Introduction
I transkriptionelle undersøgelser udført på vævet niveau, er transcriptomes af højt specialiserede, men sjældne celletyper ofte maskeret af de mere rigelige omkringliggende celler. Et eksempel på sådanne højt specialiserede celletyper er cellerne i den kvindelige reproduktive linjen (germline) i planter. Den kvindelige kønscellelinie er specificeret i udviklingslandene frøanlæg, forløberne for frø inde i frugtanlæg af blomsten 1,2. Den megaspore mor celle (MMC) er den første celle i den kvindelige kimcellelinje. Det gennemgår meiose at danne en tetrade af reducerede megaspores. Typisk kun én af disse megaspores overlever og opdeler mitotisk uden cytokinese, dvs i et syncytium. Disse mitose efterfølges af cellularization til dannelse af den modne gametofyt, som typisk består af fire celletyper: tre antipodals, to synergid celler, ægget, og den centrale celle. De æg og centrale celler er de kvindelige kønsceller der bliver befrugtede af to sædceller under douligt befrugtning at give anledning til embryo og endosperm af frøet udviklende 1,2. I det seksuelle modelsystem Arabidopsis thaliana, kun ~ 50 frø udvikle per blomst mens omkring 50-80 frø udvikle per blomst i den nært beslægtede slægten Boechera. Således er den kvindelige kimcellelinje består af kun et par højt specialiserede celletyper, hvilket gør det til et fremragende model til at studere udviklingsmæssige processer, såsom celle specifikation og differentiering.
Desuden kan indsigt i gen regulatoriske processer, der styrer plante reproduktion have anvendt værdi. I planter, kan både kønnet og ukønnet formering gennem frø (apomixis) forekomme. Mens seksuel reproduktion genererer genetisk diversitet i en population, apomixis fører til dannelsen af klonal afkom, der er genetisk identisk med moderplanten. Derfor apomixis har et stort potentiale til applikationer i landbrug og frø, som selv komplekse moderlige genotyper kanopretholdes uændret over flere generationer 3,4,5. Fordi apomixis ikke naturligt forekommer i nogen større afgrødearter, engineering af apomixis i afgrøder er af stor interesse 3,4,5. Men dette langsigtede mål er vanskeligt at opnå, fordi den underliggende genetiske og molekylære grundlag for apomixis ikke forstås tilstrækkeligt detaljeret 6.
For at få indblik i den transkriptionelle grundlag for apomiktiske reproduktion, celletype-specifikke transkriptionel profilering ved hjælp af laser-assisteret mikrodissektion (LAM) og næste generation sekventering (NGS) repræsenterer en meget kraftig tilgang 7,8. LAM er først blevet etableret for dyr og biomedicinsk forskning. I de sidste par år LAM også er blevet anvendt på plantebiologi 6,9,10. I modsætning til andre fremgangsmåder, der tillader profilering af de enkelte celle- og vævstyper, er LAM ikke nødvendigt at fremskaffe markeringslinierne 6,9,10. Derfor kan det være appløj til en celle eller vævstype uden forudgående molekylær viden. En anden fordel ved LAM er, at det kan anvendes på enhver celletype, så længe cellen kan genkendes i tørre sektioner baseret på positions- og / eller strukturelle funktioner. LAM har den yderligere fordel, at fikserede væv anvendes, hvilket forhindrer ændringer af transskriptionsprofilen under behandlingen.
Vævet af interesse, fx floral væv, er fastgjort i en ikke-tværbindende fiksativ før indlejring i paraffinvoks. Indlejring i paraffinvoks kan gøres manuelt, ifølge etablerede protokoller 9,11. Imidlertid er anvendelsen af en automatiseret vævsprocessor for dehydrering og infiltration med voks resulterer generelt i højere reproducerbarhed med hensyn til bevarelse af RNA kvalitet og vævsmorfologi. Den alternative strategi for at integrere væv i harpiks har også været brugt med held til celle typespecifikke analyser af LAM 8. Imidlertid er anvendelsen af en automated væv processor til indlejring i voks er meget tid effektivt, da mange prøver kan behandles på én gang kræver et minimum af hands-on tid. Mens opstår typisk ingen signifikant tab af RNA kvalitet under fiksering og forankring, udarbejdelse af tynde sektioner med mikrotomen og især, at montering på frameslides anvendes til LAM stadig et afgørende skridt til konservering af RNA kvalitet. Dette er tidligere blevet bemærket, og anvendelsen af en overførsel tape system er blevet beskrevet at resultere i bedre RNA kvalitet på dette trin 12. Men dette tilføjer en ekstra tidskrævende trin under forberedelsen af dias og kræver også særligt udstyr. Den optimerede protokol beskrevet nedenfor reproducerbart producerer RNA, som er af tilstrækkelig kvalitet til transkriptionel profilering med GeneCHIPs og Next Generation Sequencing (NGS) nærmer 7,11,13,14. Desuden med laseren mikrodissektion mikroskop anvendes, en høj renhed af de isolerede celletyper er flugtinely produceret 7,11,13,14.
Slægten Boechera er en fremragende model til undersøgelse af de vigtigste trin i apomiktiske reproduktion. I Boechera, har en række forskellige seksuelle og apomiktiske tiltrædelser blevet identificeret og kan bruges til sammenlignende analyser 15,16,17. I en sammenligning af celletype-specifikke transcriptomes af celler fra den kvindelige kimcellelinje fra seksuel Arabidopsis og apomiktiske Boechera, vi identificeret gener og veje, der er differentielt udtrykte, hvorved der identificeres nye sider af de regulatoriske processer vedrørende apomixis 7. Derudover denne undersøgelse bekræftet egnetheden af LAM for celletype-specifik transkriptionel analyser af små og sjældne celletyper. Vi har allerede brugt denne protokol til analyse af forskellige celletyper i en række forskellige plantearter, men arts- og kan være påkrævet vævsspecifikke ændringer af protokollen i visse tilfælde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bemærk: Denne protokol beskriver væv forberedelse, laser assisteret mikrodissektion, og RNA udtræk til transkriptionel profilering. Brug altid handsker i alle trin i protokollen. Undersøgelse og overveje sikkerhedsinstruktionerne for hvert enkelt kemikalie anvendes. Især huske på, at Xylen er et sundhedsskadeligt og kan trænge handsker og at methanol er giftige. For alle instrumenter, der anvendes, henvises til brugsanvisninger i overensstemmelse hermed.
