Introduction
Doku seviyesinde yapılan transkripsiyon çalışmalarda, son derece özel ama nadir hücre tiplerinin transcriptomes genellikle daha bol çevreleyen hücreler tarafından maskelenir. Bu son derece özel hücre tipleri için bir örnek, bitkilerde dişi üreme soy (tohum çizgisi) hücreleri bulunmaktadır. Kadın germ çiçek 1,2 dişi organ içinde, gelişmekte olan Yumurtacığa içinde tohum öncülerini belirtildi. megaspor anne hücre (MMC) kadın germline ilk hücresidir. Bu düşük megasporların bir tetrad oluşturulması için mayoz maruz kalır. Bir Sinsityum içinde, yani Tipik olarak, bu megasporların sadece biri hayatta ve sitokinez olmadan mitotik böler. Üç zıtlar iki synergid hücreleri, yumurta ve merkezi hücre: Bu mitoz tipik olarak dört hücre tipleri oluşur olgun gametofit oluşturmak üzere Hücreselleştirmeden tarafından takip edilmektedir. Yumurta ve merkezi hücreler dou sırasında iki sperm hücreleri tarafından döllenir olsun dişi gametlerin vardırble gübreleme gelişmekte tohum 1,2 embriyo ve endosperm yol vermek. 80 tohumlar yakından ilgili cinsi Boechera içinde çiçek başına geliştirmek - yaklaşık 50 iken cinsel model sistem Arabidopsis thaliana olarak, sadece ~ 50 tohum çiçek başına gelişir. Bu nedenle, kadın germ böyle hücre özellikleri ve farklılaşma gibi gelişim süreçlerini incelemek için mükemmel bir model yapma, sadece birkaç derece uzmanlaşmış hücre tipleri oluşur.
Ayrıca, bitki üreme yöneten gen düzenleyici süreçlerine anlayışlar uygulamalı bir değer olabilir. Bitkilerde, tohumlar (Apomiksisin) aracılığıyla hem cinsel ve eşeysiz üreme oluşabilir. eşeyli üreme popülasyondaki genetik çeşitliliği oluşturur iken, anne bitki genetik olarak özdeş olan klonal yavrular oluşmasına yol açar apomiksis. Bu nedenle, apomiksis bile karmaşık anne genotipler can, tarım ve tohum üretimi uygulamaları için büyük bir potansiyele sahiptirbirkaç kuşak 3,4,5 üzerinde değişmeden muhafaza edilmesi. Apomiksis doğal olarak herhangi bir önemli bitki türlerinde oluşmaz, çünkü ürünlerde Apomiksisin mühendislik büyük ilgi 3,4,5 taşımaktadır. Ancak, bu uzun vadeli bir hedef Apomiksisin altta yatan genetik ve moleküler temeli yeterli detayda 6 anlaşılır değildir, çünkü elde etmek zordur.
Lazer yardımlı mikrodiseksiyon (LAM) ve yeni nesil dizileme (NGS) kullanarak apomiktik üreme, hücre tipine spesifik transkripsiyonel profilleme düzenleyen transkripsiyon bazda içgörüler kazanmak için çok güçlü bir yaklaşım 7,8 temsil etmektedir. LAM ilk hayvan ve biyomedikal araştırmalar için kurulmuştur. Son birkaç yıl içinde LAM bitki biyolojisi 6,9,10 uygulanmıştır. Tek tek hücre ve doku tiplerinin profil sağlayan diğer yöntemlerin aksine, LAM markör hatları 6,9,10 üretilmesini gerektirmez. Bu nedenle, uygulama olabilirönceden moleküler bilgisi olmadan herhangi bir hücre veya doku tipine yalan. LAM diğer bir avantajı, hücre konumu ve / veya yapısal özelliklerine göre, kuru bölümlerde kabul edilebilir gibi sürece, herhangi bir hücre tipinde uygulanabilir olmasıdır. LAM işlem esnasında transkripsiyonel profili değişiklikleri önler sabit dokular kullanılan ek bir avantaja sahiptir.
Çevrede, örneğin, çiçek dokusu dokusu, önceden parafın balmumu içine yerleştirilmeden olmayan bir çapraz bağlama sabitleyici sabitlenmiştir. Parafin gömme kurulan protokolleri 9,11 aşağıdaki elle yapılabilir. Ancak, balmumu ile dehidratasyon ve infiltrasyon için otomatik doku işlemci kullanımı genellikle RNA kalitesi ve doku morfolojisi korunması açısından yüksek tekrarlanabilirlik ile sonuçlanır. Reçine dokuların gömme alternatif strateji de başarılı bir LAM 8 hücre tip spesifik analizler için kullanılmıştır. Bununla birlikte, bir autom kullanımıBirçok örnekleri kez zamanında eller en az gerektiren işlenebilir olarak mum gömmek için ated doku işlemci, çok zaman etkilidir. RNA kalitesi, tipik olarak önemli bir kayıp tespit ve gömme sırasında ortaya birlikte, mikrotom ile kesitlerin hazırlanması ve özellikle LAM kullanılan frameslides montaj RNA kalitesinin korunması için kritik bir aşama olarak kalır. Bu, daha önce not edilmiştir ve bir bant transfer sisteminin kullanımı, bu aşamada 12, daha iyi bir RNA kalitesi elde etmek tarif edilmiştir. Bununla birlikte, bu preparatların hazırlanması sırasında ilave bir zaman alan bir adım ekler ve özel ekipman gerektirmektedir. Aşağıda açıklanan optimize edilmiş protokol tekrarlanabilir GeneCHIPs ve Yeni Nesil Dizi (NGS) 7,11,13,14 yaklaşımları ile transkripsiyonel profilleme için yeterli kalitede RNA üretir. Buna ek olarak, kullanılan lazer mikrodiseksiyon mikroskobu ile izole edilmiş, hücre tipleri, yüksek saflıkta yatağından olaninely 7,11,13,14 üretti.
Cins Boechera apomiktik üreme kilit adımları incelemek için mükemmel bir model sistemidir. Boechera, farklı cinsel ve apomiktik katılımların çeşitli tanımlanmıştır ve Karşılaştırmalı için kullanılabilir 15,16,17 analiz eder. Cinsel Arabidopsis ve apomiktik Boechera Kadın germline hücrelerin hücre tipine spesifik transcriptomes bir karşılaştırma olarak, bu şekilde 7 apomiksis yöneten düzenleyici süreçlerin yeni yönlerini tanımlayan farklı şekilde ifade edilen genleri ve yolların tespit edilmiştir. Buna ek olarak, bu çalışma hücre tipine spesifik transkripsiyonel Lam uygunluğunu küçük ve nadir hücre tiplerinin analizi sunmaktadır. Daha önce bitki türlerinin çeşitli farklı hücre tiplerinin analizi için bu protokol kullanılır, ancak türlerin ve protokole dokuya özel modifikasyonları, bazı durumlarda gerekli olabilir var.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Not: Bu protokol, doku hazırlanması, lazer yardımlı mikrodiseksiyon ve transkripsiyon profilleme için RNA çıkarma açıklanır. Her zaman protokol tüm adımları boyunca eldiven kullanın. Eğitim ve kullanılan her kimyasal için güvenlik talimatlarını dikkate alın. Xylol zararlıdır ve eldiven nüfuz edebilir ve bu metanol toksik olması, özellikle unutmayın. kullanılan tüm araçlar için, buna göre kullanıcı kılavuzlarına başvurun.
