Introduction
ऊतक स्तर पर किया ट्रांसक्रिप्शनल अध्ययन में, अति विशिष्ट लेकिन दुर्लभ प्रकार की कोशिकाओं के transcriptomes अक्सर अधिक प्रचुर मात्रा में कोशिकाओं के आसपास के मुखौटे हैं। इस तरह के अति विशिष्ट प्रकार की कोशिकाओं के लिए एक उदाहरण पौधों में महिला प्रजनन वंश (germline) की कोशिकाओं रहे हैं। महिला germline फूल 1,2 के जायांग अंदर, विकासशील बीजाणु के भीतर निर्दिष्ट किया जाता है बीज के व्यापारियों। megaspore मां सेल (एमएमसी) महिला germline के पहले सेल है। यह कम megaspores की एक tetrad के लिए फार्म अर्धसूत्रीविभाजन आए। आमतौर पर, इन megaspores का केवल एक ही बचता है और cytokinesis बिना mitotically बिताते हैं, यानी, एक संकोश में। तीन antipodals, दो synergid कोशिकाओं, अंडे, और केंद्रीय सेल: ये mitoses परिपक्व gametophyte है, जो आम तौर पर चार प्रकार की कोशिकाओं के होते हैं के लिए फार्म cellularization द्वारा पीछा किया जाता है। अंडा और केंद्रीय कोशिकाओं मादा युग्मक कि दोगुनी दौरान दो शुक्राणु कोशिकाओं से निषेचित हो रहे हैंble निषेचन भ्रूण और विकासशील बीज 1,2 के एण्डोस्पर्म को जन्म देने के लिए। यौन मॉडल प्रणाली Arabidopsis thaliana में, केवल ~ 50 बीज फूल प्रति विकसित करते हुए लगभग 50 - 80 बीज निकट से संबंधित जीनस Boechera में फूल प्रति विकसित करना। इस प्रकार, महिला germline, केवल कुछ अति विशिष्ट प्रकार की कोशिकाओं के होते हैं यह इस तरह के सेल विनिर्देश और भेदभाव के रूप में विकास की प्रक्रिया का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल बना रही है।
इसके अलावा, जीन विनियामक संयंत्र प्रजनन शासी प्रक्रियाओं में अंतर्दृष्टि एप्लाइड मूल्य का हो सकता है। पौधों में, बीज (apomixis) के माध्यम से दोनों यौन और अलैंगिक प्रजनन हो सकता है। जबकि यौन प्रजनन आबादी में आनुवंशिक विविधता उत्पन्न करता है, प्रतिरूप संतानों के गठन कि आनुवंशिक रूप से माँ संयंत्र के लिए समान है की ओर जाता है apomixis। इसलिए, apomixis, कृषि और बीज उत्पादन में अनुप्रयोगों के लिए काफी संभावना है के रूप में भी जटिल मातृ जीनोटाइप कर सकते हैंकई पीढ़ियों 3,4,5 खत्म अनछुए बनाए रखा जाना। क्योंकि apomixis स्वाभाविक रूप से किसी भी प्रमुख फसल प्रजातियों में नहीं होती है, फसलों में apomixis के इंजीनियरिंग बहुत रुचि 3,4,5 की है। बहरहाल, यह लंबी अवधि के लक्ष्य को प्राप्त करने के लिए, क्योंकि apomixis की अंतर्निहित आनुवंशिक और आणविक आधार पर्याप्त विस्तार 6 में समझ नहीं है मुश्किल है।
Apomictic प्रजनन, सेल प्रकार विशिष्ट transcriptional रूपरेखा के शासी लेजर की सहायता microdissection (एलएएम) और अगली पीढ़ी के अनुक्रमण (NGS) का उपयोग ट्रांसक्रिप्शनल आधार में अंतर्दृष्टि हासिल करने के लिए एक बहुत शक्तिशाली दृष्टिकोण 7.8 प्रतिनिधित्व करता है। लैम पहले पशु और जैव चिकित्सा अनुसंधान के लिए स्थापित किया गया है। पिछले कुछ वर्षों में लैम भी प्लांट बायोलॉजी 6,9,10 के लिए लागू किया गया है। अन्य विधियों के अलग-अलग सेल और ऊतक प्रकार की रूपरेखा के लिए अनुमति देता है के विपरीत, लैम मार्कर लाइनों 6,9,10 की पीढ़ी की आवश्यकता नहीं है। इसलिए, यह एप्लिकेशन हो सकता हैप्रायर आणविक ज्ञान के बिना किसी भी सेल या ऊतक प्रकार के लिए झूठ बोला था। लैम का एक अन्य लाभ यह है कि यह किसी भी प्रकार की कोशिका के रूप में लंबे समय के लिए लागू किया जा सकता है के रूप में सेल की स्थिति और / या ढांचागत सुविधाओं के आधार पर सूखी वर्गों में पहचाना जा सकता है। लैम अतिरिक्त लाभ यह है कि तय ऊतकों उपयोग किया जाता है, जो प्रसंस्करण के दौरान ट्रांसक्रिप्शनल प्रोफ़ाइल के परिवर्तन को रोकता है।
ब्याज, जैसे, पुष्प ऊतक के ऊतक, पैराफिन मोम में एम्बेड करने से पहले एक गैर crosslinking लगानेवाला में तय हो गई है। पैराफिन मोम में एम्बेड मैन्युअल रूप से किया जा सकता है, स्थापित प्रोटोकॉल 9,11 के बाद। हालांकि, मोम के साथ निर्जलीकरण और घुसपैठ के लिए एक स्वचालित ऊतक प्रोसेसर का इस्तेमाल आम तौर पर शाही सेना गुणवत्ता और ऊतक आकृति विज्ञान के संरक्षण के मामले में उच्च reproducibility में यह परिणाम है। राल में ऊतकों embedding के वैकल्पिक रणनीति भी सफलतापूर्वक लैम 8 से सेल प्रकार विशिष्ट विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया गया है। हालांकि, एक autom का उपयोगमोम में embedding के लिए पैदा ऊतक प्रोसेसर, बहुत समय कुशल है के रूप में कई नमूने एक बार समय पर हाथों की एक न्यूनतम आवश्यकता होती है पर कार्रवाई की जा सकती है। आम तौर पर शाही सेना गुणवत्ता का कोई महत्वपूर्ण नुकसान निर्धारण और एम्बेडिंग के दौरान होता है, वहीं microtome के साथ पतली वर्गों की तैयारी और विशेष रूप से, लैम के लिए इस्तेमाल किया frameslides पर बढ़ते शाही सेना गुणवत्ता के संरक्षण के लिए एक महत्वपूर्ण कदम बनी हुई है। यह पहले उल्लेख किया गया है और एक टेप हस्तांतरण प्रणाली के उपयोग के इस कदम के 12 में बेहतर शाही सेना गुणवत्ता में परिणाम के लिए वर्णित किया गया है। हालांकि, इस स्लाइड की तैयारी के दौरान एक अतिरिक्त समय लेने वाली कदम कहते हैं और भी विशेष उपकरणों की आवश्यकता है। अनुकूलित नीचे वर्णित प्रोटोकॉल reproducibly आरएनए GeneCHIPs और अगली पीढ़ी के अनुक्रमण (NGS) दृष्टिकोण 7,11,13,14 साथ transcriptional रूपरेखा के लिए पर्याप्त गुणवत्ता की है कि पैदा करता है। इसके अलावा, लेजर microdissection इस्तेमाल किया माइक्रोस्कोप के साथ, अलग-थलग सेल प्रकार की एक उच्च शुद्धता राउत हैinely 7,11,13,14 का उत्पादन किया।