1. Fjernelse af RNAse aktivitet fra Glas og andet udstyr
- Før anvendelse wrap enhver glasvarer i aluminiumfolie før bagning i ~ 8 timer ved 180 ° C for at sikre RNAse free kvalitet.
- Behandle alle metaloverflader (f.eks pincet) samt arbejdsbordet og varmepladen med en passende RNAse dekontaminering opløsning. Bagefter vaske overfladerne med RNAse-frit vand til fjernelse dekontaminering opløsning. Efterfølgende rense overfladerne yderligere med 70% EtOH.
- Brug alle plastic forbrugsvarer (fx rør) helt nye uden nogen forbehandling. Hvis det er muligt, bruge plastik forbrugsvarer, der er certificeret til at blive RNase-frit.
2. vævsfiksering
- Forbered 10 ml landmandens fiksativ (3: 1 v / v ethanol: eddikesyre) i en frisk 15 ml rør på is. (Forberede Altid frisk landbrugerens fiksativ før brug). Som et alternativ, ikke-tværbindende fiksativ ethanol: eddikesyre (5: 1; vol / vol) kan anvendes 18.
- Brug en fin pincet til at indsamle knopper på udviklingsstadiet af interesse. Umiddelbart oversvømme knopper i iskold fiksativ. Brug 10 ml fiksativ til fiksering af ~ 20 knopper eller blomster fra Arabidopsis eller Boechera Bemærk:. Ved brug af plantearter med større blomster, anbefales det at dissekere blomsterne med et barberblad til at generere mindre stykker før fiksering.
- For at opnå modne gametofytter, svække de 2 - 3 største blomsterknopper af inflorescence 2 dage før høst.
- Fyld bunden af en ekssikkator med is. Åben tuberne indeholder prøverne, fx, blomster, og placere dem på is, enten ved direkte at sætte dem i isen på en måde, at de ikke kan falde over eller ved anvendelse af en passende holder. Vakuum infiltrere i 15 min før frigivelse af vakuum.
- Gentag vakuum infiltration en gang i 15 minutter.
- Slip vakuum og lager natten (~ 12 timer) på is. Dæk ice spand med låg eller aluminiumsfolie og opbevares spanden i et 4 ° C rum eller køleskab for at forhindre isen fra optøning. Bemærk: Det anbefales ikke Forlængelse fikseringen tid.
3. Tissue Embedding, Tynd Sektionsinddeling og Montering på Slides til LAM
- Tissue indlejring.
- Udveksle fiksativ til 70% ethanol fremstillet med ren ethanol og RNase-frit vand. Lad prøverne på is indtil videre behandling. Start embedding af prøverne samme dag. Hvis der ikke væv-behandling maskine er tilgængelig, gå videre til manuel indlejring som beskrevet andetsteds 9,11 og fortsætte med trin 3.1.11.
- overføre forsigtigt prøver væv indlejring kassetter med en pincet. Fast lukke kassetterne. KRITISK STEP: Undgå selv delvis tørring af prøven i dette trin. Undgå at klemme af prøver med pincet.
Bemærk: For at mærke kassetterne skal anvendes en blyant, ideelt ved at skrive på den skrå overflade af kassetten. - Opbevar indlejring kassette fyldt med knopper eller blomster i 70% ethanol, indtil alt materiale overføres til kassetter og indlejring maskine kan indlæses. Til dette formål anvender et glas farvning trug fyldt med 70% ethanol.
- Fjern kurven af vævet processoren fra retorten af maskinen og overføre integreringstilladelserne kassetter til kurven med de skrå overflader, som vender toppen og i samme retning. CRITisk STEP: Udfør denne hurtigt for at forhindre enhver tørring af væv. Hvis behandling mange indlejring kassetter på en gang, skal du placere kurven i en passende RNAse gratis container fyldt med 70% ethanol før indlæsning af prøverne.
- Læg låg på kurven og sætte kurven tilbage i retort. Luk retorten.
Bemærk: Vævet processor dehydrerer automatisk prøverne, ændrer opløsningsmiddel Xylen, og gør infiltration med smeltet paraffin. Typisk sker dette natten over. - Start programmet af vævet processor. Anbefalede standardindstillinger er 1 time 70% EtOH, tre gange 1 time 90% EtOH, tre gange 1 time 100% EtOH, to gange 1 time 100% Xylen, én gang 1 time 15 min 100% Xylen ved stuetemperatur, efterfulgt af infiltration med paraffinvoks to gange i 1 time og én gang i 3 timer ved 56 ° C 11.
Bemærk: For at sikre, at blokeringen station er klar med voks smeltet, tænde maskinen på flere timer før start ellerbruge timeren funktion til at vælge den omtrentlige starttidspunkt.
Bemærk: I tilfælde vævet ikke kan behandles umiddelbart efter, længere inkubationstider i paraffin ved 56 ° C er mulige i stedet for de 3 timer ved 56 ° C. Se i brugervejledningen til instrumentet. Typisk vil kassetterne med væv automatisk forblive i smeltet voks indtil kommandoen "tom retort" godkendes. Hvis voks ikke er smeltet ved start vævet processor, er retorten fyldt med 70% ethanol og programmet forbliver i venteposition, indtil klar til at begynde. - Tøm retort og straks overføre prøver til et paraffin bad ved 56 ° C i en blokerende station. Fjern låget fra kurven og dækker paraffin bad af det blokerende station med dens låg.