Züccaciye ve Diğer Ekipman gelen RNAse Faaliyet 1. Kaldırma
- Kullanımdan önce önce, RNaz içermeyen kalitesini sağlamak için 180 ° C'de ~ 8 saat boyunca pişirme için alüminyum folyo ile bir cam sarın.
- Herhangi bir metal yüzeyleri tedavi (örn cımbız çifti) yanı sıra çalışma tezgahı ve uygun bir RNaz dekontaminasyon solüsyonu ile ısıtma plakası. Daha sonra, dekontaminasyon çözüm kaldırmak için RNAse içermeyen su ile yüzeyleri yıkayın. Daha sonra,% 70 EtOH ile daha yüzeyleri temizlemek.
- Tüm plas kullantik sarf malzemeleri (örneğin, borular) yepyeni herhangi ön işleme tabi tutulmadan. Varsa, ücretsiz RNAse için sertifikalı plastik sarf malzemelerini kullanın.
2. Doku Fixation
- çiftçi sabitleyici 10 ml hazırlama (3: 1; hac / hac etanol: asetik asit), buz üzerinde yeni bir 15 ml tüp içinde. (Kullanmadan önce her zaman taze Çiftçi fiksatif hazırlamak). Bir alternatif olarak, non-çapraz bağlama sabitleyici etanol: asetik asit (5: 1; hac / hac) 18 kullanılabilir.
- ilgi gelişme aşamasında tomurcukları toplamak için cımbız ince bir çifti kullanın. Hemen buz gibi soğuk fiksatif tomurcukları daldırın. ~ Tespiti için Arabidopsis veya Boechera 20 tomurcukları veya çiçek sabitleştirici 10 ml kullanın Not:. Öncesinde tespitin daha küçük parçalar üretmek için bir jilet ile çiçek incelemek için tavsiye edilir büyük çiçekler ile bitki türlerini kullanırken.
- inflor 3 büyük çiçek tomurcukları - olgun gametofitleri elde etmek için, 2 emasculatehasattan önce 2 gün Escence.
- buz ile bir kurutucu alt doldurun. Ya doğrudan onlar üzerinden düşmeyecek şekilde buz içine koyarak veya uygun bir tutucu kullanarak, örnekleri, örneğin, çiçek içeren tüpler açın ve buz koyun. Vakum vakum serbest bırakmak için önce 15 dakika boyunca sızmak.
- 15 dakika boyunca bir kez vakum süzmesi tekrarlayın.
- buz üzerinde vakum ve mağaza gecede (~ 12 saat) bırakın. Bir kapak veya alüminyum folyo ile buz kovası Kapak ve çözülme buz önlemek için bir 4 ° C oda veya buzdolabında kova saklayın. Not: fiksasyon süresi uzatılması tavsiye edilmez.
3. Doku Gömme, İnce Kesit ve LAM için Slaytlar Montaj
- Doku gömme.
- Saf etanol ve RNAse içermeyen su ile hazırlanmış,% 70 etanol ile fiksatif değiştirin. daha sonra işlenene kadar buz üzerinde örneklerin bırakın. embe başlatNumunelerin dding gün. Hiçbir doku işleme makineleri mevcuttur durumda, başka bir yerde 9,11 açıklandığı gibi manuel gömme devam ve adım 3.1.11 ile devam edin.
- Yavaşça bir cımbız ile doku gömme kasetler örnekleri aktarın. Sıkıca kasetleri kapatın. KRİTİK ADIM: Bu kademe sırasında numunenin da kısmen kurumasını önlemek. cımbız ile numunelerin sıkmaktan kaçının.
Not: ideal kaset eğimli yüzeyinde yazarak, bir kalem kullanılması gereken kasetleri etiketlemek için. - Tüm malzemeler kasetleri aktarılır ve gömme makinesi yüklenebilir kadar% 70 etanol içinde tomurcuk veya çiçek yüklü gömme kaseti saklayın. Bu amaçla,% 70 etanol ile dolu cam boyama oluk kullanımı.
- Makinenin imbikten doku işlemci sepeti çıkarınız ve üst bakan eğimli yüzeyler ile ve aynı yönde sepete gömme kasetleri aktarın. CRIKortikal ADIM: dokuların herhangi kurumasını önlemek için hızlı bir şekilde bu gerçekleştirin. aynı anda bir çok gömme kasetleri işleme durumunda, önceden örnekleri yükleme% 70 etanol ile dolu uygun bir RNazsız kaba sepeti yerleştirin.
- sepet kapağı koymak ve imbik geri sepet koyun. imbik kapatın.
Not: Doku işlemci otomatik numune kurutur Ksilol için çözücü değiştirir ve erimiş parafin mumu ile sızma yapar. Tipik haliyle, bu gece boyunca yapılır. - Doku işlemci programı başlatın. Tavsiye edilen standart ayarlar infiltrasyonu, ardından 1 saat% 70 EtOH, üç kez 1 saat% 90 EtOH, üç kez 1 saat% 100 EtOH, iki katı 1 saat% 100 Xylol, bir kez 1 saat, oda sıcaklığında 15 dakika% 100 ksiloldür iki kez 1 saat ve 56 ° C'de 11 de 3 saat bir süre için, parafin mumu ile.
Not: Engelleme istasyonu erimiş balmumu ile hazır olmasını sağlamak için, başlamadan önce birkaç saat makineyi açmak veyayaklaşık başlangıç zamanı seçmek için zamanlayıcı işlevini kullanın.
Not: durumda doku 56 ° C'de yerine 3 saat arasında 56 ° C'de, hemen ardından olası parafın balmumu uzun inkübasyon süreleri olan işlenemez. Cihazın kullanım kılavuzuna başvurun. "Boş imbik" komutu onaylanana kadar Tipik olarak, dokularla kasetleri otomatik olarak erimiş mum içinde kalır. Doku işlemci başlatırken balmumu erimiş değilse, imbik% 70 etanol ile doldurulur ve başlamak için hazır olana kadar programın beklemede kalır. - imbikten boşaltın ve hemen bir engelleme istasyonunda 56 ° C'de parafin banyosu örnekleri aktarın. sepet kapağını kaldırın ve kapağı ile engelleme istasyonunun parafin banyosu kapsamaktadır.