जीनस Boechera apomictic प्रजनन का महत्वपूर्ण कदम के अध्ययन के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल प्रणाली है। Boechera में, विभिन्न यौन और apomictic accessions की एक किस्म की पहचान की गई है और तुलनात्मक के लिए इस्तेमाल किया जा सकता 15,16,17 विश्लेषण करती है। यौन Arabidopsis और apomictic Boechera से महिला germline से कोशिकाओं की कोशिका प्रकार विशिष्ट transcriptomes की तुलना में, हम जीन और रास्ते कि विभिन्न व्यक्त कर रहे हैं की पहचान की है, जिससे नियामक प्रक्रियाओं के नए पहलुओं की पहचान गवर्निंग apomixis 7। इसके अलावा, इस अध्ययन के लिए छोटे और दुर्लभ प्रकार की कोशिकाओं का विश्लेषण करती है सेल प्रकार विशिष्ट transcriptional के लिए लैम की उपयुक्तता सत्यापित। हम पहले से ही पौधों की प्रजातियों की एक किस्म में विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के विश्लेषण के लिए इस प्रोटोकॉल का इस्तेमाल किया है, लेकिन species- और प्रोटोकॉल के लिए ऊतक विशेष संशोधनों के कुछ मामलों में आवश्यक हो सकता है।
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Protocol
नोट: इस प्रोटोकॉल ऊतक तैयारी, लेजर असिस्टेड microdissection, और ट्रांसक्रिप्शनल की रूपरेखा के लिए शाही सेना निकासी का वर्णन है। हमेशा प्रोटोकॉल के सभी चरणों के दौरान दस्ताने का उपयोग करें। अध्ययन और प्रयोग किया जाता है प्रत्येक रसायन के लिए सुरक्षा के निर्देश पर विचार करें। विशेष रूप से, यह ध्यान रखें कि XYLOL हानिकारक है और दस्ताने घुसना कर सकते हैं और है कि मेथनॉल विषैला होता है। प्रयुक्त सभी उपकरणों के लिए, तदनुसार उपयोगकर्ता मैनुअल को देखें।
कांच के बने पदार्थ और अन्य उपकरणों से RNAse गतिविधि के 1. हटाने
- उपयोग करने से पहले, 180 डिग्री सेल्सियस पर ~ 8 घंटे के लिए पाक RNAse सुनिश्चित करने के लिए स्वतंत्र गुणवत्ता के लिए पहले एल्यूमीनियम पन्नी में किसी भी कांच के बने पदार्थ लपेटो।
- समझो किसी भी धातु सतहों (जैसे, चिमटी की जोड़ी) के रूप में भी काम बेंच और एक उचित RNAse परिशोधन समाधान के साथ हीटिंग थाली। बाद में, RNase मुक्त पानी के साथ सतहों धोने परिशोधन समाधान निकालने के लिए। बाद में, 70% EtOH के साथ आगे की सतहों को साफ।
- सभी Plas का प्रयोग करेंटिक उपभोग्य (जैसे, ट्यूब) नया किसी भी pretreatment के बिना। यदि उपलब्ध है, प्लास्टिक उपभोग्य कि मुक्त RNase जा करने के लिए प्रमाणित कर रहे हैं का उपयोग करें।
2. ऊतक निर्धारण
- बर्फ पर एक ताजा 15 मिलीलीटर ट्यूब में:;: किसान के लगानेवाला की 10 मिलीलीटर की तैयारी (एसिटिक एसिड 3 वी / वी इथेनॉल 1)। (हमेशा उपयोग करने से पहले नए सिरे से किसान लगानेवाला तैयार)। एक वैकल्पिक, गैर crosslinking लगानेवाला इथेनॉल के रूप में: एसिटिक एसिड (5: 1; वी / वी) 18 के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
- ब्याज के विकास के चरण में कलियों इकट्ठा करने के लिए चिमटी का जुर्माना जोड़ी का उपयोग करें। तुरंत ठंडा लगानेवाला में कलियों डूब। के निर्धारण के लिए Arabidopsis या Boechera से 20 कलियों या फूलों लगानेवाला के 10 मिलीलीटर का प्रयोग करें ~ नोट:। बड़े फूलों के साथ पौधों की प्रजातियों का उपयोग कर जब यह एक धार के साथ फूलों के टुकड़े करना छोटे टुकड़ों से पहले निर्धारण करने के लिए उत्पन्न करने के लिए सिफारिश की है।
- 3 सबसे बड़ा फूल inflor की कलियों - क्रम में परिपक्व gametophytes प्राप्त करने के लिए, 2 प्रभावहीन2 दिन पूर्व फसल के लिए escence।
- बर्फ के साथ एक exsiccator के नीचे भरें। नमूने, जैसे, फूल युक्त ट्यूबों खोलें, और बर्फ पर उन्हें जगह है, या तो सीधे एक तरह से बर्फ में उन्हें लगा कि वे पर नहीं गिर सकता है या एक उचित धारक का उपयोग करके। वैक्यूम 15 मिनट वैक्यूम की रिलीज से पहले घुसपैठ।
- 15 मिनट के लिए एक बार वैक्यूम घुसपैठ को दोहराएँ।
- बर्फ पर निर्वात और दुकान रातोंरात (~ 12 घंटा) रिलीज। एक ढक्कन या एल्यूमीनियम पन्नी के साथ बर्फ बाल्टी कवर और आदेश विगलन से बर्फ को रोकने के लिए एक 4 डिग्री सेल्सियस कमरे या फ्रिज में बाल्टी दुकान। नोट: निर्धारण समय समय को बढ़ाने की सिफारिश नहीं है।
3. ऊतक एम्बेड, पतला सेक्शनिंग, और लैम के लिए स्लाइड पर बढ़ते
- ऊतक एम्बेडिंग।
- 70% शुद्ध इथेनॉल और RNase मुक्त पानी के साथ तैयार करने के लिए इथेनॉल लगानेवाला विनिमय। आगे की प्रक्रिया जब तक बर्फ पर नमूने छोड़ दें। शुरू embeनमूनों की dding उसी दिन। मामले में कोई ऊतक प्रसंस्करण मशीन उपलब्ध है, के रूप में कहीं वर्णित 9,11 मैनुअल एम्बेड करने के लिए आगे बढ़ना है और कदम 3.1.11 के साथ जारी है।
- धीरे चिमटी की एक जोड़ी के साथ ऊतक एम्बेडिंग कैसेट के लिए नमूने हस्तांतरण। मजबूती कैसेट बंद करें। महत्वपूर्ण कदम: इस कदम के दौरान नमूने की भी आंशिक सूखने से बचें। चिमटी के साथ नमूनों की फैलाएंगे से बचें।
नोट: कैसेट एक पेंसिल का इस्तेमाल किया जाना चाहिए लेबल करने के लिए, आदर्श कैसेट के इच्छुक सतह पर लिख कर। - जब तक सभी सामग्री कैसेट को सौंप दिया है और एम्बेडिंग मशीन लोड किया जा सकता कलियों या 70% इथेनॉल में फूलों के साथ भरी हुई embedding कैसेट की दुकान। इस प्रयोजन के लिए, एक गिलास धुंधला 70% इथेनॉल के साथ भरा गर्त का उपयोग करें।
- मशीन का मुंहतोड़ जवाब से ऊतक प्रोसेसर की टोकरी निकालें और इच्छुक शीर्ष सामना करना पड़ रहा सतहों के साथ और एक ही दिशा में टोकरी में एम्बेडिंग कैसेट हस्तांतरण। सीआरआईराजनैतिक कदम: ऊतकों के किसी भी सूखने को रोकने के लिए जल्दी से इस प्रदर्शन करना। एक बार में कई embedding कैसेट प्रसंस्करण, तो एक उचित RNase मुक्त कंटेनर नमूने लोड करने से पहले 70% इथेनॉल के साथ भरा में टोकरी जगह है।
- टोकरी पर ढक्कन लगा और टोकरी मुंहतोड़ जवाब में वापस डाल दिया। मुंहतोड़ जवाब बंद करें।
नोट: ऊतक प्रोसेसर स्वचालित रूप से नमूने dehydrates, XYLOL करने के लिए विलायक बदलता है, और पिघल पैराफिन मोम के साथ घुसपैठ करता है। आमतौर पर, इस रात भर किया है। - ऊतक प्रोसेसर के प्रोग्राम प्रारंभ करें। अनुशंसित मानक सेटिंग, 1 घंटा 70% EtOH, तीन बार 1 घंटा 90% EtOH, तीन बार 1 घंटा 100% EtOH, दो बार 1 घंटा 100% XYLOL, एक समय 1 घंटा 15 मिनट 100% XYLOL कमरे के तापमान पर हैं घुसपैठ के द्वारा पीछा पैराफिन मोम के साथ दो बार 1 घंटा और 56 डिग्री सेल्सियस 11 पर 3 घंटे के लिए एक समय के लिए।