- Pile så mange friske balancering bakker på overfladen af den blokerende station opvarmet til 56 ° C, som der er kassetter i kurven.
Bemærk: En ethanol-resistente permanent markør kan bruged at mærke bunden af balancering bakker. Acetone-resistente permanente markører kan ikke anbefales. - Brug af den blokerende station, fylde en forvarmet frisk plast balancering bakke med smeltet paraffin ved 56 ° C. Løft låget af paraffin bad, afhente en kassette kun ad gangen og overføre prøver fra kassetterne til den flydende paraffin ved 56 ° C i balancering bakken ved hjælp af en pincet.
KRITISK STEP: Undgå enhver hærdning af voks omkring prøven, mens håndtering af kassetten ved at arbejde hurtigt.- Anbring alle prøver efter de behov under anvendelse af et præparat nål før hærdning af voksen. Typisk er adskillige blomster arrangeret i en afvejning bakke individuelt anbragt ca. 1 cm i hver retning.
- Gentag trin 3.1.9, indtil alle prøver overføres.
- Placer kurven tilbage til vævet processor og rengør retort ved hjælp af et passende program (se brugervejledningen).
- Sluk væv processor og blokering station. Fortsæt med trin 3.1.13.
- Hvis der ikke vævet infiltration maskine og ingen indlejring station er til rådighed, anvendes en varmeovn til at smelte paraffin ved 56 ° C. På bænken, fylde den smeltede voks i plast balancing bakker, overføre prøverne til voks, og bruge forberedelse nåle til at placere prøverne.
- Tillad paraffin til at hærde ved stuetemperatur i ~ 1 - 3 ud time før opbevaring af prøverne ved 4 ° C. Prøver kan efterfølgende behandles frisk eller opbevares i op til flere måneder.
- Udarbejdelse af tynde sektioner og dias for LAM.
- På et lysbord belyser voks blok nedefra, fjerne paraffin med prøverne fra de omkringliggende plastbakker. Dissekere en kvadreret voks blok indeholdende væv, f.eks., En knop eller blomst, under anvendelse af et RNase-frit barberblad. Til dette formål altid orientere prøverne mod toppen af voksen blok (se også
- Forbered voks blokke af alle prøver, der skal bruges til LAM ad gangen.
- På et lysbord belyser voks blok nedefra, fjerne paraffin med prøverne fra de omkringliggende plastbakker. Dissekere en kvadreret voks blok indeholdende væv, f.eks., En knop eller blomst, under anvendelse af et RNase-frit barberblad. Til dette formål altid orientere prøverne mod toppen af voksen blok (se også
- Montere blokke for at behandle indlejring kassetter fyldt med hærdet paraffinvoks: smelte et lille stykke eller dråbe af paraffin på spidsen af en passende spatel anvendelse af et Ethanol lampe og bruge hot wax at fastgøre blokken på understøtningen (med de indlejrede væv På toppen).
- Tillad voks til at hærde i mindst 20 minutter ved 4 ° C.
- Fjern overskydende voks omkring prøven med et barberblad på lysbord. Sørg for at holde en firkantet overflade med parallelle kanter (se figur 1).
- Indstil varmepladen til 42 ° C.
- Sikker montere prøverne til mikrotomen og forberede 6 - 10 um tykke sektioner. Der henvises til producentens anvisninger for brug af mikrotomen. Bemærk: Mens tyndere sektioner ofte vil give bedre strukturel opløsning, større mængde af RNA af higher kvalitet kan opnås med tykkere sektioner. For cellerne i Boechera modne gametofytter bruger vi 7 um som standard. Flytning ret langsomt med prøverne over mikrotom kniv resulterer ofte i bedre histologi.
- overføre altid paraffin bånd i en længde på ca. 10 - 15 cm i en plastik boks med en sort karton i bunden før positionering dem i LAM lysbilleder.
- Hvis det er muligt, på forhånd vælge de dele af paraffin strimler indeholder celle- eller vævstyper af interesse, f.eks frøanlæg, under et dissekere-scope og kassér resten.
- Placer den nødvendige mængde metal-indrammet slides (typisk 5 - 10) med den flade overflade på toppen på varmepladen.
- Pipette ~ 1 - 2 ml RNAse gratis vand på plast del af dias. Brug af et barberblad, skære paraffin bånd i korte stykker af ca. 4. - 5. cm lang nok til at spænde plastic vinduer. USE en pincet og et præparat nål til ideelt placere paraffin strimler parallelt med hinanden på plastic vinduer af objektglassene. Løft forsigtigt objektglasset i den ene ende for at fjerne vandet og placere objektglassene tilbage.
- Alternativt, placere varmepladen under en kemisk hætte. Anvende en lille mængde af methanol til plastdelen af objektglasset lige tilstrækkelig til at fugte overfladen (dette kan forårsage en let korrugering af gliderne). Placer paraffin strimler på dias.
Bemærk: Af hensyn til toksicitet, undgå brug af methanol, hvis muligt. Dog er anvendelsen af methanol ved dette trin forbedrer RNA kvalitet i tilfælde af kvaliteten opnået ved montering på vand ikke er tilstrækkelig. Det er værd at teste disse alternativer ved starten af et nyt projekt, som RNA kvalitet opnås varierer med celletype og arter under efterforskning.
- Alternativt, placere varmepladen under en kemisk hætte. Anvende en lille mængde af methanol til plastdelen af objektglasset lige tilstrækkelig til at fugte overfladen (dette kan forårsage en let korrugering af gliderne). Placer paraffin strimler på dias.
- Tør objektglassene natten over på varmepladen ved 42 ° C i ~ 12 timer. Dæk varmepladen meden plastik låg, der ikke rører dias. Sørg for, at plastlåg ikke hindrer udveksling af luft. Til dette mål låget kan placeres på pipette kasser eller lignende, der skal løftes.
