCs загруженных с цитоплазматическим индикатором Ca ²⁺ , обработанной SR опорожнение агента тапсигаргин (2 мкМ). Наблюдаемое переходный пик в записанном Ca ²⁺ сигнала ( 2+ высвобождения в цитоплазму SMC, даже если источник переходными Са ²⁺ не могут быть явно идентифицированы.

На фиг.4А показаны репрезентативные снимки культивируемых SMCs , экспрессирующих индикатор D1SR SR кальция и обрабатывали 100 нм эндотелина-1. Как показано на обоих чертежах 4A и 4B, эндотелин-1 индуцирует медленное, но устойчивое снижение содержания кальция SR, измеренный с помощью падения сигнала D1SR разъедать. Как видно, Логометрический протокол FRET важно исследование позволяет Ca ²⁺ движения , непосредственно связанные с режимом действия агента. Непосредственно измерения движения этого иона в / из крупнейшего Са ²⁺ магазина в камере таким образом , является полезным в предоставлении результатов представителя Ca ²⁺ динамика напрямую относящиеся к действиям SR или из - за изменения s в среде SR просветом.

Рисунок 1. Распределение SR Ca ²⁺ индикатора D1SR в аорты крыс SMCs. (А) Представитель изображения с изображением SMC культуры трансфицировали D1SR andenoviral вектор в 48 ч после заражения. (B) 2-D проекция флуоресцентного изображения распределения D1SR в культивируемой SMC с использованием YFP канала (514 нм возбуждения / 535 нм) излучения. (C) представитель мгновенный снимок SMC трансфицировали с индикатором D1SR использованием CFP (440/488 нм), лада (440/535 нм) и YFP (514/535 нм) полосовых фильтров. Шкала бар = 10 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

/files/ftp_upload/53912/53912fig2.jpg "/>
Рисунок 2. тапсигаргин вызывает значительное снижение [Са ^2+] _SR. (А) в режиме реального времени псевдоцветовую моментальных снимков (FRET канала) культивируют аорты крысы SMCs , трансфицированных D1SR и обрабатывали 2 мкМ тапсигаргин демонстрируют снижение интенсивности сигнала , указывающего , значительное снижение содержания SR Ca ²⁺ вследствие тапсигаргин-индуцированной Ca ²⁺ высвобождения. (B) представитель трассировки для F / F значение ₀ в культивируемых SMCs обрабатывали 2 мкМ тапсигаргин подтверждает значительное снижение [Ca ^2+] _SR. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Fi3. тапсигаргин цифра вызывает значительное увеличение цитоплазматического Ca ²⁺ ([Са ^2+]). (А) Представительные слепки культивируемых аорты крысы SMCs , нагруженных цитоплазматической индикатором Ca ^2+, и обрабатывали 2 мкМ тапсигаргин. Как показано, тапсигаргин вызывает значительное увеличение интенсивности сигнала в цитоплазме за счет высвобождения Са ²⁺ из SR. (B) представитель трассировки для F / F значение ₀ в культивируемых SMCs обрабатывали 2 мкМ тапсигаргин. Изображенный увеличение сигнала Ca ²⁺ считается пропорционально количеству Са ²⁺ , выделяемого из SR. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4. эндотелина-1 вызывает значительное снижение [Ca ^2+] _SR. (A) в режиме реального времени псевдоцвете снэпшоты (FRET канала) культивируют аорты крыс SMCs , трансфицированных D1SR и обрабатывают 100 нм эндотелин-1 , показывающий медленный , но устойчивое снижение интенсивности сигнала указывает на значительное снижение содержания SR Ca ²⁺ из - за эндотелин-индуцированной Ca ²⁺ высвобождения для SR. (B) представитель трассировки для F / F значение ₀ в культивируемых SMCs обработанных 100 нм эндотелина-1. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Discussion