नोट: यह सुनिश्चित करें कि अवरुद्ध स्टेशन मोम पिघल के साथ तैयार है, शुरू होने से पहले कई घंटे पर मशीन स्विच यालगभग शुरू समय का चयन करने के लिए टाइमर समारोह का उपयोग करें।
नोट: मामले में ऊतक तुरंत बाद पैराफिन मोम में अब ऊष्मायन बार 56 डिग्री सेल्सियस पर 3 घंटा के बजाय 56 डिग्री सेल्सियस पर कार्रवाई नहीं की जा सकती, कर रहे हैं संभव है। साधन के उपयोगकर्ता मैनुअल को देखें। आमतौर पर, ऊतकों के साथ कैसेट स्वचालित रूप से पिघला मोम में रहेगा जब तक "खाली मुंहतोड़ जवाब" कमांड मंजूरी दे दी है। तो मोम जब ऊतक प्रोसेसर शुरू पिघल नहीं है, मुंहतोड़ जवाब 70% इथेनॉल से भर जाता है और शुरू करने के लिए तैयार है जब तक कार्यक्रम पकड़ पर बनी हुई है। - मुंहतोड़ जवाब खाली और तुरंत एक अवरुद्ध स्टेशन में 56 डिग्री सेल्सियस पर एक पैराफिन मोम स्नान के लिए नमूने हस्तांतरण। टोकरी से ढक्कन हटाएँ और उसके ढक्कन के साथ अवरुद्ध स्टेशन के पैराफिन स्नान को कवर किया।
- ढेर अवरुद्ध स्टेशन की सतह पर कई ताजा संतुलन ट्रे 56 डिग्री सेल्सियस तक गर्म के रूप में वहाँ की टोकरी में कैसेट कर रहे हैं।
नोट: एक इथेनॉल प्रतिरोधी स्थायी मार्कर का उपयोग हो सकता हैडी संतुलन ट्रे के नीचे लेबल करने के लिए। एसीटोन प्रतिरोधी स्थायी मार्कर की सिफारिश नहीं कर रहे हैं। - अवरुद्ध स्टेशन का उपयोग कर 56 डिग्री सेल्सियस पर पिघल पैराफिन मोम के साथ एक पूर्व गर्म ताजा प्लास्टिक ट्रे संतुलन भरें। पैराफिन स्नान के ढक्कन उठा, केवल एक समय में एक कैसेट उठा और नमूने कैसेट से चिमटी की एक जोड़ी का उपयोग संतुलन ट्रे में 56 डिग्री सेल्सियस पर तरल पैराफिन मोम के लिए स्थानांतरण।
महत्वपूर्ण कदम: नमूना आसपास है, जबकि जल्दी से काम करके कैसेट से निपटने के मोम के किसी भी सख्त से बचें।- मोम का सख्त से पहले एक तैयारी सुई का उपयोग जरूरत के अनुसार सभी नमूनों की स्थिति। आमतौर पर, कई फूल एक संतुलन ट्रे व्यक्तिगत रूप से प्रत्येक दिशा में लगभग 1 सेमी दूरी पर व्यवस्थित कर रहे हैं।
- दोहराएँ कदम 3.1.9 जब तक सभी नमूने स्थानांतरित कर रहे हैं।
- टोकरी वापस ऊतक प्रोसेसर के लिए जगह है और एक उपयुक्त कार्यक्रम (उपयोगकर्ता मैनुअल को देखें) का उपयोग मुंहतोड़ जवाब साफ।
- ऊतक प्रोसेसर और अवरुद्ध स्टेशन बंद कर दें। कदम 3.1.13 के साथ आगे बढ़ें।
- मामले में कोई ऊतक घुसपैठ मशीन और कोई एम्बेडिंग स्टेशन उपलब्ध है, 56 डिग्री सेल्सियस पर पैराफिन मोम पिघला करने के लिए एक हीटिंग ओवन का उपयोग करें। बेंच पर, प्लास्टिक ट्रे में संतुलन पिघला मोम भरने के मोम के लिए नमूने हस्तांतरण, और नमूनों की स्थिति के लिए तैयारी सुइयों का उपयोग करें।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूने भंडारण से पहले 3 घंटा - पैराफिन मोम ~ 1 के लिए कमरे के तापमान पर कड़ा करने की अनुमति दें। नमूने बाद में हौसले से संसाधित या कई महीने तक के लिए भंडारित किया जा सकता है।
- पतली वर्गों और लैम के लिए स्लाइड तैयार करना।
- एक प्रकाश मेज के नीचे से मोम ब्लॉक रोशन, आसपास के प्लास्टिक की ट्रे से नमूनों के साथ पैराफिन मोम को हटा दें। बाहर ऊतक युक्त एक चुकता मोम ब्लॉक, एक कली या फूल, एक RNase मुक्त रेजर ब्लेड का उपयोग काटना जैसे।,। इस उद्देश्य के लिए, हमेशा मोम ब्लॉक के ऊपर की ओर उन्मुख नमूने (देखें भी
- सभी नमूनों कि एक समय में लैम के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए की मोम ब्लॉकों तैयार करें।
- एक प्रकाश मेज के नीचे से मोम ब्लॉक रोशन, आसपास के प्लास्टिक की ट्रे से नमूनों के साथ पैराफिन मोम को हटा दें। बाहर ऊतक युक्त एक चुकता मोम ब्लॉक, एक कली या फूल, एक RNase मुक्त रेजर ब्लेड का उपयोग काटना जैसे।,। इस उद्देश्य के लिए, हमेशा मोम ब्लॉक के ऊपर की ओर उन्मुख नमूने (देखें भी
- ब्लॉकों माउंट कठोर पैराफिन मोम के साथ भरा कैसेट embedding प्रक्रिया करने के लिए: एक इथेनॉल दीपक का उपयोग कर एक उचित रंग की नोक पर एक छोटा सा टुकड़ा या पैराफिन मोम की छोटी बूंद पिघल और (एम्बेडेड ऊतकों के साथ गर्म मोम का उपयोग समर्थन पर ब्लॉक ठीक करने के लिए शीर्ष पर)।
- मोम 4 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 20 मिनट के लिए कड़ा करने की अनुमति दें।
- प्रकाश मेज पर एक धार के साथ नमूना आसपास के अधिशेष मोम निकालें। समानांतर किनारों (चित्रा 1 देखें) के साथ एक वर्ग सतह रखने के लिए सुनिश्चित करें।
- 42 डिग्री सेल्सियस के लिए हीटिंग थाली सेट करें।
- सुरक्षित रूप से microtome के लिए नमूने माउंट और 6 तैयार - 10 माइक्रोन मोटी वर्गों। microtome प्रयोग करने के लिए निर्माता के निर्देशों को देखें। नोट: जबकि पतली वर्गों अक्सर बेहतर संरचनात्मक संकल्प, highe की शाही सेना की बड़ी राशि दे देंगेआर गुणवत्ता मोटा वर्गों के साथ प्राप्त किया जा सकता है। Boechera की कोशिकाओं gametophytes परिपक्व के लिए हम डिफ़ॉल्ट के रूप में 7 माइक्रोन का उपयोग करें। microtome चाकू से अधिक नमूनों के साथ नहीं बल्कि धीरे धीरे आगे बढ़ अक्सर बेहतर ऊतक विज्ञान का परिणाम है।
- 15 सेमी एक प्लास्टिक के डिब्बे में एक काले रंग की गत्ते के साथ तल पर उन्हें लैम स्लाइड्स में स्थिति पहले - हमेशा आयल रिबन लगभग 10 की लंबाई में हस्तांतरण।
- यदि संभव हो तो, आयल ब्याज की सेल या ऊतक प्रकार, जैसे, बीजाणु युक्त स्ट्रिप्स के कुछ हिस्सों पूर्व का चयन करें, एक विदारक गुंजाइश के तहत और बाकी त्यागें।
- हीटिंग थाली पर शीर्ष पर फ्लैट सतह के साथ - आवश्यक धातु फंसाया स्लाइड की राशि (10 आम तौर पर 5) रखें।
- Pipet ~ 1 - 2 स्लाइड की प्लास्टिक की ओर से RNase मुक्त पानी की मिलीलीटर। 5 सेमी लंबे समय पर्याप्त है प्लास्टिक की खिड़कियों अवधि के लिए - एक रेजर ब्लेड का प्रयोग, 4 के बारे में छोटे टुकड़े में पैराफिन रिबन काटा। यूचिमटी की एक जोड़ी और एक तैयारी सुई आदर्श जगह के लिए आयल स्ट्रिप्स स्लाइड की प्लास्टिक की खिड़कियों पर एक दूसरे के समानांतर se। ध्यान से पानी निकालने और स्लाइड वापस करने के लिए जगह एक छोर पर स्लाइड उठा।