- Alternativt reducere tørretiden til mindst to timer eller indtil vævet vises helt tørre. Nedsættelsen af tid fra udskæring til samling kan forbedre RNA kvalitet.
- Under en kemisk hætte, de-voks dias 2 gange i 10 min i Xylen ved hjælp af passende slide indehavere. Sørg for fuldt nedsænkes plastdelen af hvert objektglas kun men at tillade fjernelse af slæden ved at trykke den bredere ende af metalramme, der holdes tørt.
- Lad objektglassene tørre i ~ 10 minutter under den kemiske hætte før LAM.
Bemærk: Objektglas ikke umiddelbart forarbejdet kan placeres tilbage på varmepladen ved 42 ° C med vævet opad i op til et par timer. Dette vil forhindre enhver fugt fra at gå på kompromis RNA kvalitet indtil yderligere behandling.
4. Laser-assisteret mikrodissektion (LAM)
Bemærk: Proceduren til LAM vil variere med det anvendte apparat. Visse detaljer i denne protokol er tilpasset et specifikt instrument, og teknologien med at indsamle prøverne på et loft gør brug af elektrostatiske kræfter. Desuden kan detaljer variere selv mellem forskellige versioner af softwaren. Der henvises til producentens anvisninger og brugergrupper håndbøger for en detaljeret beskrivelse og specifikke instruktioner om instrument og software.
- Tænd enhederne for LAM (computer, mikroskop, laser styreboks).
- Start programmet styre mikroskop og laser.
- Tænd laseren ved at trykke den tilsvarende knap på kontrolboksen.
- Placer en hætte (0,5 ml, uden diffusor) i holderen til hætten og placere den i instrumentet.
- Støt LAM slide med en glasplade til mikroskopi. Sikre, at den flade overflade af objektglasset medvæv vedhæftet vender objektglasset.
- Placer dias i instrumentet med objektglasset nedenunder.
- Vælg 4X Mål. I programmet, skal du vælge at flytte låget til "op" position, og fortsætte med at foretage en scanning af dias.
- Søg gennem dias og identificere de strukturer af interesse. Udpeg og gemme deres positioner på dias for at være i stand til at bevæge sig tilbage til den nøjagtige position til skæring trin.
- Vælg den relevante mål (f.eks 40X eller 60X).
- Hvis det er nødvendigt, justeres laser hastighed, fokus og laser magt, og også kalibrere scenen bevægelsen ved at henvise til brugermanualen af instrumentet. Når en konto er sat op til det specifikke væv af interesse, kan indstillingerne genbruges.
- Kontroller laser position ved et enkelt skud ved at trykke på "laser shot" knappen i programmet, ideelt i en del af membranen uden væv.
- Hvis det er nødvendigt, kalibrere laseren position ved at følge the producentens anvisninger for instrumentet.
- Kontrollér kalibreringen af målet ved at flytte en oplagt struktur til alle fire hjørner af den software vindue på skærmen, holde højre museknap nede. Kontroller at håndstilling med hensyn til den indlysende struktur er den samme i alle fire hjørner. Ellers kalibrere de mål efter software manual.
- Med hætten i den "ned" position, bruge 'hånd-pen "værktøj til at markere grænser celletype eller væv af interesse, f.eks ægcellen. Dissekere cellen af interesse med laser ved at trykke på 'cut'. Bemærk: Ofte, sektionering behov, der skal gentages, hvis kant rundt i cellen ikke var helt dissekeret på en gang. I dette tilfælde anbefales det at indstille software til automatisk gøre to gentagelser af sektionen som en standard.
- Løft hætten og flytte til den næste gemte position med strukturen af interesse. Gentag trin 4.13af proceduren for at dissekere den næste celle sektioner, indtil alle celler af interesse fra et dias opsamles. Sørg for, at dækslet er placeret på en måde, at den nye sektion holder sig til en tom position på hætten.
Bemærk: Det anbefales at isolere større stykker af væv (fx dele af hele blomster eller dele af det) fra hvert objektglas efter isoleringen af encellede sektioner på en frisk hætte. Disse kan anvendes til RNA kvalitetskontrol. - Fjern dias og fortsætte med næste dias ved at gentage trin 4,4-4,9 og 4,13-4,14.
- Gentag trin 4.15 og relaterede trin, indtil de celletyper af interesse fra alle dias er blevet isoleret. Bemærk: Det anbefales ikke at høste i længere tid end ~ 4. - 5. timer på samme hætte.
- Visuelt inspicere hætten overflade efter LAM at udelukke uspecifikke kontaminering af prøven. Mens de ikke-dissekeret væv er beskyttet med folie, kan støv klæbe til overfladen på grund af elektrostatisk vedhæftning.
- To visuelt inspicere hætten, fjerne dias fra instrumentet. Sæt holderen hætten i den "ned" position og inspicere overfladen med 4X mål.
- I tilfælde små stykker af støv er synlige, fjerne dem med en lille (2 pi) pipettespids. Alternativt montere dias tilbage på instrumentet, skal du placere hætten på en fri del af dias (ingen væv), og helt ødelægge forureningen ved hjælp af laser.
- Luk hætter og fryse de tørre sektioner ved -80 ° C indtil videre anvendelse. Om nødvendigt kan prøverne opbevares i op til flere uger. Imidlertid fortsætter hurtigt i dette trin anbefales,.
5. RNA Isolation og kvalitetskontrol
Bemærk: RNA kan isoleres ved enhver metode egnet til små mængder RNA. I denne protokol er beskrevet anvendelsen af et RNA isolation kit angivet for små mængder RNA. Følge producentens instruktioner.
- Brug rørene med prøven fastgjort tilhætten enten direkte eller efter fjernelse fra -80 ° C.
- Åben tuberne og omhyggeligt pipetteres 11 pi ekstraktionsbuffer til væggen af hvert rør under anvendelse filterspidser. Skift tips mellem prøverne.