- sepete kasetleri olduğu gibi bloke istasyonu yüzeyinde Kazık kadar taze dengeleme bölümleri 56 ° C'ye kadar ısıtıldı.
Not: Bir etanol dayanıklı kalıcı marker kullanmak olabilird dengeleme tepsileri alt etiketlemek için. Aseton dayanıklı kalıcı belirteçler tavsiye edilmez. - bloke istasyonu kullanılarak, 56 ° C'de eritilmiş parafin mumu ile önceden ısıtılmış taze plastik dengeleme tepsi doldurun. , Parafin banyosu kapağını kaldırın bir seferde sadece tek bir kaseti pick up ve bir cımbız kullanarak dengeleme tepside 56 ° C'de sıvı parafin balmumu kasetlerden örnekleri aktarın.
KRİTİK ADIM: hızlı çalışarak kaseti işlerken örnek çevreleyen balmumu herhangi sertleşmesini kaçının.- balmumu sertleşmeden önce bir hazırlık iğne kullanılarak ihtiyaçlarına göre tüm örnekleri yerleştirin. Tipik olarak, çok sayıda çiçek her bir yönde yaklaşık 1 cm aralıklı dengeleme tepsi şeklinde düzenlenmiştir.
- Tüm örnekler aktarılır kadar adımı tekrarlayın 3.1.9.
- geri doku işlemciye sepet koyun ve uygun bir program (kullanım kılavuzuna bakın) kullanarak imbik temizleyin.
- Doku işlemci ve engelleme istasyonu kapatın. Adım 3.1.13 ile devam edin.
- durumda, herhangi bir doku infiltrasyonu makinesi ve hiçbir gömme istasyonu mevcuttur, 56 ° C'de parafin eritmek için bir ısıtma fırını kullanımı. bankta, plastik dengeleme tepsiler içinde erimiş balmumu doldurmak balmumu örnekleri aktarmak, ve örnekleri konumlandırmak için hazırlık iğne kullanın.
- 4 ° C'de depolamadan önce numune 3 saat - parafin ~ 1, oda sıcaklığında sertleşmeye izin verin. Numuneler, daha sonra taze işlenmiş ya da birkaç aya kadar saklanabilir.
- LAM için ince kesit ve slaytlar hazırlanması.
- aşağıdan mum blok aydınlatan bir ışık Masanın üzerinde, çevredeki plastik tepsiler alınan numuneler ile parafin mumu kaldırın. , Doku içeren bir kare mum blok parçalara ayır örn., Bir RNAse ücretsiz jilet kullanarak bir tomurcuk veya çiçek. Bu amaçla, her zaman mum blok üst kısmına doğru örnekleri yönlendirmek (ayrıca bkz
- Aynı anda LAM için kullanılması gereken tüm örneklerin mum blok hazırlayın.
- aşağıdan mum blok aydınlatan bir ışık Masanın üzerinde, çevredeki plastik tepsiler alınan numuneler ile parafin mumu kaldırın. , Doku içeren bir kare mum blok parçalara ayır örn., Bir RNAse ücretsiz jilet kullanarak bir tomurcuk veya çiçek. Bu amaçla, her zaman mum blok üst kısmına doğru örnekleri yönlendirmek (ayrıca bkz
- sertleştirilmiş parafin ile dolu kasetleri gömme işlemek için bloklar takın: Bir Etanol lamba kullanılarak uygun bir spatula ucunda küçük bir parça veya parafin mumu damlacık eritmek ve gömülü dokuları ile (destek bloğu düzeltmek için sıcak balmumu kullanın üstte).
- bal mumu, 4 ° C'de en az 20 dakika boyunca sertleşmeye izin verin.
- Işık masaya bir jilet ile örnek çevreleyen artı balmumu çıkarın. Paralel kenarları (Şekil 1) ile bir kare yüzey tutmak için emin olun.
- 42 ° C'ye kadar ısıtma plakası ayarlayın.
- Güvenle microtome örnekleri montaj ve 6 hazırlamak - 10 mikron kalınlığında kesitler. mikrotom kullanılarak için üreticinin talimatlarına bakınız. Not: ince kesitler genellikle daha iyi yapısal çözünürlük, highe RNA büyük miktarda verecektir ikenR kalitesi daha kalın bölümleri ile elde edilebilir. Boechera hücreleri gametofitleri olgun için biz varsayılan olarak 7 mikron kullanın. mikrotom bıçak üzerinde örnekleri ile oldukça yavaş hareket eden genellikle daha iyi histoloji ile sonuçlanır.
- LAM slaytlar onları yerleştirmeden önce alt kısmında siyah karton plastik bir kutu içine 15 cm - Her zaman yaklaşık 10 bir uzunlukta parafin kurdeleler aktarın.
- Eğer mümkünse, bir diseksiyon-kapsamında, örneğin faiz hücreye veya doku tipleri, ovüllerin içeren parafin şeritler parçaları önceden seçmek ve gerisini atın.
- ısıtma plakası üzerinde üstüne düz bir yüzeye sahip - metal çerçeveli slaytlar gerekli miktarda (10 genellikle 5) yerleştirin.
- Pipet ~ 1 - sürgünün plastik parça üzerine RNazsız su 2 mi. plastik pencereler span yeterince uzun 5 cm - Bir jilet kullanarak, yaklaşık 4 kısa parçalara parafin kurdeleler kesti. UBir cımbız ve ideal parafin şeritler slaytlar plastik pencereler birbirine paralel yerleştirmek için bir hazırlık iğne se. Dikkatle suyu çıkarmak ve geri slaytlar yerleştirmek için bir ucunda slayt kaldırın.
- Seçenek olarak ise, kimyasal bir başlık altında ısıtma plakası yerleştirin. yüzeyinin nemlendirilmesi için yetecek sürgünün plastik kısmına küçük bir metanol hacmi halinde (bu slaytlar hafif dalgalı neden olur). slaytlarda parafin şeritler yerleştirin.
Not: mümkünse toksisite nedeniyle, metanol kullanımını önlemek. Ancak, bu aşamada metanol kullanımı su monte edilmesi ile elde edilen kalite yetersiz olması durumunda, RNA kalitesini artırmak yapar. elde edilen RNA kalitesi soruşturma altında hücre tipi ve türler ile değişir gibi, yeni bir proje başlangıcında bu alternatifleri test faydalıdır.