- वैकल्पिक रूप से, एक रासायनिक हुड के तहत हीटिंग थाली जगह है। स्लाइड सिर्फ सतह गीला करने के लिए पर्याप्त की प्लास्टिक हिस्सा मेथनॉल की एक छोटी मात्रा लागू करें (इस स्लाइड के एक मामूली चलि पैदा कर सकता है)। स्लाइड पर आयल स्ट्रिप्स रखें।
नोट: विषाक्तता के कारणों के लिए, यदि संभव हो तो मेथनॉल के प्रयोग से बचें। हालांकि, इस कदम पर मेथनॉल के उपयोग के शाही सेना गुणवत्ता के मामले में गुणवत्ता के पानी पर बढ़ते द्वारा हासिल पर्याप्त नहीं है में सुधार करता है। यह एक नई परियोजना की शुरुआत में इन विकल्पों का परीक्षण सार्थक है, के रूप में शाही सेना गुणवत्ता हासिल की जांच के तहत सेल प्रकार और प्रजातियों के साथ बदलता रहता है।
- वैकल्पिक रूप से, एक रासायनिक हुड के तहत हीटिंग थाली जगह है। स्लाइड सिर्फ सतह गीला करने के लिए पर्याप्त की प्लास्टिक हिस्सा मेथनॉल की एक छोटी मात्रा लागू करें (इस स्लाइड के एक मामूली चलि पैदा कर सकता है)। स्लाइड पर आयल स्ट्रिप्स रखें।
- ~ 12 घंटे के लिए 42 डिग्री सेल्सियस पर गर्म थाली पर रात भर स्लाइड सूखी। कवर के साथ हीटिंग थालीएक प्लास्टिक के ढक्कन कि स्लाइड स्पर्श नहीं करता है। सुनिश्चित करें कि प्लास्टिक के ढक्कन हवा के आदान-प्रदान को रोकने नहीं है। इस उठाया जा ढक्कन उद्देश्य pipet बक्से या इसी पर रखा जा सकता है।
- वैकल्पिक रूप से, दो घंटे की एक न्यूनतम करने के लिए या ऊतक पूरी तरह से सूखा दिखाई देता है जब तक सुखाने समय कम। संग्रह करने के लिए टुकड़ा करने की क्रिया से समय की कमी के शाही सेना गुणवत्ता में सुधार हो सकता।
- एक रासायनिक हुड के तहत, de-मोम स्लाइड XYLOL में 10 मिनट के लिए 2 बार उचित स्लाइड धारकों का उपयोग कर। पूरी तरह से प्रत्येक स्लाइड के प्लास्टिक हिस्सा डूब केवल लेकिन धातु फ्रेम कि सूखा रखा जाता है के व्यापक अंत छू द्वारा स्लाइड को हटाने की अनुमति देने के लिए सुनिश्चित करें।
- स्लाइड लैम करने से पहले रासायनिक हुड के नीचे के लिए ~ 10 मिनट सूखे की अनुमति दें।
नोट: स्लाइड तुरंत कार्रवाई नहीं ऊतक में कुछ घंटे तक के लिए ऊपर का सामना करना पड़ के साथ 42 डिग्री सेल्सियस पर गर्म थाली पर वापस रखा जा सकता है। यह आगे की प्रक्रिया जब तक शाही सेना गुणवत्ता से समझौता किए से किसी भी आर्द्रता पाएगा।
4. लेजर की मदद से Microdissection (एलएएम)
नोट: लैम के लिए प्रक्रिया का इस्तेमाल किया यंत्र के साथ अलग अलग होंगे। इस प्रोटोकॉल के कुछ विवरण एक विशिष्ट साधन और electrostatic बलों के एक टोपी बनाने उपयोग पर नमूने एकत्र करने की प्रौद्योगिकी के लिए अनुकूलित कर रहे हैं। इसके अलावा, विवरण भी सॉफ्टवेयर के विभिन्न संस्करणों के बीच अंतर हो सकता है। एक विस्तृत वर्णन और उपकरण और सॉफ्टवेयर पर विशेष निर्देश के लिए निर्माता के निर्देशों और उपयोगकर्ता हैंडबुक को देखें।
- लैम (कम्प्यूटर, माइक्रोस्कोप, लेजर नियंत्रण बॉक्स) के लिए उपकरणों पर स्विच।
- कार्यक्रम माइक्रोस्कोप और लेजर संचालन शुरू करो।
- नियंत्रण बॉक्स पर इसी बटन दबाकर लेजर पर स्विच।
- एक टोपी (0.5 मिलीलीटर, diffusor के बिना) टोपी धारक में रखें और साधन में यह स्थिति।
- माइक्रोस्कोपी के लिए एक गिलास स्लाइड के साथ लैम स्लाइड का समर्थन करें। सुनिश्चित करें कि के साथ स्लाइड की सपाट सतहसंलग्न ऊतक गिलास स्लाइड चेहरे।
- गिलास स्लाइड के नीचे के साथ साधन में स्लाइड रखें।
- 4X उद्देश्य का चयन करें। कार्यक्रम में, "ऊपर" की स्थिति के लिए टोपी के लिए कदम और स्लाइड के स्कैन करने के लिए आगे बढ़ने के लिए चयन करें।
- स्लाइड के माध्यम से खोज और ब्याज की संरचनाओं की पहचान। तुच्छ और स्लाइड पर अपनी स्थिति को बचाने के काटने कदम के लिए सही स्थिति को वापस ले जाने के लिए सक्षम हो।
- उचित उद्देश्य (जैसे 40X या 60X) का चयन करें।
- यदि आवश्यक हो, लेजर गति, ध्यान, और लेजर शक्ति को समायोजित, और भी साधन के उपयोगकर्ता का मार्गदर्शन करने के लिए चर्चा करते हुए मंच के आंदोलन जांचना। एक खाता हित के विशिष्ट ऊतक के लिए स्थापित किया है एक बार, सेटिंग्स पुन: उपयोग किया जा सकता है।
- कार्यक्रम के "लेजर शॉट" बटन दबाने, आदर्श ऊतक के बिना झिल्ली के एक भाग में से एक ही शॉट द्वारा लेजर स्थिति की जाँच करें।
- यदि आवश्यक हो, वीं का पालन करके लेजर स्थिति जांचनासाधन के लिए ई निर्माता के निर्देशों।
- मॉनीटर पर सॉफ्टवेयर खिड़की के सभी चार कोनों के लिए एक स्पष्ट संरचना चलती है, सही माउस बटन दबाया रखकर उद्देश्य की जांच की जाँच करें। चेक स्पष्ट संरचना के संबंध में हाथ की स्थिति सभी चार कोनों में एक ही है। अन्यथा सॉफ्टवेयर मैनुअल निम्नलिखित उद्देश्यों को जांचना।
- 'नीचे' की स्थिति में टोपी के साथ, सेल प्रकार या ब्याज के ऊतकों, जैसे, अंडा सेल की सीमाओं को चिह्नित करने के लिए 'हाथ-कलम' उपकरण का उपयोग करें। दबाने 'कट' द्वारा लेजर के साथ ब्याज की सेल काटना। नोट: अक्सर, सेक्शनिंग जरूरतों को दोहराया जा रहा है, तो सेल के आसपास सीमा पूरी तरह से एक बार में विच्छेदित नहीं किया गया था। इस मामले में, यह सॉफ्टवेयर स्वचालित रूप से एक मानक के रूप में खंड के दो दोहराता है क्या करने के लिए निर्धारित करने की सिफारिश की है।
- टोपी लिफ्ट और ब्याज की संरचना के साथ अगले बचाया स्थिति के लिए कदम। दोहराएँ कदम 4.13प्रक्रिया के अगले सेल वर्गों काटना करने के लिए जब तक एक स्लाइड से ब्याज की सभी कोशिकाओं को एकत्र कर रहे हैं। सुनिश्चित करें कि टोपी एक तरीका है कि नई धारा टोपी पर एक खाली स्थिति से चिपक में तैनात है।
नोट: यह ऊतकों के बड़े टुकड़े को अलग करने की सिफारिश की है (उदाहरण के लिए, पूरे फूल या के कुछ हिस्सों के वर्गों) एक ताजा टोपी पर एकल कक्ष वर्गों के अलगाव के बाद प्रत्येक स्लाइड से। ये शाही सेना गुणवत्ता नियंत्रण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। - स्लाइड निकालें और कदम दोहरा 4.4 से अगली स्लाइड के साथ जारी - 4.9 और 4.13 4.14 करने के लिए।