- Luk låget og ryst ekstraktionsbuffer ned til hætten af røret.
- Anbring glassene med hætten ned i en varmeovn forvarmet til 42 ° C. Inkuber i 30 minutter i overensstemmelse med producentens anvisninger.
- Følge producentens instruktioner til kolonne forberedelse og opsamling af ekstrakten i bunden af rørene.
- Hvis materialet fra mere end en cap skal kombineres i én prøve, fortsæt med trin 5.1.1 - 5.1.2 individuelt for hvert rør / cap.
- Bagefter samle ekstrakter til én prøve i et rør og måle mængden af poolede ekstrakt med en pipette før tilsætning af en ækvivalent mængde EtOH (se producentens anvisninger).
- Sørg for, at mængden af EtOH tilføjede, før du lægger kolonnen er lig med mængden af den poolede ekstrakt.
- Efter RNA udfældning med EtOH, hurtigt videre til lastning af kolonnerne efter producentens anvisninger. Fortsæt protokol med 100 xg centrifugering trin.
- Efter indholdet af hvert indsamling rør er blevet passeret gennem søjlen, udføre en 16.000 xg centrifugeringstrin i 30 sekunder for at fjerne gennemløbet efter producentens anvisninger.
- Fortsæt med RNA-ekstraktion og oprensning efter producentens anvisninger.
- Efter påsætning af elueringspufferen til kolonnen tillade kolonnen at inkubere i 1 min. Fortsæt med at indlæse rørene ind i centrifugen følge instruktionerne i producentens anvisninger. Bemærk: En ekstra centrifugeringstrin i 1 min ved 100 xg før eluering som angivet i protokol kan øge effektiviteten af eluering.
- Uddrag RNA fra controls (større vævssnit) til RNA kvalitetskontrol følgende trin 5.1 til 5.2.7 i denne protokol.
- For RNA kvalitetskontrol belastning 1 pi ufortyndet total RNA af hver kontrolprøve på Bioanalyzer anvendelse af en RNA Pico Chip efter producentens anvisninger.
Bemærk: Det ekstraherede RNA kan anvendes til lineær forstærkning og transkriptom analyse under anvendelse microarrays eller RNA-Seq 7,11,13,14. Ideelt set bør kvalitetskontrollen indikere en RNA Integritet Number (RIN) på mindst 7. En række leverandører giver egnede kits til forstærkning, er egnede eksempler gives i ni.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Prøveforberedelse og LAM er færdig i hinanden følgende trin
Et antal på hinanden følgende trin er nødvendige for at forberede RNA for transkriptionel analyse fra udvalgte celletyper ved LAM (figur 1). Dette starter med høsten af blomster og øjeblikkelig fiksering for at sikre, at RNA-populationen forbliver uændret efter høst. Vævet er indlejret, snittet, og monteret på objektglas. Dette giver mulighed for isolering af cellerne ved LAM og sammenlægning af celle typespecifikke sektioner på en eller flere hætter (Figur 1). Materialet kan fryses bagefter eller direkte behandlet af RNA-ekstraktion. Bortset fra den fordel, LAM at være gældende for celletype-specifikke analyser i både model og ikke-modelarter, metoden forbliver snarere tidskrævende. Mindst en uges arbejdstid, nogle gange mere, er nødvendig for trin fra tissue høst til RNA-ekstraktion (figur 1). Det skal tages i betragtning, at ofte sektioner høstet over flere dage med LAM samles i én biologisk prøve og RNA ekstraktion. For Boechera ægceller, er brugen af mindst ~ 200 sektioner pr prøve stærkt anbefales, med op til ~ 100 sektioner isoleret per dag.
Isolering af Cell Typer Interessante Afhænger deres synlighed i Dry Sektioner
Isolering af cellen typespecifikke sektioner er den mest tidskrævende trin i protokollen. Indtil videre har ingen automatisering af dette trin er udviklet på grund af den komplekse karakter af prøverne. Identifikationen af cellerne af interesse under anvendelse af et software-værktøj er ikke mulig, fordi de tørre sektioner har lav kontrast og snitplanet varierer mellem prøverne på grund af det faktum, at frøanlæg er orienteret i forskellige vinkler wnden for væv (figur 2). Ikke desto mindre er den unikke morfologi af den modne kvindelige gametofyt med synergids, ægcellen, og den centrale celle (antipodal celler degenererer før befrugtning) muliggør entydig identifikation af ægceller fra forskeren (figur 2B, C, figur 3). Faktisk, i Boechera divaricarpa, ægcellen ofte krymper lidt under fremstilling og således adskilles fra de omgivende væv, en funktion fordelagtig til isolering af æg cellepopulationer med høj renhed (figur 2B, C, figur 3).
Visuel inspektion af den fælles landbrugspolitik efter LAM er Anbefalet
Visuel inspektion af hætten overfladen efter LAM tillader identifikation af eventuelle forureninger af prøven, fx ved støv. Desuden er det nyttigt at sikre, at selvKTIONER holde sig til den fælles landbrugspolitik, som til tider sektioner vild under proceduren. Typisk mange udvalgte sektioner, f.eks ægceller, kan ses på en cap efter flere timers LAM.
Den Etableret Workflow reproducerbart Resultater i god RNA kvalitet
Fra celle typespecifikke LAM isoleringer fra kvindelige gametofytter samlede RNA beløb er kun i den lave ng rækkevidde. Dette begrænsende mængde RNA gør det nødvendigt at anvende en repræsentativ kontrol isoleret fra større væv af hver slide som approksimation for RNA kvalitetskontrol efter LAM. Dette fremgår af en sammenligning af celletype-specifik RNA fra B. divaricarpa ægceller sammenlignet med kontroller fra større væv områder isoleret fra de samme dias, indikerer tilsvarende RNA kvalitet (figur 4A, B). Ved hjælp af denne metode, en god til høj RNA kvalitet med RIN tal & #8805; 7 er reproducerbart opnås. RNA opnåede kvalitet var egnet til celletype-specifikt RNA-Seq, føre til identifikation af 236 gener udtrykt i apomiktiske ægcelle men ikke i apomiktiske centrale celle, synergid celle eller apomiktiske initial celle eller i cellerne eller det modne seksuel gametofyt af Arabidopsis thaliana (figur 5) 7.