- Seçenek olarak ise, kimyasal bir başlık altında ısıtma plakası yerleştirin. yüzeyinin nemlendirilmesi için yetecek sürgünün plastik kısmına küçük bir metanol hacmi halinde (bu slaytlar hafif dalgalı neden olur). slaytlarda parafin şeritler yerleştirin.
- ~ 12 saat boyunca 42 ° C'de bir gece boyunca ısıtma plakası üzerinde slaytlar kurutun. ısıtma plakası Kapakslaytlar dokunmaz bir plastik kapak. plastik kapak hava değişimini önlemek olmadığından emin olun. Bu kapak amacı pipet kutuları veya benzeri üzerine yerleştirilebilir için kaldırılması gerekir.
- Seçenek olarak ise, iki saat en az ya da doku tamamen kuru görünene kadar kuruma süresini azaltır. koleksiyona dilimleme zaman azaltılması RNA kalitesini artırabilir.
- Bir kimyasal Kaputun altında, de-mum slaytlar uygun slayt tutucuları kullanarak ksilolde 10 dakika süreyle 2 kez. Tamamen kuru tutulur metal çerçeve geniş ucunu dokunarak slayt çıkarılmasını sağlamak için sadece değil, her slaytın plastik parçayı batığın emin olun.
- slaytlar LAM öncesinde kimyasal başlık altında ~ 10 dakika kurumasını bekleyin.
Not: hemen işleme değil Slaytlar doku bir kaç saat kadar için yukarı bakacak şekilde 42 ° C'de geri ısıtma plakası üzerine yerleştirilebilir. Bu daha fazla işlem kadar RNA kalitesinden ödün gelen herhangi bir nem önleyecektir.
4. Lazer yardımlı mikrodiseksiyon (LAM)
Not: LAM için prosedür kullanılan alet ile değişecektir. Bu protokolün bazı detayları belirli bir alet ve elektrostatik kuvvetlerin bir kapak yapma kullanımı örnek toplamak teknolojiye uyarlanmıştır. Buna ek olarak, ayrıntıları bile yazılımın farklı sürümleri arasında değişebilir. ayrıntılı bir açıklama ve enstrüman ve yazılım özel talimatlar için üreticinin talimatlarına ve kullanıcı el kitapları başvurun.
- LAM (bilgisayar, mikroskop, lazer kontrol kutusu) için cihazlar üzerinde geçin.
- mikroskop ve lazer direksiyon programını başlatın.
- kontrol kutusu üzerindeki ilgili düğmeye basarak lazer açın.
- kapak tutucu içine (diffusor 0,5 ml) bir kap yerleştirin ve enstrüman konumlandırmak.
- mikroskopi için bir cam slayt ile LAM slayt destekleyin. Emin olun sürgünün düz bir yüzeyeEkli doku cam slayt karşı karşıyadır.
- altında cam slayt ile enstrüman slayt yerleştirin.
- 4X Amaç seçin. Programda, "yukarı" pozisyona kapağı taşımak ve slayt tarama yapmaya devam seçin.
- slayt yoluyla arama ve ilgi yapılarını belirlemek. Bulabilir ve kesme adımı için tam konumuna geri hareket edebilmek için slayt üzerinde konumlarını kaydedin.
- Uygun hedefi (örneğin 40X veya 60X) seçin.
- Gerekirse, lazer hızı, odak ve lazer gücünü ayarlamak ve aynı zamanda aracın kullanım kılavuzuna bakarak sahne hareketi kalibre edin. Bir hesap özel ilgi doku için ayarlandıktan sonra, ayarlar yeniden kullanılabilir.
- ideal doku olmadan zarının bir parçası, programın "lazer atış" düğmesine basarak tek bir atış ile lazer konumunu doğrulayın.
- Gerekirse, inci izleyerek lazer pozisyonunu kalibreenstrüman e üreticinin talimatları.
- basılı sağ fare düğmesini tutarak, monitörde yazılım penceresinin dört bir yanına bariz bir yapıya taşıyarak hedefi kalibrasyonunu doğrulayın. bariz yapısına göre elin pozisyonu dört köşesinden aynı olup olmadığını kontrol edin. Aksi takdirde, yazılım kılavuzuna aşağıdaki amaçları kalibre.
- 'Aşağı' konumunda kap, hücre tipi veya ilgi dokusu, örneğin, yumurta hücresinin sınırlarını işaretlemek için 'el kalem' aracını kullanın. 'Kes' tuşuna basarak lazer ile ilgi hücre parçalara ayır. Not: Genellikle, ihtiyaçlarını kesit tekrarlanması hücre etrafında sınır tamamen seferde disseke olmasaydı. Bu durumda, otomatik olarak bir standart olarak bölümün iki tekrarlar yapmak için yazılım ayarlanması önerilir.
- Kapağı kaldırın ve ilgi yapısı ile bir sonraki kaydedilmiş konuma geçmek. Adımı tekrarlayın 4.13Bir slayttan ilgi tüm hücreleri toplanır kadar prosedürün bir sonraki hücre bölümleri incelemek için. Emin kapak yeni bölüm kap boş pozisyona yapışıyor bir şekilde konumlanmasına dikkat edin.
Not: dokuların büyük parçaları izole edilmesi tavsiye edilir (örneğin, bütün çiçekler ya da parçalarının bölümleri) taze kap tek hücre bölümlerinin izolasyonu sonra her slayt. Bu RNA kalite kontrolü için de kullanılabilir. - slayt çıkarın ve adımları 4.4 tekrarlayarak sonraki slayta devam - 4.14 ile 4.9 ve 4.13.
- tüm slaytlar ilgi hücre tipleri kadar adımı yineleyin 4.15 ve ilgili adımlar izole edilmiştir. Not: ~ 4 daha uzun süre hasat için tavsiye edilmez - Aynı kap 5 saat.
- Görme numunenin spesifik olmayan kirlilikleri dışlamak için LAM sonra kapağı yüzeyini kontrol edin. olmayan disseke dokular folyo ile korunmaktadır iken, toz nedeniyle elektrostatik yapışma yüzeyine sopa olabilir.
- To görsel, kapağı kontrol cihazdan slayt kaldırmak. 'Aşağı' pozisyonunda kapak tutucu yerleştirin ve 4X amacı ile yüzeyi kontrol edin.
- toz küçük parçalar görebilir durumda, küçük bir (2 | il) pipet ile kaldırın. Alternatif olarak, geri enstrüman üzerinde slayt monte slayt (hiçbir dokuların) ücretsiz bir parçası kapağını yerleştirin ve tamamen lazer kullanarak kontaminasyonu yok.
- Yakın kapaklar ve sonraki kullanıma kadar -80 ° C'de kuru bölümler dondurma. Gerekirse, numuneler bir kaç haftaya kadar saklanabilir. Ancak, bu aşamada hızlı bir şekilde işlem yapılarak, tavsiye edilir.