- दोहराएँ कदम 4.15 और संबंधित चरणों सभी स्लाइड्स से ब्याज की सेल प्रकार जब तक पृथक किया गया है। नोट: यह ~ 4 से अधिक समय के लिए फसल के लिए अनुशंसित नहीं है - 5 एक ही टोपी पर मानव संसाधन।
- नेत्रहीन लैम के बाद टोपी सतह का निरीक्षण नमूने के unspecific संदूषण बाहर करने के लिए। गैर-विच्छेदित ऊतकों पन्नी के साथ संरक्षित कर रहे हैं, वहीं धूल इलेक्ट्रोस्टैटिक आसंजन के कारण सतह के लिए छड़ी कर सकते हैं।
- टीओ नेत्रहीन टोपी का निरीक्षण किया, साधन से स्लाइड को हटा दें। 'नीचे' की स्थिति में टोपी धारक की जगह और 4X उद्देश्य के साथ सतह का निरीक्षण किया।
- मामले की धूल के छोटे-छोटे टुकड़ों में दिखाई दे रहे हैं, उन्हें एक छोटी सी (2 μl) विंदुक टिप के साथ हटा दें। वैकल्पिक रूप से, साधन पर वापस स्लाइड माउंट स्लाइड (कोई ऊतकों) के एक नि: शुल्क भाग पर टोपी जगह है, और पूरी तरह से लेजर का उपयोग करते हुए प्रदूषण को नष्ट कर।
- बंद टोपियां और -80 डिग्री सेल्सियस तक आगे उपयोग पर शुष्क वर्गों फ्रीज। यदि आवश्यक हो, नमूने कई सप्ताह तक के लिए भंडारित किया जा सकता है। हालांकि, इस कदम पर जल्दी से आगे बढ़ने की सिफारिश की है।
5. शाही सेना अलगाव और गुणवत्ता नियंत्रण
नोट: शाही सेना किसी भी आरएनए की छोटी मात्रा के लिए उपयुक्त विधि द्वारा अलग किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल में एक शाही सेना अलगाव किट आरएनए की छोटी मात्रा के लिए निर्दिष्ट के उपयोग में वर्णित है। निर्माता के निर्देशों का पालन करें।
- नमूने के लिए संलग्न के साथ ट्यूब का उपयोग करेंटोपी या तो सीधे या -80 डिग्री सेल्सियस से हटाने के बाद।
- ट्यूब खुला और ध्यान से फिल्टर युक्तियों का उपयोग प्रत्येक ट्यूब की दीवार के लिए निकासी बफर के 11 μl pipet। नमूने के बीच सुझावों के लिए परिवर्तित करें।
- ढक्कन बंद करें और ट्यूब की टोपी के लिए नीचे निष्कर्षण बफर हिला।
- टोपी के साथ ट्यूब एक हीटिंग ओवन 42 डिग्री सेल्सियस के लिए छोड़ देते में नीचे रखें। निर्माता के निर्देशों के बाद 30 मिनट के लिए सेते हैं।
- स्तंभ तैयार करने के लिए निर्माता के निर्देशों का पालन करें और ट्यूबों के तल पर निकालने का संग्रह।
- 5.1.2 व्यक्तिगत रूप से प्रत्येक ट्यूब / टोपी के लिए - एक से अधिक टोपी से सामग्री का एक नमूना में जोड़ा जा करने की जरूरत है, कदम 5.1.1 के साथ आगे बढ़ें।
- बाद में, एक ट्यूब में एक नमूना के लिए अर्क पूल और पूर्व EtOH के एक बराबर राशि के अलावा के लिए एक विंदुक के साथ जमा निकालने की मात्रा को मापने (निर्माता के निर्देशों को देखें)।
- सुनिश्चित करें कि एट की राशिओह जोड़ा पहले स्तंभ लोड जमा निकालने की मात्रा के बराबर है।
- EtOH के साथ शाही सेना वर्षा के बाद, निर्माता के निर्देशों का पालन स्तंभों की लोडिंग के लिए जल्दी से आगे बढ़ें। 100 XG centrifugation कदम के साथ प्रोटोकॉल जारी रखें।
- बाद प्रत्येक एकत्रित ट्यूब की सामग्री कॉलम के माध्यम से पारित किया गया है, प्रवाह के माध्यम से निम्नलिखित निर्माता के निर्देशों को हटाने के लिए 30 सेकंड के लिए एक 16,000 XG centrifugation कदम प्रदर्शन करते हैं।
- शाही सेना निष्कर्षण और शुद्धि निर्माता के निर्देशों का पालन के साथ आगे बढ़ें।
- स्तंभ के लिए क्षालन बफर के लोड करने के बाद स्तंभ 1 मिनट के लिए सेते दें। निर्माता के निर्देशों में निर्देशों का पालन सेंट्रीफ्यूज में ट्यूब लोड करने के लिए आगे बढ़ें। नोट: 100 XG क्षालन से पहले 1 मिनट के लिए एक अतिरिक्त centrifugation कदम के रूप में प्रोटोकॉल में संकेत क्षालन की दक्षता में वृद्धि कर सकते हैं।
- शेष भाग से शाही सेना निकालेंrols शाही सेना गुणवत्ता नियंत्रण के लिए (बड़ा ऊतक वर्गों) कदम इस प्रोटोकॉल के 5.2.7 के लिए 5.1 के बाद।
- शाही सेना गुणवत्ता नियंत्रण लोड करने के लिए 1 μl Bioanalyzer पर प्रत्येक नियंत्रण नमूना निर्माता के निर्देशों का पालन एक शाही सेना पिको चिप का उपयोग करने का undiluted कुल शाही सेना।
नोट: निकाले शाही सेना रैखिक प्रवर्धन और transcriptome विश्लेषण प्रोटीन या शाही सेना Seq 7,11,13,14 प्रयोग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। आदर्श रूप में, गुणवत्ता नियंत्रण का संकेत देना चाहिए एक शाही सेना वफ़ादारी संख्या (Rin) कम से कम 7 के आपूर्तिकर्ताओं की एक संख्या प्रवर्धन के लिए उपयुक्त किट प्रदान करते हैं उपयुक्त उदाहरण 9 में दिए गए हैं।
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Representative Results
नमूना तैयार करना और लैम लगातार कदम में किया जाता है
लगातार कदम की एक संख्या लैम (चित्रा 1) द्वारा चयनित प्रकार की कोशिकाओं से ट्रांसक्रिप्शनल विश्लेषण के लिए शाही सेना को तैयार करने के लिए आवश्यक हैं। यह सुनिश्चित करने के लिए कि शाही सेना आबादी फसल के बाद अपरिवर्तित बनी हुई फूलों और तत्काल निर्धारण की फसल के साथ शुरू होता है। ऊतक, एम्बेडेड sectioned और स्लाइड पर मुहिम शुरू की है। इस Lam से कोशिकाओं और एक या कई टोपियां (चित्रा 1) पर सेल प्रकार विशिष्ट वर्गों की पूलिंग के अलगाव की अनुमति देता है। सामग्री बाद में जमे हुए किया जा सकता है या सीधे आरएनए निष्कर्षण द्वारा कार्रवाई की। इसके अलावा लैम का लाभ सेल प्रकार विशिष्ट के लिए लागू किया जा करने के लिए दोनों मॉडल और गैर-मॉडल प्रजातियों में विश्लेषण करती है, विधि समय लेने वाली नहीं बल्कि बनी हुई है। समय अधिक काम कर रहा है, कभी कभी कम से कम एक सप्ताह, तिवारी से कदम के लिए आवश्यक हैआरएनए निकासी के लिए ssue फसल (चित्रा 1)। यह खाता है कि अक्सर लैम के कई दिनों में काटा वर्गों एक जैविक नमूने और आरएनए निष्कर्षण में जमा कर रहे हैं में रखा जाना चाहिए। Boechera अंडे की कोशिकाओं के लिए, नमूना प्रति कम से कम 200 ~ वर्गों के उपयोग अत्यधिक की सिफारिश की अप ~ 100 वर्गों के साथ प्रति दिन अलग है।