Figur 1:. Scheme af trinene i protokollen, med angivelse af Minimal tid, der kræves pr Trin Fiksering af blomster eller væv af interesse sker natten over. Den næste dag, er indlejring i gang, som løber over natten, hvilket resulterer i indlejrede materiale på dag 3 i protokollen. På dag kan genereres 3 mikrotomknive sektioner startende fra indlejrede prøver i voks blokke. Båndene af de tynde paraffinsnit er monteret på objektglas og efterladt til tørring natten over. Påe til flere dages LAM vil være forpligtet til at opnå tilstrækkeligt materiale til en biologisk kopiere. Efter RNA isolering og kvalitetskontrol, kan udføres bibliotek forberedelse til RNA-Seq at forberede transkriptom analyse. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: ægceller klart kan identificeres i tyndslib, På grund af den karakteristiske morfologi for den Kvindelige gametofyt (A) Skematisk tegning af den modne kvindelige gametofyt (Polygonum type) (B - C) Tynde snit gennem frøanlæg huser kvindelige gametofytter i.. Boechera divaricarpa. Ægceller er klart synlige. På grund morfologien af den kvindelige gametofyt ofte ikke alle celletyper (ægcelle: E, synergids: s, Central celle: cc) er synlige i en enkelt sektion. Scale barer = 50 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. LAM af ægceller i Boechera divaricarpa. A og C. afsnit af den modne gametofyt af B. divaricarpa ved 7 um før og, B og D, efter mikrodissektion med laser-enhed (ægcellen: e, synergids: s, central celle: cc). Scale barer = 50 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
<strong> Figur 4. RNA kvalitet Laser-dissekeret ægceller og Kontrol Sektioner. (A) RNA kvalitet som analyseres ud fra ægcelle sektioner i forhold til (B) større væv områder høstet fra de samme slides som kontroller. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. Identifikation af gener udtrykt Kun i apomiktiske ægcelle i forhold til de Celler af apomiktiske og Seksuelle Ældre gametofytter eller apomiktiske Initial Cell. Heatmap af 236 gener udtrykt i apomiktiske ægcelle men hverken i apomiktiske centrale celle, synergid celle eller apomiktiske initial celle af B. gunnisoniana eller de celler i det modne seksuelle gametofyt af A. thaliana 7 Hierarkiskgruppering af prøver og gener var baseret på euklidisk afstand og hierarkisk agglomerative klyngedannelse. Red betegner høj ekspression og sort lav ekspression. Farver er skaleret per række. apo:. apomiktiske Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen er egnet til forskellige celler og væv Typer
LAM kombineret med transkriptom analyser af microarrays eller RNA-Seq er et værdifuldt værktøj til at få indsigt i de specifikke mønstre af genaktivitet regulerer udviklingsmæssige eller fysiologiske processer 7-11,13,14. Men egnethed denne metode for en given celletype er kritisk afhængig af strukturelle spørgsmål. Cellen skal være klart synlige og utvetydigt kunne identificeres i de tørre sektioner anvendes til LAM. I Boechera divaricarpa, morfologi gametofyt tillader en nem identifikation af ægget celle (figur 2, figur 3). I sidste ende, hastigheden af isoleringen af en specifik cellepopulation afhænger også den frekvens, hvor celletypen kan findes på et objektglas, der udveksles objektglas og scanning nye dias er tidskrævende trin. Eftersom afhængig af celletypen, på mindst 200 - 250 cell sektioner bør samles per prøve, egnetheden af metoden for en bestemt undersøgelse design afhænger i høj grad af de tidsmæssige krav til LAM trin.
Desuden, afhængigt af morfologi af vævet, kan det være fordelagtigt med hensyn til struktur for at reducere tykkelsen af afsnittene til 6 pm. Tilsvarende tykkere sektioner af ideelt ≥ 8 um resulterer typisk i større RNA mængde og RNA af lidt højere kvalitet fra den samme mængde vævssnit. Desuden bør cellerne af interesse have mindst en diameter af 8 - 10 um for at gøre isolationen af LAM gennemførlig.
I princippet kan protokollen beskrevet her justeres til forskellige celle- og vævstyper fra fjernt beslægtede arter. Imidlertid kan RNA kvalitet varierer endog mellem forskellige celletyper af samme art 7,10,13. Denne protokol er justeret baseret på små og kritiske celletyper. Således kan det nu anvendes til en broader vifte af prøver uden yderligere justeringer. Mindre ændringer af protokollen kan alligevel være nødvendigt, afhængigt af celletypen og arter, der undersøges. Det anbefales først at bruge begge alternative fikseringsmidler (se protokol 1.1) ved opsætning metoden til en ny art eller celletype til en sammenligning af morfologi og RNA kvalitet.
I princippet kan protokollen tilpasses og udføres med forskellige instrumenter, der er egnede til laser mikrodissektion 9. Det er dog nødvendigt skal bemærkes, at instrumenterne varierer både i lasereffekt og den minimale bredde af laserstrålen, der kan anvendes, såvel som i teknologien for prøveudtagningen. Navnlig til isolering af små celler og vævsområder, lasere resulterer i en smal laser sti er bedre egnet. Laserstrålen af instrumentet vi bruger, er temmelig fint (~ 1 um bred) og tillader dissektion af små celler. Prøvetagning teknologi indsamle cells på en klæbrig dækoverflade ved elektrostatisk adhæsion er særlig fordelagtig til små celletyper og isoleringen af encellede sektioner. Dette minimerer risikoen for prøvetab ved elektrostatiske virkninger.