5. RNA İzolasyonu ve Kalite Kontrol
Not: RNA'nın küçük miktarlarda uygun herhangi bir yöntem ile izole edilebilir. Bu protokolde RNA küçük miktarlarda tanımlanan bir RNA izolasyon kiti kullanımı tarif edilmektedir. üreticinin talimatlarına uyun.
- bağlı numune ile tüpleri kullanınkap, ya doğrudan ya da -80 ° C ila çıkarıldıktan sonra.
- tüplerin açık ve dikkatli bir şekilde filtre ipuçlarını kullanarak her bir tüp çeperine ekstraksiyon tamponu 11 ul pipetleyin. örnekler arasındaki ipuçları değiştirin.
- Kapağı kapatın ve tüpün kapağı aşağı ekstraksiyon tamponu sallayın.
- 42 ° C'ye ısıtılmış bir ısıtma fırın içinde aşağı kap tüpleri yerleştirin. imalatçının talimatlarına uygun olarak 30 dakika boyunca inkübe edin.
- Kolon hazırlanması için üreticinin yönergelerini izleyin ve tüplerin alt kısmında özü toplamak.
- tek tek her tüp / cap için 5.1.2 - Birden fazla kap malzeme bir örnek birleştirilebilir gerekiyorsa, adım 5.1.1 ile devam edin.
- (Üreticinin talimatlarına bakınız) sonra, tek bir tüp içinde, bir örnek için özleri havuzu ve EtOH eşdeğer miktarda ilave edilmeden önce, bir pipet ile toplanmış özü miktarını ölçün.
- Emin olun Et miktarıOH Yükleme işleminden sonra kolon toplanmış özü hacmine eşit önce ilave edildi.
- EtOH ile RNA yağış sonrasında, üreticinin talimatlarına aşağıdaki sütunlardan yükleme hızla devam edin. 100 xg santrifüj adımla protokol devam edin.
- Her bir toplama tüpünün içeriği kolonundan geçirildi sonra, akış oranı, aşağıdaki üreticinin talimatlarına kaldırmak için 30 saniye için 16,000 x g santrifüj adımı gerçekleştirmek.
- üreticinin talimatlarına uygun RNA ekstraksiyonu ve saflaştırılması ile devam ediniz.
- sütun elüsyon tamponu Yükleme işleminden sonra kolon, 1 dakika boyunca inkübasyona izin verin. üreticinin talimatlarına talimatları izleyerek santrifüj tüpleri yüklenmeye devam. Not: elüsyondan önce, 100 xg'de 1 dakika boyunca Ek bir santrifüj işleminin elüsyon verimliliğini artırabilir protokolde belirtilen.
- Çürük RNA Özüadımlar bu protokolün 5.2.7 5.1 aşağıdaki RNA kalite kontrolü için Rols (büyük doku bölümleri).
- RNA kalite kontrolü yükü için 1 ul üreticinin talimatlarına aşağıdaki bir RNA Pico Chip kullanarak Bioanalyzer her bir kontrol numunesinin seyreltilmemiş toplam RNA.
Not: ekstre RNA doğrusal amplifikasyon ve mikrodiziler veya RNA-DİZ 7,11,13,14 kullanılarak transcriptome analizi için kullanılabilir. İdeal olarak, kalite kontrol tedarikçi bir dizi amplifikasyonu için uygun kitler sağlar en az 7 arasında bir RNA Bütünlük sayısı (RIN), uygun örnekler 9'da verilmiştir göstermelidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Numune Hazırlama ve LAM Ardıl Adımlar yapılır
Birbirini takip eden bir dizi adım LAM (Şekil 1) tarafından seçilen hücre tiplerinden transkripsiyonel analiz için RNA'nın hazırlanması gerekmektedir. Bu RNA nüfus hasattan sonra değişmeden kalmasını sağlamak için çiçek ve acil tespitin hasat başlar. Doku, sarılır, bölümlere ayrılır ve slaytlar üzerine monte edilir. Bu LAM hücre ve bir ya da birçok kapaklar (Şekil 1) üzerine hücre tipine spesifik bölümlerin birleştirilmesi izolasyonuna izin verir. materyal sonradan dondurulmuş veya doğrudan RNA ekstraksiyon yoluyla işlenebilir. Her ne kadar iki modeli olmayan model tür analizler LAM avantajı hücre tipine özgü için geçerli olduğu için, yöntemin zaman yerine kalır. Bazı durumlarda, daha fazla zaman çalışma en az bir hafta, TI adımları için gerekli olanRNA ekstraksiyonu için ssue hasat (Şekil 1). Bu LAM birkaç gün içinde hasat genellikle bölümler, bir biyolojik numune ve RNA ekstraksiyonu halinde bir araya getirildi dikkate alınması gerekmektedir. 100 ° 'ye kadar bölümler günde izole sahip Boechera yumurta hücreleri için, numune başına en az yaklaşık 200 bölümlerin kullanılması önemle önerilir.
İlgi Hücre Türleri İzolasyonu Kuru bölümlerde kendi Görünürlük bağlıdır
hücre tipine spesifik bölümlerin izole edilmesi protokolü en zaman alıcı bir adımdır. Şimdiye kadar, bu aşamanın herhangi otomasyon sonucu numune karmaşık yapısı için geliştirilmiştir. kuru bölümler düşük kontrast ve bölüm uçağı nedeniyle ovules w farklı açılarda yönlendirilmiş gerçeğine örnekler arasında değişir çünkü bir yazılım aracını kullanarak ilgi hücrelerinin tanımlanması mümkün değildirdoku ithin (Şekil 2). Bununla birlikte, olgun kadın synergids ile Gametofit, yumurta hücresinin ve merkezi hücresi (antipot hücreler döllenme öncesi dejenere) eşsiz morfoloji araştırmacı tarafından yumurta hücreleri (Şekil 3 Şekil 2B, C) açık belirlenmesini sağlar. Gerçekten de, Boechera divaricarpa olarak, yumurta hücresi, genellikle hazırlanması sırasında biraz büzülür ve böylece, çevre dokulardan, yüksek saflıkta (Şekil 2B, C; Şekil 3) yumurta hücresi popülasyonlarının izole edilmesi için avantaj sağlayan bir özellik ayırır.
LAM sonra Cap Gözle Muayene Tavsiye
LAM sonra kapağın yüzeyinin görsel kontrol toz, örnek, örneğin, herhangi bir olası bulaşıcı maddelerin tanımlanmasına izin verir. Buna ek olarak, kendiliğinden sağlamak için yararlıseksiyonlar olarak bazen bölümler işlem sırasında kaybolur, kap sopa. Tipik olarak, çok sayıda seçilmiş bölümleri, örneğin, yumurta hücreleri, LAM birkaç saat sonra tek bir kap görülebilir.