ब्याज की सेल प्रकार के अलगाव सूखी धारा में उनकी दृश्यता पर निर्भर करता है
सेल प्रकार विशिष्ट वर्गों के अलगाव प्रोटोकॉल का सबसे अधिक समय लेने वाली कदम है। अब तक, इस कदम का कोई स्वचालन नमूनों की जटिल प्रकृति की वजह से विकसित किया गया है। क्योंकि सूखी वर्गों कम विपरीत है और इस खंड विमान तथ्य यह है कि बीजाणु विभिन्न कोणों डब्ल्यू पर केंद्रित कर रहे हैं के कारण नमूनों के बीच होती है एक सॉफ्टवेयर उपकरण का उपयोग ब्याज की कोशिकाओं की पहचान संभव नहीं हैऊतक Ithin (चित्रा 2)। फिर भी, synergids के साथ परिपक्व महिला gametophyte, अंडा सेल, और केंद्रीय सेल (प्रतिमुख कोशिकाओं निषेचन से पहले पतित) की अनूठी आकृति विज्ञान शोधकर्ता द्वारा अंडे की कोशिकाओं (चित्रा 3 चित्रा 2 बी, सी) की स्पष्ट पहचान की अनुमति देता है। दरअसल, Boechera divaricarpa में, अंडा सेल अक्सर तैयारी के दौरान एक सा सिकुड़ती है और इस तरह, एक सुविधा उच्च शुद्धता (चित्रा 2 बी, सी, चित्रा 3) पर अंडा सेल आबादी के अलगाव के लिए लाभप्रद आसपास के ऊतकों से अलग करती है।
लैम के बाद कैप के दृश्य निरीक्षण की सिफारिश की है
लैम के बाद टोपी सतह के दृश्य निरीक्षण, नमूने, जैसे की किसी भी संभव संदूषण की पहचान के लिए अनुमति देता है धूल से। इसके अलावा, यह सुनिश्चित करने के लिए एसई कि उपयोगी हैctions टोपी से चिपके रहते हैं, के रूप में कभी कभी वर्गों प्रक्रिया के दौरान खो जाते हैं। आमतौर पर, कई चयनित वर्गों, जैसे, अंडा सेल, एक टोपी पर लैम के कई घंटे के बाद देखा जा सकता है।
स्थापित कार्यप्रवाह reproducibly अच्छा शाही सेना गुणवत्ता में परिणाम
महिला gametophytes से सेल प्रकार विशिष्ट लैम isolations से, कुल शाही सेना मात्रा केवल कम एनजी रेंज में हैं। शाही सेना के इस सीमित राशि के लिए यह आवश्यक लैम के बाद शाही सेना गुणवत्ता नियंत्रण के लिए एक सन्निकटन के रूप में प्रत्येक स्लाइड के बड़े ऊतकों से अलग एक प्रतिनिधि नियंत्रण का उपयोग करने के लिए बनाता है। इस बी से सेल प्रकार विशिष्ट शाही सेना के एक तुलना द्वारा प्रदर्शन किया है के रूप में divaricarpa अंडा सेल में ही स्लाइड से अलग बड़ा ऊतक क्षेत्रों, इसी तरह की शाही सेना गुणवत्ता का संकेत से नियंत्रित की तुलना में (चित्रा -4 ए, बी)। इस विधि का प्रयोग, RIN संख्या & # के साथ उच्च गुणवत्ता आरएनए के लिए एक अच्छा8805; 7 reproducibly प्राप्त की है। शाही सेना गुणवत्ता हासिल सेल प्रकार विशिष्ट शाही सेना seq के लिए उपयुक्त था, लेकिन apomictic केंद्रीय सेल, synergid सेल, या apomictic प्रारंभिक सेल में नहीं 236 जीनों apomictic अंडा सेल में व्यक्त की पहचान के लिए अग्रणी है, और न ही कोशिकाओं या में Arabidopsis thaliana के परिपक्व यौन gametophyte (चित्रा 5) 7।
चित्रा 1:। प्रोटोकॉल के इस कदम की योजना, कम से कम समय चरण प्रति आवश्यक संकेत फिक्सेशन फूल या ब्याज के ऊतकों की रात भर किया है। अगले दिन, एम्बेडिंग शुरू कर दिया है, जो प्रोटोकॉल का 3 दिन में एम्बेडेड सामग्री में जिसके परिणामस्वरूप रात पर चलाता है। दिन में 3 microtome मोम ब्लॉक में एम्बेडेड नमूनों से शुरू वर्गों उत्पन्न किया जा सकता है। पतली आयल वर्गों के रिबन स्लाइड पर मुहिम शुरू की और रात भर सूखने के लिए छोड़ दिया जाता है। परलैम के कई दिनों के लिए ई एक जैविक को दोहराने के लिए पर्याप्त सामग्री प्राप्त करने के लिए आवश्यक हो जाएगा। शाही सेना अलगाव और गुणवत्ता नियंत्रण के बाद, शाही सेना seq के लिए पुस्तकालय तैयारी transcriptome विश्लेषण तैयार करने के लिए किया जा सकता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2: अंडे की कोशिकाओं महिला gametophyte की विशेषता आकृति विज्ञान (ए) परिपक्व महिला gametophyte (Polygonum प्रकार) के योजनाबद्ध ड्राइंग (बी - सी) के कारण, पतली वर्गों में स्पष्ट रूप से पहचाने जाने योग्य हैं में महिला gametophytes शरण बीजाणु के माध्यम से पतली वर्गों।। Boechera divaricarpa। अंडा सेल में स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहे हैं। ई, synergids:: S महिला gametophyte की आकृति विज्ञान बार नहीं सभी प्रकार की कोशिकाओं (अंडा सेल के कारण, केंद्रीय सेल: सीसी) एक एकल खंड में दिखाई दे रहे हैं। स्केल सलाखों = 50 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3. Boechera divaricarpa। ए के अंडा सेल और बी के परिपक्व gametophyte की सी धारा के लैम और, बी और डी से पहले 7 माइक्रोन पर divaricarpa, लेजर डिवाइस (अंडा सेल: ई, synergids: एस, केंद्रीय सेल: सीसी) के साथ microdissection के बाद। स्केल सलाखों = 50 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
<strong> चित्रा 4. आरएनए लेजर-विच्छेदित अंडे की कोशिकाओं और नियंत्रण वर्गों की गुणवत्ता। (ए) शाही सेना गुणवत्ता नियंत्रण के रूप में एक ही स्लाइड से काटा (बी) बड़ा ऊतक क्षेत्रों की तुलना में अंडा सेल वर्गों से विश्लेषण किया जाता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
Apomictic और यौन परिपक्व gametophytes या की कोशिकाओं की तुलना में केवल Apomictic अंडा सेल में व्यक्त जीनों की पहचान चित्रा 5. Apomictic प्रारंभिक सेल। 236 apomictic अंडा सेल में व्यक्त जीनों लेकिन न तो apomictic केंद्रीय कक्ष में, synergid सेल के हीटमैप बी का या apomictic प्रारंभिक सेल gunnisoniana है और न ही ए के परिपक्व यौन gametophyte की कोशिकाओं थालिअना 7 श्रेणीबद्धनमूने और जीन की क्लस्टरिंग इयूक्लिडियन दूरी और श्रेणीबद्ध agglomerative क्लस्टरिंग पर आधारित था। लाल उच्च अभिव्यक्ति और काले कम अभिव्यक्ति को दर्शाता है। रंग पंक्ति प्रति पहुंचा रहे हैं। एपीओ:। apomictic यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
प्रोटोकॉल अलग सेल और ऊतक प्रकार के लिए उपयुक्त है