RNA Kvalitet Opnået er vigtigt for yderligere Transkriptionelle Analyser
Et af de mest kritiske punkter for en vellykket RNA-Seq bibliotek forberedelse er RNA kvalitet. Mens flere udbydere af amplifikationsprodukter kits optimeret deres teknologi for RNA af endnu lavere integritet, kvaliteten af de opnåede data efter transkriptom analyse af enten microarrays eller RNA-Seq forøger typisk med kvaliteten af input RNA. Under anvendelse af denne etableret protokol, opnåedes god og meget reproducerbar RNA kvalitet til forskellige udviklingsstadier i de kvindelige reproduktive væv og kimcellelinje i Arabidopsis og Boechera (fx figur 4). Mens denne metode anvendesogså for mere fjernt beslægtede arter (f.eks, tomat, upubliceret), skal det tages i betragtning, der kan kræves små optimeringer eller modifikationer afhængigt af arten, vævstype, og selv laboratoriemiljøet som for eksempel en høj luftfugtighed kan kompromittere RNA integritet under slide forberedelse og LAM.
Et afgørende skridt i protokollen er monteringen af sektioneret voks striber indeholder prøverne til dias. Her, navnlig kontakten til vand er et kritisk trin. Mens erstatte vand ved EtOH resulterer ikke i nogen væsentlig forbedring af RNA integritet efter isolering (upubliceret), udskiftning af vand ved hjælp af methanol gør. Imidlertid bør methanol kun håndteres under den kemiske hætte og med stor omhu. Afhængigt af prøven typen, som et alternativ til anvendelsen af methanol, kan tørretiderne efter montering med vand reduceres til ~ 2 timer (se 3.3.3.1), hvilket resulterer i lige så god RNA kvalitet.Udførelse af en afprøvning for at teste RNA kvalitet, der opnås ved at montere enten vand eller methanol for celletypen og arter af interesse anbefales ved begyndelsen af et nyt projekt.
LAM er en kraftfuld teknologi til Transkriptionelle Analyser
Afslutningsvis har vi med succes optimeret og anvendt kombinationen af LAM og celletype-specifik transkriptom analyse af microarrays og RNA-Seq til forskellige celler i seksuelle og apomiktiske germlinie afstamning i Arabidopsis thaliana og Boechera spp., Således at sammenlignende transkriptionelle analyser (se også figur 5) 7,11,13,14. Den beskrevne fremgangsmåde bærer en række fordele i forhold til andre teknologier, der muliggør celletype-specifik transkriptionel analyse. Vigtigt er det, afhængigt af genkendelighed af celletyper eller væv af interesse i afsnittet, det kan anvendes til sjældne celletyper af både modelog ikke-model arter, såsom cellerne i det modne kvindelige gametofyt i Boechera spp., eller det kan endda bruges til at isolere cellulære domæner, fx polære halvdele af celler 19. Lignende anvendelser ville ikke være muligt med andre metoder, som er afhængige af fluorescerende aktiverede sortering af celler eller kerner (FACS / ventilatorer) 10.
En væsentlig ulempe ved fremgangsmåden er den tid krav. Mens fiksering og forankring ikke kræver forlænget hands-til tiden og kan samtidig blevet gjort for en stor mængde af blomster, LAM som sådan er meget tidskrævende og for en celletype-specifik analyse, typisk 3 dage til 3 uger LAM (i gennemsnit 5 timer per dag ved det lasermikroskop) skal planlægges. I denne henseende er det nyttigt at gøre nogle forudgående test for hastigheden af isolering af den specifikke celletype målrettet til korrekt designe undersøgelsen. Desuden, selv ved brug af denne optimerede protokol, forsøg for at teste RNA kvalitet er stærkt reroses.
Sammenfattende LAM er et stærkt værktøj til den transkriptionelle analyse på løsningen af individuelle celletyper eller endda subdomæner af celler, som ikke kunne opnås ved anvendelse af alternative eksisterende metoder. I denne henseende er det bærer enormt potentiale til at tillade analyser, f.eks af udviklingsprocesser, med en meget høj tidslig og rumlig opløsning. Dette blev eksemplificeret ved analyserne af transcriptomes celler på alle vigtige trin for seksuel og apomiktiske reproduktion i Arabidopsis og Boechera 7,11,13,14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol | VWR | 1,009,861,000 | absolute EMPROVE Ph Eur,BP,USP |
| 15 ml falcon centrifuge tubes | VWR | 62406-200 | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent | G2939AA | |
| Acetic Acid | Applichem | A3686,2500 | 100% Molecular biology grade |
| Ambion Nuclease free water | life technologies | AM9932 | |
| ASP200 S | Leica | 14048043624 | tissue processor |
| black cardboard | can be purchased in special paper shops | ||
| DNA- and RNAse-free Frame Slides | Micro Dissect GmbH | 1, 4 µm PET-membrane; can also be purchased from Leica | |
| Dumond Forceps | Actimed | 0208-5SPSF-PS | |
| ethanol lamp | |||
| exsiccator | Sigma-Aldrich | Z354074-1EA | Nalgene Vaccuum Dessicator or similar equipment |
| filter tips 10 µl | Axon Lab AG | AL60010 | can be replaced by similar tips |
| filter tips 1,000 µl | Axon Lab AG | AL60010 | can be replaced by similar tips |
| filter tips 20 µl | Axon Lab AG | AL60020 | can be replaced by similar tips |
| filter tips 200 µl | Axon Lab AG | AL60200 | can be replaced by similar tips |
| forceps precision | VWE | 232-1221 | |
| glass slide holder | Huber & Co.AG | 10.0540.01 | Färbekästen nach Hellendahl |
| glass staining trough | Huber & Co.AG | 10.0570.01 | Färbekasten |