Kurulmuş İş Akışı tekrarlanabilir İyi RNA Kalite Sonuçları
kadın gametofitleri hücre tipine özgü LAM izolasyonlar gelen toplam RNA miktarları sadece düşük ng aralığındadır. RNA Bu sınırlayıcı miktarı gerekli LAM sonra RNA kalite kontrolü için bir yaklaşım olarak her slayt büyük dokulardan izole bir temsilci denetimi kullanmak için yapar. Bu B hücre tipine spesifik RNA bir karşılaştırma ile ortaya konmuştur olarak divaricarpa yumurta hücreleri benzer RNA kalitesini gösteren aynı slaytlar izole büyük doku bölgelerden gelen kontrollere göre (Şekil 4A, B). RIN sayı ve # yüksek RNA kalitesi, bu yöntem kullanılarak, iyi8805; 7 tekrarlanabilir elde edilir. elde RNA kalitesi, ancak apomiktik merkez hücre synergid hücresi ya da apomiktik başlangıç hücresinde apomiktik yumurta hücresi ifade 236 genlerin belirlenmesine yol hücre tipine spesifik RNA SEQ için uygundur, ne de hücre ya da Arabidopsis thaliana olgun cinsel gametofit (Şekil 5) 7.
Şekil 1:. Protokolün Adımlar Programı, Adım başı Gerekli Minimal Zaman belirten Tespit çiçek veya ilgi dokuların bir gecede yapılır. Ertesi gün, katıştırma, başlatıldığında protokol 3. günde gömülü malzemenin sonuçlanan gece boyunca çalıştığı. günde mum blok gömülü örnekleri başlayarak 3 mikrotom bölümleri oluşturulabilir. İnce parafin kesit şeritleri dilimlerin üzerine yerleştirildi ve gece boyunca kurumaya bırakılır. üzerindeLAM birkaç gün e bir biyolojik deney için yeterli malzeme elde etmek için gerekli olacaktır. RNA izolasyonu ve kalite kontrolünden sonra, RNA Sek için kütüphane hazırlık transcriptome analiz hazırlamak için yapılabilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2: Yumurta Hücreleri nedeniyle dişi gametofit Karakteristik Morfoloji (A) olgun dişi gametofit (Polygonum tipi) şematik çizim (B - C), İnce bölümlerde açıkça Tanıtıcı olan kadın gametofitleri barındıran Yumurtacığa ile ince kesitler.. Boechera divaricarpa. Yumurta hücreleri açıkça görülebilir. e synergids: s nedeniyle sık sık dişi gametofit morfolojisi tüm hücre tipleri (yumurta hücresi içinMerkezinden hücresi: cc) tek bir bölümde görebilir. Ölçek çubukları 50 mikron =. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Boechera divaricarpa. A Yumurta hücrelerinin ve B olgun gametofit C. Bölüm Şekil 3. LAM , B ve D ve daha önce 7 mikron de divaricarpa, lazer cihazının (yumurta hücresi: e, synergids: s, merkezi hücre: cc) ile mikrodiseksiyon sonra. Ölçek çubukları 50 mikron =. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
<strong> Lazer Dissected Yumurta hücrelerinin ve Kontrol Bölüm Şekil 4. RNA Kalite. Kontroller aynı slaytlar hasat (B) büyük doku alanlarına kıyasla yumurta hücresi bölümleri analiz olarak (A) RNA kalitesi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
236 apomiktik yumurta hücresinde eksprese edilen genlerin ama ne apomiktik merkez hücre içinde, synergid hücrenin apomiktik ve Cinsel Olgun gametofitleri veya hücrelere kıyasla sadece Apomiktik Yumurta hücrede ifade Genlerin Şekil 5. Kimlik Apomiktik ilk hücre. İlgi haritası , B ya da apomiktik başlangıç hücre gunnisoniana veya A. olgun cinsel gametofit hücreleri thaliana 7 Hiyerarşikörnekler ve genlerin kümeleme Öklid mesafe ve hiyerarşik Aglomeratif kümeleme dayanmaktadır. Kırmızı yüksek ifade ve siyah düşük ifadesini gösterir. Renkler sıra başına ölçeklenir. apo:. apomiktik bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokol Farklı Hücre ve Doku tipleri için uygundur
Transcriptome ile kombine LAM mikroarrayler veya analizleri RNA-Seq gelişimsel ya da fizyolojik süreçleri 7-11,13,14 düzenleyen gen aktivitesinin spesifik kalıpları içine anlayışlar kazanmak için değerli bir araçtır. Ancak, herhangi bir belirli hücre tipi için bu yöntemin uygunluğu, yapısal konular kritik olarak bağlıdır. Hücre açıkça görülebilir ve LAM için kullanılan kuru bölümlerinde belirgin olarak teşhis edilebilmesi gerekir. Boechera divaricarpa olarak, Gametofit morfolojisi yumurta hücresinin (Şekil 2, Şekil 3) kolay bir şekilde belirlenmesini sağlar. Sonunda, belirli bir hücre popülasyonu izolasyonu hızı da hücre tipi yeni slaytlar slaytlar alışverişi ve taranması gibi bir slayt bulunabilir hangi frekansına bağlıdır zaman alıcı adımlardır. 250 hücre tarikatı - en az 200, hücre tipine bağlı olarak bu verileniyonları örnek başına toplanmalıdır, belirli bir çalışma düzeni için olan yöntemin uygunluğu, büyük ölçüde LAM adımı için zaman gereksinimlerine bağlıdır.
Buna ek olarak, dokunun morfolojisi bağlı olarak, 6 um bölümlerin kalınlığının azaltılması için, yapı olarak avantajlı olabilir. Benzer şekilde ideal olarak ≥ 8 um kalın bölümler tipik olarak doku bölümleri aynı miktarda biraz daha yüksek kalitede yüksek RNA miktarı ve RNA ile sonuçlanır. mümkün LAM ile izolasyon için 10 um - Buna ek olarak, ilgi konusu hücreler, 8, en az bir çapa sahip olmalıdır.
Prensip olarak, burada açıklanan protokol uzak akraba türlerde farklı hücre ve doku tipleri için ayarlanabilir. Bununla birlikte, RNA kalitesi, aynı türün 7,10,13 farklı hücre tipleri arasında değişebilir. Bu protokol, küçük ve kritik hücre türlerine göre ayarlandı. Bu nedenle, artık broade uygulanabilirdaha fazla ayarlamalar olmadan numunelerin r aralığı. protokol küçük değişikliklerle, yine araştırılmaktadır hücre tipine ve türüne göre gerekli olabilir. morfoloji ve RNA kalitesi karşılaştırmak için yeni bir tür ya da hücre tipi için bir yöntem ayarlarken ilk iki alternatif fiksatif kullanılması önerilir (protokol 1.1).