Transcriptome के साथ संयुक्त लैम प्रोटीन या द्वारा विश्लेषण शाही सेना Seq एक महत्वपूर्ण उपकरण विकास या शारीरिक प्रक्रियाओं को विनियमित करने 7-11,13,14 जीन गतिविधि के विशिष्ट पैटर्न में अंतर्दृष्टि हासिल करने के लिए है। हालांकि, किसी भी प्रकार की कोशिका के लिए इस विधि की उपयुक्तता गंभीर रूप से संरचनात्मक मुद्दों पर निर्भर है। सेल स्पष्ट रूप से दिखाई और सूखी लैम के लिए इस्तेमाल किया वर्गों में स्पष्ट रूप से पहचाने जाने की जरूरत है। Boechera divaricarpa में, gametophyte की आकृति विज्ञान अंडा सेल (चित्रा 2, चित्रा 3) के एक आसान पहचान के लिए अनुमति देता है। अंत में, एक विशेष सेल आबादी के अलगाव की गति भी आवृत्ति, जिस पर सेल प्रकार एक स्लाइड पर पाया जा सकता है, स्लाइड्स का आदान प्रदान और नई स्लाइड स्कैनिंग के रूप में पर निर्भर करता है समय लेने वाली कदम उठाए हैं। कि सेल के प्रकार पर निर्भर देखते हुए कम से कम 200 - 250 सेल संप्रदायआयनों नमूना प्रति जमा किया जाना चाहिए, एक निश्चित अध्ययन डिजाइन के लिए विधि की उपयुक्तता काफी हद तक लैम कदम के लिए समय की आवश्यकताओं पर निर्भर करता है।
इसके अलावा, ऊतक की आकृति विज्ञान पर निर्भर करता है, यह फायदेमंद संरचना के मामले में होना 6 माइक्रोन के लिए वर्गों की मोटाई कम करने के लिए हो सकता है। इसी तरह, आदर्श ≥ 8 माइक्रोन का मोटा वर्गों आमतौर पर ऊतक वर्गों का एक ही राशि से अधिक है आरएनए मात्रा और थोड़ा उच्च गुणवत्ता की शाही सेना में परिणाम। 10 माइक्रोन लैम संभव से अलगाव बनाने के लिए - इसके अलावा, ब्याज की कोशिकाओं 8 के कम से कम एक व्यास होनी चाहिए।
सिद्धांत रूप में, यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल दूर से संबंधित प्रजातियों से अलग सेल और प्रकार के ऊतकों को समायोजित किया जा सकता है। हालांकि, शाही सेना गुणवत्ता भी एक ही प्रजाति 7,10,13 के विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के बीच भिन्न हो सकते हैं। इस प्रोटोकॉल छोटे और महत्वपूर्ण प्रकार की कोशिकाओं के आधार पर समायोजित किया गया है। इस प्रकार, यह अब एक broade करने के लिए लागू किया जा सकताआगे समायोजन के बिना नमूनों की आर सीमा होती है। प्रोटोकॉल के मामूली संशोधनों फिर भी, आवश्यकता हो सकती है जांच के तहत सेल प्रकार और प्रजातियों पर निर्भर करता है। यह पहली बार दोनों विकल्प fixatives का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है (प्रोटोकॉल 1.1 देखें) जब एक नई प्रजाति या आकृति विज्ञान और शाही सेना गुणवत्ता की तुलना के लिए सेल प्रकार के लिए विधि की स्थापना।
प्रिंसिपल, प्रोटोकॉल के लिए अनुकूलित और लेजर microdissection 9 के लिए उपयुक्त विभिन्न उपकरणों के साथ किया जा सकता है। हालांकि, यह उल्लेखनीय है कि उपकरणों के नमूने की प्रौद्योगिकी के क्षेत्र में, लेजर शक्ति और लेजर बीम कि लागू किया जा सकता है की न्यूनतम चौड़ाई में दोनों भिन्न के रूप में अच्छी तरह से की जरूरत है। विशेष रूप से छोटे कोशिकाओं और ऊतकों क्षेत्रों, लेज़रों एक संकीर्ण लेजर पथ में जिसके परिणामस्वरूप के अलगाव के लिए बेहतर अनुकूल हैं। साधन का उपयोग हम लेजर बीम बल्कि ठीक है (~ 1 माइक्रोन व्यापक) और छोटे कोशिकाओं के विच्छेदन की अनुमति देता है। सेल इकट्ठा करने का नमूना प्रौद्योगिकीइलेक्ट्रोस्टैटिक आसंजन से एक चिपचिपा टोपी सतह पर रास छोटे सेल प्रकार और एकल कक्ष वर्गों के अलगाव के लिए विशेष रूप से लाभप्रद है। इस इलेक्ट्रोस्टैटिक प्रभाव से नमूना नुकसान के जोखिम को कम करता है।
आरएनए गुणवत्ता प्राप्त आगे Transcriptional विश्लेषण के लिए महत्वपूर्ण है
सफल शाही सेना Seq पुस्तकालय तैयारी के लिए सबसे महत्वपूर्ण बिंदुओं में से एक शाही सेना गुणवत्ता है। प्रवर्धन किट के कई प्रदाताओं भी कम अखंडता की शाही सेना के लिए अपनी प्रौद्योगिकी अनुकूलित करते हैं, तो प्रोटीन या शाही सेना Seq द्वारा transcriptome विश्लेषण के बाद प्राप्त आंकड़ों की गुणवत्ता आम तौर पर इनपुट शाही सेना की गुणवत्ता के साथ बढ़ जाती है। इस स्थापित प्रोटोकॉल का प्रयोग, महिला प्रजनन ऊतकों के विकास के विभिन्न चरणों के लिए अच्छा है और अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य शाही सेना गुणवत्ता और Arabidopsis और Boechera में germline प्राप्त किया गया था (जैसे, चित्रा 4)। जबकि विधि लागू हैयह भी अधिक दूर से संबंधित प्रजातियों (जैसे, टमाटर, अप्रकाशित) के लिए, यह उदाहरण के लिए, कि छोटे अनुकूलन या संशोधन प्रजातियों, ऊतक प्रकार के आधार पर आवश्यक हो सकता है ध्यान में रखा जाना करने के लिए, और के रूप में भी प्रयोगशाला वातावरण की जरूरत है, एक उच्च आर्द्रता स्लाइड तैयार करने और लैम के दौरान शाही सेना अखंडता समझौता हो सकता है।
प्रोटोकॉल के दौरान एक महत्वपूर्ण कदम स्लाइड्स के नमूने युक्त sectioned मोम धारियों के बढ़ते है। इधर, विशेष रूप से पानी के लिए संपर्क एक महत्वपूर्ण कदम है। EtOH से पानी की जगह के बाद अलगाव (अप्रकाशित) आरएनए अखंडता के किसी भी महत्वपूर्ण सुधार में परिणाम नहीं करता है, मेथनॉल द्वारा पानी के प्रतिस्थापन है। हालांकि, मेथनॉल केवल रासायनिक हुड के नीचे और बड़ी सावधानी से नियंत्रित किया जाना चाहिए। , नमूना प्रकार पर निर्भर करता मेथनॉल के उपयोग के लिए एक विकल्प के रूप में, पानी के साथ बढ़ते के बाद सूखने बार भी उतना ही अच्छा आरएनए गुणवत्ता में जिसके परिणामस्वरूप ~ 2 घंटा (3.3.3.1 देखें) को कम किया जा सकता है।शाही सेना गुणवत्ता या तो पानी या सेल प्रकार और ब्याज की प्रजातियों के लिए मेथनॉल पर बढ़ते द्वारा हासिल परीक्षण करने के लिए एक परीक्षण के प्रदर्शन के लिए एक नई परियोजना की शुरुआत में सिफारिश की है।
लैम Transcriptional विश्लेषण के लिए एक शक्तिशाली प्रौद्योगिकी है