| Heated Paraffin Embedding Module Leica | Leica | Leica EG 1150 H | blocking station, similar devises are suitable |
| Heating and Drying Table | Medax | 15501 | other models and/or suppliers are suitable |
| ice bucket | VWR ice bucket with lid | 10146-184 | similar buckets equally suitable |
| light table | UVP An Analytical Jena Company | TW-26 | white light transluminator |
| microscope slide | Thermo Scientific | 10143562CE | cut edges |
| microtome blade | Thermo Scientific | FEAHS35 | S35 microtome blade disposable |
| MMI Cell Cut Plus Instrument | MMI (Molecular Machines and Industries) | ||
| Non-stick, RNAse free Microfuge tubes, 2 ml | life technologies | AM12475 | |
| Paraplast X-TRA | Roth | X882.2 | for histology |
| PicoPure RNA Isolation Kit | life technologies | KIT0204 | Arcturus PicoPure RNA Isolation Kit |
| plastic balancing trays | Semadeni AG | 2513 | |
| plastic box | Semadeni AG | 2971 | Plastikdose PS |
| plastic lid for heating plate | homemade | ||
| preparation needle | VWR | 631-7159 | |
| RNA 6000 Pico Kit | Agilent | 5067-1513 | |
| RNAse free microfuge tubes | life technologies | AM12400 | |
| RNAse ZAP Decontamination Solution | life technologies | AM9780 | |
| Semi-automated Rotary Microtome | Leica | RM2245 | similar devices are equally suitable |
| Tissue Loc Histo Screen Cassettes | Thermo Scientific | C-1000_AQ | similar cassettes of other suppliers are suitable |
| Tubes with adhesive lid, without diffusor 500 µl | MMI (Molecular Machines and Industries) | 50204 | |
| Xylol (Isomere) ROTIPURAN | VWR | 4436.2 | min. 99%, p.a., ACS, ISO SP |
| process embedding cassettes | Leica | 14039440000 | Leica Jet Cassette I without lid |
| Universal Oven | Memmert | UF55 | other models and/or suppliers are suitable |
References
- Maheshwari, P. An Introduction to the Embryology of Angiosperms. , McGraw-Hill. New York. (1950).
- Willemse, M. T. M., Van Went, J. L. The female gametophyte. Embryology of Angiosperms. Johri, B. M. , Springer-Verlag. Berlin. 159-196 (1984).
- Koltunow, A. M., Bicknell, R. A., Chaudhury, A. M. Apomixis: Molecular strategies for the generation of genetically identical seeds without fertilization. Plant Physiol. 108, 1345-1352 (1995).
- Vielle-Calzada, J. P., Crane, C., Stelly, D. M. Apomixis - the asexual revolution. Science. 274, 1322-1323 (1996).
- Grossniklaus, U., Koltunow, A., van Lookeren Campagne, M. A bright future for apomixis. Trends Plant Sci. 3, 415-416 (1998).
- Schmidt, A., Schmid, M. W., Grossniklaus, U. Plant germline formation: molecular insights define common concepts and illustrate developmental flexibility in apomictic and sexual reproduction. Development. 142, 229-241 (2015).
- Schmidt, A., et al. Apomictic and sexual germline development differ with respect to cell cycle, transcriptional, hormonal and epigenetic regulation. PLOS GENET. 10, e1004476 (2014).
- Okada, T., et al. Enlarging cells initiating apomixis in Hieractium praealtum transition to an embryo sac program prior to entering mitosis. Plant Physiol. 163, 216-231 (2013).
- Wuest, S. E., Grossniklaus, U. Laser-assisted microdissection applied to floral tissues. Methods Mol Biol. 1110, 329-344 (2014).
- Wuest, S. E., Schmid, M. W., Grossniklaus, U. Cell-specific expression profiling of rare cell types as exemplified by its impact on our understanding of female gametophyte development. Curr Opin Plant Biol. 16 (1), 41-49 (2013).
- Wuest, S. E., et al. Arabidopsis female gametophyte gene expression map reveals similarities between plant and animal gametes. Curr Biol. 20, 1-7 (2010).
- Cai, S., Lashbrook, C. C. Laser capture microdissection of plant cells from tape-transferred paraffin sections promotes recovery of structurally intact RNA for global gene profiling. Plant J. 48 (4), 628-637 (2006).
- Schmidt, A., Wuest, S. E., Vijverberg, K., Baroux, C., Kleen, D., Grossniklaus, U. Transcriptome analysis of the Arabidopsis megaspore mother cell uncovers the importance of RNA helicases for plant germ line development. PLOS BIOL. 9, e1001155 (2011).
- Schmid, M. W., Schmidt, A., Klostermeier, U. C., Barann, M., Rosenstiel, P., Grossniklaus, U. A powerful method for transcriptional profiling of specific cell types in eukaryotes: laser-assisted microdissection and RNA sequencing. PLOS ONE. 7, e29685 (2012).
- Mau, M., et al. Hybrid apomicts trapped in the ecological niches of their sexual ancestors. Proc Natl Acad Sci.U S A. 112 (18), 2357-2365 (2015).
- Aliyu, O. M., Seifert, M., Corral, J. M., Fuchs, J., Sharbel, T. F. Copy number variation in transcriptionally active regions of sexual and apomictic Boechera. demonstrates independently derived apomictic lineages. Plant Cell. 25 (10), 3808-3823 (2013).
- Corral, J. M., et al. A conserved apomixis-specific polymorphism is correlated with exclusive exonuclease expression in premeiotic ovules of apomictic boechera species. Plant Physiol. 163 (4), 1660-1672 (2013).
- Deeken, R., Ache, P., Kajahn, I., Klinkenberg, J., Bringmann, G., Hedrich, R. Identification of Arabidopsis thaliana. phloem RNAs provides a search criterion for phloem-based transcripts hidden in complex datasets of microarray experiments. Plant J. 55, 746-775 (2008).
- Schmid, M. W. Genome Scale Quantitative Biology in Arabidopsis thaliana. , University of Zürich. PhD Thesis 40-104 (2015).