Prensip olarak, protokol adapte edilebilir ve lazer mikrodiseksiyon 9 uygun farklı enstrümanlar ile yapıldı. Ancak, bu cihazlar numune alma tekniği, hem de, lazer gücü ve uygulanabilir lazer ışınının en az genişlikte iki değişiklik olduğunu belirtmek gerekir. Özellikle dar bir lazer yolu ile sonuçlanan, küçük hücre ve doku alanlarında, lazerler izolasyonu için daha uygundur. Kullandığımız aletin lazer ışını (~ 1 mikron geniş) oldukça ince ve küçük hücrelerin diseksiyonu sağlar. cel toplama örnekleme tekniğiElektrostatik yapışma yapışkan bir kap yüzeyi üzerindeki mi, küçük hücre tipleri ve tek bir hücre bölümlerinin izole edilmesi için özellikle avantajlıdır. Bu elektrostatik etkileri ile örnek kaybı riskini en aza indirir.
Elde edilen RNA Kalite Ek Transkripsiyonel Analizler için Önemli
Başarılı RNA Seq kütüphane hazırlanması için en kritik noktalardan biri RNA kalitesidir. amplifikasyon kitleri birkaç sağlayıcıları daha düşük bütünlüğü RNA için kendi teknolojisini optimize ederken, ya mikroarray'ler veya RNA-Sek tarafından transcriptome analizinden sonra elde edilen verilerin kalitesi, tipik giriş RNA kalitesi ile artar. Kurulan bu protokolü kullanarak, iyi ve yüksek tekrarlanabilir RNA kadın üreme dokuların farklı gelişim aşamalarında kalite ve Arabidopsis ve Boechera germ elde edildi (örneğin, Şekil 4). yöntemi geçerli ikenAyrıca daha uzak akraba türlerde (örneğin, domates, yayınlanmamış) için, örneğin, küçük optimizasyonlar ve modifikasyonlar türler, doku tipine bağlı olarak gerekli olabileceğini dikkate alınması ve hatta laboratuvar ortamında olarak gereken, bir yüksek nem slayt hazırlama ve LAM sırasında RNA bütünlüğünü tehlikeye atabilir.
protokol sırasında kritik bir adım slaytlar örnekleri içeren kesitli balmumu şeritler montaj olduğunu. Burada, özellikle suya temas kritik bir adımdır. EtOH suyu yerine yalıtım (yayınlanmamış) sonra RNA bütünlüğü önemli bir gelişme ile sonuçlanmaz birlikte, metanol, su yerine yapar. Ancak, metanol sadece kimyasal başlık altında ve büyük bir dikkatle ele alınmalıdır. metanol kullanımına bir alternatif olarak, Örnek tipine bağlı olarak, su ile monte edildikten sonra kuruma süreleri eşit derecede iyi bir RNA kalitesi elde ~ 2 saat (3.3.3.1 bakınız) indirgenebilir.Ya hücre tipine ve ilgi türler için su ya da metanol montaj elde RNA kalitesini test etmek için bir deneme gerçekleştirme, yeni bir projenin başında tavsiye edilir.
LAM Transkripsiyonel Analizlerde Güçlü Teknolojisi
Sonuç olarak, başarılı bir şekilde optimize edilmiş ve LAM ve Arabidopsis thaliana ve Boechera spp cinsel ve apomiktik tohum çizgisi soy farklı hücrelere microarrays ve RNA-DİZ hücre tipine spesifik transcriptome analizi kombinasyonu uyguladık., Bu şekilde, karşılaştırmalı transkripsiyon analizleri sağlayan 7,11,13,14 (aynı zamanda bakınız Şekil 5). hücre tipine spesifik transkripsiyonel analizi sağlayan diğer teknolojilere kıyasla açıklanan yöntem bir dizi avantaj taşımaktadır. Önemli olarak, hücre tipleri veya bölümün daki dokuların tanınırlığını bağlı olarak, her iki model nadir hücre tiplerine uygulanabilirve Boechera spp. olgun dişi gametopitin hücreleri olmayan modeli türü veya hatta, örneğin, hücresel etki, hücre 19 polar yarısını ayırmak için kullanılabilir. Benzer uygulamalar hücreler veya çekirdeklerin (FACS / FANS) 10 floresan aktive sıralama kullanan diğer yöntemlerle mümkün olmazdı.
yöntemin önemli bir mahsur, uzun bir gerekliliktir. tespit ve gömme zaman ellerini uzatılmış gerekli değildir ve aynı zamanda çiçek büyük miktarda LAM için yapıldı çıkarabilirler örneğin 3 haftalık çok zaman alıcı bir hücre tipine spesifik analizler için, ve tipik olarak 3 gün olarak LAM (lazer mikroskobu günde ortalama 5 saat üzerinde) planlanması gerekir. Bu bağlamda, düzgün çalışmayı tasarlamak için hedeflenen spesifik hücre tipi izolasyonu hızı için bazı ön testler yapmak yararlı olur. Bu optimize edilmiş protokolü kullanarak bile ek olarak, denemeler oldukça yeniden RNA kalitesini test etmekövgüyle.