Этот протокол описывает трансфекцию VSMCs с D1SR аденовируса для исследования концентрации Ca ²⁺ в просвете СР. Этот метод позволяет для прямого измерения Са ²⁺ в пределах этой органеллы, а также его перемещения в / из СР в результате применения различных кальциевых движущихся агентов. Этот метод имеет много преимуществ для исследователей , работающих в направлении всеобъемлющего понимания того , как изменения в SR и цитоплазматических уровни Ca ²⁺ влияют на общее здоровье клеток и как эти изменения взаимосвязаны. Традиционное наблюдение внутриклеточного движения Ca ²⁺ включает в себя отслеживание изменений только цитоплазматическими уровней Ca ^2+. Важным преимуществом полученных от использования D1SR или подобные конструкции, таким образом, является способность контролировать движение этого иона с участием конкретной органеллы, такие как SR, вместо того, чтобы сделать нечеткие выводы о влиянии агонистов на СР покосвенно наблюдать изменения в цитоплазматических уровней Ca ²⁺ , индуцированных таких манипуляций. В том же духе, агенты, служащие влияют SR Ca ²⁺ конкретно может быть более эффективно использованы для оценки их влияния на обоих органелл и клеток в масштабах всей клеточных концентраций Ca ²⁺ и общее состояние здоровья. Именно благодаря этим преимуществам , которые трансфекции культивируемых клеток с D1SR обеспечивает более прямой, а также бесплатный, метод измерения изменений в внутрипросветных SR уровней Ca ^2+. Важное значение имеет также тот факт , что эта модель представляет собой инструмент для измерения изменений в концентрации Ca ²⁺ внутри сети SR в ответ на фармакологических или физиологических агентов , которые , как известно, вызывают клеточный стресс или специфические функциональные реакции. Это будет возможно путем создания калибровочной кривой для индикатора D1SR в любой клетке, представляющей интерес. Концентрация кальция в ER / SR можно затем рассчитать путем калибровки нормализованное отношение D1SR (F / F ₀) Против стандартной калибровочной кривой , как описано выше ^{10, 11.}

Ограничение протокола изложенного здесь является отсутствие информации, доступной на использовании D1SR конструкции в других типах клеток. Этот метод до сих пор оказалась успешной для SMCs крыс в наших исследованиях несколько раз ^13-15, хотя его использование с другими типами клеток до настоящего времени было ограничено. Для успеха этого метода, жизненно важно, чтобы все меры предосторожности, чтобы обеспечить здоровое развитие этапов клеточной культуры. Поэтому очень важно использовать соответствующий материал, позволяющий рост клеток на пластинах, таких как многих белков на основе гелеобразных веществ, доступных для покупки, которые доказали свою способствовать достаточный рост аорты крыс SMCs на стеклянным дном микроскопии пластин. Изменчивость в успехе трансфекции D1SR и последующей визуализации можно наблюдать, если клетки не готовы во время их оптимальных ходов и при высокой сплошности. Изменения в рhenotype присущая длительного использования одной и той же клеточной линии может привести к неоптимальным трансфекцию и слабый сигнал получают на стадии формирования изображения. Ограничения, замешанные в использовании этого метода, таким образом, в основном сделанные неизбежным необходимой работы для культивирования клеток, а эксперименты с использованием конструкции D1SR должны быть получены в течение по крайней мере 36-48 часов до их выполнения для обеспечения слитности клеток для работы с изображениями и достаточное время для инкубации растущих клеток с аденовирусом.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (high glucose, pyruvate)	Life technologies	11995-065	Warm in 37 °C water bath before use
Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced, 5 ml	Corning	356230	Keep at -20 °C until right before use
Newborn Calf Serum	Sigma-Aldrich		Keep at -20 °C until right before use
35 mm glass-bottomed plates	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C
250 ml 0.2 μM vented blue plug seal cap flask	BD Falcon	353136
Trypsin/EDTA Solution	Life technologies	25200056	Keep at -20 °C until right before use
50 ml Polypropylene Conical Tube	BD Falcon	352070
D1SR	N/A	N/A	Gift
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8779
Pluronic F-127	Sigma-Aldrich	P2443
Fluo 4-AM	Life technologies	F-23917	Keep at -20 °C until right before use
1.5 ml Black Microcentrifuge Tubes	Argos Technologies	T7100BK
Leica TCS SP5 confocal microscope	Leica Microsystems
Leica Application Suite 2.6.3 (with FRET SE Wizard application)	Leica Microsystems
GraphPad Prism 5.0	GraphPad Software, Inc.