अंत में, हम सफलतापूर्वक अनुकूलित और लैम और प्रोटीन और आरएनए Seq Arabidopsis thaliana में और Boechera एसपीपी में यौन और apomictic germline वंश की विभिन्न कोशिकाओं को सेल प्रकार विशिष्ट transcriptome विश्लेषण के संयोजन आवेदन किया है।, इस प्रकार तुलनात्मक विश्लेषण ट्रांसक्रिप्शनल की इजाजत दी 7,11,13,14 (भी चित्रा 5 देखें)। विधि वर्णित लाभ के एक नंबर भालू अन्य प्रौद्योगिकियों सेल प्रकार विशिष्ट transcriptional विश्लेषण की अनुमति की तुलना में। महत्वपूर्ण बात है, सेल प्रकार या अनुभाग में ब्याज के ऊतकों की recognizability पर निर्भर करता है, यह दोनों मॉडल की दुर्लभ प्रकार की कोशिकाओं के लिए लागू किया जा सकता हैऔर इस तरह Boechera एसपीपी। में परिपक्व महिला gametophyte की कोशिकाओं के रूप में गैर मॉडल प्रजातियों, या यह भी सेलुलर डोमेन, जैसे, कोशिकाओं 19 के ध्रुवीय हिस्सों को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इसी तरह के अनुप्रयोगों अन्य तरीकों कि कोशिकाओं या नाभिक (FACS / प्रशंसक) 10 के फ्लोरोसेंट सक्रिय छँटाई पर भरोसा के साथ संभव नहीं होगा।
विधि की एक बड़ी खामी समय की आवश्यकता है। निर्धारण और एम्बेडिंग समय पर हाथ बढ़ाया है, जबकि यह नहीं है की आवश्यकता होती है और इसके साथ ही फूलों की एक बड़ी राशि है, लैम के लिए किया गया सकते हैं के रूप में इस तरह के 3 सप्ताह के लिए बहुत समय लेने वाली और एक सेल प्रकार विशिष्ट विश्लेषण के लिए, आम तौर पर 3 दिनों का है लैम (लेजर माइक्रोस्कोप में प्रति दिन औसतन 5 घंटा पर) की योजना बनाई जानी चाहिए। इस संबंध में, यह ठीक से अध्ययन डिजाइन करने के लिए लक्षित विशेष सेल प्रकार के अलगाव की गति के लिए कुछ पूर्व परीक्षण करने के लिए उपयोगी है। इसके अलावा, यहां तक कि जब यह अनुकूलित प्रोटोकॉल का उपयोग, परीक्षणों शाही सेना गुणवत्ता अत्यधिक फिर से परीक्षण करने के लिए कर रहे हैंकी सराहना की।
सारांश में, लैम व्यक्ति प्रकार की कोशिकाओं या कोशिकाओं के भी उप डोमेन का संकल्प है, जो वैकल्पिक मौजूदा तरीकों का प्रयोग कर प्राप्त नहीं किया जा सकता है पर ट्रांसक्रिप्शनल विश्लेषण के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है। इस संबंध में, यह जबरदस्त क्षमता भालू एक बहुत ही उच्च अस्थायी और स्थानिक संकल्प के साथ विकास की प्रक्रिया का विश्लेषण करती अनुमति देने के लिए, उदाहरण के लिए,। यह Arabidopsis और Boechera 7,11,13,14 में यौन और प्रजनन apomictic के सभी महत्वपूर्ण कदम पर कोशिकाओं के transcriptomes के विश्लेषण के द्वारा उदाहरण था।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol | VWR | 1,009,861,000 | absolute EMPROVE Ph Eur,BP,USP |
| 15 ml falcon centrifuge tubes | VWR | 62406-200 | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent | G2939AA | |
| Acetic Acid | Applichem | A3686,2500 | 100% Molecular biology grade |
| Ambion Nuclease free water | life technologies | AM9932 | |
| ASP200 S | Leica | 14048043624 | tissue processor |
| black cardboard | can be purchased in special paper shops | ||
| DNA- and RNAse-free Frame Slides | Micro Dissect GmbH | 1, 4 µm PET-membrane; can also be purchased from Leica | |
| Dumond Forceps | Actimed | 0208-5SPSF-PS | |
| ethanol lamp | |||
| exsiccator | Sigma-Aldrich | Z354074-1EA | Nalgene Vaccuum Dessicator or similar equipment |
| filter tips 10 µl | Axon Lab AG | AL60010 | can be replaced by similar tips |
| filter tips 1,000 µl | Axon Lab AG | AL60010 | can be replaced by similar tips |
| filter tips 20 µl | Axon Lab AG | AL60020 | can be replaced by similar tips |
| filter tips 200 µl | Axon Lab AG | AL60200 | can be replaced by similar tips |
| forceps precision | VWE | 232-1221 | |
| glass slide holder | Huber & Co.AG | 10.0540.01 | Färbekästen nach Hellendahl |
| glass staining trough | Huber & Co.AG | 10.0570.01 | Färbekasten |
| Heated Paraffin Embedding Module Leica | Leica | Leica EG 1150 H | blocking station, similar devises are suitable |
| Heating and Drying Table | Medax | 15501 | other models and/or suppliers are suitable |
| ice bucket | VWR ice bucket with lid | 10146-184 | similar buckets equally suitable |
| light table | UVP An Analytical Jena Company | TW-26 | white light transluminator |
| microscope slide | Thermo Scientific | 10143562CE | cut edges |
| microtome blade | Thermo Scientific | FEAHS35 | S35 microtome blade disposable |
| MMI Cell Cut Plus Instrument | MMI (Molecular Machines and Industries) | ||
| Non-stick, RNAse free Microfuge tubes, 2 ml | life technologies | AM12475 | |
| Paraplast X-TRA | Roth | X882.2 | for histology |
| PicoPure RNA Isolation Kit | life technologies | KIT0204 | Arcturus PicoPure RNA Isolation Kit |
| plastic balancing trays | Semadeni AG | 2513 | |
| plastic box | Semadeni AG | 2971 | Plastikdose PS |
| plastic lid for heating plate | homemade | ||
| preparation needle | VWR | 631-7159 | |
| RNA 6000 Pico Kit | Agilent | 5067-1513 | |
| RNAse free microfuge tubes | life technologies | AM12400 | |
| RNAse ZAP Decontamination Solution | life technologies | AM9780 | |
| Semi-automated Rotary Microtome | Leica | RM2245 | similar devices are equally suitable |
| Tissue Loc Histo Screen Cassettes | Thermo Scientific | C-1000_AQ | similar cassettes of other suppliers are suitable |
| Tubes with adhesive lid, without diffusor 500 µl | MMI (Molecular Machines and Industries) | 50204 | |
| Xylol (Isomere) ROTIPURAN | VWR | 4436.2 | min. 99%, p.a., ACS, ISO SP |
| process embedding cassettes | Leica | 14039440000 | Leica Jet Cassette I without lid |
| Universal Oven | Memmert | UF55 | other models and/or suppliers are suitable |
References
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