Özetle, LAM alternatif mevcut yöntemler kullanılarak elde edilememiştir bireysel hücre tipleri veya hücre bile alt etki çözünürlükte, en transkripsiyon analiz için güçlü bir araçtır. Bu bağlamda, çok yüksek zamansal ve mekansal çözünürlüğe sahip, gelişim süreçleri, örneğin, analiz izin muazzam potansiyeli taşımaktadır. Bu Arabidopsis ve Boechera 7,11,13,14 cinsel ve apomiktik üreme tüm kilit aşamalarında hücrelerin transcriptomes analizi ile örneklenmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol | VWR | 1,009,861,000 | absolute EMPROVE Ph Eur,BP,USP |
| 15 ml falcon centrifuge tubes | VWR | 62406-200 | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent | G2939AA | |
| Acetic Acid | Applichem | A3686,2500 | 100% Molecular biology grade |
| Ambion Nuclease free water | life technologies | AM9932 | |
| ASP200 S | Leica | 14048043624 | tissue processor |
| black cardboard | can be purchased in special paper shops | ||
| DNA- and RNAse-free Frame Slides | Micro Dissect GmbH | 1, 4 µm PET-membrane; can also be purchased from Leica | |
| Dumond Forceps | Actimed | 0208-5SPSF-PS | |
| ethanol lamp | |||
| exsiccator | Sigma-Aldrich | Z354074-1EA | Nalgene Vaccuum Dessicator or similar equipment |
| filter tips 10 µl | Axon Lab AG | AL60010 | can be replaced by similar tips |
| filter tips 1,000 µl | Axon Lab AG | AL60010 | can be replaced by similar tips |
| filter tips 20 µl | Axon Lab AG | AL60020 | can be replaced by similar tips |
| filter tips 200 µl | Axon Lab AG | AL60200 | can be replaced by similar tips |
| forceps precision | VWE | 232-1221 | |
| glass slide holder | Huber & Co.AG | 10.0540.01 | Färbekästen nach Hellendahl |
| glass staining trough | Huber & Co.AG | 10.0570.01 | Färbekasten |
| Heated Paraffin Embedding Module Leica | Leica | Leica EG 1150 H | blocking station, similar devises are suitable |
| Heating and Drying Table | Medax | 15501 | other models and/or suppliers are suitable |
| ice bucket | VWR ice bucket with lid | 10146-184 | similar buckets equally suitable |
| light table | UVP An Analytical Jena Company | TW-26 | white light transluminator |
| microscope slide | Thermo Scientific | 10143562CE | cut edges |
| microtome blade | Thermo Scientific | FEAHS35 | S35 microtome blade disposable |
| MMI Cell Cut Plus Instrument | MMI (Molecular Machines and Industries) | ||
| Non-stick, RNAse free Microfuge tubes, 2 ml | life technologies | AM12475 | |
| Paraplast X-TRA | Roth | X882.2 | for histology |
| PicoPure RNA Isolation Kit | life technologies | KIT0204 | Arcturus PicoPure RNA Isolation Kit |
| plastic balancing trays | Semadeni AG | 2513 | |
| plastic box | Semadeni AG | 2971 | Plastikdose PS |
| plastic lid for heating plate | homemade | ||
| preparation needle | VWR | 631-7159 | |
| RNA 6000 Pico Kit | Agilent | 5067-1513 | |
| RNAse free microfuge tubes | life technologies | AM12400 | |
| RNAse ZAP Decontamination Solution | life technologies | AM9780 | |
| Semi-automated Rotary Microtome | Leica | RM2245 | similar devices are equally suitable |
| Tissue Loc Histo Screen Cassettes | Thermo Scientific | C-1000_AQ | similar cassettes of other suppliers are suitable |
| Tubes with adhesive lid, without diffusor 500 µl | MMI (Molecular Machines and Industries) | 50204 | |
| Xylol (Isomere) ROTIPURAN | VWR | 4436.2 | min. 99%, p.a., ACS, ISO SP |
| process embedding cassettes | Leica | 14039440000 | Leica Jet Cassette I without lid |
| Universal Oven | Memmert | UF55 | other models and/or suppliers are suitable |
References
- Maheshwari, P. An Introduction to the Embryology of Angiosperms. , McGraw-Hill. New York. (1950).
- Willemse, M. T. M., Van Went, J. L. The female gametophyte. Embryology of Angiosperms. Johri, B. M. , Springer-Verlag. Berlin. 159-196 (1984).
- Koltunow, A. M., Bicknell, R. A., Chaudhury, A. M. Apomixis: Molecular strategies for the generation of genetically identical seeds without fertilization. Plant Physiol. 108, 1345-1352 (1995).
- Vielle-Calzada, J. P., Crane, C., Stelly, D. M. Apomixis - the asexual revolution. Science. 274, 1322-1323 (1996).
- Grossniklaus, U., Koltunow, A., van Lookeren Campagne, M. A bright future for apomixis. Trends Plant Sci. 3, 415-416 (1998).
- Schmidt, A., Schmid, M. W., Grossniklaus, U. Plant germline formation: molecular insights define common concepts and illustrate developmental flexibility in apomictic and sexual reproduction. Development. 142, 229-241 (2015).
- Schmidt, A., et al. Apomictic and sexual germline development differ with respect to cell cycle, transcriptional, hormonal and epigenetic regulation. PLOS GENET. 10, e1004476 (2014).
- Okada, T., et al. Enlarging cells initiating apomixis in Hieractium praealtum transition to an embryo sac program prior to entering mitosis. Plant Physiol. 163, 216-231 (2013).
- Wuest, S. E., Grossniklaus, U. Laser-assisted microdissection applied to floral tissues. Methods Mol Biol. 1110, 329-344 (2014).
- Wuest, S. E., Schmid, M. W., Grossniklaus, U. Cell-specific expression profiling of rare cell types as exemplified by its impact on our understanding of female gametophyte development. Curr Opin Plant Biol. 16 (1), 41-49 (2013).
- Wuest, S. E., et al. Arabidopsis female gametophyte gene expression map reveals similarities between plant and animal gametes. Curr Biol. 20, 1-7 (2010).
- Cai, S., Lashbrook, C. C. Laser capture microdissection of plant cells from tape-transferred paraffin sections promotes recovery of structurally intact RNA for global gene profiling. Plant J. 48 (4), 628-637 (2006).
- Schmidt, A., Wuest, S. E., Vijverberg, K., Baroux, C., Kleen, D., Grossniklaus, U. Transcriptome analysis of the Arabidopsis megaspore mother cell uncovers the importance of RNA helicases for plant germ line development. PLOS BIOL. 9, e1001155 (2011).
- Schmid, M. W., Schmidt, A., Klostermeier, U. C., Barann, M., Rosenstiel, P., Grossniklaus, U. A powerful method for transcriptional profiling of specific cell types in eukaryotes: laser-assisted microdissection and RNA sequencing. PLOS ONE. 7, e29685 (2012).
- Mau, M., et al. Hybrid apomicts trapped in the ecological niches of their sexual ancestors. Proc Natl Acad Sci.U S A. 112 (18), 2357-2365 (2015).
- Aliyu, O. M., Seifert, M., Corral, J. M., Fuchs, J., Sharbel, T. F. Copy number variation in transcriptionally active regions of sexual and apomictic Boechera. demonstrates independently derived apomictic lineages. Plant Cell. 25 (10), 3808-3823 (2013).
- Corral, J. M., et al. A conserved apomixis-specific polymorphism is correlated with exclusive exonuclease expression in premeiotic ovules of apomictic boechera species. Plant Physiol. 163 (4), 1660-1672 (2013).
- Deeken, R., Ache, P., Kajahn, I., Klinkenberg, J., Bringmann, G., Hedrich, R. Identification of Arabidopsis thaliana. phloem RNAs provides a search criterion for phloem-based transcripts hidden in complex datasets of microarray experiments. Plant J. 55, 746-775 (2008).
- Schmid, M. W. Genome Scale Quantitative Biology in Arabidopsis thaliana. , University of Zürich. PhD Thesis 40-104 (2015).
